Summary
Descrito é um método de economia de tempo e espaço para contar ovos e determinar as taxas de escotilha de mosquitos individuais usando 24 placas de cultura de tecido de poço, o que pode aumentar substancialmente a escala e a velocidade dos ensaios de fecundidade e fertilidade.
Abstract
Os mosquitos representam um problema significativo de saúde pública como vetores de vários patógenos. Para aqueles estudos que exigem uma avaliação dos parâmetros de aptidão do mosquito, em particular a produção de ovos e as taxas de escotilha no nível individual, os métodos convencionais têm colocado uma carga substancial sobre os pesquisadores devido à alta intensidade de trabalho e aos requisitos de espaço laboratorial. Descrito é um método simples usando 24 placas de cultura de tecido de poço com agarose em cada poço e imagem digital de cada poço para determinar números de ovos e taxas de escotilha em um nível individual com requisitos de tempo e espaço substancialmente reduzidos.
Introduction
O controle de mosquitos para proteger os humanos de patógenos transportados por vetores é um importante objetivo de saúde pública, principalmente devido à falta de vacinas eficazes para a maioria dos patógenos transportados por mosquitos. Muitos estudos visam reduzir o condicionamento físico do mosquito em conjunto com uma estratégia de redução populacional aplicável em campo1,2,3. Isso inclui estudos extensivos para criar mosquitos transgênicos e/ou linhas de nocaute CRISPR/Cas9. Tais abordagens de modificação populacional requerem uma avaliação detalhada dos parâmetros de aptidão individual4. Técnicas laboratoriais convencionais para avaliar a aptidão dos mosquitos fêmeas incluem a contenção individual de mosquitos fêmeas acasaladas e alimentadas pelo sangue em recipientes de 100 mL5,tubos consíquicos modificados de 50 mL ou tubos para criação de Drosophila modificados fornecendo superfícies úmidas usando papel de algodão úmido e filtro para oviposição (ou seja, papéis de ovo)1,2,6,7. Tais métodos requerem um espaço relativamente grande (por exemplo, 30 cm x 30 cm x 10 cm: W x L x H para até 100 tubos de Drosophila) (Figura 1), e a manipulação de papéis individuais de ovos para contagem de ovos e larvas de eclosão, que podem ser trabalhosas intensivas. Este manuscrito apresenta um método para contar ovos de mosquito e determinar as taxas de escotilha usando 24 placas de poço e surgiu como uma superfície de oviposição para contornar essas questões8.
Simultaneamente, Ioshino et al.9 descreveram um método detalhado usando 12 e 24 placas de poço para realizar a contagem de óvulos obtidas de fêmeas individuais. Seu protocolo representou uma melhoria significativa dos métodos convencionais na economia de tempo e espaço9. No entanto, o protocolo que eles descreveram continua a usar papel filtro molhado como uma superfície para oviposição, o que requer o desdobramento de cada papel individual para obter contagem, pois os ovos são frequentemente encontrados por baixo ou em dobras. Seu protocolo também não incluía o uso de tecnologias de imagem ou um método para contagem de larvas.
Apresentado é um método aprimorado para realizar ensaios de aptidão para o número de óvulos (ou seja, fecundidade) e taxa de escotilha (ou seja, fertilidade) usando agarose como superfície oviposition em um formato de placa de cultura de tecido de 24 poços para Ae. aegypti que oviposit em superfícies úmidas. Estas placas foram nomeadas placas "EAgaL", de Egg, Agarose, e Larva. Essas 24 placas de poço fornecem aos mosquitos individuais uma superfície mínima para colocar ovos, simplificando e reduzindo drasticamente o tempo e esforço necessários para contar e manter ovos e larvas eclodidas por alguns dias. A placa EAgaL usa agarose translúcida para a superfície de oviposition, o que elimina a necessidade de manusear papéis de ovo e encontrar os ovos e larvas quando eclodido; fotografar cada poço estabelece um registro arquivado de longo prazo dos resultados e separa o processo de contagem em tempo e espaço do processo de criação/manuseio, onde o tempo é muitas vezes limitado.
