Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

כימות של חומצות חומיות ופולביות בחצבי Humate, DOC, חומרים מהומרים ומוצרים מסחריים המכילים חומרים חומיים

Published: March 18, 2022 doi: 10.3791/61233
Automatic Translation
1, 1
1Bio Huma Netics, Inc.

Summary

שיטה זו מספקת כימות כבידתי של חומרים חומיים (למשל, חומצות חומיות ופולביות) על בסיס נטול אפר, בחומרים יבשים ונוזליים מגחלים רכים (כלומר, ליגניט מחומצן ולא מחומצן ופחם תת-ביטומיני), עפרות חומות ופצלי שמן, אפונה, קומפוסטים ודשנים מסחריים ותיקוני קרקע.

Abstract

מטרת שיטה זו היא לספק ריכוז מדויק ומדויק של חומצות חומיות (HA) ו/או פולביות (FA) בגחלים רכות, עפרות חומיות ופצלי שמן, אפונים, קומפוסטים ומוצרים מסחריים המכילים חומרים חומיים. השיטה מבוססת על מיצוי אלקליין של חומרי בדיקה, באמצעות 0.1 N NaOH כמחלץ, והפרדה של חומרים חומיים מסיסים אלקליין (HS) ממוצרים שאינם מסיסים על ידי צנטריפוגה. ה- pH של תמצית אלקליין צנטריפוגה מותאם לאחר מכן pH 1 עם conc. HCl, אשר גורם משקעים של HA. ה- HA המשקף מופרדים מהשבר הפלווי (FF) (שבר ה- HS שנותר בפתרון,) על ידי צנטריפוגה. לאחר מכן ה- HA מיובש בתנור או בהקפאה ותכולת האפר של HA היבש נקבע. המשקל של HA טהור (כלומר, ללא אפר) HA מחולק לאחר מכן על ידי המשקל של המדגם ואת השבר המתקבל מוכפל על ידי 100 כדי לקבוע את % HA במדגם. כדי לקבוע את תוכן ה-FA, ה-FF נטען על שרף DAX-8 הידרופובי, אשר סופג את שבר ה-FA המכונה גם חומצה פולבית הידרופובית (HFA). שבר החומצה הלא פולבית הנותר, המכונה גם שבר פולווי ההידרופילי (HyFF) מוסר לאחר מכן על ידי שטיפת השרף עם H2O deionized עד שכל החומר שאינו מעובד מוסר לחלוטין. לאחר מכן, ה-FA מושבת עם 0.1 N NaOH. Na-fulvate וכתוצאה מכך הוא פרוטוניזציה לאחר מכן על ידי העברתו מעל שרף H + -exchange חזק. FA המתקבל הוא תנור או מיובש בהקפאה, תוכן האפר נקבע ואת הריכוז במדגם מחושב כמתואר לעיל עבור HA.

Introduction

חומרים הומיים (HS) הם שאריות דינמיות הנובעות מפירוק מיקרוביאלי וטרנספורמציה של רקמות צמחים מתים1,2,3 מוגבר עם תוצרי לוואי מיקרוביאליים וביומסה 3,4,5 באמצעות תהליך המכונה humification6. HS נמצאים בקרקעות, מים טבעיים, משקעי אגם, אפונה, גחלים רכות ופצלי humic ומייצגים כ -25% מכלל הפחמן האורגני על פני כדור הארץ7. חומרים אלה הם תערובות מורכבות של אלפי מולקולות ייחודיות המחולקות לשלושה שברים עיקריים בהתבסס על המסיסות השונות שלהם בפתרונות מימיים בסיסיים וחומציים מאוד. שברים אלה הם חומצות חומיות (HAs), המהוות את השבר המסיס אלקלי אך מסיס בחומצה; חומצות פולוויות (FAs), השבר מסיס הן אלקלי והן חומצה; ושבר ההומין, שאינו מסיס בכל ערכי ה- pH6,8. השבר הפולווי (FF) מחולק עוד יותר לשברים ההידרופוביים FA (HFA) וההידרופיליים (HyFA). שברים אלה מוגדרים כחלק מה-FF הנקשר לשרף DAX-8 הידרופובי (HFA) ולחלק שאינו נקשר לשרף (HyFA).

HS משמשים יותר ויותר בחקלאות, שם הם נמצאים בשימוש נרחב כמו biostimulants יבול, בגידול בעלי חיים, במיוחד כתוסף להאכיל בעלי חיים, בכרייה בבוץ קידוח, ותיקון סביבתי כמו מעבורות אלקטרונים. המחקר בשימוש ב- HS ביישומים רפואיים אנושיים גדל גם הוא.

