Summary
Beskrevet er en tids- og plassbesparende metode for å telle egg og bestemme lukehastigheten til individuelle mygg ved hjelp av 24 brønnvevskulturplater, noe som kan øke omfanget og hastigheten på fecundity og fruktbarhetsanalyser betydelig.
Abstract
Mygg representerer et betydelig folkehelseproblem som vektorer av ulike patogener. For de studiene som krever en vurdering av mygg fitness parametere, spesielt egg produksjon og luke priser på individnivå, konvensjonelle metoder har lagt en betydelig byrde på etterforskere på grunn av høy arbeidsintensitet og laboratorieplass krav. Beskrevet er en enkel metode ved hjelp av 24 brønnvevskulturplate med agarose i hver brønn og digital avbildning av hver brønn for å bestemme eggtall og lukehastigheter på individnivå med betydelig reduserte tids- og plassbehov.
Introduction
Kontrollen av mygg for å beskytte mennesker mot vektorbårne patogener er et viktig folkehelsemål, hovedsakelig på grunn av mangel på effektive vaksiner for de fleste patogener som bæres av mygg. Mange studier tar sikte på å redusere mygg fitness i forbindelse med en felt-gjeldende befolkningsreduksjon strategi1,2,3. Dette inkluderer omfattende studier for å lage transgene mygg og / eller CRISPR / Cas9 knockout linjer. Slike befolkningsmodifikasjonsmetoder krever en detaljert vurdering av individuelle treningsparametere4. Konvensjonelle laboratorieteknikker for å vurdere kondisjon av kvinnelige mygg inkluderer den individuelle inneslutningen av parret, blodmatet kvinnelige mygg i 100 ml beholdere5,modifiserte 50 ml koniske rør eller rør for Drosophila oppdrett modifisert ved å gi fuktige overflater ved hjelp av fuktig bomull og filterpapirplater for oviposisjon (dvs. eggpapir)1,2,6,7. Slike metoder krever en relativt stor plass (f.eks. 30 cm x 30 cm x 10 cm: B x L x H i opptil 100 Drosophila-rør) (Figur 1), og manipulering av individuelle eggpapir for å telle egg og klekkelarver, noe som kan være arbeidskrevende. Dette manuskriptet presenterer en metode for å telle myggegg og bestemme lukehastigheter ved hjelp av 24 brønnplater og agarose som en oviposisjonsoverflate for å omgå disse problemene8.
Samtidig beskrev Ioshino et al.9 en detaljert metode ved hjelp av 12 og 24 brønnplater for å utføre eggtelling oppnådd fra individuelle kvinner. Deres protokoll representerte en betydelig forbedring fra konvensjonelle metoder for å spare tid og plass9. Protokollen de beskrev fortsetter imidlertid å bruke vått filterpapir som en overflate for oviposisjon, noe som krever utfoldelse av hvert enkelt papir for å få tellinger, da egg ofte finnes under eller i bretter. Deres protokoll omfattet heller ikke bruk av bildeteknologier eller en metode for larvaltelling.
Presentert er en forbedret metode for å utføre treningsanalyser for eggnummer (dvs. fecundity) og lukehastighet (dvs. fruktbarhet) ved hjelp av agarose som en oviposisjonsoverflate i et 24 brønnvevskulturplateformat for Ae. aegypti som oviposit på fuktige overflater. Disse platene fikk navnet "EAgaL" plater, fra Egg, Agarose og Larva. Disse 24 brønnplatene gir individuelle mygg en minimal overflate for å legge egg, og dermed forenkle og drastisk redusere tiden og innsatsen som trengs for å telle og vedlikeholde egg og klekkede larver i noen dager. EAgaL-platen bruker gjennomskinnelig agarose for oviposisjonsoverflaten, noe som eliminerer behovet for å håndtere eggpapir og finne egg og larver når de klekkes; fotografering av hver brønn etablerer en langsiktig arkivert oversikt over resultatene og skiller telleprosessen i både tid og rom fra oppdretts-/håndteringsprosessen, der tiden ofte er begrenset.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plateforberedelse
- Bor hull i 24 vevskulturplatelokk (4−6 hull per brønn) ved hjelp av en husholdningsbor med en bit på ~ 1,6 mm(figur 2).
