Summary
Beskrevet er en tids- og rumbesparende metode til at tælle æg og bestemme lugehastigheder for individuelle myg ved hjælp af 24 godt vævskulturplader, hvilket kan øge omfanget og hastigheden af fecundity og frugtbarhedsanalyser betydeligt.
Abstract
Myg udgør et betydeligt folkesundhedsproblem som vektorer af forskellige patogener. For de undersøgelser, der kræver en vurdering af myg fitness parametre, især ægproduktion og luge satser på det individuelle niveau, konventionelle metoder har lagt en betydelig byrde på efterforskerne på grund af høj arbejdsintensitet og laboratorie pladskrav. Beskrevet er en simpel metode ved hjælp af 24 godt væv kultur plade med agarose i hver brønd og digital billeddannelse af hver brønd til at bestemme æg numre og luge satser på et individuelt niveau med væsentligt reduceret tid og plads krav.
Introduction
Kontrol af myg for at beskytte mennesker mod vektorbårne patogener er et vigtigt folkesundhedsmål, hovedsagelig på grund af manglen på effektive vacciner til de fleste af de patogener, der bæres af myg. Mange undersøgelser har til formål at reducere myg fitness i forbindelse med et felt-gældende befolkningsreduktion strategi1,2,3. Dette omfatter omfattende undersøgelser for at skabe transgene myg og / eller CRISPR / Cas9 knockout linjer. Sådanne metoder til befolkningsændringer kræver en detaljeret vurdering af de enkelte fitnessparametre4. Konventionelle laboratorieteknikker til vurdering af kvindelige mygs egnethed omfatter individuel indeslutning af parrede, blodfodrede hunmyg i 100 mL beholdere5, modificerede 50 mL koniske rør eller rør til Drosophila-opdræt modificeret ved at give fugtige overflader ved hjælp af fugtige bomulds- og filterpapirskiver til fåreposition (dvs. ægpapir)1,2,6,7. Sådanne metoder kræver et relativt stort rum (f.eks. 30 cm x 30 cm x 10 cm: W x L x H i op til 100 Drosophila-rør) (figur 1) og manipulation af individuelle ægpapir til optælling af æg og rugelarver, som kan være arbejdskrævende. Dette manuskript præsenterer en metode til at tælle myggeæg og bestemme klækkehastigheder ved hjælp af 24 brøndplader og agarose som en oviposition overflade for at omgå disse spørgsmål8.
Samtidig beskrev Ioshino et al.9 en detaljeret metode ved hjælp af 12 og 24 brøndplader til at udføre ægtælling opnået fra individuelle kvinder. Deres protokol repræsenterede en betydelig forbedring i forhold til konventionelle metoder til at spare tid og plads9. Den protokol, de beskrev, fortsætter dog med at bruge vådt filterpapir som overflade til oviposition, hvilket kræver, at hvert enkelt papir foldes ud for at få tæller, da æg ofte findes under eller i folder. Deres protokol omfattede heller ikke brugen af billeddannelsesteknologier eller en metode til larvetælling.
Præsenteret er en forbedret metode til at udføre fitness assays for æg nummer (dvs. fecundity) og luge sats (dvs. frugtbarhed) ved hjælp af agarose som en oviposition overflade i en 24 godt væv kultur plade format for Ae. aegypti at oviposit på fugtige overflader. Disse plader blev navngivet "EAgaL" plader, fra Egg, Agarose, og Larva. Disse 24 brøndplader giver individuelle myg en minimal overflade til at lægge æg, hvilket forenkler og drastisk reducerer den tid og indsats, der er nødvendig for at tælle og vedligeholde æg og udklækkede larver i et par dage. EAgaL-pladen bruger gennemskinnelig agarose til ovipositionsoverfladen, hvilket eliminerer behovet for håndtering af ægpapir og finde æg og larver, når de klækkes; fotografering hver brønd etablerer en langsigtet arkiveret registrering af resultaterne og adskiller optællingsprocessen i både tid og rum fra opdræt / håndtering proces, hvor tiden ofte er begrænset.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tilberedning af plader
- Bor huller i 24 brøndvævskulturpladelåg (4-6 huller pr. brønd) ved hjælp af en husholdningsboremaskine med en ~ 1,6 mm (1/16 tommer) bit(figur 2).