קיימות שיטות רבות לכמות של HA ו- FA. עם זאת, רוב השיטות הללו אינן מדויקות ואינן מדויקות. לדוגמה, שתי השיטות הנפוצות ביותר לקביעת HA בארה"ב הן השיטה הצבעונית9 ושיטת מחלקת המזון והחקלאות של קליפורניה (CDFA), שתיהן הוצגו כדי להעריך יתר על המידה את כמות HA במגוון עפרות ולחלץ מקורות ממערב ארה"ב וקנדה10. השיטה הצבעונית או הספקטרופוטומטרית אינה מדויקת מכיוון שהיא מסתמכת על ספיגת תמציות אלקליין הכוללות, בנוסף ל- HA, FA וכרומופורים אחרים שכולם נספגים באורך הגל המשמש והתקן אינו מייצג את החומרים הנבדקים10. שיטת CDFA אינה מדויקת מכיוון שהיא אינה מספקת ריכוזי HA על בסיס ללא אפר. מכיוון שלעפרות שונות יש כמויות שונות של אפר, שחלקן נישאות עם החילוץ ותהליך החילוץ עצמו מוסיף אפר, שיטה זו אינה מספקת ערך מדויק עבור ריכוזי HA10. בתגובה לצורך בשיטה מדויקת ומדויקת, נוהל כבידתי מתוקנן המבוסס על זה שפורט על ידי 11 פורסם בשנת 2014 כדי לטפל בכמות של HA ו- FA על בסיס ללא אפר12. שיטה זו הותאמה אז, עם שינויים קלים, על ידי הארגון הבינלאומי לתקנות (ISO) בשנת 2018 תחת דשנים ומרככי קרקע כ"קביעת ריכוזי חומצות פולוויות חומיות והידרופוביות בחומרי דשן"13.

מאמר זה מתאר את הפרוטוקול לחילוץ וכמות של חומצות פולוויות חומיות והידרופוביות ונותן פרטים על הדיוק והדיוק של הנתונים המופקים מהשיטה.

Protocol

1. הכנת מדגם מוצק

  1. לרסק כ 5 גרם של המדגם להיות מנותח, באמצעות מרגמה ועלי, כך 100% של מדגם כתוש עובר דרך ארה"ב סטנדרטי מסננת מסננת גודל מס '200 (כלומר, 74 מיקרומטר) מוודא כי האבקה מעורבת היטב.
  2. לקבוע את תכולת הלחות של האבקה כבידתית.
    1. לשקול אלומיניום שוקל סירה ולתעד את המסה (Wwb).
    2. העבר כ 2 גרם של אבקת מדגם לתוך סירת השקילה ולתעד את המסה (Wws + wb).
    3. מניחים את סירת השקילה בתנור ייבוש במשך 24 שעות ב 102 °C ((לא יעלה על 102 °C (65 °F). לאחר 24 שעות, להסיר את סירת השקילה מתנור ייבוש ומניחים במייבש להתקרר לפחות 1 שעה.
    4. לשקול ולתעד את המסה של סירת השקילה ואבקת מדגם מיובשת (Wds + wb).
    5. קבע את תכולת הלחות באמצעות פורמולה 1.1.
      פורמולה 1.1 תכולת לחות של אבקת דגימה מוצקה
      % לחות = ((((Wws +wb- Wwb) – (Wds+wb - Wwb))/ (Wws+wb - Wwb)) * 100

2. הליך חילוץ

  1. דוגמאות מוצקות
    1. שקול כ 2.5 גרם של אבקת מדגם מסונן (Wsamp) לתוך סירת שקילה פלסטיק או אלומיניום ולתעד את המשקל לארבעה מקומות עשרוניים.
    2. טען את המדגם לתוך צילינדר מדורג 1 L ולמלא את הגליל ל 1 L עם 0.1 M NaOH (4 g NaOH x L-1).
    3. מוסיפים מוט ערבוב מגנטי (למשל, באורך 5 - 7 ס"מ) ומערבבים במהירות (כלומר, 300 - 400 סל"ד) על צלחת ערבוב עד שהדגימה מתערבבת היטב.
    4. מעבירים את כל תכולת הגליל המדורג לבקבוק ארלנמייר 1 ליטר, מפנים את מרחב הראש של הבקבוקון בגז N2 ומכסים את פתח הבקבוק עם כיסוי אטום.
    5. מניחים את בקבוק ארלנמייר על צלחת ערבוב ומערבבים ב 300 - 400 סל"ד במשך 16 - 18 שעות.
  2. דגימות נוזליות
    1. עבור חומרים נוזליים, לערבב ביסודיות את המדגם על ידי רועד כדי להבטיח כי נוזל הבדיקה מעורבב הומוגנית. ודא שכל השאריות שאולי נפלו לתחתית המיכל מעורבבות היטב.
    2. הוסף כ 5 גרם של נוזל הבדיקה, במשקל 4 מקומות עשרוניים (WTL), כדי 1 L מדורג צילינדר.
    3. מלא את הגליל המדורג עם 0.1 M NaOH לכרך סופי של 1 L.
    4. מוסיפים מוט ערבוב מגנטי (למשל, באורך 5 - 7 ס"מ) ומערבבים במהירות (למשל, 300 - 400 סל"ד) על צלחת ערבוב עד שדגימת הבדיקה מעורבת לחלוטין.
    5. מעבירים את התערובת לבקבוק ארלנמייר 1 ליטר, מפנים את מרחב הראש בגז N2 ומכסים את פתח הבקבוקון בכיסוי אטום.
    6. מניחים את בקבוק ארלנמייר על צלחת ערבוב ומערבבים ב 300 - 400 סל"ד במשך 1 שעה.
      הערה: לאחר נקודה זו, הטיפול בדגימות מוצקות ונוזליות זהה.