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Protocol
1. Preparação da placa
- Furos em 24 tampas de placa de cultura de tecido bem (4-6 furos por poço) usando uma broca doméstica com um bit ~1,6 mm (1/16 in)(Figura 2).
NOTA: Esses orifícios evitam que a condensação da água se acumule na tampa, onde os mosquitos podem colocar ovos. O tamanho padrão do Ae. aegypti feminino (estirpe "Liverpool") é ~3,11 mm de envergadura. A redução do tamanho dos orifícios é recomendada ao usar mosquitos menores para evitar escapar da placa. - No dia anterior ao experimento de oviposição, lave e enxágue as placas completamente e mergulhe-as em 1-5% de alvejante por 30-60 min em temperatura ambiente. Enxágüe bem em água desionizada e seque-as.
NOTA: Este processo reduz a chance de fungos e bactérias crescerem em agarose. - O derretimento surgiu em 2% em água deionizada e imediatamente adiciona 500 μL da agarose derretida a cada poço das 24 placas do poço usando uma pipeta de 1.000 μL(Figura 3A,B). Quando a agarose começar a esfriar e entupir a ponta da pipeta, reaqueça a agarose e use uma nova ponta de pipeta.
NOTA: Evite tocar nas paredes do poço com a ponta da pipeta, pois pode deixar um pedaço de agarose na parede onde uma fêmea pode colocar ovos, complicando o processo de imagem e contagem. - Antes de usar, seque qualquer condensação nas paredes do poço durante a noite em um banco de laboratório(Figura 3C,D).
NOTA: A linha do tempo do ensaio da placa EAgaL desde a alimentação sanguínea até a imagem larval é retratada na Figura 4, que é para mosquitos colônias(Ae. aegypti "Liverpool" criado sob luz de 14 h:ciclo de luz escura, 27 °C, 80% de umidade relativa, 500 larvas em uma bandeja de 49,5 cm x 29,2 cm x 9,5 cm com 2 L de água), em condições insetívias. Recomenda-se que cada laboratório teste a placa EAgaL com os mosquitos sendo utilizados, especialmente quando se utiliza diferentes cepas, diferentes espécies de mosquitos, bem como diferentes protocolos de criação.
2. Alimentação de mosquitos
NOTA: É fundamental o uso de mosquitos criados em condições uniformes para todos os grupos de tratamento e grupos de controle, pois a nutrição larval tem impacto nos parâmetros de aptidão do mosquito10,11. Larvas traseiras em condições despovoadas com alimentos suficientes. Deixe que os mosquitos fêmeas se eclosem na presença de machos para que o acasalamento seja assegurado e maduro por pelo menos 3 dias.
- Remova qualquer fonte de água e/ou açúcar dos mosquitos do sexo feminino pelo menos 16 h antes da alimentação sanguínea, a fim de melhorar a alimentação sanguínea.
- Aqueça um circulador de água para alimentação artificial a 37 °C e alimente mosquitos fêmeas usando sangue vertebrado colocado em alimentadores artificiais por 15-30 min (Figura 5A).
- Anestesiar mosquitos com CO2 ou no gelo, transferi-los para um prato de vidro no gelo e selecionar aqueles que são engorgados com sangue(Figura 5B) em um recipiente fornecido com 30% de água de sacarose por mais de 72 h, quando as fêmeas terminam a excreção e o desenvolvimento de ovos.
NOTA: Se as fêmeas forem fornecidas com uma menor concentração de água de sacarose, remova a água de sacarose e quaisquer superfícies úmidas após 48 h para evitar que as fêmeas oviposis.
3. Oviposition
- Cerca de 1 h antes de transferir mosquitos para as placas, adicione 2−3 gotas (~80-120 μL) de água em cada poço de placa usando uma pipeta de transferência.
- Pelo menos 72 horas após a alimentação sanguínea, mosquitos derrubados com CO2 ou no gelo, transfira-os para um prato de vidro no gelo, e coloque individualmente cada mosquito em uma tampa invertida da placa de poço 24 no gelo(Figura 6A).