BEMÆRK: Disse huller forhindrer vandkondensation fra agarose for at akkumulere på låget, hvor myg kan lægge æg. Standardstørrelsen af kvindelige Ae. aegypti ("Liverpool" stamme) er ~ 3,11 mm vingefang. Reduktion af hullernes størrelse anbefales, når du bruger mindre myg for at undgå flugt fra pladen. - Dagen før ovipositionseksperimentet vaskes og skylles pladerne grundigt, og de lægges i blød i 1−5% blegemiddel i 30-60 minutter ved stuetemperatur. Skyl grundigt under rindende deioniseret vand og tør dem.
BEMÆRK: Denne proces reducerer risikoen for svampe og bakterier vokser på agarose. - Smelt agarose ved 2% i deioniseret vand og tilsæt straks 500 μL af den smeltede agarose til hver brønd af de 24 brøndplader ved hjælp af en 1.000 μL pipette (Figur 3A,B). Når agarose begynder at afkøle og tilstoppe pipettespidsen, opvarmes agarose igen og bruges en ny pipettespids.
BEMÆRK: Undgå at røre ved brøndens vægge med pipettespidsen, da den kan efterlade et stykke agarose på væggen, hvor en kvinde kan lægge æg, hvilket komplicerer billeddannelses- og optællingsprocessen. - Før brug skal du tørre eventuel kondens på brøndvæggene natten over på en laboratoriebænk (Figur 3C,D).
BEMÆRK: Tidslinjen for EAgaL pladeanalysen fra blodfoder til larvebilleddannelse er afbildet i figur 4, som er for kolonimygger (Ae. aegypti "Liverpool" opdrættet under 14 timers lys:10 h mørkt lys cyklus, 27 °C, 80% relativ luftfugtighed, 500 larver i en 49,5 cm x 29,2 cm x 9,5 cm bakke med 2 L vand), under insektforhold. Det anbefales, at hvert laboratorium tester EAgaL-pladen med de myg, der bruges, især når du bruger forskellige stammer, forskellige mygarter samt forskellige opdrætsprotokoller.
2. Myggenet
BEMÆRK: Det er vigtigt at bruge myg opdrættet under ensartede forhold for alle behandlingsgrupper og kontrolgrupper, fordi larve ernæring har en indvirkning på myg fitness parametre10,11. Bageste larver under urørte forhold med tilstrækkelig mad. Lad kvindelige myg etabere i nærværelse af mænd, så parring er sikret og moden i mindst 3 dage.
- Fjern enhver kilde til vand og/eller sukker fra de kvindelige myg mindst 16 timer før blodfodring for at øge blodfodringen.
- Varm en vandcirkulationspumpe til kunstig fodring ved 37 °C, og foder kvindelige myg med hvirveldyrblod placeret i kunstige fødefodere i 15-30 minutter (figur 5A).
- Bedøve myg med CO2 eller på is, overføre dem til en glasskål på is, og vælg dem, der er engorged med blod (Figur 5B) i en beholder forsynet med 30% saccharose vand i mere end 72 timer, når hunnerne er færdig udskillelse og æg udvikling.
BEMÆRK: Hvis hunnerne får en lavere koncentration af saccharosevand, fjernes saccharosevandet og eventuelle våde overflader efter 48 timer for at forhindre hunnerne i at få faar.
3.Oviposition
- Ca. 1 time før myg overføres til pladerne, tilsættes 2-3 dråber (~80−120 μL) vand til hver pladebrønd ved hjælp af en overførselspipette.
- Mindst 72 timer efter blodfodring, knockdown myg med CO2 eller på is, overføre dem til en glas skål på is, og individuelt placere hver myg på en omvendt låg af de 24 godt plade på is (Figur 6A).
BEMÆRK: Denne procedure er blevet anvendt fra Ioshino et al.9. - Når alle 24 myg er placeret, skal låget dækkes med en omvendt pladebund(figur 6B),låget og pladen fastgøres med et friskt, nyt elastik og placeres i et miljøkammer (eller opdrætsrum)(figur 6C),indtil myggene kommer sig (~10−15 min) og drej pladen til højre side op (Figur 6D).
- Lad de kvindelige myg oviposit i 24−48 timer og fjern kvinder ved at frigive dem fra pladerne i et stort bur.
