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Biochemistry

ह्यूमेट अयस्कों, डीओसी, ह्यूमिफाइड सामग्री और ह्यूमिक पदार्थ युक्त वाणिज्यिक उत्पादों में ह्यूमिक और फुल्विक एसिड का परिमाणीकरण

Published: March 18, 2022 doi: 10.3791/61233
Automatic Translation
1, 1
1Bio Huma Netics, Inc.

Summary

यह विधि नरम कोयले (यानी, ऑक्सीकरण और गैर-ऑक्सीकृत लिग्नाइट और उप-बिटुमिनस कोयला), ह्यूमेट अयस्कों और शेल्स, पीट, कम्पोस्ट और वाणिज्यिक उर्वरकों और मिट्टी संशोधनों से शुष्क और तरल पदार्थों में राख-मुक्त आधार पर ह्यूमिक पदार्थों (जैसे, ह्यूमिक और फुल्विक एसिड) का एक गुरुत्वाकर्षण परिमाणीकरण प्रदान करती है।

Abstract

इस विधि का उद्देश्य नरम कोयले, ह्यूमिक अयस्कों और शेल्स, पीट, कम्पोस्ट और ह्यूमिक पदार्थ युक्त वाणिज्यिक उत्पादों में ह्यूमिक (एचए) और / या फुल्विक एसिड (एफए) की एक सटीक और सटीक एकाग्रता प्रदान करना है। विधि परीक्षण सामग्री के क्षारीय निष्कर्षण पर आधारित है, एक निकालने के रूप में 0.1 एन NaOH का उपयोग कर, और centrifugation द्वारा nonsoluble उत्पादों से क्षारीय घुलनशील humic पदार्थों (HS) के अलगाव। सेंट्रीफ्यूज्ड क्षारीय अर्क के पीएच को तब कंक के साथ पीएच 1 में समायोजित किया जाता है। एचसीएल, जिसके परिणामस्वरूप एचए की वर्षा होती है। अवक्षेपित एचए को फुल्विक अंश (एफएफ) (एचएस का अंश जो समाधान में रहता है,) से सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा अलग किया जाता है। एचए तब ओवन या फ्रीज सूखा है और सूखे एचए की राख सामग्री निर्धारित की जाती है। शुद्ध (यानी, राख-मुक्त) एचए के वजन को तब नमूने के वजन से विभाजित किया जाता है और परिणामस्वरूप अंश को नमूने में % एचए निर्धारित करने के लिए 100 से गुणा किया जाता है। एफए सामग्री को निर्धारित करने के लिए, एफएफ को हाइड्रोफोबिक डीएएक्स -8 राल पर लोड किया जाता है, जो एफए अंश को हाइड्रोफोबिक फुलविक एसिड (एचएफए) के रूप में भी संदर्भित करता है। शेष गैर-फुल्विक एसिड अंश, जिसे हाइड्रोफिलिक फुल्विक अंश (HyFF) भी कहा जाता है, को तब विआयनीकृत H2O के साथ राल को धोकर हटा दिया जाता है जब तक कि सभी गैर-अवशोषित सामग्री को पूरी तरह से हटा नहीं दिया जाता है। FA तो 0.1 N NaOH के साथ desorbed है. परिणामस्वरूप Na-fulvate तो एक मजबूत एच + विनिमय राल पर पारित करके protonated है. परिणामी एफए ओवन या फ्रीज सूखे, राख सामग्री निर्धारित और नमूने में एकाग्रता के रूप में एचए के लिए ऊपर वर्णित गणना की है.

Introduction

ह्यूमिक पदार्थ (एचएस) गतिशील अवशेष हैं जो माइक्रोबियल अपघटन और मृत पौधे के ऊतकों के परिवर्तन के परिणामस्वरूप होते हैं1,2,3 माइक्रोबियल उप-उत्पादों और बायोमास 3,4,5 के साथ संवर्धित एक प्रक्रिया के माध्यम से जिसे ह्यूमिफिकेशन 6 कहा जाता है। एचएस मिट्टी, प्राकृतिक पानी, झील के तलछट, पीट, नरम कोयले और ह्यूमिक शेल में मौजूद हैं और पृथ्वी पर कुल कार्बनिक कार्बन का अनुमानित 25% का प्रतिनिधित्व करते हैं। ये पदार्थ हजारों अद्वितीय अणुओं के जटिल मिश्रण हैं जो दृढ़ता से बुनियादी और एसिड जलीय समाधानों में उनकी विभिन्न घुलनशीलताओं के आधार पर तीन मुख्य अंशों में विभाजित होते हैं। ये अंश ह्यूमिक एसिड (एचए) हैं, जिसमें क्षार-घुलनशील लेकिन एसिड-अघुलनशील अंश शामिल हैं; फुलविक एसिड (एफए), क्षार और एसिड दोनों में घुलनशील अंश; और ह्यूमिन अंश, जो सभी पीएच मानों पर अघुलनशील है6,8. फुलविक अंश (एफएफ) को हाइड्रोफोबिक एफए (एचएफए) और हाइड्रोफिलिक (एचआईएफए) अंशों में विभाजित किया गया है। इन अंशों को एफएफ के हिस्से के रूप में परिभाषित किया गया है जो हाइड्रोफोबिक डीएएक्स -8 राल (एचएफए) और उस हिस्से को बांधता है जो राल (एचएफए) से नहीं बांधता है।

एचएस का उपयोग कृषि में तेजी से किया जा रहा है, जहां वे व्यापक रूप से फसल बायोस्टिमुलेंट्स के रूप में उपयोग किए जाते हैं, पशुपालन में, विशेष रूप से पशुधन फ़ीड एडिटिव के रूप में, ड्रिलिंग मड में खनन में, और इलेक्ट्रॉन शटल के रूप में पर्यावरणीय उपचार। मानव चिकित्सा अनुप्रयोगों में एचएस के उपयोग में अनुसंधान भी बढ़ रहा है।