NOTA: Este procedimento foi aplicado a partir de Ioshino et al.9. - Uma vez colocados todos os 24 mosquitos, cubra a tampa com um fundo de placa invertido(Figura 6B),fixe a tampa e a placa com um novo elástico e coloque em uma câmara ambiental (ou sala de criação)(Figura 6C)até que os mosquitos se recuperem (~10-15 min) e vire a placa para cima(Figura 6D).
- Deixe as fêmeas mosquitos oviposit por 24-48 h e remova as fêmeas liberando-as das placas em uma gaiola grande.
NOTA: Se é importante acompanhar as fêmeas individuais, anestesia-as resfriando as placas e removê-las individualmente no gelo. Oviposition atrasada e excreções escuras que interferem na contagem de ovos foram observadas quando as fêmeas foram transferidas para os pratos antes de 72 h pós-refeição sanguínea (PBM) (Figura 7D).
4. Contagem de ovos
- Verifique cada poço da placa de 24 poços, pois às vezes os mosquitos colocam ovos na parede dos poços e à margem da superfície agarose/plástico, onde são difíceis de resolver em fotografias. Usando uma escova de tinta molhada, mova os ovos colocados na parede e borda da agarose para a superfície plana da agarose para que todos os ovos estejam em um plano uniforme e não se sobreponham uns aos outros.
NOTA: A borda da agarose é tipicamente fora do plano focal da câmera devido à tensão superficial da solução agarose. - Usando fórceps, remova quaisquer pernas, asas e outras partículas quebradas nos poços que possam interferir com ovos de imagem(Figura 7C).
- Insira papel branco sob a placa para aumentar o contraste com ovos de mosquito escuros antes da imagem usando um iluminador estereomicroscope(Figura 7A).
- Tire uma imagem de cada poço usando uma câmera digital compacta no modo microscópio, o que permite ao usuário focar em objetos tão próximos quanto 1 cm. Essa capacidade permite que a câmera seja colocada diretamente na placa para imagem de ovos sem um tripé ou um suporte(Figura 7A). Para distinguir ovos individuais colocados em aglomerados, use o modo fino ou super fino para capturar imagens de alta resolução para que detalhes de close-up possam ser vistos.
NOTA: Limpe o cartão de memória da câmera antes de usar para evitar confusão entre imagens novas e antigas. - Depois de fotografar cada poço de uma placa, tire uma imagem de toda a placa com um rótulo de ordem de imagem para distinguir cada placa mais tarde(Figura 7E).
- Adicione uma camada fina ~5 gotas de água (~200 μL) com uma pipeta de transferência para cada poço para evitar que seu plugue de agarose e os ovos sequem e induzam o desenvolvimento e a eclosão de embriões. Preste atenção aos níveis de água nas primeiras horas e verifique todos os dias, pois pode haver perda de água devido à absorção pela agarose ou evaporação. Adicione água quando seu nível estiver muito baixo para as larvas chocarem.
NOTA: A evaporação da água ocorre de forma não uniforme dentro de uma placa e dentro de uma pilha de placas. Observou-se que a secagem ocorre na seguinte ordem: 1) poços de canto (A1, A6, D1, D6) secam o mais rápido; seguido por 2) poços na borda externa da placa (A2-A5, B1, B6, C1, C6, D2-D5); e últimos 3) poços dentro. Quando as placas são empilhadas, a placa superior seca mais rápido. - Transfira as imagens para um computador com ImageJ (Fiji) e renomeie os arquivos para uma organização mais fácil, como "[iD de placa]_[bem ID].jpg"(Figura 8A,B).
- Crie um arquivo de planilha para registrar números de ovos (ou seja, fecundidade) e números larvais e calcular a taxa de escotilha (ou seja, fertilidade)(Figura 9E).