BEMÆRK: Hvis det er vigtigt at holde styr på de enkelte hunner, skal du bedøve dem ved at afkøle pladerne og fjerne dem individuelt på is. Forsinket oviposition og mørke udskillelser, der forstyrrer ægtællingen, blev observeret, da hunnerne blev overført til pladerne tidligere end 72 timer efter blodmel (PBM) (Figur 7D).
4. Ægtælling
- Kontroller hver brønd af de 24 brøndplade, da myg nogle gange lægger æg på brøndenes væg og ved margenen af agarose / plastoverfladen, hvor de er vanskelige at løse på fotografier. Brug en våd pensel, flytte æg lagt på væggen og kanten af agarose til den flade overflade af agarose, så alle æg er i et ensartet plan og ikke overlapper hinanden.
BEMÆRK: Kanten af agarose er typisk ude af kameraets brændplan på grund af overfladespændingen af agaroseopløsningen. - Brug pincet, fjerne eventuelle brækkede ben, vinger og andre partikler i brøndene, der kan forstyrre billeddiagnostik æg (Figur 7C).
- Indsæt hvidt papir under pladen for at øge kontrasten med mørke myggeæg inden billeddannelse ved hjælp af en stereomikroskop illuminator (Figur 7A).
- Tag et billede af hver brønd ved hjælp af et kompakt digitalt kamera i mikroskoptilstand, som giver brugeren mulighed for at fokusere på objekter så tæt som 1 cm. Denne evne gør det muligt at placere kameraet direkte på pladen for at afbilde æg uden stativ eller stativ (Figur 7A). For at skelne mellem individuelle æg, der er lagt i klumper, skal du bruge den fine eller superfine tilstand til at tage billeder i høj opløsning, så nærbilleder kan ses.
BEMÆRK: Ryd kameraets hukommelseskort, før det bruges, for at undgå forvirring mellem nye og gamle billeder. - Når du har fotograferet hver brønd på en plade, skal du tage et billede af hele pladen med en billedbestillingsetiket for at skelne mellem hver plade senere (Figur 7E).
- Tilsæt et tyndt lag ~5 dråber vand (~200 μL) med en overførselspipette til hver brønd for at forhindre, at dets agarosestik og æggene tørrer og fremkalder embryoudvikling og udklækning. Vær opmærksom på vandstanden i de første par timer og kontroller hver dag, fordi der kan være vandtab på grund af absorption af agarose eller fordampning. Tilsæt vand, når niveauet er for lavt til, at larver kan luge.
BEMÆRK: Fordampning af vand sker ikke ensartet både i en plade og i en stak plader. Det er blevet observeret, at tørring sker i følgende rækkefølge: 1) hjørnebrønde (A1, A6, D1, D6) tørrer hurtigst; efterfulgt af 2) brønde ved pladens yderkant (A2-A5, B1, B6, C1, C6, D2-D5) og sidste 3) brønde indeni. Når pladerne er stablet, tørrer toppladen hurtigst. - Overfør billederne til en computer med ImageJ (Fiji), og omdøb filerne, .jpg så de bliverlettere at organisation, f.eks.
- Opret en regnearksfil for at registrere ægnumre (dvs. fecundity) og larvetal og beregne lugehastighed (dvs. frugtbarhed)(figur 9E).
- Åbn billederne med ImageJ (Fiji)12, og brug værktøjet "multipunkt" til at markere hvert æg (Figur 9A−C); zoom-in eller zoom-out ved hjælp af "+" eller "–" for at tælle æggene i klumper. Når du har markeret alle æggene, skal du dobbeltklikke på flerpunktsikonet for at få opdateret antallet af mærker (Figur 9D). Registrer resultaterne i et regneark.
5. Fertilitetsvurdering
BEMÆRK: Om 2 dage kan de første instar larver begynde at eeklose i brøndene. Vent i 3-5 dage mere før billeddannelse/optælling for at sikre, at alle levedygtige æg klækkes.
- Forbered larvefoder ved at blande 1/16 spsk (~ 168 mg) fiskefoder (dvs. normal myg larve kost) i 20 mL vand og venter på store faste partikler til at bosætte sig (Figur 10A−D). Begynd at tilføje mad (supernatanten) til de brønde, der indeholder udklækkede larver, så snart de vises, fordi de ikke overlever længe uden mad.
BEMÆRK: Overskydende tilsætning af madpartikler kan forstyrre billeddannelse og optælling af udklækkede larver. - Ca. 5-8 dage efter tilsætning af vand til brøndene afkøles pladen ved at dække med knust is i 15-20 minutter for at bedøve larver.