MERK: Disse hullene forhindrer vannkondensasjon fra agarose å samle seg på lokket, hvor mygg kan legge egg. Standardstørrelsen på kvinnelige Ae. aegypti ("Liverpool" stamme) er ~ 3,11 mm vingespenn. Redusere størrelsen på hullene anbefales ved bruk av mindre mygg for å unngå å unnslippe fra platen. - På dagen før oviposisjonseksperimentet, vask og skyll platene grundig og suge dem i 1-5% blekemiddel i 30-60 min ved romtemperatur. Skyll grundig under rennende deionisert vann og tørk dem.
MERK: Denne prosessen reduserer sjansen for at sopp og bakterier vokser på agarose. - Smelte agarose ved 2% i deionisert vann og tilsett umiddelbart 500 μL av smeltet agarose til hver brønn av de 24 brønnplatene ved hjelp av en 1000 μL pipette (Figur 3A,B). Når agarose begynner å avkjøle og tette pipettespissen, oppvarmer du agarose og bruker en ny pipettespiss.
MERK: Unngå å berøre veggene i brønnen med pipettespissen fordi den kan etterlate et stykke agarose på veggen der en kvinne kan legge egg, noe som kompliserer bilde- og telleprosessen. - Før bruk tørker du ut eventuell kondens på brønnveggene over natten på en labbenk (Figur 3C,D).
MERK: Tidslinjen til EAgaL-plateanalysen fra blodfôring til larvalavbildning er avbildet i figur 4, som er for koloni mygg (Ae. aegypti "Liverpool" oppdrettet under 14 h lys: 10 h mørkt lys syklus, 27 °C, 80% relativ fuktighet, 500 larver i en 49,5 cm x 29,2 cm x 9,5 cm skuff med 2 L vann), under insektforhold. Det anbefales at hvert laboratorium tester EAgaL-platen med myggene som brukes, spesielt når du bruker forskjellige stammer, forskjellige myggarter, samt forskjellige oppdrettsprotokoller.
2. Myggfôring
MERK: Det er viktig å bruke mygg oppdrettet under ensartede forhold for alle behandlingsgrupper og kontrollgrupper, fordi larval ernæring har innvirkning på mygg fitness parametere10,11. Bakre larver under urørte forhold med tilstrekkelig mat. La kvinnelige mygg eclose i nærvær av menn slik at parring sikres og modnes i minst 3 dager.
- Fjern enhver kilde til vann og / eller sukker fra de kvinnelige myggene minst 16 timer før blodfôring for å forbedre blodfôringen.
- Varm opp en vannsirkulasjon for kunstig fôring ved 37 °C og fôr kvinnelige mygg med virveldyrblod plassert i kunstige matere i 15-30 min (Figur 5A).
- Bedøv mygg med CO2 eller på is, overfør dem til en glassfat på is, og velg de som er innhyllet med blod (Figur 5B) i en beholder utstyrt med 30% sukrose vann i mer enn 72 timer, når kvinner fullfører utskillelse og eggutvikling.
MERK: Hvis hunnene er utstyrt med en lavere konsentrasjon av sukrosevann, fjern sukrosevannet og eventuelle våte overflater etter 48 timer for å forhindre at hunnene ovipositerer.
3. Oviposisjon
- Ca 1 time før du overfører mygg til platene, tilsett 2-3 dråper (~ 80-120 μL) vann i hver plate godt ved hjelp av en overføringspipette.
- Minst 72 timer etter blodfôring, nedslagsmygg med CO2 eller på is, overfør dem til en glassfat på is, og plasser hver mygg individuelt på et invertert lokk på 24 brønnplaten på is (Figur 6A).
MERK: Denne prosedyren er brukt fra Ioshino et al.9. - Når alle de 24 myggene er plassert, dekk lokket med en invertert platebunn (Figur 6B), fest lokket og platen med et friskt, nytt gummibånd og plasser det i et miljøkammer (eller bakerom) (Figur 6C) til myggene kommer seg (~10−15 min) og vri platen til høyre side opp (Figur 6D).
- La de kvinnelige myggene oviposit i 24-48 timer og fjern kvinner ved å slippe dem fra platene i et stort bur.
MERK: Hvis det er viktig å holde styr på individuelle kvinner, bedøv dem ved å kjøle ned platene og fjerne dem individuelt på is. Forsinket oviposisjon og mørke utskillelser som forstyrrer eggtelling ble observert da kvinner ble overført til platene tidligere enn 72 timer etter blodmel (PBM) (Figur 7D).