3. הסרת חומרים לא מסיסים מתמציות אלקליין

  1. בסיום ערבוב, להסיר את הבקבוק מהצלחת לערבב, להעביר את התערובת לצינורות צנטריפוגה מתאימים צנטריפוגה צנטריפוגה צנטריפוגה נפח כולו ב 4,921 x גרם במשך 30 דקות.
  2. לאסוף את supernatant אלקליין המכיל HA ו- FA בבקבוק נקי 1 L Erlenmeyer המכיל בר ערבוב מגנטי. השלך את החומר הבלתי מסיס. סינון באמצעות צמר זכוכית או נייר סינון איכותי בגודל נקבוביות של 2.5 מיקרומטר מומלץ אם חלקיקים שיורית אינם מואצים לאחר צנטריפוגה.

4. משקעים והפרדה של חה מ FF

  1. תוך כדי ערבוב תמצית אלקליין ב 300 - 400 סל"ד על צלחת ערבוב, להכניס בדיקה pH לתוך החלק האמצעי של הפתרון (אנכית) ולהוסיף conc. HCl dropwise לתמצית אלקליין עד pH יציב של pH 1.0 ± 0.1 הוא הגיע.
  2. ברגע pH של pH 1 הוא הגיע ונשאר יציב, להסיר את הבדיקה pH מן הבקבוק, לאחזר את מוט ערבוב, לכסות את הבקבוק עם כיסוי אטום ולתת הבקבוק לשבת עד HA מזורז התיישב לתחתית הבקבוקון.
    הערה: הזמן שלוקח HA לזרז ולנשור מהפתרון ישתנה בהתאם למקור ולכמות של HA במדגם. זה בדרך כלל לוקח 1 -6 שעות עבור HA כדי לזרז לחלוטין לנשור מהפתרון.
  3. צנטריפוגה התמצית והאיץ HA ב 4921 x g עבור 1 שעה. לאחר צנטריפוגה, לשפוך את FF supernatant לתוך 1 L Erlenmeyer נקי לכסות עם כיסוי אטום.
    הערה: זמן צנטריפוגה ארוך יותר עשוי להיות נחוץ על מנת לארוז את HA למטה בחוזקה מספיק כדי לאפשר decanting FF ללא הכללה של כל HA מזורז.
  4. מניחים את צינורות הצנטריפוגה בתנור ייבוש המוחזק ב 100 °C (50 °F) במשך 24 שעות.
  5. לאחר הייבוש, מוציאים את הצינורות מתנור הייבוש ומניחים במייבש כדי להתקרר לטמפרטורת החדר. לאחר הקירור, מעבירים כמותית את השאריות מהצינור על ידי גירוד אותו מהצדדים ומהתחתית של הצינור עם מרית, להעביר לסירה במשקל מזופת, ולתעד את המסה (WEHA). שאריות זה הוא "HA שחולץ".
    הערה: אם צינורות צנטריפוגה גדול מ 50 מ"ל שימשו בהפרדה של HA ו FF, זה נוח להעביר את HA מזורז לצינורות צנטריפוגה עמידים בטמפרטורה 50 מ"ל לתהליך הייבוש. כמו כן, אם יש מייבש הקפאה זמין, ניתן לייבש את HA המושקע בהקפאה. איסוף של HA במצב מיובש בהקפאה קל יותר כי ה- HA אינו נדבק לצד צינורות הפלסטיק ואין צורך לגרד אותו.

5. קביעת תוכן אפר

הערה: ההליך לקביעת תוכן אפר של דגימות HA ו- FA מיובשות זהה. ההליך המשתמש בסימון עבור HA מוצג.

  1. מעבירים כ-30 מ"ג של ה-HA המיובש (WHA) לצלחת קרמיקה נקייה ושוקלת מראש (WCD) שיובשה בעבר בתנור ייבוש בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס ואז התקררה במייבש לטמפרטורת החדר. לאחר הקלטת המסה המשולבת של HA משוקלל צלחת (WHA + CD), לשרוף את HA בתנור עמום במשך 2 שעות ב 600 מעלות צלזיוס.
    הערה: עבור כל מדגם HA, יש לעבד שלושה עותקים משוכפלים ואת תוכן האפר הממוצע המשמש בחישוב של HA טהור.
  2. לאחר 2 שעות, מוציאים את המנה והתכולה מהתנור העמום ומניחים במייבש להתקרר. פעם מגניב, לשקול את המנה עם אפר (WASH + CD) ולחשב את יחס האפר (אשרת) באמצעות פורמולה 1.2:
    פורמולה 1.2 אשרת = (WASH+CD - WCD) / (WHA +CD - WCD)

6. קביעת אחוז חילוץ המטוהרים של חה

  1. קבע את המסה הסופית של HA הטהור (WPHA) על-ידי תיקון תוכן האפר באמצעות פורמולה 1.3:
    פורמולה 1.3 WPHA = WEHA * (1- אשרת)

7. קביעת הריכוז (%) של HA טהור במדגם המקור המקורי

  1. לקבוע את הריכוז של HA טהור באמצעות פורמולה 1.4 ו 1.5:
    פורמולה 1.4: % HA טהור במדגם מוצק = (WPHA/Wsamp) * 100
    פורמולה 1.5: % HA טהור במדגם נוזלי = (WPHA/WTL) * 100