एचए और एफए की मात्रा के लिए कई तरीके मौजूद हैं। हालांकि, इनमें से अधिकांश तरीके न तो सटीक हैं और न ही सटीक हैं। उदाहरण के लिए, संयुक्त राज्य अमेरिका में एचए के निर्धारण के लिए दो सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले तरीके colorimetric method9 और California Department of Food and Agriculture (CDFA) विधि हैं, जिनमें से दोनों को अयस्क की एक श्रृंखला में एचए की मात्रा को अधिक महत्व देने और पश्चिमी अमेरिका और कनाडा 10 से स्रोतों को निकालने के लिए दिखाया गया था। colorimetric या spectrophotometric विधि गलत है क्योंकि यह क्षारीय अर्क के अवशोषण पर निर्भर करता है जिसमें एचए, एफए और अन्य क्रोमोफोर के अलावा शामिल हैं, जो सभी तरंग दैर्ध्य पर अवशोषित करते हैं और मानक परीक्षण की जा रही सामग्रियों का प्रतिनिधि नहीं है। CDFA विधि सटीक नहीं है क्योंकि यह राख-मुक्त आधार पर एचए सांद्रता प्रदान नहीं करती है। क्योंकि विभिन्न अयस्कों में राख की अलग-अलग मात्रा होती है, जिनमें से कुछ निष्कर्षण के साथ ले जाया जाता है और निष्कर्षण प्रक्रिया स्वयं राख जोड़ती है, यह विधि एचए सांद्रता 10 के लिए एक सटीक मूल्य प्रदान नहीं करती है। एक सटीक और सटीक विधि की आवश्यकता के जवाब में, एक विस्तृत by11 पर आधारित एक मानकीकृत ग्रेविमेट्रिक प्रक्रिया को 2014 में प्रकाशित किया गया था ताकि राख मुक्त आधार पर एचए और एफए दोनों की मात्रा को संबोधित किया जा सके। इस विधि को तब मामूली संशोधनों के साथ अनुकूलित किया गया था, 2018 में उर्वरकों और मिट्टी कंडीशनर के तहत मानकीकरण के लिए अंतर्राष्ट्रीय संगठन (आईएसओ) द्वारा "उर्वरक सामग्री में ह्यूमिक और हाइड्रोफोबिक फुलविक एसिड सांद्रता का निर्धारण" के रूप में।

यह पेपर ह्यूमिक और हाइड्रोफोबिक फुल्विक एसिड के निष्कर्षण और मात्रा के लिए प्रोटोकॉल की रूपरेखा तैयार करता है और विधि से उत्पादित डेटा की सटीकता और सटीकता पर विवरण देता है।

Protocol

1. ठोस नमूना तैयारी

  1. एक मोर्टार और पेस्टल का उपयोग करके विश्लेषण किए जाने वाले नमूने के लगभग 5 ग्राम को क्रश करें, ताकि कुचल नमूने का 100% अमेरिकी मानक छलनी जाल आकार नंबर 200 (यानी, 74 μm) के माध्यम से गुजरता है, यह सुनिश्चित करने के लिए कि पाउडर अच्छी तरह से मिश्रित है।
  2. gravimetrically पाउडर की नमी सामग्री निर्धारित करें।
    1. एक एल्यूमीनियम वजन नाव वजन और बड़े पैमाने पर रिकॉर्ड (Wwb).
    2. वजन नाव में नमूना पाउडर के लगभग 2 ग्राम हस्तांतरण और द्रव्यमान रिकॉर्ड (Wws + wb).
    3. वजन नाव को 102 डिग्री सेल्सियस (102 डिग्री सेल्सियस से अधिक न करें) पर 24 घंटे के लिए सुखाने वाले ओवन में रखें। 24 घंटे के बाद, ओवन को सुखाने से वजन नाव को हटा दें और कम से कम 1 घंटे के लिए ठंडा करने के लिए एक डेसिकेटर में रखें।
    4. वजन और वजन नाव और सूखे नमूना पाउडर (Wds + wb) के द्रव्यमान रिकॉर्ड.
    5. सूत्र 1.1 का उपयोग करके नमी की मात्रा निर्धारित करें।
      फार्मूला 1.1 ठोस नमूना पाउडर की नमी सामग्री
      % नमी = (((Wws+wb- Wwb) – (Wds+wb - Wwb))/(Wws+wb - Wwb)) * 100

2. निष्कर्षण प्रक्रिया

  1. ठोस नमूने
    1. एक प्लास्टिक या एल्यूमीनियम वजन नाव में छलनी नमूना पाउडर (Wsamp) के लगभग 2.5 ग्राम वजन और चार दशमलव स्थानों के लिए वजन रिकॉर्ड.
    2. एक 1 एल स्नातक सिलेंडर में नमूना लोड करें और सिलेंडर को 0.1 M NaOH (4 g NaOH x L-1) के साथ 1 L तक भरें।
    3. एक चुंबकीय हलचल पट्टी जोड़ें (उदाहरण के लिए, लंबाई में 5 - 7 सेमी) और एक हलचल प्लेट पर तेजी से हलचल (यानी, 300 - 400 आरपीएम) जब तक कि नमूना पूरी तरह से मिश्रित न हो जाए।
    4. स्नातक सिलेंडर की पूरी सामग्री को 1 एल एर्लेनमेयर फ्लास्क में स्थानांतरित करें, एन 2 गैस के साथ फ्लास्क के हेडस्पेस को खाली करें और एक एयरटाइट कवर के साथ फ्लास्क खोलने को कवर करें।
    5. एक हलचल प्लेट पर Erlenmeyer फ्लास्क जगह और 16 - 18 ज के लिए 300 - 400 rpm पर मिश्रण.
  2. तरल नमूने
    1. तरल पदार्थों के लिए, यह सुनिश्चित करने के लिए कि परीक्षण तरल सजातीय रूप से मिश्रित है, हिलाकर नमूने को अच्छी तरह से मिलाएं। सुनिश्चित करें कि कंटेनर के नीचे गिरने वाले किसी भी अवशेष को अच्छी तरह से मिश्रित किया गया है।
    2. परीक्षण तरल के लगभग 5 ग्राम जोड़ें, 4 दशमलव स्थानों (WTL) के लिए वजन, एक 1 एल स्नातक सिलेंडर के लिए।
    3. 0.1 M NaOH के साथ स्नातक सिलेंडर को 1 L की अंतिम मात्रा में भरें।
    4. एक चुंबकीय हलचल बार जोड़ें (उदाहरण के लिए, लंबाई में 5 - 7 सेमी) और परीक्षण नमूना पूरी तरह से मिश्रित होने तक एक हलचल प्लेट पर तेजी से हलचल (उदाहरण के लिए, 300 - 400 आरपीएम)।
    5. मिश्रण को 1 एल एर्लेनमेयर फ्लास्क में स्थानांतरित करें, एन 2 गैस के साथ हेडस्पेस को खाली करें और एक एयरटाइट कवर के साथ फ्लास्क खोलने को कवर करें।
    6. एक हलचल प्लेट पर Erlenmeyer फ्लास्क जगह और 1 ज के लिए 300 - 400 rpm पर मिश्रण.
      नोट:: इस बिंदु के बाद, ठोस और तरल नमूनों की हैंडलिंग समान है।