- Tag billeder af hver brønd, mens du holder pladerne på is, som det blev gjort med æggene. Til larvebilleder skal du give en mørk baggrund ved at indsætte et sort materiale under pladen for at hjælpe med at forbedre kontrasten. Efter at have fotograferet hver brønd på en plade, skal du tage et billede af hele pladen med en billedordreetiket for at skelne hver plade senere.
BEMÆRK: Billeder tages, mens pladerne er på is, fordi larvebevægelse kan kompromittere optællingen. Pladerne kan genbruges; fryse og fjerne myg og agarose til rengøring til næste brug. EAgaL-pladen er ikke egnet til opdræt af larver til fremskredne stadier. - Åbn billeder med ImageJ (Fiji), og brug værktøjet "multi-point" til at tælle ved at klikke på hver larve. I løbet af 3−5-dages perioden kan nogle larver have smeltet, især i brønde med lavt antal larver. Derfor, når du tæller, skal du udelukke skuret neglebånd (dvs. exuviae), der ligner hoved-kun larver med en lille smule krop eller indskrumpede larver (Figur 10E). Registrer resultaterne i regnearket.
6. Udfør analyse
- Efter at have indsamlet alle nødvendige data til fecundity og fertilitetsanalyse, udføre passende statistisk analyse og oprette grafer ved hjælp af foretrukken software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Myg blev injiceret med dsRNA rettet mod en kandidat jern transportør (FeT) eller kontrol gen (EGFP), blod-fodret, og målt for fecundity og fertilitet output ved hjælp af EAgaL plade metode, efter proceduren beskrevet ovenfor.
Myg, hvor FeT-udtrykket blev bragt til tavshed efter dsRNA-injektion, udviste en betydelig reduktion i både ægnummer og klækkehastighed(figur 11A−C). Alle kontrol- og behandlingsmyg blev placeret i EAgaL-pladerne efter 72 timer PBM. FeT-tavse myg udviste også forsinket udskillelse og små og lyse æg(Figur 12A,B). Eksempelresultater kan også findes i Tsujimoto et al.8.
Figur 1: Fluerør, der almindeligvis anvendes til myggen fecundity / frugtbarhed assays. (A) Et enkelt rør med fugtigt bomulds- og cirkulært filterpapir med svamphætte. (B) 100 rør i et stativ (~30 cm x 30 cm). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Boring af huller i et låg på 24 brøndvævskulturplader. (A)Boring i gang. (B) Et låg med huller, der forhindrer kondens. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Anvendelse af agarose (2% i vand) i brøndene. (A)Anvendelse af agarose ved hjælp af en 1.000 μL pipette. Bemærk, at spidsen ikke rører væggen i brønden. (B)En plade med agarose i bunden. (C) Væg af en brønd lige efter agarose størknet. Bemærk kondens på væggen. (D) Væg af en brønd, når kondens fordampet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Tidslinje fra blodfodring (dag 0) til larvebilleddannelse (dag 10−13). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Kunstig blodfodring og udvælgelse af engorged kvinder. (A)Blodfoder ved hjælp af kunstig føder. (B) Udvælgelse af engorged hunner på is. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Overførsel af hunner til EAgaL-plade. (A) Overfør bedøvede hunner til et omvendt pladelåg på is. (B) Derefter anbringes den inverterede agaroseholdige plade forsigtigt på det omvendte låg, og (C) fjern pladen med låg fastgjort fra isen og hold den i en omvendt position, indtil hunnerne er kommet sig efter bedøvelse. (D,E) Vend den hunholdig plade rundt til den opadgående position. Bemærk, at låget og den nederste del af pladen holdes af en elastik, og at den nederste del er mærket. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Billeddannelse af hver brønd efter hunnerne blev fjernet. (A)Digitalt kamera oven på en ægholdig 24 brøndplade til billedbehandling. (B) Typisk billede af en brønd. (C)En brønd, der indeholder et ben, og som skal fjernes. (D) Prøvebillede af en brønd, hvor en kvinde var blevet placeret på 48 timer PBM. Bemærk de mørke udskillelsesmærker, som kan komplicere ægtælling (pile). (E)Hele pladen med en billedbehandlingsordreetiket, der er fremstillet efter afbildningen af alle pladens brønde. Dette hjælper med at genkende brønde under analysen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: Omdøbning af billederne for bedre organisation. (A)Billeder af individuelle ægholdige brønde, herunder en billedordreetiket med de navne, der automatisk tildeles af kameraet. (B) De samme billeder omdøbt med plateID_wellID.jpg format. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9: Optælling af æg ved hjælp af "Fiji" (ImageJ2) software. (A) Skærmbillede afFiji-software,der viser værktøjet " multipunkt " fremhævet (turkis firkant). (B) Et godt billede med Fiji tælle mærker på æggene. (C) Zoome ind hjælper, når tælle større æg grupper. (D) Hvis du dobbeltklikker på værktøjsikonet "flere punkter" i hovedvinduet, vises antal (rød cirkel). (E) Et eksempel på et regneark med formlen til beregning af skraveret sats. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 10: Larve kost forberedelse og en brønd indeholdende larver og exuviae. (A)Fiskefoder på jorden. (B) 20 mL vand i en kop. (C) Blanding af fødevarer og vand fra fisk på jorden. (D)Mad/vand afregnes i 15 min. Tag supernatant af denne blanding som larve mad. (E) Godt med smeltede larver; repræsentative exuviae er angivet med pile. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 11: Tælle data fra et genhæmningseksperiment. Myg injiceret med dsRNA mod formodede jern transportør (FeT) udviste en betydelig reduktion af (A) æg nummer,(B)larvetal, og (C) luge sats i forhold til kontrol (EGFP). Barer viser betyde ± SD. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 12: Repræsentative billeder af brøndene, der viser yderligere fænotyper i gentrøstede myg. dsFeT viste forsinket udskillelse (mørkebrune mærker) og små, let farvede æg. Der vises to repræsentative brønde for hver behandling. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Ft | EAgaL | |
| (1) Prep | 20 min 29,0 sek. | 3 min 49,3 sek. |
| (2) F_in | 3 min 55,0 sek. | 1 min 56,0 sek. |
| (3) F_out/E_img | 43 min 44,3 sek. | 15 min 28,3 sek. |
| (4) L_img | 38 min 03,5 sek. | 9 min 30,5 sek. |
Tabel 1: Tidskrav til færdiggørelse af flyverørsmetoden (FT) i forhold til EAgaL-plademetoden. (1) Prep: Tid, der kræves for at placere bomuld, hæld vand i, og indsæt filterpapir disk i Drosophila opdræt rør (FT) versus hælde af agarose i brønde på 24 godt plade (EAgaL). (2) F_in: Den tid, det tager at anbringe individuelle myg i opdrætsrør (FT) eller brønde på 24 brøndpladen (EAgaL). (3) F_out/E_img: Tid til at frigive myg i et større bur, fjerne, udfolde æg papir, og billede æggene på papiret (FT) eller frigive myg i et større bur og billede hver brønd af de 24 godt plade (EAgaL). (4) L_img: Den tid, det tager at forestille larver udklækket i en lille beholder (FT) eller hver brønd af 24-brøndspladen (EAgaL) efter koldbedøvelse. I alt 24 rør blev brugt til FT.