8. הכנת טורים לטיהור HFA

  1. הכן עמודת כרומטוגרפיה בלחץ נמוך עמוסה בשרף DAX-8 פולימתילמתקרילט. אם לא נעשה שימוש בשרף בעבר, השרו את השרף במתנול במשך 2 שעות ולאחר מכן שטפו ביסודיות עם H2O deionized עד שכל המתנול מוסר.
    1. הסר חלקיקי שרף קטנים שצפים על המים בשלב זה. אם נעשה שימוש בשרף בעבר, צור אותו מחדש כמתואר בסעיף 10.
  2. לאחר שטיפה יסודית, יוצקים את השרף לתוך עמוד כרומטוגרפיה זכוכית 5 x 25 ס"מ מצויד חתיכת קצה עם פריט 10 מיקרומטר לתמיכה במיטת שרף. השאירו 2.5 עד 5 ס"מ בחלק העליון של העמודה לפתרון ללא שרף כדי לאפשר ערבוב של FF לפני הכניסה למיטת השרף. התאימו את החלק העליון לעמודה ושאבו את H2O שעברו דה-יוניזציה דרך החלק העליון של העמודה כדי לארוז את מיטת השרף DAX-8 באמצעות משאבה פריסטלטית.

9. בידוד של HFA

  1. לאחר אריזת מיטת השרף, טען את ה- FF על העמוד באמצעות משאבה פריסטלטית, בלחץ נמוך, דרך החלק העליון של העמוד. השתמש בקצב זרימה של 35 – 40 מ"ל / דקה. זה קריטי כי החלק העליון של השרף בעמודה נשאר מכוסה עם פתרון לאורך כל הליך הטעינה והשטיפה כדי למנוע ייבוש של השרף ותקשור של התמצית למרות מיטת השרף.
  2. לאחר שבר פולווי כבר טעון לחלוטין על השרף, לשטוף את השרף עם מים deionized, כדי להסיר את "שבר פולווי הידרופילי" לא מסופג (HyFF) על ידי שאיבתו דרך החלק העליון של הטור באמצעות משאבה peristaltic תחת לחץ נמוך. השתמש בקצב זרימה של 35 – 40 מ"ל / דקה. יש להשליך את השפכים המכילים HyFF אלא אם כן הוא ישמש לניתוח.
  3. שטפו את העמודה עם H2O שעבר דה-יוניזציה עד שהספיגה ב-350 ננומטר של שפכי העמודות שווה (לדוגמה, בתוך 0.015 יחידות ספיגה) לזו של H2O המנוטרל המשמש לשטיפת העמודה. השתמש במים שעברו דה-יוניזציה לאפס (כלומר, ריק) את הספקטרופוטומטר.
  4. ביטול ה-HFA על ידי התחמקות אחורית על ידי שאיבת 0.1 M NaOH דרך החלק התחתון של העמודה באמצעות המשאבה הפריסטלטית. השתמש בקצב זרימה של 35 – 40 מ"ל / דקה. לכוד את שפך המשאבה (Na-fulvate במיכל נקי בגודל מספיק (למשל, 2 L Erlenmeyer).
    הערה: רוב HFA סופגים לחלק העליון מאוד של מיטת שרף DAX-8. ביטול ספיגה על-ידי הצגת 0.1 M NaOH מתחתית העמודה ממזער את הכמות של 0.1 M NaOH הדרושה לביטול מלא של ה- FA.
  5. כל HFA כבר desorbed כאשר הספיגה של קולחן עמודה שווה לספיגה של 0.1 M NaOH המשפיע ב 350 ננומטר. השתמש ב- 0.1 M NaOH כריק הספקטרופוטומטרי. הוסף את השפכים שנלקחו כדי לבדוק את הספיגה של פתרון FA desorbed כדי להבטיח שכל FA נלכד.

10. ה-HFA דה-אפר על ידי פרוטונציה

  1. העבר את פתרון Na-fulvate, שוב ושוב, על ידי הזנת כבידה, באמצעות שרף H + - שרף החלפה חזק (טבלת חומרים) הכלול בעמודה 5 × 50 ס"מ, עם פריט זכוכית כדי לשמור על השרף, עד מוליכות חשמלית של הקולחים הוא < 120 μS / ס"מ, כפי שנמדד עם מד מוליכות חשמלית. לפני כל מעבר, שרף H +-exchange דורש שיפוץ כמתואר בסעיף 11.
    1. כדי להבטיח שכל ה-FA יוסר מהשרף לאחר המעבר הסופי, שטפו את השרף במים שעברו דה-יוניזציה עד שספיגת הקולחים ב-350 ננומטר זהה (למשל, בתוך 0.015 יחידות ספיגה) כמים המנופחים המשמשים לשטיפת העמוד. השתמש H2O deionized כמו ריק ספקטרופוטומטרי. הוסיפו את הכביסה ואת כל מנות הקולחים שנלקחו כדי לבדוק את הספיגה לתמיסת FA המטוהרת. כדי לסייע בהסרת כל FA, השרף יכול להיות נסער (למשל, באמצעות זכוכית ארוכה או מוט פלסטיק) מספר פעמים.
  2. רכז את ה-FA לנפח של כ-15 ±-2 מ"ל באמצעות מאייד סיבובי בטמפרטורה של 55°C (55°F).
  3. מעבירים לחלוטין את תרכיז ה-FA בגודל 15 מ"ל לצינור צנטריפוגות מפלסטיק 50 מ"ל ומיובשים בטמפרטורה של 60±3 מעלות צלזיוס ליובש מתמיד בתנור ייבוש. ייבוש בהקפאה הוא חלופה לייבוש בתנור. לאחר הייבוש מעבירים את הצינור למייבש כדי להתקרר.
    1. הסר FA מהצינור על ידי גירוד הצדדים והתחתון של הצינור עם מרית ושקול את FA שנאסף על נייר שקילה מזופת מראש. חומר זה הוא "FA שחולץ" (WEFA).
    2. קבע את יחס האפר (ASHrat) של FA שחולץ כמתואר תחת שלב 6 עבור HA וחשב את יחס האפר באמצעות פורמולה 1.2. קבע את משקל ה- FA שחולץ ללא אפר (WPFA) באמצעות פורמולה 1.3, תוך החלפת ה- WEFA במשקל של WEHA. לבסוף קבע את % FA הטהור במדגם באמצעות פורמולה 1.4 המחליף WPFA עבור WPHA.