3. क्षारीय अर्क से nonsoluble सामग्री के हटाने

  1. सरगर्मी के पूरा होने पर, हलचल प्लेट से फ्लास्क को हटा दें, मिश्रण को उपयुक्त सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें और 30 मिनट के लिए 4,921 x g पर पूरी मात्रा को सेंट्रीफ्यूज करें।
  2. एक चुंबकीय हलचल पट्टी युक्त एक साफ 1 एल Erlenmeyer फ्लास्क में एचए और एफए युक्त alkaline supernatant ले लीजिए. अघुलनशील सामग्री को छोड़ दें। कांच ऊन या गुणात्मक 2.5 μm ताकना आकार फिल्टर कागज के माध्यम से निस्पंदन की सिफारिश की है यदि अवशिष्ट कण centrifugation के बाद अवक्षेपित नहीं कर रहे हैं.

4. वर्षा और एफएफ से एचए का पृथक्करण

  1. एक हलचल प्लेट पर 300 - 400 आरपीएम पर क्षारीय अर्क को हिलाते समय, समाधान के मध्य भाग (लंबवत) में एक पीएच जांच डालें और क्षारीय अर्क में कॉन्क HCl ड्रॉपवाइज जोड़ें जब तक कि पीएच 1.0 ± 0.1 का एक स्थिर पीएच तक नहीं पहुंच जाता है।
  2. एक बार जब पीएच 1 का पीएच पहुंच जाता है और स्थिर रहता है, तो फ्लास्क से पीएच जांच को हटा दें, हलचल बार को पुनः प्राप्त करें, फ्लास्क को एयरटाइट कवर के साथ कवर करें और फ्लास्क को तब तक बैठने दें जब तक कि अवक्षेपित एचए फ्लास्क के नीचे नहीं बस जाता है।
    नोट: समय यह अवक्षेपित करने के लिए एक HA लेता है और समाधान से बाहर ड्रॉप करने के लिए स्रोत और नमूने में HA की मात्रा के आधार पर भिन्न होगा। यह आमतौर पर एचए को पूरी तरह से अवक्षेपित करने और समाधान से बाहर निकलने के लिए 1 -6 घंटे लेता है।
  3. 1 घंटे के लिए 4921 x g पर निकालने और अवक्षेपित HA सेंट्रीफ्यूज करें। centrifugation के बाद, एक साफ 1 एल Erlenmeyer में supernatant एफएफ बंद डालो और एक एयरटाइट कवर के साथ कवर.
    नोट: एक लंबे समय तक सेंट्रीफ्यूज समय के क्रम में आवश्यक हो सकता है के लिए HA को मजबूती से नीचे पैक करने के लिए पर्याप्त रूप से अवक्षेपित HA में से किसी को भी शामिल किए बिना FF decanting की अनुमति देने के लिए.
  4. सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को 24 घंटे के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर आयोजित एक सुखाने वाले ओवन में रखें।
  5. सूखने के बाद, सूखने वाले ओवन से ट्यूबों को हटा दें और कमरे के तापमान पर ठंडा करने के लिए एक डेसिकेटर में रखें। ठंडा करने के बाद, मात्रात्मक रूप से ट्यूब से अवशेषों को एक स्पैटुला के साथ ट्यूब के किनारों और नीचे से स्क्रैप करके स्थानांतरित करें, एक टार्ड वजन नाव में स्थानांतरित करें, और द्रव्यमान (डब्ल्यूईएचए) रिकॉर्ड करें। यह अवशेष "निकाले गए एचए" है।
    नोट: यदि 50 मिलीलीटर से अधिक सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों का उपयोग एचए और एफएफ के पृथक्करण में किया गया है, तो सुखाने की प्रक्रिया के लिए तापमान प्रतिरोधी 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में अवक्षेपित एचए को स्थानांतरित करना सुविधाजनक है। इसके अलावा, यदि एक फ्रीज ड्रायर उपलब्ध है, तो अवक्षेपित एचए को फ्रीज किया जा सकता है। फ्रीज-सूखे राज्य में एचए का संग्रह आसान है क्योंकि एचए प्लास्टिक ट्यूबों के पक्ष में नहीं रहता है और इसे स्क्रैप करने की आवश्यकता नहीं है।

5. राख सामग्री का निर्धारण

नोट:: सूखे एचए और एफए नमूनों की राख सामग्री के निर्धारण के लिए प्रक्रिया समान है। HA के लिए संकेतन का उपयोग करने वाली प्रक्रिया दिखाई गई है।

  1. सूखे एचए (डब्ल्यूएचए) के लगभग 30 मिलीग्राम को एक साफ, पूर्व-वजन वाले सिरेमिक डिश (डब्ल्यूसीडी) में स्थानांतरित करें जिसे पहले 100 डिग्री सेल्सियस पर एक सुखाने वाले ओवन में सुखाया गया था और फिर कमरे के तापमान पर एक डेसिकेटर में ठंडा किया गया था। भारित एचए और डिश (डब्ल्यूएचए + सीडी) के संयुक्त द्रव्यमान को रिकॉर्ड करने के बाद, एचए को 600 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए मफल ओवन में दहन करें।
    नोट:: प्रत्येक HA नमूने के लिए, तीन प्रतिकृति संसाधित किया जाना चाहिए और शुद्ध HA की गणना में उपयोग की जाने वाली औसत राख सामग्री।
  2. 2 घंटे के बाद, मफल ओवन से पकवान और सामग्री को हटा दें और ठंडा करने के लिए एक डेसिकेटर में रखें। एक बार ठंडा होने के बाद, पकवान को राख (WASH + CD) के साथ तौलें और सूत्र 1.2 का उपयोग करके राख अनुपात (Ashrat) की गणना करें:
    सूत्र 1.2 Ashrat = (WASH+ CD - WCD) / (WHA + CD - WCD)