| Masseomkostninger | |||||
| EAgaL plade | Fluerør | ||||
| vare | pris | kvantitet | vare | pris | kvantitet |
| 24-brønds plader | 45,61 kr. | Sag af 50 | Papirark til kromatografi | 103,63 kr. | 46 × 57 cm 100 ark/PK |
| Agarose | 250,97 kr. | 500 gram | Fluerørsstativer + rør | 68,45 kr. | 5 bakker med 100 bakker |
| Olympus TG-6 | 375,00 kr. | Fluerør stik | 66,10 kr. | Sag af 200 | |
| Vatkugler | 104,27 kr. | Sag af 2000 | |||
| Starttotal | 671,58 kr. | Starttotal | 342,45 kr. | ||
| Enhedsomkostninger (en 24-brønds plade eller 24 rør) | |||||
| EAgaL plade | Fluerør | ||||
| vare | pris | seddel | vare | pris | seddel |
| en 24-brønds plade | 0,91 kr. | bulkpris/50 | Papirark til kromatografi | 0,16 kr. | 641,7 sæt af 24 rør værd(2) |
| Agarose pr. plade | 0,15 kr. | 500g= 1667 plader(1) | Fluerørsstativer + rør | 39,00 kr. | (bulkpris/500) × 24 |
| Fluerør stik | 79,00 kr. | (bulkpris/200) × 24 | |||
| Vatkugler | 11,00 kr. | (bulkpris/2000) × 24 | |||
| Enhed i alt | 11,00 kr. | Enhed i alt | 129,00 kr. | ||
Tabel 2: Sammenligning af omkostninger mellem EAgaL-pladen og FT. Top: Bulk omkostninger til opstart (forudsat en boremaskine og en borekrone kan leveres af en forsker). Nederst: Anslåede omkostninger for en 24 brøndplade (EAgaL-plade) og 24 FT. (1) Forudsat at en plade kræver lidt mere end lige nok til en 24 brøndplade (12mL), 15 mL på 2% = 0,3 g agarose pr. Plade, kan i alt 500 g agarose lave 1.667 plader. (2) Et ark papir kan gøre 154 af ~ 38 mm diameter diske. Med 100 ark kan der laves 641,7 (15.400/24) sæt med 24 rør.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EAgaL-pladen reducerer drastisk arbejdskraft, tid og plads til at udføre individuelle fecundity og fertilitetsanalyser i Aedes aegypti sammenlignet med FT-metoden. Den foreløbige sammenligning mellem FT-metoden og EAgaL-pladen resulterede i kortere tid for alle trin (billedteknikken blev anvendt på FT-metoden)(tabel 1). Som reference findes et skøn over start- og analyseomkostninger (en 24 brønd EAgaL-plade mod 24 FT' er) i tabel 2.
Der er et par punkter at overveje, når du bruger EAgaL plader. En første bekymring var, at myg placeret i et så lille rum muligvis ikke lægger alle æg på grund af begrænset bevægelse. For at afgøre, om dette var tilfældet, blev myggene samlet overført til et større bur med en oviposition kop foret med et køkkenrulle med vand i yderligere 48 timer, efter at de tilbragte 48 timer i EAgaL-pladerne. Myggene lagde faktisk yderligere æg, men det gennemsnitlige antal æg pr. Kvinde var kun 2,1, hvilket ikke resulterer i nogen forskel i resultatet af en statistisk analyse i de fleste, hvis ikke alle, tilfælde. Disse tal er fra mere end 500 testede myg (data vises ikke). Dette kan dog udelukkende være for Ae. aegypti "Liverpool" myg stamme med de beskrevne betingelser. Hvert laboratorium kan være nødvendigt at teste, om dette er tilfældet for dets myg og forhold.
Til billedbehandling dækkede det enkelte billede af et kamera, der er fastgjort til et stereomikroskop, ikke en hel brønd, selv ved den laveste forstørrelse. Dette krævede at få flere billeder pr godt og til gengæld lappe billederne, eller holde styr på æg overlappede i flere billeder af den samme brønd. Begge tilgange komplicerede analysen alvorligt og øgede det involverede arbejde betydeligt. På grund af karakteren af et stereomikroskop er kameravinklen altid lidt venstre eller højre fra vinkelret vinkel, hvilket gør venstre eller højre sidevægsblok til en del af agaroseoverfladen.
Forurening af mikroorganismer, især svampe, kan være et problem under analysen. Selvom blegning kan minimere forureningen før ovipositionen, kan svampe være til stede i insektmiljøet og bæres af myggene selv. I sådanne tilfælde kan det reducere forekomsten at holde insektrum rene. Det er bedst for hvert laboratorium at teste en EAgaL-plade for at opdage eventuelle problemer.
Bemærk, at EAgaL plademetoden ikke var designet til at opretholde mygkulturer ud over de tidlige larvestadier. Det gennemsnitlige antal larver pr. brønd var typisk over 60, og det er ikke usædvanligt at have mere end 100 larver pr. Brønd. Dette skaber overfyldte forhold, hvilket resulterer i en forsinkelse i udviklingen, lavere hvalp sats, og meget små voksne, som kan kompromittere downstream undersøgelser.
I øjeblikket er denne metode kun blevet testet med Ae. aegypti. Det testes dog i øjeblikket for at udvide sin anvendelse til andre arter af Aedes og endda andre slægter af myg som Anopheles og Culex.