- Abra as imagens com ImageJ (Fiji)12 e use a ferramenta "multi-point" para marcar cada ovo (Figura 9A−C); zoom-in ou zoom-out usando "+" ou "-" chave para contar os ovos em aglomerados. Depois de marcar todos os ovos, clique duas vezes no ícone de vários pontos para aumentar o número de marcas(Figura 9D). Regissua os resultados em uma planilha.
5. Avaliação da fertilidade
NOTA: Em 2 dias, as primeiras larvas instar podem começar a se escoar nos poços. Aguarde mais 3-5 dias antes da imagem/contagem para garantir que todos os ovos viáveis eclodam.
- Prepare alimentos larvais misturando 1/16 colheres de sopa (~168 mg) de alimentos para peixes moídos (ou seja, dieta normal de larvas de mosquito) em 20 mL de água e esperando que grandes partículas sólidas se instalem(Figura 10A-D). Comece a adicionar alimentos (o supernasce) aos poços que contêm larvas eclodidas assim que elas aparecem, pois elas não sobrevivem por muito tempo sem comida.
NOTA: O excesso de adição de partículas alimentares pode interferir na imagem e na contagem de larvas eclodidas. - Aproximadamente 5-8 dias após a adição de água aos poços, esfrie a placa cobrindo com gelo esmagado por 15-20 min para anestesiar larvas.
- Tire imagens de cada poço enquanto mantém as placas no gelo como foi feito com os ovos. Para imagens larvais, forneça um fundo escuro inserindo um material preto sob a placa para ajudar a melhorar o contraste. Depois de fotografar cada poço de uma placa, tire uma imagem de toda a placa com um rótulo de ordem de imagem para distinguir cada placa mais tarde.
NOTA: As imagens são tiradas enquanto as placas estão no gelo porque o movimento larval pode comprometer a contagem. As placas são reutilizáveis; congelar e remover os mosquitos e agarose para limpar para o próximo uso. A placa EAgaL não é adequada para criar larvas em estágios avançados. - Abra imagens com ImageJ (Fiji) e use a ferramenta "multi-point" para contar clicando em cada larva. Durante o período de 3 a 5 dias algumas larvas podem ter se fundido, especialmente em poços com baixo número de larvas. Portanto, ao contar, exclua as cutículas do galpão (ou seja, exuviae), que parecem larvas somente para a cabeça com um pouco de corpo, ou larvas encolhidas(Figura 10E). Regissos resultados na planilha.
6. Realizar análises
- Tendo coletado todos os dados necessários para a análise de fecundidade e fertilidade, realize análises estatísticas adequadas e crie gráficos utilizando software preferencial.
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Representative Results
Os mosquitos foram injetados com dsRNA visando um transportador de ferro candidato (FeT) ou gene de controle (EGFP), alimentado por sangue, e medidos para fecundidade e produção de fertilidade usando o método de placa EAgaL, seguindo o procedimento descrito acima.
Mosquitos em que a expressão fet foi silenciada após a injeção de dsRNA apresentaram uma redução significativa tanto no número de ovos quanto na taxa de escotilha (Figura 11A−C). Todos os mosquitos de controle e tratamento foram colocados nas placas de EAgaL após 72 h PBM. Mosquitos silenciados por FeT também apresentaram excreção retardada e ovos pequenos e de cor clara(Figura 12A,B). Exemplos também podem ser encontrados em Tsujimoto et al.8.