6. शुद्ध निकाले गए HA के प्रतिशत का निर्धारण

  1. सूत्र 1.3 का उपयोग करके राख सामग्री के लिए सही करके शुद्ध HA (WPHA) का अंतिम द्रव्यमान निर्धारित करें:
    सूत्र 1.3 WPHA = WEHA * (1- Ashrat)

7. मूल स्रोत नमूने में शुद्ध एचए की एकाग्रता (%) का निर्धारण

  1. सूत्र 1.4 और 1.5 का उपयोग करके शुद्ध HA की सांद्रता ज्ञात कीजिये:
    सूत्र 1.4: ठोस नमूने में % शुद्ध HA = (WPHA / Wsamp) * 100
    सूत्र 1.5: तरल नमूने में % शुद्ध HA = (WPHA / WTL) * 100

8. एचएफए शुद्धिकरण के लिए कॉलम तैयारी

  1. Polymethylmethacrylate DAX-8 राल के साथ पैक एक कम दबाव क्रोमैटोग्राफी स्तंभ तैयार करें। यदि राल का उपयोग पहले नहीं किया गया है, तो 2 घंटे के लिए मेथनॉल में राल को भिगोएं और फिर विआयनीकृत एच 2 ओ के साथ अच्छी तरह से कुल्ला करें जब तक कि सभी मेथनॉल को हटा नहीं दिया जाता है।
    1. इस समय पानी पर तैरने वाले छोटे राल कणों को हटा दें। यदि राल का उपयोग पहले किया गया है, तो इसे पुन: उत्पन्न करें जैसा कि अनुभाग 10 में वर्णित है।
  2. एक बार अच्छी तरह से कुल्ला करने के बाद, राल को 5 x 25 सेमी ग्लास क्रोमैटोग्राफी कॉलम में डालें जो राल बिस्तर समर्थन के लिए 10 μm फ्रिट के साथ एक अंत टुकड़े के साथ फिट किया गया है। राल बिस्तर में प्रवेश करने से पहले एफएफ के मिश्रण को सक्षम करने के लिए राल मुक्त समाधान के लिए कॉलम के शीर्ष पर 2.5 से 5 सेमी छोड़ दें। स्तंभ के लिए शीर्ष टुकड़ा फिट और एक peristaltic पंप का उपयोग करके DAX-8 राल बिस्तर पैक करने के लिए स्तंभ के शीर्ष के माध्यम से deionized H2O पंप.

9. एचएफए का अलगाव

  1. एक बार राल बिस्तर पैक हो जाने के बाद, कॉलम के शीर्ष के माध्यम से कम दबाव के तहत, एक पेरिस्टाल्टिक पंप का उपयोग करके कॉलम पर एफएफ लोड करें। 35 - 40 mL / मिनट की प्रवाह दर का उपयोग करें। यह महत्वपूर्ण है कि कॉलम में राल का शीर्ष पूरे लोडिंग और रिंसिंग प्रक्रिया के दौरान समाधान के साथ कवर किया जाता है ताकि राल के सूखने और अर्क के चैनलिंग को रोका जा सके, हालांकि राल बिस्तर।
  2. एक बार फुल्विक अंश को राल पर पूरी तरह से लोड कर दिया गया है, तो रेजिन को विआयनीकृत पानी से धोएं, ताकि कम दबाव में पेरिस्टाल्टिक पंप का उपयोग करके कॉलम के शीर्ष के माध्यम से पंप करके गैर-अधिशोषित "हाइड्रोफिलिक फुल्विक अंश" (HyFF) को हटा दिया जा सके। 35 - 40 mL / मिनट की प्रवाह दर का उपयोग करें। HyFF युक्त बहिस्त्राव को तब तक छोड़ दें जब तक कि इसका उपयोग विश्लेषण के लिए नहीं किया जाएगा।
  3. विआयनीकृत H2O के साथ स्तंभ को तब तक धोएं जब तक कि स्तंभ बहिस्त्राव के 350 एनएम पर अवशोषण बराबर न हो (उदाहरण के लिए, 0.015 अवशोषण इकाइयों के भीतर) स्तंभ को धोने के लिए उपयोग किए जाने वाले विआयनीकृत H2O के बराबर न हो। स्पेक्ट्रोफोटोमीटर को शून्य (यानी, रिक्त) के लिए विआयनीकृत पानी का उपयोग करें।
  4. Peristaltic पंप का उपयोग कर स्तंभ के नीचे के माध्यम से 0.1 M NaOH पंप पंप द्वारा वापस क्षालन द्वारा HFA desorb. 35 - 40 mL / मिनट की प्रवाह दर का उपयोग करें। पंप बहिस्त्राव पर कब्जा (एक साफ पर्याप्त आकार के कंटेनर में Na-fulvate (उदाहरण के लिए, 2 एल Erlenmeyer).
    नोट: HFA के अधिकांश DAX-8 राल बिस्तर के बहुत ऊपर adsorbs. Desorption कॉलम के नीचे से 0.1 M NaOH पेश करके पूरी तरह से FA desorb करने के लिए आवश्यक 0.1 M NaOH की मात्रा को कम करता है।
  5. सभी एचएफए को अवशोषित कर दिया गया है जब स्तंभ बहिस्त्राव का अवशोषण 350 एनएम पर 0.1 एम NaOH influent के अवशोषण के बराबर होता है। Spectrophotometric रिक्त के रूप में 0.1 M NaOH का उपयोग करें। सभी एफए पर कब्जा कर लिया गया है यह सुनिश्चित करने के लिए अवशोषित एफए समाधान के अवशोषण की जांच करने के लिए लिया गया बहिस्त्राव जोड़ें।

10. HFA डी-ashing द्वारा प्रोटॉनवाद

  1. Na-fulvate समाधान को पास करें, बार-बार, गुरुत्वाकर्षण फ़ीड द्वारा, मजबूत धनायन H + - विनिमय राल (सामग्री की तालिका) के माध्यम से, जो 5 × 50 सेमी कॉलम में निहित है, जिसमें राल को बनाए रखने के लिए ग्लास फ्रिट के साथ, जब तक कि बहिस्त्राव की विद्युत चालकता <120 μS / सेमी नहीं होती है, जैसा कि विद्युत चालकता मीटर के साथ मापा जाता है। प्रत्येक पास से पहले, एच + एक्सचेंज राल को धारा 11 में वर्णित नवीनीकरण की आवश्यकता होती है।
    1. यह सुनिश्चित करने के लिए कि अंतिम पास के बाद सभी एफए को राल से हटा दिया जाता है, राल को विआयनीकृत पानी से धोएं जब तक कि 350 एनएम पर बहिस्त्राव का अवशोषण समान न हो (उदाहरण के लिए, 0.015 अवशोषण इकाइयों के भीतर) स्तंभ को धोने के लिए उपयोग किए जाने वाले विआयनीकृत पानी के रूप में। स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक रिक्त स्थान के रूप में विआयनीकृत H2O का उपयोग करें। धोने और शुद्ध एफए समाधान के लिए absorbance की जांच करने के लिए लिया किसी भी बहिस्त्राव भागों जोड़ें। सभी एफए को हटाने में मदद करने के लिए, राल को कई बार उत्तेजित किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, एक लंबे ग्लास या प्लास्टिक की छड़ का उपयोग करके)।
  2. 55 डिग्री सेल्सियस पर एक रोटरी बाष्पीकरणकर्ता का उपयोग करके एफए को लगभग 15 ± 2 एमएल की मात्रा में केंद्रित करें।
  3. पूरी तरह से 15 एमएल एफए ध्यान केंद्रित करने के लिए एक 50 मिलीलीटर प्लास्टिक सेंट्रीफ्यूज ट्यूब और एक सुखाने ओवन में लगातार सूखापन के लिए 60±3 डिग्री सेल्सियस पर सूखी स्थानांतरित। फ्रीज-सुखाने ओवन सुखाने के लिए एक विकल्प है। सूखने के बाद ट्यूब को ठंडा करने के लिए एक desiccator को स्थानांतरित करें।
    1. एक स्पैटुला के साथ ट्यूब पक्षों और नीचे स्क्रैप करके ट्यूब से एफए को हटा दें और पूर्व-टार्ड वजन कागज पर एकत्र एफए का वजन करें। यह सामग्री "निकाली गई FA" (WEFA) है।
    2. HA के लिए चरण 6 के तहत वर्णित के रूप में निकाले गए FA का राख अनुपात (ASHrat) निर्धारित करें और सूत्र 1.2 का उपयोग करके राख अनुपात की गणना करें। फार्मूला 1.3 का उपयोग करके राख (WPFA) के बिना निकाले गए FA का वजन निर्धारित करें, WEHA के वजन के लिए WEFA को प्रतिस्थापित करें। अंत में WPHA के लिए WPFA प्रतिस्थापन फॉर्मूला 1.4 का उपयोग करके नमूने में % शुद्ध FA निर्धारित करें।

11. DAX-8 राल पुनर्जनन

  1. 0.1 M HCl (8.33 mL केंद्रित HCl / 1000 mL अंतिम मात्रा deionized H2O) को 35 - 40 mL / मिनट की प्रवाह दर पर स्तंभ के नीचे के माध्यम से पंप करके DAX-8 राल को पुन: उत्पन्न करें जब तक कि बहिस्त्राव का पीएच इनफ्लुएंट के पीएच के बराबर न हो। पुनर्जनन के दौरान DAX-8 स्तंभ के माध्यम से सभी अभिकर्मकों को पंप करने के लिए peristaltic पंप का उपयोग करें।
  2. स्तंभ को स्तंभ के शीर्ष में पंप करके डीआई पानी के साथ कुल्ला करें जब तक कि बहिस्त्राव का पीएच इनफ्लुएंट (यानी, डीआई पानी) के पीएच के बराबर न हो जाए।

12. एच + - धनायन विनिमय राल पुनर्जनन

  1. एक बड़े बीकर (जैसे, 4 एल प्लास्टिक बीकर) में राल डालकर एक बैच प्रक्रिया में एच + धनायन विनिमय राल को पुन: उत्पन्न करें, डीआई एच 2 ओ के साथ राल को कवर करके कई बार कुल्ला करें, मिश्रण करें और फिर पानी डालें।
  2. 1 M HCl (83.3 mL केंद्रित HCl / 1000 mL अंतिम मात्रा DI पानी) के साथ राल को कवर करें। कभी-कभी सरगर्मी के साथ कम से कम 2 घंटे के लिए खड़े होने दें (उदाहरण के लिए, हर 30 मिनट में एक बार)।
  3. एसिड को बंद करके और डीआई पानी के साथ राल को कवर करके राल से अतिरिक्त एसिड को हटा दें। 15 s के लिए एक सरगर्मी रॉड के साथ जोर से हिलाएं, फिर राल को फ्लास्क के नीचे गिरने दें और फिर पानी डालें। प्रक्रिया को तब तक दोहराएं जब तक कि कुल्ला पानी की विद्युत चालकता 0.7 μS / सेमी ≤ न हो जाए।
  4. पुन: उत्पन्न राल को वापस स्तंभ में लोड करें। यह सुनिश्चित करने के लिए विआयनीकृत H2O के साथ कवर करें कि राल उपयोगों के बीच गीला रहता है।

Representative Results

विधि के लिए प्रदर्शन डेटा तालिका 1 – 5 में प्रदान किए गए हैं। एचए और एफएचए की बहुत अलग सांद्रता के साथ तरल वाणिज्यिक नमूनों से एचए और एफएएच के निष्कर्षण के लिए विधि की सटीकता तालिका 1 में दी गई है।

एचए के लिए सापेक्ष मानक विचलन (आरएसडी) एचएफए के लिए उन लोगों की तुलना में कम थे, लेकिन तीन तरल नमूनों पर औसत एचएफए आरएसडी 6.83% पर था जो परिशुद्धता की उच्च डिग्री को इंगित करता है। Horwitz अनुपात (HorRat) एक सामान्यीकृत प्रदर्शन पैरामीटर है जो प्रयोगशाला परिशुद्धता के बीच के बारे में विश्लेषण के तरीकों की उपयुक्तता को इंगित करता है। यहां इसका उपयोग इंट्रा-प्रयोगशाला परिशुद्धता के लिए किया गया था। मान < 0.5 अज्ञात औसत या विधि के साथ अनुभव के एक उच्च स्तर का संकेत हो सकता है। मान > 2.0 परीक्षण नमूनों की विषमता, विधि अनुकूलन या अधिक व्यापक प्रशिक्षण की आवश्यकता का संकेत देते हैं, जो पता लगाने की सीमा या एक अप्रयोज्य विधि से नीचे काम करते हैं। तरल नमूनों के विश्लेषण के लिए, एचएफए विश्लेषणों में से एक के लिए होराट केवल 2 > गया था (तालिका 1)।

तीन ह्यूमिक अयस्क नमूनों से एचए और एचएफए के निष्कर्षण के लिए सटीक डेटा तालिका 2 में दिया गया है। फिर से, अयस्क 2 से निकाले गए एचएफए और अयस्क 3 से एचए के अपवाद के साथ, होरैट के सभी 2 से नीचे थे। यह ह्यूमिक अयस्क के नमूनों के लिए एचए और एचएफए के निष्कर्षण के लिए इस विधि की सटीकता की एक उच्च डिग्री को दर्शाता है।

संयंत्र biostimulants के निर्माता अक्सर ऐसे उत्पादों को तैयार करते हैं जिनमें समुद्री शैवाल, अकार्बनिक उर्वरकों, कोयले या गुड़ जैसे अन्य अवयवों के अलावा एचएस होता है। तालिका 3 विधि की सटीकता पर इन प्रकार के additives के समावेश के विश्लेषण के परिणाम देता है। एडिटिव्स में से किसी ने भी एचए या एचएफए की वसूली को काफी प्रभावित नहीं किया (तालिका 3)।

तालिका 4 और तालिका 5 क्रमशः एचए और एचएफए की वसूली की रिपोर्ट करते हैं, तरल नमूनों से जो बहुत कम सांद्रता वाले वाणिज्यिक उत्पादों का अनुकरण करते हैं। वसूली उत्कृष्ट थी और एचए (तालिका 4) के लिए 88% और 97% और एचएफए (तालिका 5) के लिए 92% और 104% के बीच थी। एचए और एचएफए के लिए औसत वसूली क्रमशः 93% और 97% थी, और दोनों एचएस के लिए % आरएसडी 5% से कम थे। जबकि परिशुद्धता उत्कृष्ट है, ये डेटा प्रयोगशाला प्रतिकृतियों को करने की आवश्यकता का संकेत देते हैं। विधि का पता लगाने की सीमा (एमडीएल) और विधि मात्रा सीमा एचए के लिए 4.62 और 1.47 मिलीग्राम / एल और एचएफए के लिए 4.8 और 1.53 मिलीग्राम / एल थी।

ह्यूमिक पदार्थ, %
भौतिक L16 L17 L2
HFA हा HFA हा HFA हा
प्रतिनिधि 1 1.44 17 6.59 7.76 0.36 4.46
प्रतिनिधि 2 1.39 16.03 6.25 7.79 0.42 4.93
प्रतिनिधि 3 1.34 16.44 6.02 7.55 0.4 4.46
प्रतिनिधि 4 1.54 16.75 6.2 7.69 0.33 4.53
औसत 1.43 16.56 6.27 7.7 0.38 4.6
एसडी 0.09 0.42 0 0.11 0.04 0.23
24
RSD, % 6.29 2.53 3.8 1.39 10.4 4.91
हॉर चूहा (आर) 1.58 0.72 1.25 0.47 2.31 1.55
एक निष्कर्षण की स्थिति 1 एल 0.1 एम NaOH में 1 ग्राम थे।

तालिका 1. निष्कर्षण और तरल वाणिज्यिक नमूनों से एचए और एचएफए की मात्रा में विधि की परिशुद्धता। निष्कर्षण की स्थिति 1 एल 0.1 एम NaOH में 1 ग्राम थे।

ह्यूमिक पदार्थ, %
अयस्क 1 अयस्क 2 अयस्क 3
भौतिक HFA हा HFA हा HFA हा
प्रतिनिधि 1 1.75 67.4 1.31 27.01 1.55 8.95
प्रतिनिधि 2 1.69 67.63 1.25 27.48 1.41 7.2
प्रतिनिधि 3 1.63 67.1 1.27 27.34 1.47 8.35
प्रतिनिधि 4 1.77 67.59 1.55 26.89 1.51 7.98
औसत 1.71 67.53 1.35 27.18 1.49 8.12
एसडी 0.06 0.94 0.14 0.28 0.06 0.73
RSD, % 3.7 1.39 10.33 1.02 4.02 9.02
HorRat(r) 0.99 0.66 2.71 0.42 1.07 3.09

तालिका 2. ह्यूमिक अयस्कों से एचए और एचएफए के निष्कर्षण और मात्रा में विधि की परिशुद्धता। निष्कर्षण की स्थिति 1 L 0.1 M NaOH में 1 g नमूना थे। (लैमर एट अल. 2014 से लिया गया डेटा)

प्रतिकृति मिलावटी HA, % FA, % सापेक्ष वसूली HA, % सापेक्ष वसूली HFA, %
1 कोई नहीं 81.61 12.86
2 कोई नहीं 80.16 12.78
1 समुद्री शैवाल 80.21 12.85
2 समुद्री शैवाल 80.72 12.79 99.5 99.6
1 खाद 80.25 12.98
2 खाद 79.57 123.77 98.8 101.6
1 कोयला 78.79 12.92
2 कोयला 81.27 12.84 98.9 101.8
1 शीरा 79.38 12.99
2 शीरा 81.02 12.72 99.2 100.9
औसत 80.3 12.85
एसडी 0.885 0.09
2.5 g/L के FA + HA की अंतिम सांद्रता को 0.1 M NaOH में जोड़ा गया। (लैमर एट अल. 2015 से लिया गया डेटा)

तालिका 3. एक Gascoyne लियोनार्डाइट से HA और HFA की मात्रा पर मिलावटखोरों का प्रभाव। (लैमर एट अल. 2015 से लिया गया डेटा)

हा
नमूना ID निकाला, मिलीग्राम बरामद, मिलीग्राम पुनर्प्राप्त किया गया, %
1 24.6 23.7 96.3
2 22.6 19.9 88.1
3 25.2 23.6 93.7
4 22.5 21.5 95.6
5 23.9 21.8 91.2
6 23.2 20.8 89.7
7 24 23.2 96.7
औसत 23.7 22.1 93
एसडी 1.01 1.52 3.43
RSD, % 4.35 6.88 3.67
(लैमर एट अल. 2014 से लिया गया डेटा)

तालिका 4. spiked रिक्त स्थान से एचए की वसूली. (लैमर एट अल. 2014 से लिया गया डेटा)

एफए
नमूना ID निकाला, मिलीग्राम बरामद, मिलीग्राम पुनर्प्राप्त किया गया, %
1 19.9 19 95.48
2 23.1 22.9 99.13
3 20.7 19.4 93.72
4 20.5 19.8 96.39
5 20.8 21.6 103.85
6 21.9 20.1 91.78
7 22.7 22.3 98.24
औसत 21.37 20.73 96.94
एसडी 1.21 1.53 3.95
RSD, % 5.64 7.36 4.07
(लैमर एट अल. 2014 से लिया गया डेटा)

तालिका 5. spiked रिक्त स्थान से HFA की वसूली. (लैमर एट अल. 2014 से लिया गया डेटा)

Discussion

इस विधि में एचए के निष्कर्षण और अलगाव के प्रारंभिक चरण अपेक्षाकृत सरल हैं। क्योंकि एचएफए के अलगाव में कॉलम क्रोमैटोग्राफी शामिल है, दोहराए जाने योग्य परिणाम प्राप्त करना प्रत्येक चरण और अभ्यास के विवरण के सख्त पालन के साथ आता है। विशेष रूप से, रेजिन की सही तैयारी प्राथमिक महत्व की है। यह बेहद महत्वपूर्ण है कि polymethylmethacrylate DAX-8 राल तैयार किया जाता है और ठीक से पैक किया जाता है। राल की सही पैकिंग एचएफए की उपज और गुणवत्ता दोनों को प्रभावित करती है। यदि चैनलिंग मौजूद है, तो न तो pretreatment (यानी अम्लीकरण) या HFA का सोखना पूरा हो जाएगा, और अलगाव गलत परिणामों के लिए नेतृत्व करेगा। यदि राल में चैनल या रिक्त स्थान नमूना लोड करने से पहले देखे जाते हैं, तो कॉलम को हटा दिया जाना चाहिए और राल मोतियों को पुनर्वितरित करने के लिए हिलाया जाना चाहिए, उन्हें चैनलों के बिना बसने की अनुमति देकर, और फिर राल के माध्यम से स्वच्छ DI H2O पंप करके फिर से पैक किया जाना चाहिए। इसके अलावा, जैसा कि प्रोटोकॉल में उल्लेख किया गया है, राल पर एफएफ लोड करते समय राल के ऊपर तरल की मात्रा को बनाए रखना, एफएफ को राल में प्रवेश करने से पहले मिश्रण करने की अनुमति देगा और परिणामस्वरूप अधिक प्रभावी सोखना होगा। मजबूत धनायन एच + विनिमय राल (सामग्री की तालिका) के लिए, पूर्ण पुनर्जनन को जल्दी नहीं किया जा सकता है। Na + / H + विनिमय में समय लगता है और इसलिए यह एक थोक उपचार में सबसे अच्छा किया जाता है ताकि राल को फिर से अम्लीकृत होने के दौरान मिश्रित किया जा सके। DI H2O के साथ कुल्ला करते समय राल मिश्रण अतिरिक्त HCl को हटाने में मदद करता है। जब अतिरिक्त एसिड को हटाने के लिए अम्लीकृत राल को बढ़ाते हैं, तो राल को मिलाने से एचसीएल को हटाने में मदद मिलती है। एसिड को उस बिंदु पर निकालना बेहद महत्वपूर्ण है जहां 0.7 μS / सेमी ≤ की विद्युत चालकता तक पहुंच जाती है। यदि नहीं, तो एचसीएल को एचएफए के साथ ले जाया जाएगा।

अंत में, जब DAX-8 राल से HFA desorbing, एक बार influent के absorbance बहिस्त्राव के absorbance के बराबर है, यह एक अच्छा अभ्यास है कि स्तंभ को कुछ घंटों के लिए बैठने के लिए देखने के लिए अगर किसी भी अतिरिक्त HFA जारी किया जाएगा. यदि हां, तो इसे राल के ऊपर तरल के पीलेपन के रूप में देखा जाएगा। यदि ऐसा होता है, तो अतिरिक्त एचएफए को निरंतर desorption द्वारा हटाया जा सकता है जब तक कि influent / बहिस्त्राव absorbances फिर से बराबर न हो।

एचएफए अलगाव के नुकसानों में से एक यह है कि पूरी प्रक्रिया समय लेने वाली है। DAX-8 राल से HFA का पूरा desorption और H + विनिमय राल से पूरी तरह से हटाने दोनों HFA की एक महत्वपूर्ण मात्रा है कि रोटरी वाष्पीकरण द्वारा कम किया जाना है में परिणाम. यह निश्चित रूप से विश्लेषण में एक बाधा है। इस समय को कम करने के प्रयास में, 0.1 M NaOH के बजाय एसीटोन का उपयोग करके DAX-8 राल से HFA को अवशोषित करने का सुझाव दिया गया है। लेखकों ने दावा किया कि NaOH के स्थान पर desorbent के रूप में 50% एसीटोन का उपयोग करके, एक समान HFA परिणाम प्राप्त किया गया था और DAX-8 को पर्याप्त रूप से पुनर्जीवित किया गया था और इस प्रकार H + -विनिमय चरण को समाप्त किया जा सकता है। इस संशोधन के परिणामस्वरूप पानी की तुलना में एसीटोन की मात्रा में कमी और तेज रोटरी वाष्पीकरण के परिणामस्वरूप विश्लेषण समय बहुत कम हो गया। यह संशोधन आगे के अध्ययन के योग्य है।

यह विधि कार्बनिक पदार्थों के विश्लेषण तक सीमित है जो ह्यूमिफिकेशन की प्रक्रिया से गुजरचुकी है, और पीट और नरम कोयले के मामले में, क्रमशः पीटिफिकेशन और दोनों पीटिफिकेशन और कोलिफिकेशन की आगे की प्रक्रियाएं। Humification एक ऐसी प्रक्रिया है जिससे मृत, मुख्य रूप से पौधे की सामग्री, रोगाणुओं के एक अनुक्रम द्वारा विघटित होती है जो तेजी से अड़ियल सब्सट्रेट का उपभोग और संशोधन करती है। अजैविक प्रक्रियाएं अपघटन और पुन: संश्लेषण प्रतिक्रियाओं में भी भाग लेती हैं। Humification अंततः अपेक्षाकृत अड़ियल सामग्री के उत्पादन में परिणाम होता है जिसमें हजारों अणुओं के विषम मिश्रण शामिल होते हैं जो आणविक भार और कार्बन, ऑक्सीजन और हाइड्रोजन सामग्री की एक श्रृंखला बनाते हैं जो एचएस बनाते हैं। एचएस को आगे पीटिफिकेशन और कोलिफिकेशन द्वारा संशोधित किया जाता है। इसलिए, यह विधि पौधों की सामग्री के लिए उपयुक्त नहीं है जिन्हें रासायनिक प्रक्रियाओं द्वारा संशोधित किया गया है। उदाहरण के लिए, लिग्नोसल्फोनेट का व्यापक रूप से एचएफए मिलावटी के रूप में उपयोग किया जाता है। लिग्नोसल्फोनेट सल्फाइट पल्पिंग प्रक्रिया का एक उप-उत्पाद है। इसलिए, यह सामग्री ह्यूमिफिकेशन की प्रक्रिया द्वारा उत्पादित नहीं की गई है। इसके अलावा, कई पदार्थ हैं जो DAX-8 राल से बंधे हैं। उदाहरण के लिए, DAX-8 राल का उपयोग समाधान 15 से कीटनाशकों को adsorb करने के लिए किया गया है। जाहिर है, कीटनाशक एचएस नहीं हैं। इस प्रकार, DAX-8 राल के लिए एक सामग्री का बंधन एक दावे को सही नहीं ठहराता है कि यह एक एचएफए है। पूर्वापेक्षाएं दोनों humification और DAX-8 राल के लिए बाध्यकारी द्वारा उत्पादन कर रहे हैं.

जैसा कि विभिन्न अनुप्रयोगों में एचएस के विभिन्न घटकों के योगदान के बारे में अधिक सीखा जाता है, यह एचएस को और अधिक भिन्न करने के लिए फायदेमंद हो सकता है और इस प्रकार तदनुसार विधि को संशोधित कर सकता है। जैसा कि यह मौजूद है, विधि HYFA को निर्धारित नहीं करती है। हालांकि, इस अंश में गतिविधि भी हो सकती है जैसे कि पौधे के बायोस्टिम्यूलेशन में, जहां पूरे एफएफ को आमतौर पर शुद्ध एचएफए के बजाय कृषि उपचार में लागू किया जाता है।

Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों को Humic उत्पाद व्यापार एसोसिएशन (HPTA) को स्वीकार करने के लिए काम है कि इस पत्र में वर्णित तरीकों के मानकीकरण में जिसके परिणामस्वरूप इस पत्र में वर्णित तरीकों के मानकीकरण में परिणाम और भी लॉरेंस Mayhew और Drs. डैन Olk और पॉल ब्लूम मानकीकरण काम के दौरान तकनीकी सहायता के लिए.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amberlite IR 120 H+-exchange resin Sigma-Aldrich 10322 H+ form
Analytical Balance Ohaus PA214 w/ glass draft shield
Centrifuge Beckman Coulter Allegra X-14 minimum 4300 rpm
Centrifuge tubes Beckman Coulter To fit rotor selected
Ceramic Combustion Crucibles Sigma Z247103
Chromatography column for DAX-8 Diba Omnifit 006EZ-50-25-FF
Chromatography column for IR 120 Chemglass CG-1187-21 2 in. by 24 in.
Dessicator Capitol Scientic Kimax 21200-250 Vacuum type
Drying Oven Fisher Scientific Isotemp Precision±3?C
Electrical conductivity meter HM Digital EC-3
Erlenmeyer Flasks Amazon 1L, 2L
HCl concentrated Sigma-Aldrich 320331
Magnetic Stir Plate Barnstead-Thermolyne Dataplate 721
Magnetic Stir bars These can be obtained at many outlets
Muffle Furnace Fisher scientific Thermolyne Type 47900
NaOH Sigma-Aldrich 795429
Nitrogen gas Praxair UNI1066 99.99% purity
Peristaltic pump Cole Parmer Masterflex 7518-00
Perstaltic tubing Cole Parmer Masterflex Pharmed 06508-17
pH meter Oakton Instruments WD-35618--03
Rotary Evaporator Buchi R-210/R-215
Spectrophotometer Healthcare SCiences Ultrospec II Dual beam 200 to 900 nm with wavelength accuracy of ±1 nm and reproducibility of ±0.5 nm.

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References

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जैव रसायन अंक 181 ह्यूमिक पदार्थ ह्यूमिक एसिड फुल्विक एसिड परिमाणीकरण विधि राख मुक्त आधार गुरुत्वाकर्षण विधि
ह्यूमेट अयस्कों, डीओसी, ह्यूमिफाइड सामग्री और ह्यूमिक पदार्थ युक्त वाणिज्यिक उत्पादों में ह्यूमिक और फुल्विक एसिड का परिमाणीकरण
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Lamar, R. T., Monda, H.… More

Lamar, R. T., Monda, H. Quantification of Humic and Fulvic Acids in Humate Ores, DOC, Humified Materials and Humic Substance-Containing Commercial Products. J. Vis. Exp. (181), e61233, doi:10.3791/61233 (2022).

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