Summary
המתואר הוא זמן ושיטת חיסכון במקום לספור ביצים ולקבוע את שיעורי הצוהר של יתושים בודדים באמצעות 24 גם צלחות תרבית רקמה, אשר יכול להגדיל באופן משמעותי את קנה המידה ואת המהירות של פוריות ופוריות מבחני.
Abstract
יתושים מייצגים בעיה משמעותית בבריאות הציבור כווקטורים של פתוגנים שונים. עבור אותם מחקרים הדורשים הערכה של הפרמטרים כושר יתושים, במיוחד ייצור ביצים ושיעורי הצוהר ברמה האישית, שיטות קונבנציונליות יש לשים נטל משמעותי על החוקרים בשל אינטנסיביות עבודה גבוהה ודרישות חלל מעבדה. המתואר היא שיטה פשוטה באמצעות 24 צלחת תרבית רקמה היטב עם agarose בכל באר הדמיה דיגיטלית של כל באר כדי לקבוע את מספרי הביצים ואת קצבי הצוהר ברמה האישית עם דרישות זמן ומרחב מופחת באופן משמעותי.
Introduction
השליטה של יתושים כדי להגן על בני אדם מפני פתוגנים המועברים על ידי וקטורים היא מטרה חשובה לבריאות הציבור, בעיקר בשל היעדר חיסונים יעילים עבור רוב הפתוגנים הנישאים על ידי יתושים. מחקרים רבים שואפים להפחית את כושר היתושים בשילוב עם אסטרטגיה להפחתת אוכלוסייה ישימה בשטח1,2,3. זה כולל מחקרים מקיפים ליצירת יתושים מהונדסים ו/או קווי נוקאאוט CRISPR/Cas9. גישות שינוי אוכלוסייה כאלה דורשות הערכה מפורטת של פרמטרי כושר אישיים4. טכניקות מעבדה קונבנציונליות כדי להעריך את הכושר של יתושים נקבה כולל את ההכלה האישית של יתושים נקבה מזווגת, שניזונו בדם במיכלי 100 מ"ל5, צינורות חרוטים שונה 50 מ"ל, או צינורות לגידול Drosophila שונה על ידי מתן משטחים לחים באמצעות כותנה לחה דיסקים נייר מסנן עבור oviposition (כלומר, ניירות ביצה)1,2,6,7. שיטות כאלה דורשות מרחב גדול יחסית (למשל, 30 ס"מ x 30 ס"מ x 10 ס"מ: W x L x H עד 100 צינורות דרוסופילה) (איור 1),ומניפולציה של ניירות ביצה בודדים לספירת ביצים וזחלים בוקעים, אשר יכול להיות עבודה אינטנסיבית. כתב יד זה מציג שיטה לספור ביצי יתושים ולקבוע את קצב הפתח באמצעות 24 לוחות באר ו agarose כמשטח oviposition לעקוף את הנושאים האלה8.
במקביל, Ioshino et al.9 תיאר שיטה מפורטת באמצעות 12 ו 24 צלחות באר לבצע ספירת ביצים המתקבל נקבות בודדות. הפרוטוקול שלהם ייצג שיפור משמעותי משיטות קונבנציונליות בחיסכון בזמן ובמרחב9. עם זאת, הפרוטוקול שהם תיארו ממשיך להשתמש בנייר סינון רטוב כמשטח עבור oviposition, אשר דורש נפרש כל נייר בודדים כדי לקבל ספירות, כמו ביצים נמצאים לעתים קרובות מתחת או בקפלים. הפרוטוקול שלהם גם לא כלל שימוש בטכנולוגיות הדמיה או שיטה לספירת זחלים.
מוצג היא שיטה משופרת לבצע מבחני כושר עבור מספר הביצה (כלומר, פוריות) ואת קצב הצוהר (כלומר, פוריות) באמצעות agarose כמשטח oviposition בפורמט 24 צלחת תרבות רקמה היטב עבור Ae. aegypti כי oviposit על משטחים לחים. צלחות אלה נקראו "EAgaL" צלחות, מ Egg, אגא עלה,ו Larva. 24 צלחות באר אלה מספקות ליתושים בודדים משטח מינימלי להטיל ביצים, ובכך מפשטות ומפחיתות באופן דרסטי את הזמן והמאמץ הדרושים כדי לספור ולתחזק ביצים וזחלים בקעו במשך כמה ימים. צלחת EAgaL משתמשת agarose שקוף עבור פני השטח oviposition, אשר מבטל את הצורך בטיפול ניירות ביצה ומציאת הביצים הזחלים כאשר בקעו; צילום כל באר קובע תיעוד ארכיוני ארוך טווח של התוצאות ומפריד את תהליך הספירה הן בזמן והן בחלל מתהליך גידול /טיפול, שבו הזמן מוגבל לעתים קרובות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת צלחת
- קידוח חורים ב-24 מכסי לוחות רקמות (4-6 חורים לבאר) באמצעות מקדחה ביתית עם סיבית של ~ 1.6 מ"מ (1/16 אינץ')(איור 2).