Figura 1: Tubos de mosca comumente usados para ensaios de fecundidade/fertilidade de mosquitos. (A) Um único tubo com algodão úmido e papel filtro circular com tampa de esponja. (B) 100 tubos em um rack (~30 cm x 30 cm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Furos de perfuração em uma tampa de 24 placas de cultura de tecido de poço. (A) Perfuração em processo. (B) Uma tampa com orifícios que impedem a condensação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Aplicando agarose (2% na água) nos poços. (A) Aplicação de agarose usando uma pipeta de 1.000 μL. Note que a ponta não está tocando na parede do poço. (B) Uma placa contendo agarose na parte inferior. (C) Parede de um poço logo após agarose solidificou. Note a condensação na parede. (D) Parede de um poço quando a condensação evaporou. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Linha do tempo desde alimentação sanguínea (dia 0) até imagem larval (dia 10-13). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Alimentação sanguínea artificial e seleção de fêmeas engorgadas. (A) Alimentação sanguínea usando alimentador artificial. (B) Seleção de fêmeas engorgadas no gelo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Transferência de fêmeas para placa EAgaL. (A) Transfira fêmeas anestesiadas para uma tampa de placa invertida no gelo. (B) Em seguida, coloque cuidadosamente a placa invertida contendo a ágarose sobre a tampa invertida e (C) remova a placa com a tampa presa do gelo e mantenha-a uma posição invertida até que as fêmeas se recuperem da anestesia. (D,E) Gire a placa que contém fêmeas para a posição ascendente. Observe que a tampa e a parte inferior da placa são mantidas por um elástico e que a parte inferior está rotulada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Imagem de cada poço após a retirada das fêmeas. (A) Câmera digital em cima de uma placa de 24 poços contendo ovos para imagem. (B) Imagem típica de um poço. (C) Um poço contendo uma perna, que deve ser removido. (D) Imagem amostral de um poço em que uma fêmea havia sido colocada a 48 h PBM. Observe as marcas de excreção escuras, que podem complicar a contagem de ovos (setas). (E) Placa inteira mostrando um rótulo de pedido de imagem preparado após a imagem de todos os poços da placa. Isso ajuda a reconhecer poços durante a análise. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Renomeando as imagens para uma melhor organização. (A) Imagens de poços individuais contendo ovos, incluindo um rótulo de ordem de imagem com os nomes automaticamente atribuídos pela câmera. (B) As mesmas imagens renomeadas com formato plateID_wellID.jpg. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: Contando ovos usando o software "Fiji" (ImageJ2). (A) Captura de tela do software Fiji mostrando a ferramenta "multi-ponto" destacada (quadrado turquesa). (B) Uma imagem bem com Fiji conta marcas nos ovos. (C) O zoom ajuda na contagem de grupos de ovos maiores. (D) Clicar duas vezes no ícone da ferramenta "multi-point" na janela principal mostra a contagem (círculo vermelho). (E) Um exemplo de uma planilha com fórmula de cálculo da taxa de hatch. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10: Preparação da dieta larval e um poço contendo larvas e exuviae. (A)Comida de peixe moída. (B) 20 mL de água em um copo. (C) Mistura de comida de peixe moído e água. (D) Comida/água liquidada por 15 min. Tome supernante desta mistura como alimento larval. (E) Bem com larvas fundidas; exuviae representativo são indicados por setas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 11: Conte dados de um experimento de silenciamento genético. Os mosquitos injetados com dsRNA contra o transportador de ferro putativo (FeT) apresentaram redução significativa do número de ovos (A),(B)larval e (C) taxa de escotilha em comparação com o controle (EGFP). Bares mostram ± SD. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 12: Imagens representativas dos poços mostrando fenótipos adicionais em mosquitos silenciados por genes. dsFeT mostrou excreção retardada (marcas marrons escuras) e ovos pequenos e levemente coloridos. Dois poços representativos para cada tratamento são mostrados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Ft | EAgaL | |
| (1) Prep | 20 min 29,0 seg | 3 min 49,3 seg |
| (2) F_in | 3 min 55,0 seg | 1 min 56,0 seg |
| (3) F_out/E_img | 43 min 44,3 seg | 15 min 28,3 seg |
| (4) L_img | 38 min 03,5 seg | 9 min 30,5 seg |
Tabela 1: Requisitos de tempo para conclusão do método do tubo de mosca (FT) em comparação com o método da placa EAgaL. (1) Prepare:Tempo necessário para colocar algodão, derramar água e inserir disco de papel filtro em tubos de criação de Drosophila (FT) versus derramamento de agarose em poços de 24 placas de poço (EAgaL). (2) F_in: Tempo necessário para colocar mosquitos individuais em tubos de criação (FT) ou poços da placa de 24 poços (EAgaL). (3) F_out/E_img: Tempo necessário para liberar mosquito em uma gaiola maior, remover, desdobrar papel de ovo e imaginar os ovos no papel (FT) ou liberar mosquitos em uma gaiola maior e imagem cada poço da placa de poço 24 (EAgaL). (4) L_img: Tempo necessário para a imagem larvas eclodidas em um pequeno recipiente (FT) ou cada poço da placa de 24 poços (EAgaL) após anestesia fria. Um total de 24 tubos foram usados para FT.