4. Eggtelling
- Kontroller hver brønn på 24 brønnplaten, da mygg noen ganger legger egg på veggen av brønner og på kanten av agarose / plastoverflaten, hvor de er vanskelige å løse på fotografier. Bruk en våt pensel, flytt eggene som legges på veggen og kanten av agarose til den flate overflaten av agarose slik at alle eggene er i et jevnt plan og ikke overlapper med hverandre.
MERK: Kanten på agarose er vanligvis ute av kameraets fokusplan på grunn av overflatespenningen til agaroseløsningen. - Bruk tang til å fjerne eventuelle brukne ben, vinger og andre partikler i brønnene som kan forstyrre bildeleggingen (Figur 7C).
- Sett inn hvitt papir under platen for å øke kontrasten med mørke myggegg før avbildning ved hjelp av en stereomikroskopbelysning (figur 7A).
- Ta et bilde av hver brønn ved hjelp av et kompakt digitalt kamera i mikroskopmodus, som lar brukeren fokusere på objekter så nært som 1 cm. Denne funksjonen gjør at kameraet kan plasseres direkte på platen for å avbilde egg uten stativ eller stativ (figur 7A). For å skille individuelle egg lagt i klumper, bruk den fine eller superfine modusen for å fange bilder med høy oppløsning slik at nærbilder kan ses.
MERK: Tøm minnekortet til kameraet før bruk for å forhindre forvirring mellom nye og gamle bilder. - Når du har fotografert hver brønn på en plate, tar du et bilde av hele platen med en etikett for bilderekkefølge for å skille hver plate senere (Figur 7E).
- Tilsett et tynt lag ~ 5 dråper vann (~ 200 μL) med en overføringspipette til hver brønn for å forhindre at agarosepluggen og eggene tørker og for å indusere embryoutvikling og klekking. Vær oppmerksom på vannstanden de første timene og sjekk hver dag, fordi det kan være vanntap på grunn av absorpsjon av agarose eller fordampning. Tilsett vann når nivået er for lavt for larver å klekke.
MERK: Fordampning av vann skjer ikke-ensartet både i en plate og i en stabel med plater. Det er observert at tørking skjer i følgende rekkefølge: 1) hjørnebrønner (A1, A6, D1, D6) tørker raskest; etterfulgt av 2) brønner i ytterkanten av platen (A2-A5, B1, B6, C1, C6, D2-D5); og siste 3) brønner inni. Når platene er stablet, tørker toppplaten raskest. - Overfør bildene til en datamaskin med ImageJ (Fiji) og gi nytt navn til filene for enklere organisering, for eksempel "[plate-ID]_[brønn-ID].jpg" (Figur 8A,B).
- Opprett en regnearkfil for å registrere eggnumre (dvs. fecundity) og larvetall og beregne skraveringshastighet (dvs. fruktbarhet) (Figur 9E).
- Åpne bildene med ImageJ (Fiji)12, og bruk verktøyet" multi-point" til å markere hvert egg (Figur 9A-C); zoome inn eller ut ved hjelp av tasten "+" eller "–" for å telle eggene i klumper. Når du har merket alle eggene, dobbeltklikker du flerpunktsikonet for å vise antall merker (Figur 9D). Registrer resultatene i et regneark.
5. Fertilitet vurdering
MERK: Om 2 dager kan de første instar larver begynne å eclose i brønnene. Vent i 3-5 dager til før avbildning/telling for å sikre at alle levedyktige egg klekkes.
- Forbered larvmat ved å blande 1/16 spiseskje (~168 mg) malt fiskemat (dvs. vanlig mygg larval diett) i 20 ml vann og vent på at store faste partikler skal bosette seg (Figur 10A-D). Begynn å legge til mat (supernatanten) til brønnene som inneholder klekkede larver så snart de vises, fordi de ikke overlever lenge uten mat.
MERK: Overflødig tilsetning av matpartikler kan forstyrre avbildning og telling av klekkede larver. - Omtrent 5-8 dager etter tilsetning av vann til brønnene, avkjøl platen ved å dekke med knust is i 15-20 min for å bedøve larver.