הערה: חורים אלה מונעים עיבוי מים מן agarose לצבור על המכסה, שבו יתושים עשויים להטיל ביצים. הגודל הסטנדרטי של נקבת Ae. aegypti (זן "ליברפול") הוא ~ 3.11 מ"מ מוטת כנפיים. צמצום גודל החורים מומלץ בעת שימוש יתושים קטנים יותר כדי למנוע בריחה מהצלחת. - ביום שלפני הניסוי oviposition, לשטוף ולשטוף את הצלחות ביסודיות להשרות אותם 1-5% אקונומיקה במשך 30-60 דקות בטמפרטורת החדר. יש לשטוף היטב תחת מים שעברו דה-יון ולייבש אותם.
הערה: תהליך זה מקטין את הסיכוי של פטריות וחיידקים גדל על agarose. - ממיסים אגרוז ב-2% במים שעברו דה-יון ומוסיפים מיד 500 μL של ההתעוררות המותכת לכל באר של 24 לוחות הבאר באמצעות פיפטה של 1,000 μL(איור 3A,B). כאשר agarose מתחיל להתקרר ולסתום את קצה פיפטה, לחמם מחדש את agarose ולהשתמש קצה פיפטה חדש.
הערה: הימנע מנגיעה בקירות הבאר עם קצה פיפטה כי זה עלול להשאיר חתיכת agarose על הקיר שבו נקבה עלולה להטיל ביצים, לסבך את תהליך ההדמיה והספירה. - לפני השימוש, ייבשו כל עיבוי על קירות הבאר במשך הלילה על ספסל מעבדה(איור 3C,D).
הערה: ציר הזמן של בדיקת צלחת EAgaL מהזנת דם להדמיית זחל מתואר באיור 4, המיועד ליתושים במושבה (Ae ). aegypti "ליברפול" גדל תחת 14 שעות אור:10 שעות מחזור אור כהה, 27 °C (60 °F), 80% לחות יחסית, 500 זחלים ב 49.5 ס"מ x 29.2 ס"מ x 9.5 ס"מ מגש עם 2 L של מים), בתנאים חרקים. מומלץ כי כל מעבדה לבדוק את צלחת EAgaL עם יתושים בשימוש, במיוחד בעת שימוש זנים שונים, מינים שונים יתושים, כמו גם פרוטוקולי גידול שונים.
2. האכלת יתושים
הערה: זה קריטי להשתמש יתושים שגודלו בתנאים אחידים עבור כל קבוצות הטיפול וקבוצות הבקרה, כי תזונה זחל יש השפעה על הפרמטרים כושר יתושים10,11. זחלים אחוריים בתנאים לא צפופים עם מספיק מזון. תן יתושים נקבה eclose בנוכחות זכרים, כך הזדווגות מובטחת, ובוגר לפחות 3 ימים.
- הסר כל מקור מים ו/או סוכר מהיתושים הנשיים לפחות 16 שעות לפני האכלת הדם על מנת לשפר את האכלת הדם.
- מחממים סירקולטור מים להאכלה מלאכותית ב-37 מעלות צלזיוס ומאכילים יתושים נקביים באמצעות דם בעלי חוליות המוצב במאכילים מלאכותיים למשך 15-30 דקות(איור 5A).
- הרדמה של יתושים עם CO2 או על קרח, מעבירים אותם לצלחת זכוכית על קרח, ובוחרים יתושים עםדם (איור 5B)למיכל המסופק עם 30% מי סוכרוז ליותר מ-72 שעות, כאשר הנקבות מסיימות את הפרשת הביצים.
הערה: אם הנקבות מסופקות עם ריכוז נמוך יותר של מים סוכרוז, להסיר את מי סוכרוז וכל משטחים רטובים לאחר 48 שעות כדי למנוע את הנקבות ovipositing.