| Custos a granel | |||||
| Placa EAgaL | Tubos de mosca | ||||
| item | preço | quantidade | item | preço | quantidade |
| Placas de 24 poços | $45.61 | Caso de 50 | Folhas de papel cromatografia | $103.63 | 46 × 57 cm 100 Folhas/PK |
| agarose | $250.97 | 500 gramas | Racks de tubos de mosca + tubos | $68.45 | 5 bandejas de 100 |
| Olympus TG-6 | $375.00 | Plugues de tubos voadores | $66.10 | Caso de 200 | |
| Bolas de algodão | $104.27 | Caso de 2000 | |||
| Total de inicialização | $671.58 | Total de inicialização | $342.45 | ||
| Custo unitário (uma placa de 24 poços ou 24 tubos) | |||||
| Placa EAgaL | Tubos de mosca | ||||
| item | preço | nota | item | preço | nota |
| uma placa de 24 poços | $0,91 | preço a granel/50 | Folhas de papel cromatografia | $0.16 | 641,7 conjuntos de 24 tubos que valem(2) |
| Agarose por placa | $0.15 | 500g= 1667 placas(1) | Racks de tubos de mosca + tubos | $3.29 | (preço a granel/500) × 24 |
| Plugues de tubos voadores | $7.93 | (preço a granel/200) × 24 | |||
| Bolas de algodão | $1,25 | (preço a granel/2000) × 24 | |||
| Total da unidade | $1,06 | Total da unidade | $12.63 | ||
Tabela 2: Comparação de custos entre a placa EAgaL e a FT. Topo: Custos em massa para inicialização (assumindo uma broca e uma broca pode ser fornecido por um pesquisador). Inferior: Custos estimados para uma placa de 24 poços (placa EAgaL) e 24 FT.(1) Supondo que uma placa exija um pouco mais do que apenas o suficiente para uma placa de 24 poços (12mL), 15 mL de 2% = 0,3 g de agarose por placa, um total de 500 g de agarose pode fazer 1.667 placas. (2) Uma folha de papel pode fazer 154 de discos de ~38 mm de diâmetro. Com 100 folhas, podem ser feitos conjuntos de 24 tubos.
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Discussion
A placa EAgaL reduz drasticamente o trabalho, o tempo e o espaço para realizar ensaios individuais de fecundidade e fertilidade no Aedes aegypti quando comparado com o método FT. A comparação preliminar entre o método FT e a placa EAgaL resultou em tempos mais curtos para todas as etapas (a técnica de imagem foi aplicada ao método FT) (Tabela 1). Como referência, uma estimativa de inicialização e por ensaio (uma placa EAgaL de 24 poços versus 24 FTs) são fornecidas na Tabela 2.
Há alguns pontos a considerar ao usar as placas EAgaL. Uma preocupação inicial era que os mosquitos colocados em um espaço tão pequeno não podem colocar todos os ovos devido ao movimento limitado. Para determinar se esse era o caso, os mosquitos foram transferidos coletivamente para uma gaiola maior com um copo de oviposition forrado com uma toalha de papel com água por mais 48 h depois de passarem 48 horas nas placas EAgaL. Os mosquitos de fato depositou ovos adicionais, mas o número médio de ovos por fêmea foi de apenas 2,1, o que não resulta em qualquer diferença no resultado de qualquer análise estatística na maioria, se não todos, casos. Esses números são de mais de 500 mosquitos testados (dados não apresentados). No entanto, isso pode ser apenas para a cepa de mosquito Ae. aegypti "Liverpool" com as condições descritas. Cada laboratório pode precisar testar se este é o caso de seus mosquitos e condições.