- Ta bilder av hver brønn mens du holder platene på is som det ble gjort med eggene. For larvbilder, gi en mørk bakgrunn ved å sette inn et svart materiale under platen for å forbedre kontrasten. Etter å ha fotografert hver brønn av en plate, ta et bilde av hele platen med en bilderekkefølgeetikett for å skille hver plate senere.
MERK: Bilder tas mens platene er på is fordi larvebevegelse kan kompromittere tellingen. Platene er gjenbrukbare; fryse og fjerne mygg og agarose å rengjøre for neste bruk. EAgaL-platen er ikke egnet for oppdrett av larver til avanserte stadier. - Åpne bilder med ImageJ (Fiji) og bruk"multi-point"-verktøyet til å telle ved å klikke på hver larve. I løpet av 3-5 dager kan noen larver ha smeltet, spesielt i brønner med lavt antall larver. Derfor, når du teller, utelukke skuret kutikkler (dvs. exuviae), som ser ut som hode-bare larver med litt kropp, eller krympede larver (Figur 10E). Registrer resultatene i regnearket.
6. Utfør analyse
- Etter å ha samlet alle nødvendige data for fecundity og fruktbarhet analyse, utføre passende statistisk analyse og lage grafer ved hjelp av foretrukket programvare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mygg ble injisert med dsRNA rettet mot en kandidat jerntransportør (FeT) eller kontrollgen (EGFP), blodmatet, og målt for fecundity og fruktbarhet utgang ved hjelp av EAgaL plate metode, etter prosedyren beskrevet ovenfor.
Mygg der FeT-uttrykket ble stilnet etter dsRNA-injeksjon viste en betydelig reduksjon i både eggnummer og lukehastighet (Figur 11A−C). Alle kontroll- og behandlingsmygg ble plassert i EAgaL-platene etter 72 h PBM. FeT-stille mygg viste også forsinket utskillelse og små og lyse egg (Figur 12A,B). Eksempelresultater finnes også i Tsujimoto et al.8.
Figur 1: Flyrør som vanligvis brukes til myggavføring/fertilitetsanalyser. (A) Et enkelt rør med fuktig bomull og sirkulært filterpapir med svamphette. (B) 100 rør i et stativ (~30 cm x 30 cm). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Boring av hull i et lokk på 24 brønnvevskulturplate. (A) Boring pågår. (B) Et lokk med hull som forhindrer kondens. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Påføring av agarose (2 % i vann) i brønnene. (A) Påføring av agarose ved hjelp av en 1000 μL pipette. Vær oppmerksom på at spissen ikke berører brønnens vegg. (B) En plate som inneholder agarose på bunnen. (C) Vegg av en brønn rett etter agarose størknet. Legg merke til kondensen på veggen. (D) Vegg av en brønn når kondens fordampet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Tidslinje fra blodfôring (dag 0) til larvavbildning (dag 10−13). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Kunstig blodfôring og utvalg av engorgede kvinner. (A) Blodfôring ved hjelp av kunstig mater. (B) Utvalg av engorgede kvinner på is. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Overføring av kvinner til EAgaL-tallerken. (A) Overfør bedøvede kvinner til et invertert platelokk på is. (B) Plasser deretter den inverterte agaroseholdige platen forsiktig på det inverterte lokket og (C) fjern platen med lokket festet fra isen og hold den i omvendt stilling til kvinner har kommet seg fra anestesi. (D,E) Vri den hunnholdige platen rundt til oppadgående stilling. Vær oppmerksom på at lokket og den nederste delen av platen holdes av et gummibånd og at den nederste delen er merket. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Bildebehandling av hver brønn etter at kvinner ble fjernet. (A) Digitalt kamera oppå en eggholdig 24 brønnplate for avbildning. (B) Typisk bilde av en brønn. (C) En brønn som inneholder et ben, som må fjernes. (D) Prøvebilde av en brønn der en kvinne hadde blitt plassert på 48 h PBM. Legg merke til de mørke utskillelsesmerkene, noe som kan komplisere eggtelling (piler). (E) Hele platen viser en bilderekkefølgeetikett utarbeidet etter avbildning av alle brønnene på platen. Dette bidrar til å gjenkjenne brønner under analyse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Gi nytt navn til bildene for bedre organisering. (A) Bilder av individuelle eggholdige brønner, inkludert en bilderekkefølgeetikett med navnene som automatisk tildeles av kameraet. (B) De samme bildene som har fått nytt navn med plateID_wellID.jpg format. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9: Telle egg ved hjelp av programvaren Fiji (ImageJ2). (A) Skjermbilde avFiji-programvaresom viser " multi-point " -verktøyet uthevet (turkis firkant). (B) Et godt bilde med Fiji teller merker på eggene. (C) Zooming inn hjelper når du teller større egggrupper. (D) Når du dobbeltklikker verktøyikonet "flere punkt"i hovedvinduet, vises antall (rød sirkel). (E) Et eksempel på et regneark med beregningsformel for skraveringshastighet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 10: Larval diettpreparat og en godt inneholdende larver og eksuviae. (A) Malt fiskemat. (B) 20 ml vann i en kopp. (C) Blanding av malt fiskemat og vann. (D) Mat/vann avgjort i 15 min. Ta supernatant av denne blandingen som larvalmat. (E) Vel med smeltede larver; representativ exuviae er indikert med piler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 11: Telle data fra et genaktiveringseksperiment. Mygg injisert med dsRNA mot putativ jerntransportør (FeT) viste betydelig reduksjon av (A) eggnummer, (B) larvalnummer og (C) lukehastighet i forhold til kontroll (EGFP). Barer viser gjennomsnittlig ± SD. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 12: Representative bilder av brønnene som viser flere fenotyper i gentaushet mygg. dsFeT viste forsinket utskillelse (mørkebrune merker) og små, lettfargede egg. Det vises to representative brønner for hver behandling. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Ft | EAgal | |
| (1) Forberedelse | 20 min 29,0 sek | 3 min 49,3 sek |
| (2) F_in | 3 min 55,0 sek | 1 min 56,0 sek |
| (3) F_out/E_img | 43 min 44,3 sek | 15 min 28,3 sek |
| (4) L_img | 38 min 03,5 sek | 9 min 30,5 sek |
Tabell 1: Tidskrav for fullføring av flyrørmetoden (FT) i forhold til EAgaL-platemetoden. (1) Klargjøring: Tiden det tar å plassere bomull, hell vann i og sett filterpapirskiven inn i Drosophila-oppdrettsrør (FT) kontra helling av agarose i brønner på 24 brønnplater (EAgaL). (2) F_in: Tid som kreves for å plassere individuelle mygg i oppdrettsrør (FT) eller brønner på 24 brønnplaten (EAgaL). (3) F_out/E_img: Tid som kreves for å slippe mygg i et større bur, fjerne, brette ut eggpapir og avbilde eggene på papiret (FT) eller slippe mygg i et større bur og bilde hver brønn av 24 brønnplaten (EAgaL). (4) L_img: Tid som kreves for å avbilde larver klekket ut i en liten beholder (FT) eller hver brønn av 24 brønnplaten (EAgaL) etter kaldbedøvelse. Totalt 24 rør ble brukt til FT.
| Bulkkostnader | |||||
| EAgaL-plate | Fluerør | ||||
| vare | pris | kvantitet | vare | pris | kvantitet |
| 24-brønns plater | $ 45.61 | Tilfelle av 50 | Ark med kromatografi | $ 103.63 | 46 × 57 cm 100 Ark/PK |
| Agarose | $ 250.97 | 500 gram | Fly tube stativer + rør | $ 68.45 | 5 skuffer med 100 |
| Olympus TG-6 | $ 375.00 | Fly tube plugger | $ 66.10 | Tilfelle av 200 | |
| Bomull baller | $ 104.27 | Tilfelle av 2000 | |||
| Totalt antall oppstart | $ 671.58 | Totalt antall oppstart | $ 342.45 | ||
| Enhetskostnad (en 24-brønns plate eller 24 rør) | |||||
| EAgaL-plate | Fluerør | ||||
| vare | pris | notat | vare | pris | notat |
| en 24-brønns plate | $ 0.91 | bulk pris / 50 | Ark med kromatografi | $ 0.16 | 641,7 sett med 24 rør verdt(2) |