3. אוביופוזיציה
- כשעה לפני העברת יתושים ללוחות, מוסיפים 2-3 טיפות (~ 80-120 μL) של מים לתוך כל צלחת גם באמצעות פיפטה העברה.
- לפחות 72 שעות לאחר האכלת דם, נפילת יתושים עם CO2 או על קרח, מעבירים אותם לצלחת זכוכית על קרח, ומניחים בנפרד כל יתוש על מכסה הפוך של 24 צלחת הבאר על הקרח(איור 6A).
הערה: הליך זה הוחל מ Ioshino ואח'9. - לאחר שכל 24 היתושים הונחו, כסו את המכסה בתחתית צלחת הפוכה(איור 6B),אבטחו את המכסה והצלחת עם גומייה חדשה ורעננה והניחו אותה בתא סביבתי (או בחדר גידול)(איור 6C)עד שהיתושים יתאוששו (כ-10-15 דקות) וסובבו את הצלחת ימינה למעלה(איור 6D).
- אפשרו לנקבות היתושים להיכנס ל-24-48 שעות ולהסיר נקבות על ידי שחרורן מהצלחות לכלוב גדול.
הערה: אם חשוב לעקוב אחר נקבות בודדות, המרדים אותן על ידי צינון הצלחות והסרתן בנפרד על קרח. התעכבות והפרשות כהות המפריעות לספירת הביציות נצפו כאשר הנקבות הועברו ללוחות לפני 72 שעות לאחר ארוחת הדם (PBM)(איור 7D).
4. ספירת ביצים
- בדוק כל באר של צלחת 24 היטב, כמו לפעמים יתושים להטיל ביצים על הקיר של בארות בשולי משטח agarose / פלסטיק, שם הם קשים לפתור בתצלומים. באמצעות מברשת צבע רטוב, להזיז את הביצים שהוטלו על הקיר ואת קצה agarose על פני השטח השטוחים של agarose כך שכל הביצים נמצאים במישור אחיד ולא חופפים אחד עם השני.
הערה: קצה ההתעוררות נמצא בדרך כלל מחוץ למישור המוקד של המצלמה בשל מתח פני השטח של פתרון agarose. - בעזרת מלקחיים, יש להסיר את כל הרגליים, הכנפיים וחלקיקים אחרים בבארות שעלולים להפריע לביצי ההדמיה (איור 7C).
- הכנס נייר לבן מתחת לצלחת כדי להגביר את הניגודיות עם ביצי יתושים כהות לפני ההדמיה באמצעות תאורת סטריאומיקרוסקופ(איור 7A).
- צלם תמונה של כל באר באמצעות מצלמה דיגיטלית קומפקטית במצב מיקרוסקופ, המאפשרת למשתמש להתמקד באובייקטים עד 1 ס"מ. יכולת זו מאפשרת למקם את המצלמה ישירות על הצלחת כדי לדמות ביצים ללא חצובה או מעמד(איור 7A). כדי להבחין בין ביצים בודדות שהוטלו בגושים, השתמש במצב עדין או עדין במיוחד כדי ללכוד תמונות ברזולוציה גבוהה כך שניתן יהיה לראות פרטי תקריב.
הערה: נקה את כרטיס הזיכרון של המצלמה לפני השימוש כדי למנוע בלבול בין תמונות חדשות לתמונות ישנות. - לאחר צילום כל באר של צלחת, צלם תמונה של הצלחת כולה עם תווית סדר הדמיה כדי להבחין בין כל לוח מאוחר יותר(איור 7E).
- הוסף שכבה דקה ~ 5 טיפות מים (~ 200 μL) עם פיפטה העברה לכל באר כדי למנוע תקע agarose שלה ואת הביצים ייבוש כדי לגרום להתפתחות העובר ובקעה. שים לב למפלס המים בשעות הראשונות ולבדוק כל יום, כי ייתכנו אובדן מים עקב ספיגה על ידי agarose או אידוי. מוסיפים מים כאשר המפלס שלהם נמוך מדי עבור זחלים לבקוע.