11. התחדשות שרף DAX-8

  1. לחדש את שרף DAX-8 על ידי שאיבת 0.1 M HCl (8.33 מ"ל מרוכז HCl / 1000 מ"ל נפח סופי deionized H2O) בקצב זרימה של 35 - 40 מ"ל / דקה דרך החלק התחתון של העמודה עד ה- pH של השפכים שווה ל- pH של המשפיעים. השתמש במשאבה הפריסטלטית כדי לשאוב את כל הריאגנטים דרך עמודת DAX-8 במהלך התחדשות.
  2. שטפו את העמוד במי DI על ידי שאיבתו לראש העמודה עד שה- pH של הקולחים שווה ל- pH של המשפיעים (כלומר, מים DI).

12. התחדשות שרף חילופי H+-cation

  1. לחדש את H + שרף חילופי קטיון בתהליך אצווה על ידי שפיכת השרף לתוך גדולה (למשל, פלסטיק 4 L), לשטוף מספר פעמים על ידי כיסוי השרף עם DI H2O, ערבוב ולאחר מכן לשפוך את המים.
  2. מכסים את השרף עם 1 M HCl (83.3 מ"ל מרוכז HCl / 1000 מ"ל נפח סופי DI מים). תן לעמוד על מינימום של 2 שעות עם ערבוב מדי פעם (למשל, פעם ב 30 דקות).
  3. הסר את החומצה העודפת מן השרף על ידי שפיכת החומצה וכיסוי השרף עם מים DI. מערבבים במרץ עם מוט ערבוב במשך 15 שניות, ואז נותנים לשרף לרדת לתחתית הבקבוק ואז לשפוך את המים. חזור על התהליך עד מוליכות חשמלית של מי השטיפה ≤ 0.7 μS / ס"מ.
  4. טען את השרף המחודש בחזרה לעמודה. מכסים עם H2O deionized כדי לוודא את השרף נשאר רטוב בין שימושים.

Representative Results

נתוני ביצועים עבור השיטה מסופקים בטבלאות 1 – 5. הדיוק של השיטה להפקת HA ו- FAH מדגימות מסחריות נוזליות עם ריכוזים שונים מאוד של HA ו- FHA ניתנים בטבלה 1.

סטיות התקן היחסיות (RSDs) עבור HA היו נמוכות מאלה של HFA, אך ממוצע HFA RSD על פני שלוש דגימות הנוזלים היה על 6.83% מה שמצביע על רמה גבוהה של דיוק. יחס הורביץ (HorRat) הוא פרמטר ביצועים מנורמל המציין את התאמתן של שיטות ניתוח לגבי דיוק המעבדה. כאן הוא שימש לדיוק תוך-מעבדתי. ערך < 0.5 עשוי להצביע על ממוצע לא ידוע או על רמת ניסיון גבוהה עם השיטה. ערכים > 2.0 מצביעים על הטרוגניות של דגימות בדיקה, צורך באופטימיזציה של שיטה או הכשרה מקיפה יותר, הפועלת מתחת למגבלת הזיהוי או שיטה לא תקפה. לניתוח דגימות נוזלים, HorRat היה רק > 2 עבור אחד הניתוחים HFA (טבלה 1).

נתונים מדויקים להפקת HA ו- HFA משלוש דגימות עפרות חומיות ניתנים בטבלה 2. שוב, למעט HFA שחולצו עפרות 2 ו HA מ עפרות 3, כל HorRat של היו מתחת 2. זה מדגים רמה גבוהה של דיוק של שיטה זו לחילוץ של HA ו- HFA עבור דגימות עפרות humic.

יצרנים של ביוסטימולנטים צמחיים לעתים קרובות לנסח מוצרים המכילים HS בנוסף מרכיבים אחרים כמו אצות, דשנים אנאורגניים, גחלים או מולסה. טבלה 3 מספקת את התוצאות של ניתוח של הכללת סוגים אלה של תוספים על הדיוק של השיטה. אף אחד מהתוספים לא השפיע על ההתאוששות של HA או HFA באופן משמעותי (טבלה 3).

טבלה 4 וטבלה 5 מדווחות על ההתאוששות של HA ו- HFA, בהתאמה, מדגימות נוזליות המדמה מוצרים מסחריים עם ריכוזים נמוכים מאוד. ההתאוששות הייתה מצוינת ונעה בין 88% ל -97% עבור HA (טבלה 4) ו 92% ו 104% עבור HFA (טבלה 5). ההתאוששות הממוצעת עבור HA ו- HFA היו 93% ו - 97%, בהתאמה ו- % RSD עבור שני HS היו פחות מ -5%. בעוד הדיוק מצוין, נתונים אלה מצביעים על הצורך לבצע שכפולי מעבדה. מגבלת זיהוי השיטה (MDL) ומגבלת כמות השיטה היו 4.62 ו 1.47 מ"ג / ליטר עבור HA ו 4.8 ו 1.53 מ"ג / ליטר עבור HFA.