På grund af de reducerede tids- og pladskrav til EAgaL-plademetoden kan fecundity- og fertilitetsanalyserne skaleres op til semihøj gennemløb (dvs. 5-10 plader eller mere pr. eksperiment). Denne funktion af EAgaL plademetoden kan være yderst nyttig til at vurdere de vigtige fitnessparametre for myg til insekticidtest, sterilitetsevaluering, transgenese og genredigeringsundersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter for denne undersøgelse.
Acknowledgments
Vi takker Texas A &M Agrilife Research Insect Vectored Diseases Grant Program for finansiering. Vi takker også Adelman lab medlemmer for hjælp til at udvikle denne metode og forslag, når udarbejdelsen af manuskriptet, samt Kevin Myles lab medlemmer. Vi takker også korrekturlæsere og redaktører for deres hjælp til at gøre dette manuskript bedre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.6 mm Φ drill bit | alternatively heated nails can be used | ||
| 1000 μL pipette tips (long) | Olympus plastics | 24-165RL | |
| 24-well tissue culture plate | Thermo Scientific | 930186 | clear, flat-bottom with ringed lid plates |
| Agarose | VWR | 0710-500G | |
| Compact digital camera | Olympus | TG-5/TG-6 | |
| Computer (Windows, Mac or Linux) | |||
| Deionized water | |||
| Fiji (imageJ) software | download from: https://fiji.sc/ | ||
| Forceps | Dumont | sharp forceps may break mosquito's body | |
| Glass Petri dishes | VWR | ||
| Household bleach | |||
| Household electric drill | |||
| illuminator for stereomicroscope (gooseneck) | |||
| P-1000 pipette | Gilson | ||
| paint brushes | |||
| Rubber bands | |||
| SD card | to record digital camera images (DSHC, SDXC should be better) | ||
| Spreadsheet software (Microsoft Excel) | Microsoft | Any spreadsheet software works | |
| TetraMin fish food | Tetra | ground with coffee grinder, blender or morter & pestle | |
| Transfer pipetts | VWR | 16011-188 |
References
- Bond, J. G., et al. Optimization of irradiation dose to Aedes aegypti and Ae. albopictus in a sterile insect technique program. PLoS One. 14 (2), 0212520 (2019).
- Fernandes, K. M., et al. Aedes aegypti larvae treated with spinosad produce adults with damaged midgut and reduced fecundity. Chemosphere. 221, 464-470 (2019).
- Inocente, E. A., et al. Insecticidal and Antifeedant Activities of Malagasy Medicinal Plant (Cinnamosma sp.) Extracts and Drimane-Type Sesquiterpenes against Aedes aegypti Mosquitoes. Insects. 10 (11), 373 (2019).
- Marrelli, M. T., Moreira, C. K., Kelly, D., Alphey, L., Jacobs-Lorena, M. Mosquito transgenesis: what is the fitness cost. Trends in Parasitology. 22 (5), 197-202 (2006).
- da Silva Costa, G., Rodrigues, M. M. S., Silva, A. A. E. Toward a blood-free diet for Anopheles darlingi (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. , 217 (2019).
- Gonzales, K. K., Tsujimoto, H., Hansen, I. A. Blood serum and BSA, but neither red blood cells nor hemoglobin can support vitellogenesis and egg production in the dengue vector Aedes aegypti. PeerJ. 3, 938 (2015).
- Gonzales, K. K., et al. The Effect of SkitoSnack, an Artificial Blood Meal Replacement, on Aedes aegypti Life History Traits and Gut Microbiota. Scientific Reports. 8 (1), 11023 (2018).
- Tsujimoto, H., Anderson, M. A. E., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Identification of Candidate Iron Transporters From the ZIP/ZnT Gene Families in the Mosquito Aedes aegypti. Frontiers in Physiology. 9, 380 (2018).
- Ioshino, R. S., et al. Oviplate: A Convenient and Space-Saving Method to Perform Individual Oviposition Assays in Aedes aegypti. Insects. 9 (3), 103 (2018).
- Price, D. P., Schilkey, F. D., Ulanov, A., Hansen, I. A. Small mosquitoes, large implications: crowding and starvation affects gene expression and nutrient accumulation in Aedes aegypti. Parasites & Vectors. 8, 252 (2015).
- Valerio, L., Matilda Collins, C., Lees, R. S., Benedict, M. Q. Benchmarking vector arthropod culture: an example using the African malaria mosquito, Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae). Malaria Journal. 15 (1), 262 (2016).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