| Agarose per plate | $0.15 | 500g = 1667 plater(1) | Fly tube stativer + rør | $ 3.29 | (bulkpris/500) × 24 |
| Fly tube plugger | $ 7.93 | (bulkpris/200) × 24 | |||
| Bomull baller | $ 1.25 | (bulkpris/2000) × 24 | |||
| Enhet totalt | $ 1.06 | Enhet totalt | $ 12.63 | ||
Tabell 2: Kostnadssammenligning mellom EAgaL-platen og FT. Topp: Bulkkostnader for oppstart (forutsatt at en drill og en bor kan leveres av en forsker). Bunn: Estimerte kostnader for en 24 brønnplate (EAgaL-plate) og 24 FT. (1) Forutsatt at en plate krever litt mer enn akkurat nok for en 24 brønnplate (12 ml), kan 15 ml av 2% = 0,3 g agarose per plate, totalt 500 g agarose lage 1667 plater. (2) Ett ark kan lage 154 av ~ 38 mm diameter plater. Med 100 ark kan det gjøres 641,7 (15 400/24) sett med 24 rør.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EAgaL-platen reduserer drastisk arbeidskraft, tid og rom for å utføre individuelle fecundity og fruktbarhetsanalyser i Aedes aegypti sammenlignet med FT-metoden. Foreløpig sammenligning mellom FT-metoden og EAgaL-platen resulterte i kortere tider for alle trinn (bildeteknikk ble brukt på FT-metoden) (Tabell 1). Som referanse er det gitt et estimat på oppstart og per analyse (en 24 brønn EAgaL plate versus 24 FTs) kostnader i tabell 2.
Det er noen punkter å vurdere når du bruker EAgaL-platene. En første bekymring var at mygg plassert i et så lite rom kanskje ikke legger alle egg på grunn av begrenset bevegelse. For å avgjøre om dette var tilfelle, ble myggene samlet overført til et større bur med en oviposisjonskopp foret med et papirhåndkle med vann i ytterligere 48 timer etter at de tilbrakte 48 timer i EAgaL-platene. Myggene la faktisk flere egg, men gjennomsnittlig antall egg per kvinne var bare 2,1, noe som ikke resulterer i noen forskjell i utfallet av noen statistisk analyse i de fleste, om ikke alle, tilfeller. Disse tallene er fra mer enn 500 mygg testet (data ikke vist). Dette kan imidlertid være utelukkende for Ae. aegypti "Liverpool" myggstamme med forholdene som er beskrevet. Hvert laboratorium må kanskje teste om dette er tilfelle for mygg og forhold.
For bildebehandling dekket ikke det ene bildet av et kamera som er koblet til et stereomikroskop en hel brønn, selv ved laveste forstørrelse. Dette krevde å skaffe flere bilder per brønn og i sin tur lappe bildene, eller holde oversikt over egg overlappet i flere bilder av samme brønn. Begge tilnærmingene kompliserte analysen og økte arbeidet som var involvert betydelig. Videre, på grunn av arten av et stereomikroskop, er kameravinkelen alltid litt venstre eller høyre fra vinkelrett vinkel, noe som gjør venstre eller høyre sideveggblokk til en del av den agarose overflaten.
Forurensning av mikroorganismer, spesielt sopp, kan være et problem under analysen. Selv om bleking kan minimere forurensningen før oviposisjonen, kan sopp være til stede i insektmiljøet og bæres av myggene selv. I slike tilfeller kan det å holde insektsrom rene redusere forekomsten. Det er best for hvert laboratorium å teste en EAgaL-plate for å oppdage potensielle problemer.
Vær oppmerksom på at EAgaL-platemetoden ikke ble designet for å opprettholde myggkulturer utover de tidlige larvestadiene. Gjennomsnittlig antall larver per brønn var vanligvis over 60, og det er ikke uvanlig å ha mer enn 100 larver per brønn. Dette skaper overfylte forhold, noe som resulterer i en forsinkelse i utviklingen, lavere puperingsrate og svært små voksne, noe som kan kompromittere nedstrømsstudier.
For øyeblikket er denne metoden bare testet med Ae. aegypti. Imidlertid blir den for tiden testet for å utvide sin anvendelse til andre arter av Aedes og til og med andre genera mygg som Anopheles og Culex.
På grunn av de reduserte tids- og plasskravene for EAgaL-platemetoden, kan fecundity- og fruktbarhetsanalysene skaleres opp til semihøy gjennomstrømning (dvs. 5-10 plater eller mer per eksperiment). Denne egenskapen til EAgaL-platemetoden kan være ekstremt nyttig for å vurdere de viktige treningsparametrene til mygg for insektmiddeltesting, sterilitetsevaluering, transgenese og genredigeringsstudier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter for denne studien.
Acknowledgments
Vi takker Texas A&M Agrilife Research Insect Vectored Diseases Grant Program for finansiering. Vi takker også Adelman lab-medlemmene for hjelp til å utvikle denne metoden og forslag når de utarbeider manuskriptet, samt Kevin Myles labmedlemmer. Vi takker også anmeldere og redaktører for deres hjelp til å gjøre dette manuskriptet bedre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.6 mm Φ drill bit | alternatively heated nails can be used | ||
| 1000 μL pipette tips (long) | Olympus plastics | 24-165RL | |
| 24-well tissue culture plate | Thermo Scientific | 930186 | clear, flat-bottom with ringed lid plates |
| Agarose | VWR | 0710-500G | |
| Compact digital camera | Olympus | TG-5/TG-6 | |
| Computer (Windows, Mac or Linux) | |||
| Deionized water | |||
| Fiji (imageJ) software | download from: https://fiji.sc/ | ||
| Forceps | Dumont | sharp forceps may break mosquito's body | |
| Glass Petri dishes | VWR | ||
| Household bleach | |||
| Household electric drill | |||
| illuminator for stereomicroscope (gooseneck) | |||
| P-1000 pipette | Gilson | ||
| paint brushes | |||
| Rubber bands | |||
| SD card | to record digital camera images (DSHC, SDXC should be better) | ||
| Spreadsheet software (Microsoft Excel) | Microsoft | Any spreadsheet software works | |
| TetraMin fish food | Tetra | ground with coffee grinder, blender or morter & pestle | |
| Transfer pipetts | VWR | 16011-188 |
References
- Bond, J. G., et al. Optimization of irradiation dose to Aedes aegypti and Ae. albopictus in a sterile insect technique program. PLoS One. 14 (2), 0212520 (2019).
- Fernandes, K. M., et al. Aedes aegypti larvae treated with spinosad produce adults with damaged midgut and reduced fecundity. Chemosphere. 221, 464-470 (2019).
- Inocente, E. A., et al. Insecticidal and Antifeedant Activities of Malagasy Medicinal Plant (Cinnamosma sp.) Extracts and Drimane-Type Sesquiterpenes against Aedes aegypti Mosquitoes. Insects. 10 (11), 373 (2019).
- Marrelli, M. T., Moreira, C. K., Kelly, D., Alphey, L., Jacobs-Lorena, M. Mosquito transgenesis: what is the fitness cost. Trends in Parasitology. 22 (5), 197-202 (2006).
- da Silva Costa, G., Rodrigues, M. M. S., Silva, A. A. E. Toward a blood-free diet for Anopheles darlingi (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. , 217 (2019).
- Gonzales, K. K., Tsujimoto, H., Hansen, I. A. Blood serum and BSA, but neither red blood cells nor hemoglobin can support vitellogenesis and egg production in the dengue vector Aedes aegypti. PeerJ. 3, 938 (2015).
- Gonzales, K. K., et al. The Effect of SkitoSnack, an Artificial Blood Meal Replacement, on Aedes aegypti Life History Traits and Gut Microbiota. Scientific Reports. 8 (1), 11023 (2018).
- Tsujimoto, H., Anderson, M. A. E., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Identification of Candidate Iron Transporters From the ZIP/ZnT Gene Families in the Mosquito Aedes aegypti. Frontiers in Physiology. 9, 380 (2018).
- Ioshino, R. S., et al. Oviplate: A Convenient and Space-Saving Method to Perform Individual Oviposition Assays in Aedes aegypti. Insects. 9 (3), 103 (2018).
- Price, D. P., Schilkey, F. D., Ulanov, A., Hansen, I. A. Small mosquitoes, large implications: crowding and starvation affects gene expression and nutrient accumulation in Aedes aegypti. Parasites & Vectors. 8, 252 (2015).
- Valerio, L., Matilda Collins, C., Lees, R. S., Benedict, M. Q. Benchmarking vector arthropod culture: an example using the African malaria mosquito, Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae). Malaria Journal. 15 (1), 262 (2016).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