חומרים חומיים, %
חומר L16 L17 L2
HFA חה HFA חה HFA חה
נציג 1 1.44 17 6.59 7.76 0.36 4.46
נציג 2 1.39 16.03 6.25 7.79 0.42 4.93
נציג 3 1.34 16.44 6.02 7.55 0.4 4.46
נציג 4 1.54 16.75 6.2 7.69 0.33 4.53
התכוון 1.43 16.56 6.27 7.7 0.38 4.6
SD 0.09 0.42 0 0.11 0.04 0.23
24
RSD, % 6.29 2.53 3.8 1.39 10.4 4.91
הור ראט(ר) 1.58 0.72 1.25 0.47 2.31 1.55
a תנאי החילוץ היו 1 גרם ב 1 L 0.1 M NaOH.

טבלה 1. דיוק השיטה בהפקה וכמות של HA ו- HFA מדגימות מסחריות נוזליות. תנאי החילוץ היו 1 גרם ב 1 L 0.1 M NaOH.

חומרים חומיים, %
עפרות 1 עפרות 2 עפרות 3
חומר HFA חה HFA חה HFA חה
נציג 1 1.75 67.4 1.31 27.01 1.55 8.95
נציג 2 1.69 67.63 1.25 27.48 1.41 7.2
נציג 3 1.63 67.1 1.27 27.34 1.47 8.35
נציג 4 1.77 67.59 1.55 26.89 1.51 7.98
התכוון 1.71 67.53 1.35 27.18 1.49 8.12
SD 0.06 0.94 0.14 0.28 0.06 0.73
RSD, % 3.7 1.39 10.33 1.02 4.02 9.02
HorRat(r) 0.99 0.66 2.71 0.42 1.07 3.09

טבלה 2. דיוק השיטה בהפקה וכמות של HA ו- HFA מעפרות חומיות. תנאי החילוץ היו 1 גרם מדגם ב 1 L 0.1 M NaOH. (נתונים שנלקחו מלמאר ואח', 2014)

לשכפל נואף חה, % FA, % שחזור יחסי HA, % HFA של שחזור יחסי, %
1 ללא 81.61 12.86
2 ללא 80.16 12.78
1 אצות 80.21 12.85
2 אצות 80.72 12.79 99.5 99.6
1 דשן 80.25 12.98
2 דשן 79.57 123.77 98.8 101.6
1 פחם 78.79 12.92
2 פחם 81.27 12.84 98.9 101.8
1 דבשה 79.38 12.99
2 דבשה 81.02 12.72 99.2 100.9
התכוון 80.3 12.85
SD 0.885 0.09
ריכוז סופי של FA + HA של 2.5 גרם / ליטר הוסיף 0.1 M NaOH. (נתונים שנלקחו מלמאר ואח', 2015)

טבלה 3. השפעת נואפים על כמות של HA ו- HFA מגסקוין לאונרדיט. (נתונים שנלקחו מלמאר ואח', 2015)

חה
מזהה לדוגמה מופק, מ"ג התאושש, מ"ג שוחזר, %
1 24.6 23.7 96.3
2 22.6 19.9 88.1
3 25.2 23.6 93.7
4 22.5 21.5 95.6
5 23.9 21.8 91.2
6 23.2 20.8 89.7
7 24 23.2 96.7
התכוון 23.7 22.1 93
SD 1.01 1.52 3.43
RSD, % 4.35 6.88 3.67
(נתונים שנלקחו מלמאר ואח', 2014)

שולחן 4. התאוששות של HA מכדורים ריקים ממוסמרים. (נתונים שנלקחו מלמאר ואח', 2014)

FA
מזהה לדוגמה מופק, מ"ג התאושש, מ"ג שוחזר, %
1 19.9 19 95.48
2 23.1 22.9 99.13
3 20.7 19.4 93.72
4 20.5 19.8 96.39
5 20.8 21.6 103.85
6 21.9 20.1 91.78
7 22.7 22.3 98.24
התכוון 21.37 20.73 96.94
SD 1.21 1.53 3.95
RSD, % 5.64 7.36 4.07
(נתונים שנלקחו מלמאר ואח', 2014)

שולחן 5. התאוששות של HFA מריק ממוסמר. (נתונים שנלקחו מלמאר ואח', 2014)