Para a imagem, a única imagem de uma câmera ligada a um estereomicroscópio não cobria um poço inteiro mesmo com a menor ampliação. Isso exigiu a obtenção de várias imagens por poço e, por sua vez, remendar as imagens, ou manter o controle dos ovos sobrepostos em várias imagens do mesmo poço. Ambas as abordagens complicaram severamente a análise e aumentaram significativamente o trabalho de trabalho envolvido. Além disso, devido à natureza de um estereótipo, o ângulo da câmera é sempre ligeiramente esquerdo ou direito do ângulo perpendicular, o que faz com que a parede lateral esquerda ou direita bloqueie uma parte da superfície agarose.
A contaminação por microrganismos, especialmente fungos, pode ser um problema durante o ensaio. Embora o branqueamento possa minimizar a contaminação antes da oviposição, os fungos podem estar presentes no ambiente inseticário e transportados pelos próprios mosquitos. Nesses casos, manter os espaços insetídutos limpos pode reduzir a incidência. É melhor para cada laboratório testar uma placa EAgaL para detectar quaisquer problemas potenciais.
Note que o método da placa EAgaL não foi projetado para manter culturas de mosquitos além dos estágios larvais iniciais. O número médio de larvas por poço era tipicamente superior a 60, e não é incomum ter mais de 100 larvas por poço. Isso cria condições lotadas, que resultam em um atraso no desenvolvimento, menor taxa de pupação e adultos muito pequenos, o que pode comprometer estudos a jusante.
Atualmente, este método só foi testado com Ae. aegypti. No entanto, está sendo testado para expandir sua aplicação para outras espécies de Aedes e até mesmo outros gêneros de mosquitos como Anopheles e Culex.
Devido aos requisitos reduzidos de tempo e espaço para o método da placa EAgaL, os ensaios de fecundidade e fertilidade podem ser dimensionados até o rendimento semi-alto (ou seja, 5-10 placas ou mais por experimento). Esta característica do método da placa EAgaL pode ser extremamente útil para avaliar os importantes parâmetros de aptidão dos mosquitos para testes de inseticidas, avaliação de esterilidade, transgênese e estudos de edição de genes.
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Disclosures
Os autores não declaram conflitos de interesse para este estudo.
Acknowledgments
Agradecemos ao Programa de Subvenção de Doenças Vetoriadas de Insetos da Texas A&M Agrilife Research pelo financiamento. Agradecemos também aos membros do laboratório Adelman pela ajuda no desenvolvimento deste método e sugestões na elaboração do manuscrito, bem como aos membros do laboratório de Kevin Myles. Agradecemos também aos revisores e editores por sua ajuda para tornar este manuscrito melhor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.6 mm Φ drill bit | alternatively heated nails can be used | ||
| 1000 μL pipette tips (long) | Olympus plastics | 24-165RL | |
| 24-well tissue culture plate | Thermo Scientific | 930186 | clear, flat-bottom with ringed lid plates |
| Agarose | VWR | 0710-500G | |
| Compact digital camera | Olympus | TG-5/TG-6 | |
| Computer (Windows, Mac or Linux) | |||
| Deionized water | |||
| Fiji (imageJ) software | download from: https://fiji.sc/ | ||
| Forceps | Dumont | sharp forceps may break mosquito's body | |
| Glass Petri dishes | VWR | ||
| Household bleach | |||
| Household electric drill | |||
| illuminator for stereomicroscope (gooseneck) | |||
| P-1000 pipette | Gilson | ||
| paint brushes | |||
| Rubber bands | |||
| SD card | to record digital camera images (DSHC, SDXC should be better) | ||
| Spreadsheet software (Microsoft Excel) | Microsoft | Any spreadsheet software works | |
| TetraMin fish food | Tetra | ground with coffee grinder, blender or morter & pestle | |
| Transfer pipetts | VWR | 16011-188 |
References
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