הערה: אידוי מים מתרחש באופן לא אחיד הן בתוך צלחת והן בתוך ערימה של צלחות. זה נצפתה כי ייבוש מתרחשת בסדר הבא: 1) בארות פינה (A1, A6, D1, D6) לייבש את המהיר ביותר; ואחריו 2) בארות בקצה החיצוני של הצלחת (A2-A5, B1, B6, C1, C6, D2-D5); ואחרון 3) בארות בפנים. כאשר צלחות מוערמות, הלוח העליון מתייבש המהיר ביותר. - העבר את התמונות למחשב עם ImageJ (פיג'י) ושנה את שמות הקבצים עבור ארגון קל יותר כגון "[מזהה לוח]_[מזהה טוב].jpg" (איור 8A,B).
- צור קובץ גיליון אלקטרוני כדי לתעד מספרי ביציות (כלומר, פוריות) ומספרי זחלים ולחשב את קצב הפתח (כלומר, פוריות) (איור 9E).
- פתחו את התמונות בעזרת ImageJ (פיג'י)12 והשתמשו בכלי "multi-point" כדי לסמן כל ביצה(איור 9A-C); הגדלה או הגדלה באמצעות מקש "+" או "-" כדי לספור את הביצים בגושים. לאחר סימון כל הביצים, לחצו פעמיים על הסמל מרובה הנקודות כדי להעלות את מספר הסימנים (איור 9D). רשום את התוצאות בגיליון אלקטרוני.
5. הערכת פוריות
הערה: בעוד יומיים, זחלי instar הראשון עשוי להתחיל eclose בבארות. המתן 3-5 ימים נוספים לפני הדמיה/ספירה כדי להבטיח שכל הביצים הקיימות יבקעו.
- הכינו מזון זחלים על ידי ערבוב 1/16 כף (~ 168 מ"ג) של מזון דגים טחון (כלומר, דיאטת זחל יתושים רגילה) ב 20 מ"ל של מים ומחכה חלקיקים מוצקים גדולים להתיישב (איור 10A-D). התחל להוסיף מזון (supernatant) לבארות המכילות זחלים בקעו ברגע שהם מופיעים, כי הם לא שורדים זמן רב ללא מזון.
הערה: תוספת עודפת של חלקיקי מזון עלולה להפריע להדמיה ולספירה של זחלים שבקעו. - כ 5-8 ימים לאחר הוספת מים לבארות, לקרר את הצלחת על ידי כיסוי עם קרח כתוש במשך 15-20 דקות כדי להרדים זחלים.
- צלם כל באר תוך שמירה על הצלחות על הקרח כפי שנעשה עם הביצים. לתמונות זחל, ספקו רקע כהה על-ידי הוספת חומר שחור מתחת ללוח כדי לסייע בשיפור הניגודיות. לאחר צילום כל באר של צלחת, לצלם תמונה של הצלחת כולה עם תווית סדר הדמיה להבחין כל צלחת מאוחר יותר.
הערה: תמונות נלקחות בזמן שהצלחות על הקרח מכיוון שתנועת הזחל עלולה לסכן את הספירה. הצלחות ניתנות לשימוש חוזר; להקפיא ולהסיר את היתושים ו agarose לנקות לשימוש הבא. צלחת EAgaL אינה מתאימה לגידול זחלים לשלבים מתקדמים. - פתח תמונות עם ImageJ (פיג'י) והשתמש בכלי " multi-point " כדי לספורעל-ידילחיצה על כל זחל. במהלך 3-5 ימים תקופה כמה זחלים אולי התכווצו, במיוחד בארות עם מספרים נמוכים של זחלים. לכן, בעת הספירה, אל תכלול את הקציצים (כלומר, exuviae), שנראים כמו זחלים ראש בלבד עם קצת גוף, או זחלים מכווצים (איור 10E). רשום את התוצאות בגיליון האלקטרוני.
6. בצע ניתוח
- לאחר שאספתי את כל הנתונים הדרושים לניתוח פוריות ופוריות, בצע ניתוח סטטיסטי מתאים וצור גרפים באמצעות תוכנה מועדפת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
יתושים הוזרקו עם dsRNA מיקוד טרנספורטר ברזל מועמד (FeT) או גן בקרה (EGFP), דם מוזן, ונמדד עבור פוריות ותפוקת פוריות באמצעות שיטת צלחת EAgaL, בעקבות ההליך המתואר לעיל.
יתושים שבהם הושתק ביטוי FeT בעקבות הזרקת dsRNA הראו ירידה משמעותית הן במספר הביצים והן בקצב הפתחים (איור 11A-C). כל יתושים שליטה וטיפול הונחו בצלחות EAgaL לאחר 72 h PBM. יתושים המושתקים על ידי FeT הציגו גם הפרשה מאוחרת וביצים קטנות וקלות אור(איור 12א,B). תוצאות לדוגמה ניתן למצוא גם ב Tsujimoto ואח'8.
איור 1: צינורות זבובים המשמשים בדרך כלל לפוריות יתושים/מבחני פוריות. (A)צינור יחיד עם כותנה לחה ונייר סינון עגול עם כובע ספוג. (B)100 צינורות בארון תקשורת (~ 30 ס"מ x 30 ס"מ). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: קידוח חורים במכסה של 24 צלחת תרבית רקמות באר. (A)קידוח בתהליך. (B)מכסה עם חורים המונעים עיבוי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: החלת אגרוז (2% במים) על הבארות. (A) החלת agarose באמצעות פיפטה μL 1,000. שים לב כי הקצה אינו נוגע בקיר של הבאר. (B)צלחת המכילה agarose בתחתית. (ג)קיר של באר מיד לאחר שהתגבש. שים לב לתמצית על הקיר. (ד)קיר של באר כאשר עיבוי התאדה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ציר זמן מהזנת דם (יום 0) להדמיית זחל (יום 10-13). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: הזנת דם מלאכותית ובחירת נקבות שקועות. (A)האכלת דם באמצעות מאכיל מלאכותי. (B)מבחר נקבות שקועות בקרח. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: העברת נקבות לצלחת EAgaL. (A)להעביר נקבות מורדמות למכסה צלחת הפוכה על קרח. (B)לאחר מכן הניחו בזהירות את הצלחת ההפוכה המכילה אגרוז על המכסה ההפוך ו-( C) הסירו צלחת עם מכסה מחובר מהקרח ושמרו אותה במצב הפוך עד שהנקבות יתאוששו מהרדמה. (D,E) סובבו את הצלחת המכילה את הנקבה לתנוחה כלפי מעלה. שים לב כי המכסה ואת החלק התחתון של הצלחת מוחזקים על ידי גומייה וכי החלק התחתון מסומן. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: הדמיה של כל אחת מהן לאחר הסרת הנקבות. (A)מצלמה דיגיטלית על גבי ביצה המכילה 24 צלחת היטב להדמיה. (B)תמונה אופיינית של באר. (ג)באר המכילה רגל, שיש להסירה. (D) תמונה לדוגמה של באר שבה נקבה הוצבה ב 48 h PBM. שים לב לסימני הפרשה כהים, אשר יכול לסבך ספירת ביצים (חצים). (ה)צלחת שלמה המציגה תווית סדר הדמיה שהוכנה בעקבות ההדמיה של כל הבארות של הצלחת. זה עוזר לזהות בארות במהלך הניתוח. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: שינוי שם התמונות לארגון טוב יותר. (A)תמונות של בארות בודדות המכילות ביצים כולל תווית סדר תמונה עם השמות המוקצים באופן אוטומטי על ידי המצלמה. (B) אותן תמונות ששמן שונה לתבנית plateID_wellID.jpg. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 9: ספירת ביצים באמצעות תוכנת "פיג'י" (ImageJ2). (A) צילום מסך של תוכנת פיג'י המציגה את הכלי "multi-point" מסומן (ריבוע טורקיז). (B)תמונה טובה עם סימני ספירה פיג'י על הביצים. (C) הגדלת התצוגה מסייעת בעת ספירת קבוצות ביצים גדולות יותר. (D) לחיצה כפולה על סמל הכלי "multi-point" בחלון הראשי מציגה ספירה (עיגול אדום). (E) דוגמה לגיליון אלקטרוני עם נוסחת חישוב קצב קווקוו. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 10: הכנת דיאטת הזחלים ובאר המכילה זחלים ואקזוות. (א)מזון דגים טחון. (B)20 מ"ל של מים בספל. (ג)תערובת של מזון דגים טחונים ומים. (ד)אוכל / מים התיישבו במשך 15 דקות. קח supernatant של תערובת זו כמו מזון זחל. (E)ובכן עם זחלים מותכים; exuviae מייצג מסומנים על ידי חצים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 11: ספירת נתונים מניסוי להשתקת גנים. יתושים מוזרקים עם dsRNA נגד טרנספורטר ברזל putative (FeT) הציג הפחתה משמעותית של (A) מספר הביצה, (B) מספר זחל, ו - (C) קצב הצוהר בהשוואה לשליטה (EGFP). ברים מראים ממוצע ± SD. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 12: תמונות מייצגות של הבארות המציגות פנוטיפים נוספים אצל יתושים מושתקים בגנים. dsFeT הראה הפרשה מאוחרת (סימנים חומים כהים) וביצים קטנות וצבעוניות קלות. מוצגות שתי בארות מייצגות לכל טיפול. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| רגל | אג"ל (1999) | |
| (1) הכנה | 20 דק' 29.0 שניות | 3 דקות 49.3 שניות |
| (2) F_in | 3 דקות 55.0 שניות | דקה אחת 56.0 שניות |
| (3) F_out/E_img | 43 דק' 44.3 שניות | 15 דק' 28.3 שניות |
| (4) L_img | 38 דק' 03.5 שניות | 9 דקות 30.5 שניות |
טבלה 1: דרישות זמן להשלמת שיטת צינור הזבוב (FT) בהשוואה לשיטת הצלחת EAgaL. (1) הכנה: הזמן הנדרש כדי למקם כותנה, לשפוך מים פנימה, ולהכניס דיסק נייר מסנן לתוך צינורות גידול Drosophila (FT) לעומת שפיכת agarose לתוך בארות של 24 צלחת היטב (EAgaL). (2)F_in: הזמן הנדרש כדי למקם יתושים בודדים לתוך צינורות גידול (FT) או בארות של צלחת 24 היטב (EAgaL). (3)F_out/E_img: הזמן הנדרש לשחרור יתוש לכלוב גדול יותר, להסיר, לפרוש נייר ביצה, ולצלם את הביצים על הנייר (FT) או לשחרר יתושים בכלוב גדול יותר ולצלם כל באר של 24 צלחת הבאר (EAgaL). (4)L_img: הזמן הנדרש כדי לדמיין זחלים בקעו במיכל קטן (FT) או כל באר של צלחת 24 היטב (EAgaL) לאחר הרדמה קרה. בסך הכל 24 צינורות שימשו עבור FT.
| עלויות בצובר | |||||
| צלחת EAgaL | צינורות זבובים | ||||
| פריט | מחיר | כמות | פריט | מחיר | כמות |
| צלחות 24 באר | $45.61 | מקרה של 50 | גיליונות נייר כרומטוגרפיים | $103.63 | 46 × 57 ס"מ 100 גיליונות / PK |
| אגרוז (סרט) | $250.97 | 500 גרם | מתלי צינור זבוב + צינורות | $68.45 | 5 מגשים של 100 |
| אולימפוס TG-6 | $375.00 | תקעים של צינור זבוב | $66.10 | מקרה של 200 | |
| כדורי כותנה | $104.27 | תיק 2000 | |||
| סכום אתחול כולל | $671.58 | סכום אתחול כולל | $342.45 | ||
| עלות יחידה (צלחת 24 באר או 24 צינורות) | |||||
| צלחת EAgaL | צינורות זבובים | ||||
| פריט | מחיר | הערה | פריט | מחיר | הערה |
| צלחת של 24 באר | $0.91 | מחיר בצובר/50 | גיליונות נייר כרומטוגרפיים | $0.16 | 641.7 סטים של 24 צינורות בשווי(2) |
| אגרוז לכל צלחת | $0.15 | 500 גרם = 1667 צלחות(1) | מתלי צינור זבוב + צינורות | $3.29 | (מחיר בצובר/500) × 24 |
| תקעים של צינור זבוב | $7.93 | (מחיר בצובר/200) × 24 | |||
| כדורי כותנה | $1.25 | (מחיר בצובר/2000) × 24 | |||
| סה"כ יחידה | $1.06 | סה"כ יחידה | $12.63 | ||
טבלה 2: השוואת עלויות בין צלחת EAgaL ו- FT. למעלה: עלויות בצובר עבור הפעלה (בהנחה תרגיל קצת מקדחה יכול להיות מסופק על ידי חוקר). למטה: עלויות משוערות עבור צלחת אחת 24 גם (צלחת EAgaL) ו 24 FT. (1) בהנחה צלחת דורשת קצת יותר מאשר רק מספיק עבור צלחת 24 גם (12mL), 15 מ"ל של 2% = 0.3 גרם של agarose לכל צלחת, סך של 500 גרם של agarose יכול לעשות 1,667 צלחות. (2) גיליון נייר אחד יכול לעשות 154 של ~ 38 מ"מ קוטר דיסקים. עם 100 גיליונות, 641.7 (15,400/24) סטים של 24 צינורות ניתן לעשות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
צלחת EAgaL מפחיתה באופן דרסטי את העבודה, הזמן והמרחב לביצוע מבחני פוריות ופוריות אישיים ב- Aedes aegypti בהשוואה לשיטת FT. השוואה ראשונית בין שיטת FT ללוח EAgaL הביאה לזמנים קצרים יותר עבור כל השלבים (טכניקת ההדמיה הוחלה על שיטת FT) (טבלה 1). כנקודת התייחסות, הערכה של עלויות ההפעלה וההפעלה (צלחת EAgaL אחת 24 גם לעומת 24 FTs) מסופקים בטבלה 2.
יש כמה נקודות שיש לקחת בחשבון בעת שימוש בלוחות EAgaL. החשש הראשוני היה כי יתושים להציב בחלל כה קטן לא יכול להטיל את כל הביצים בשל תנועה מוגבלת. כדי לקבוע אם זה היה המקרה, היתושים הועברו באופן קולקטיבי לכלוב גדול יותר עם oviposition מרופד במגבת נייר עם מים במשך 48 שעות נוספות לאחר שבילו 48 שעות בצלחות EAgaL. היתושים אכן מטילים ביצים נוספות, אך מספר הביצים הממוצע לנקבה היה 2.1 בלבד, מה שאינו מביא להבדל כלשהו בתוצאות של כל ניתוח סטטיסטי ברוב המקרים, אם לא כולם. מספרים אלה הם מיותר מ -500 יתושים שנבדקו (נתונים לא מוצגים). עם זאת, זה עשוי להיות אך ורק עבור Ae. aegypti "ליברפול" זן יתוש עם התנאים המתוארים. ייתכן שכל מעבדה תצטרך לבדוק אם זה המקרה עבור היתושים והתנאים שלה.
להדמיה, התמונה היחידה של מצלמה המחוברת לסטריאומיקרוסקופ לא כיסתה באר שלמה אפילו בהגדלה הנמוכה ביותר. זה נדרש קבלת תמונות מרובות לכל טוב בתורו תיקון התמונות, או מעקב אחר ביצים חופפות בתמונות מרובות של אותה באר. שתי הגישות סיבכו מאוד את הניתוח והגדילו משמעותית את מספר העובדים המעורבים. יתר על כן, בשל אופיו של סטריאומיקרוסקופ, זווית המצלמה היא תמיד מעט שמאלה או ימינה מהזווית הניצבת, מה שהופך את הקיר בצד שמאל או ימין לחסום חלק משטח agarose.
זיהום על ידי מיקרואורגניזמים, במיוחד פטריות, יכול להיות בעיה במהלך ההסתערות. למרות הלבנה יכול למזער את הזיהום לפני oviposition, פטריות עשוי להיות נוכח בסביבה חרקים נישא על ידי היתושים עצמם. במקרים כאלה, שמירה על מרחבים חרקיים נקיים עשויה להפחית את השכיחות. עדיף עבור כל מעבדה כדי לבדוק צלחת EAgaL כדי לזהות בעיות פוטנציאליות.
שים לב כי שיטת צלחת EAgaL לא נועדה לשמור על תרבויות יתושים מעבר לשלבי הזחל המוקדמים. המספר הממוצע של זחלים לבאר היה בדרך כלל מעל 60, וזה לא יוצא דופן יש יותר מ 100 זחלים לכל באר. זה יוצר תנאים צפופים, אשר לגרום לעיכוב בפיתוח, שיעור גורים נמוך יותר, ומבוגרים קטנים מאוד, אשר עלול לסכן מחקרים במורד הזרם.
נכון לעכשיו שיטה זו נבדקה רק עם Ae. aegypti. עם זאת, הוא נבדק כעת כדי להרחיב את היישום שלה למינים אחרים של Aedes ואפילו סוגים אחרים של יתושים כגון אנופלס ו Culex.
בשל דרישות הזמן והמרחב המופחתות עבור שיטת הצלחת EAgaL, ניתן לשנות את מבחני הפוריות והפוריות עד לתפוקה גבוהה למחצה (כלומר, 5-10 צלחות או יותר לכל ניסוי). תכונה זו של שיטת צלחת EAgaL עשויה להיות שימושית מאוד כדי להעריך את פרמטרי הכושר החשובים של יתושים לבדיקת קוטלי חרקים, הערכת עקרות, transgenesis, ומחקרי עריכת גנים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין ניגודי אינטרסים למחקר זה.
Acknowledgments
אנו מודים טקסס A&M Agrilife מחקר חרקים וקטור מחלות גרנט תוכנית למימון. אנו מודים גם לחברי המעבדה של אדלמן על העזרה בפיתוח שיטה זו והצעות בעת ניסוח כתב היד, כמו גם לחברי המעבדה של קווין מיילס. אנו מודים גם לסוקרים ולעורכים על עזרתם לשפר את כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.6 mm Φ drill bit | alternatively heated nails can be used | ||
| 1000 μL pipette tips (long) | Olympus plastics | 24-165RL | |
| 24-well tissue culture plate | Thermo Scientific | 930186 | clear, flat-bottom with ringed lid plates |
| Agarose | VWR | 0710-500G | |
| Compact digital camera | Olympus | TG-5/TG-6 | |
| Computer (Windows, Mac or Linux) | |||
| Deionized water | |||
| Fiji (imageJ) software | download from: https://fiji.sc/ | ||
| Forceps | Dumont | sharp forceps may break mosquito's body | |
| Glass Petri dishes | VWR | ||
| Household bleach | |||
| Household electric drill | |||
| illuminator for stereomicroscope (gooseneck) | |||
| P-1000 pipette | Gilson | ||
| paint brushes | |||
| Rubber bands | |||
| SD card | to record digital camera images (DSHC, SDXC should be better) | ||
| Spreadsheet software (Microsoft Excel) | Microsoft | Any spreadsheet software works | |
| TetraMin fish food | Tetra | ground with coffee grinder, blender or morter & pestle | |
| Transfer pipetts | VWR | 16011-188 |
References
- Bond, J. G., et al. Optimization of irradiation dose to Aedes aegypti and Ae. albopictus in a sterile insect technique program. PLoS One. 14 (2), 0212520 (2019).
- Fernandes, K. M., et al. Aedes aegypti larvae treated with spinosad produce adults with damaged midgut and reduced fecundity. Chemosphere. 221, 464-470 (2019).
- Inocente, E. A., et al. Insecticidal and Antifeedant Activities of Malagasy Medicinal Plant (Cinnamosma sp.) Extracts and Drimane-Type Sesquiterpenes against Aedes aegypti Mosquitoes. Insects. 10 (11), 373 (2019).
- Marrelli, M. T., Moreira, C. K., Kelly, D., Alphey, L., Jacobs-Lorena, M. Mosquito transgenesis: what is the fitness cost. Trends in Parasitology. 22 (5), 197-202 (2006).
- da Silva Costa, G., Rodrigues, M. M. S., Silva, A. A. E. Toward a blood-free diet for Anopheles darlingi (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. , 217 (2019).
- Gonzales, K. K., Tsujimoto, H., Hansen, I. A. Blood serum and BSA, but neither red blood cells nor hemoglobin can support vitellogenesis and egg production in the dengue vector Aedes aegypti. PeerJ. 3, 938 (2015).
- Gonzales, K. K., et al. The Effect of SkitoSnack, an Artificial Blood Meal Replacement, on Aedes aegypti Life History Traits and Gut Microbiota. Scientific Reports. 8 (1), 11023 (2018).
- Tsujimoto, H., Anderson, M. A. E., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Identification of Candidate Iron Transporters From the ZIP/ZnT Gene Families in the Mosquito Aedes aegypti. Frontiers in Physiology. 9, 380 (2018).
- Ioshino, R. S., et al. Oviplate: A Convenient and Space-Saving Method to Perform Individual Oviposition Assays in Aedes aegypti. Insects. 9 (3), 103 (2018).
- Price, D. P., Schilkey, F. D., Ulanov, A., Hansen, I. A. Small mosquitoes, large implications: crowding and starvation affects gene expression and nutrient accumulation in Aedes aegypti. Parasites & Vectors. 8, 252 (2015).
- Valerio, L., Matilda Collins, C., Lees, R. S., Benedict, M. Q. Benchmarking vector arthropod culture: an example using the African malaria mosquito, Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae). Malaria Journal. 15 (1), 262 (2016).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