Discussion

השלבים הראשונים של חילוץ ובידוד של HA בשיטה זו הם פשוטים יחסית. מכיוון שבידוד ה- HFA כרוך בכרומטוגרפיה של עמודות, השגת תוצאות חוזרות מגיעה עם הקפדה קפדנית על הפרטים של כל צעד ותרגול. בפרט, הכנה נכונה של שרפים היא בעלת חשיבות עליונה. חשוב מאוד כי שרף DAX-8 polymethylmethacrylate מוכן ונארז כראוי. אריזה נכונה של השרף משפיעה הן על התשואה והן על האיכות של HFA. אם קיים תקשור, אז לא טיפול מקדים (כלומר החמצה) או ספיחה של HFA יהיה שלם, ואת ההפרדה תוביל לתוצאות לא מדויקות. אם ערוצים או רווחים בשרף נצפים לפני טעינת הדגימה יש להסיר את העמודה ולנער אותה כדי להפיץ מחדש את חרוזי השרף, על ידי מתן אפשרות להם להתיישב ללא ערוצים, ולאחר מכן ארוז מחדש על ידי שאיבת DI H2O נקי דרך השרף. בנוסף, כפי שצוין בפרוטוקול, שמירה על נפח נוזל מעל השרף בעת טעינת ה- FF על השרף, תאפשר ל- FF לערבב לפני הכניסה לשרף ולגרום לספיחה יעילה יותר. עבור שרף H +-exchange החזק (טבלת חומרים), התחדשות מלאה לא ניתן למהר. חילופי Na +/H+ לוקח זמן ולכן זה נעשה בצורה הטובה ביותר בטיפול בתפזורת, כך השרף יכול להיות מעורבב תוך כדי חומצה מחדש. ערבוב השרף תוך כדי שטיפה עם DI H2O מסייע בהסרת ה-HCl העודף. כאשר עולים את השרף חומצי כדי להסיר חומצה עודפת, ערבוב השרף לעזור להסיר את HCl. חשוב מאוד להסיר את החומצה עד לנקודה שבה מוליכות חשמלית של ≤ 0.7 μS / ס"מ הוא הגיע. אם לא, HCl יועבר עם HFA.

לבסוף, כאשר desorbing HFA מן שרף DAX-8, פעם הספיגה של המשפיע שווה את הספיגה של השפכים, זה מנהג טוב לתת את הטור לשבת במשך כמה שעות כדי לראות אם כל HFA נוסף ישוחרר. אם כן, זה ייראה כמו הצהבה של הנוזל מעל השרף. במקרה כזה, ניתן להסיר את ה-HFA הנוסף על ידי ירידה מתמשכת עד שספיגות משפיעות/שפכים יהיו שוות שוב.

אחד החסרונות של בידוד HFA הוא כי התהליך כולו הוא זמן רב. הירידה המלאה של HFA מן שרף DAX-8 והסרה מלאה מן שרף H + -exchange שניהם לגרום נפח משמעותי של HFA כי יש להפחית על ידי אידוי סיבובי. זה בהחלט צוואר בקבוק בניתוח. במאמץ להפחית את הזמן הזה, desorbing HFA מן שרף DAX-8 באמצעות אצטון ולא 0.1 M NaOH הוצע14. המחברים טענו כי באמצעות 50% אצטון כמו desorbent במקום NaOH, תוצאה דומה HFA הושגה ואת DAX-8 היה מחדש כראוי ולכן צעד H +-exchange ניתן לבטל. שינוי זה הביא לזמן ניתוח מופחת מאוד כתוצאה מירידה בנפח המיוצר ואידוי סיבובי מהיר יותר של אצטון בהשוואה למים. שינוי זה ראוי למחקר נוסף.

שיטה זו מוגבלת לניתוח של חומר אורגני שעבר את תהליך ההאמרה, ובמקרה של כבול וגחלים רכות, תהליכים נוספים של כבול וגם כבול ופחם, בהתאמה. ההאמרה היא התהליך שבו מת, בעיקר חומר צמחי, נרקב על ידי רצף של חיידקים הצורכים ומשנים מצעים סרבנים יותר ויותר. תהליכים Abiotic גם להשתתף בפירוק ותגובות סינתזה מחדש. ההאמרה גורמת בסופו של דבר לייצור חומרים סרבנים יחסית הכוללים תערובות הטרוגניות של אלפי מולקולות היוצרות מגוון של משקל מולקולרי ותכולת פחמן, חמצן ומימן היוצרים HS. HS משתנים עוד יותר על ידי כבול ופחם. לכן, שיטה זו אינה מתאימה לחומרים צמחיים ששונו על ידי תהליכים כימיים. לדוגמה, ליגנוסולפונט נמצא בשימוש נרחב כנואף HFA. ליגנוסולפונט הוא תוצר לוואי של תהליך ריסוק הגופרית. לכן, חומר זה לא הופק על ידי תהליך של humification. בנוסף, ישנם חומרים רבים שנקשרים לשרף DAX-8. לדוגמה, שרף DAX-8 שימש להסרת חומרי הדברה ספיחה מפתרון15. ברור, חומרי הדברה אינם HS. לפיכך, כריכת חומר לשרף DAX-8 אינה מצדיקה טענה כי מדובר ב- HFA. התנאים המוקדמים הם גם ייצור על ידי humification ו מחייב DAX-8 שרף.

ככל שנלמד יותר על תרומתם של הרכיבים השונים של HS ביישומים שונים, זה עשוי להיות יתרון כדי להפריד עוד יותר HS ובכך לשנות את השיטה בהתאם. כפי שהוא קיים, השיטה אינה מכמתת את HYFA. עם זאת, שבר זה עשוי להיות גם פעילות למשל ביוטימולציה של צמחים, שבו FF כולו מוחל בדרך כלל בטיפולים חקלאיים ולא HFA מטוהר.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

Acknowledgments

המחברים רוצים להודות לאיגוד הסחר במוצרי Humic (HPTA) על תמיכתם במימון העבודה שהביאה לתקנון של השיטות המתוארות במאמר זה וגם לורנס מייהו וד"ר דן אולק ופול בלום לתמיכה טכנית במהלך עבודת התקינה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amberlite IR 120 H+-exchange resin Sigma-Aldrich 10322 H+ form
Analytical Balance Ohaus PA214 w/ glass draft shield
Centrifuge Beckman Coulter Allegra X-14 minimum 4300 rpm
Centrifuge tubes Beckman Coulter To fit rotor selected
Ceramic Combustion Crucibles Sigma Z247103
Chromatography column for DAX-8 Diba Omnifit 006EZ-50-25-FF
Chromatography column for IR 120 Chemglass CG-1187-21 2 in. by 24 in.
Dessicator Capitol Scientic Kimax 21200-250 Vacuum type
Drying Oven Fisher Scientific Isotemp Precision±3?C
Electrical conductivity meter HM Digital EC-3
Erlenmeyer Flasks Amazon 1L, 2L
HCl concentrated Sigma-Aldrich 320331
Magnetic Stir Plate Barnstead-Thermolyne Dataplate 721
Magnetic Stir bars These can be obtained at many outlets
Muffle Furnace Fisher scientific Thermolyne Type 47900
NaOH Sigma-Aldrich 795429
Nitrogen gas Praxair UNI1066 99.99% purity
Peristaltic pump Cole Parmer Masterflex 7518-00
Perstaltic tubing Cole Parmer Masterflex Pharmed 06508-17
pH meter Oakton Instruments WD-35618--03
Rotary Evaporator Buchi R-210/R-215
Spectrophotometer Healthcare SCiences Ultrospec II Dual beam 200 to 900 nm with wavelength accuracy of ±1 nm and reproducibility of ±0.5 nm.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DiDonato, N., Chen, H., Waggoner, D., Hatcher, P. G. Potential origin and formation for molecular components of humic acids in soils. Geochimica et Cosmochimica Acta. 178, 210-222 (2016).
  2. Waggoner, D. C., Chen, H., Willoughby, A. S., Hatcher, P. G. Formation of black carbon-like and alicyclic aliphatic compounds by hydroxyl radical initiated degradation of lignin. Organic Geochemistry. 82, 69-76 (2015).
  3. Baldock, J. A., Skjemstad, J. O. Role of the soil matrix and minerals in protecting natural organic materials against biological attack. Organic Geochemistry. 31 (7-8), 697-710 (2015).
  4. Kallenbach, C. M., Frey, S. D., Grandy, A. S. Direct evidence for microbial-derived soil organic matter formation and its ecophysiological controls. Nature Communications. 7, 13630 (2016).
  5. Schaeffer, A., Nannipieri, P., Kastner, M., Schmidt, B., Botterweck, J. From humic substances to soil organic matter-microbial contributions. In honour of Konrad Haider and James P. Martin for their outstanding research contributionns to soil science. Journal of Soils Sediments. 15 (9), 1865-1881 (2015).
  6. Stevenson, F. J. Humus Chemistry: Genesis, Composition, Reactions. 2e. , Wiley. (1994).
  7. Weber, J., Chen, Y., Jamroz, E., Miano, T. Preface: humic substances in the environment. Journal of Soils and Sediments. 18, 2665-2667 (2018).
  8. Schnitzer, M. Organic matter characterization. Methods of soil analysis, part 2: Chemical and microbiological properties. Page, A. L., Miller, R. H., Keeny, D. R. , American Society of Agronomy. Madison, Wisc. 581-594 (1982).
  9. Mehlich, A. Photometric determination of humic matter in soils: A proposed method. Communications in Soil Science and Plant Analysis. 15 (12), 1417-1422 (1984).
  10. Lamar, R. T., Talbot, K. H. Critical comparison of humid acid test methods. Communications in Soil Science and Plant Analysis. 50 (15-16), 2309-2322 (2009).
  11. Swift, R. S. Organic matter characterization. Methods of soil analysis, part 3: Chemical methods. Sparks, D. L. , Soil Science Society of America. Madison, WI. 1011-1069 (1996).
  12. Lamar, R. T., Olk, D. C., Mayhew, L., Bloom, P. R. A new standardized method for quantitation of humic and fulvic acids in humic ores and commercial products. Journal of the AOAC International. 97 (3), 722-731 (2014).
  13. International Organization of Standards. Fertilizers and soil conditioners-Determination of humic and hydrophobic fulvic acids concentrations in fertilizer materials. International Organization of Standards. , ISO/DIS 19822 (1982).
  14. Liam, L. E., Serben, T., Cano, M. Gravimetric quantification of hydrophobic filmic acids in lignite material using acetone. Journal of the AOAC International. 102 (6), 1901-1907 (2019).
  15. House, W. A., Zhmud, B. V., Orr, D. R., Lloyd, G. K., Irons, G. P. Transportation of pesticides by colloids. Final Report. Institute of Freshwater Ecology. National Environment Research Council. , IFE Report No. RL/T11059N1/6 (1998).

Tags

ביוכימיה גיליון 181 חומרים חומיים חומצות חומיות חומצות פולוויות שיטת כימות בסיס ללא אפר שיטה כבידתית
כימות של חומצות חומיות ופולביות בחצבי Humate, DOC, חומרים מהומרים ומוצרים מסחריים המכילים חומרים חומיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lamar, R. T., Monda, H.… More

Lamar, R. T., Monda, H. Quantification of Humic and Fulvic Acids in Humate Ores, DOC, Humified Materials and Humic Substance-Containing Commercial Products. J. Vis. Exp. (181), e61233, doi:10.3791/61233 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter