Summary
この方法は、軟質炭(すなわち、酸化および非酸化褐炭および亜瀝青炭)、フミン酸鉱石および頁岩、泥炭、堆肥および商業肥料および土壌改良からの乾燥および液体材料中の腐植物質(例えば、フミン酸およびフルボ酸)の重量定量を提供する。
Abstract
この方法の目的は、軟炭、腐植鉱石および頁岩、泥炭、堆肥および腐植物質含有市販製品中の腐植質(HA)および/またはフルボ酸(FA)の正確かつ正確な濃度を提供することである。この方法は、試験物質のアルカリ抽出に基づいており、抽出剤として0.1N NaOHを使用し、遠心分離によって非可溶性生成物からアルカリ可溶性腐植物物質(HS)を分離した。次いで、遠心分離されたアルカリ性抽出物のpHを、濃度HClでpH1に調整し、これがHAの沈殿をもたらす。沈殿したHAは、遠心分離によりフルボ画分(FF)(溶液中に残存するHSの画分)から分離される。次いで、HAをオーブンまたは凍結乾燥し、乾燥HAの灰分含有量を決定する。次いで、純粋な(すなわち、灰を含まない)HAの重量を、試料および得られた画分の重量で割って100を掛けて、試料中の%HAを決定する。FA含有量を決定するために、FFを疎水性DAX-8樹脂に装填し、疎水性フルボ酸(HFA)とも呼ばれるFA画分を吸着する。残りの非フルボ酸分画は、親水性フルボ画分(HyFF)とも呼ばれ、その後、すべての非吸収材料が完全に除去されるまで、脱イオン化H2Oで樹脂を洗浄することによって除去される。次いで、FAは0.1N NaOHで脱離する。得られたNa-フルベートは、強力なH+交換樹脂の上に通過させることによってプロトン化される。得られたFAをオーブンまたは凍結乾燥し、HAについて上記のようにして測定した灰分および試料中の濃度を算出した。
Introduction
腐植質(HS)は、腐化と呼ばれるプロセスを通じて微生物の副産物およびバイオマス3,4,5で増強された死んだ植物組織の微生物分解および形質転換から生じる動的残留物1,2,3である6。HSは土壌、天然水、湖沼堆積物、泥炭、軟炭、腐植質頁岩に存在し、地球上の全有機炭素の推定25%を占めています7。これらの物質は、強塩基性および酸水溶液中でのそれらの異なる溶解度に基づいて3つの主要な画分に分画される何千ものユニークな分子の複雑な混合物である。これらの画分はフミン酸(HA)であり、アルカリ可溶性であるが酸不溶性画分を含む。フルボ酸(FA)、アルカリおよび酸の両方に可溶な画分;そして、すべてのpH値6、8で不溶性であるフミン画分。フルボ画分(FF)は、疎水性FA(HFA)画分と親水性画分(HyFA)にさらに細分される。これらの画分は、疎水性DAX-8樹脂(HFA)に結合するFFの部分と、樹脂に結合しない部分(HyFA)と定義される。
HSは、作物の生物刺激剤として広く使用されている農業、畜産、特に家畜飼料添加物、掘削泥の採掘、電子シャトルとしての環境修復にますます使用されています。ヒトの医療用途におけるHSの使用に関する研究も増加しています。
HAおよびFAの定量には多くの方法が存在する。ただし、これらの方法のほとんどは正確でも正確でもありません。例えば、米国でHAの測定に最も広く使用されている2つの方法は、比色法9 とカリフォルニア州食品農業省(CDFA)法であり、どちらも米国西部とカナダからの鉱石および抽出物源の範囲におけるHAの量を過大評価することが示された10。比色法または分光光度法は、HA、FA、および使用される波長ですべて吸収する他の発色団に加えて、アルカリ抽出物の吸光度に依存しており、標準物質は試験される材料を代表していないため、不正確です10。CDFA法は、灰を含まないベースでHA濃度を提供しないため、正確ではありません。異なる鉱石は異なる量の灰を有し、その一部は抽出と共に運ばれ、抽出プロセス自体が灰を追加するので、この方法はHA濃度の正確な値を提供しない10。正確で正確な方法の必要性に応えて、HAとFAの両方の定量を灰のない基準で扱うために、2014年に11 によって詳述されたものに基づく標準化された重量測定手順が公開されました12。この方法は、その後、2018年に国際標準化機構(ISO)によって「肥料および土壌改良剤」の下で「肥料材料中の腐植質および疎水性フルボ酸濃度の測定」13として、若干の変更を加えて適応されました。
この論文では、フミン酸および疎水性フルボ酸の抽出および定量のためのプロトコルを概説し、この方法から生成されるデータの精度および精度について詳細に説明する。
Protocol
1. 固形試料調製
- 乳鉢および乳棒を用いて、分析される試料の約5gを破砕し、破砕試料の100%が目開きサイズ200号(すなわち、74μm)の米国標準ふるいを通過するように、粉末がよく混合されていることを確認する。
- 粉末の含水率を重量測定で測定する。
- アルミ製の計量ボートの重量を量り、質量(Wwb)を記録します。
- 約2gのサンプル粉末を計量ボートに移し、質量(Wws + wb)を記録する。
- 計量ボートを乾燥炉に102°Cで24時間置きます(102°Cを超えないでください)。24時間後、計量ボートを乾燥オーブンから取り出し、デシケーターに入れて少なくとも1時間冷却します。
- 計量ボートと乾燥サンプル粉末(Wds + wb)の質量を計量して記録します。
- 式 1.1 を使用して含水率を決定します。
式1.1 固体試料粉末の含水率
% 水分 = (((Wws+wb- Wwb) – (Wds+wb - Wwb))/ (Wws+wb - Wwb)) * 100
2. 抽出手順
- 固体サンプル
- ふるいにかけたサンプルパウダー(Wsamp)の約2.5gをプラスチックまたはアルミニウム製の計量ボートに計量し、その重量を小数点以下4桁まで記録します。
- サンプルを1 Lメスシリンダーにロードし、シリンダーを0.1 M NaOH(4 g NaOH x L-1)で1 Lに充填します。
- マグネチックスターラーバー(例えば、長さ5〜7cm)を加え、サンプルが完全に混合されるまで、攪拌プレート上で急速に(すなわち、300〜400rpm)攪拌する。
- メスシリンダーの内容物全体を1L三角フラスコに移し、フラスコのヘッドスペースをN2 ガスで排気し、フラスコ開口部を気密カバーで覆う。
- 三角フラスコを攪拌板の上に置き、300〜400rpmで16〜18時間混合する。
- 液体サンプル
- 液状物の場合は、試験液が均一に混合されていることを確認するために振とうしてサンプルを十分に混合してください。容器の底に落ちた可能性のある残留物が完全に混ざっていることを確認してください。
- 小数点以下4桁(WTL)に秤量した試験液約5gを1Lメスシリンダーに加える。
- メスシリンダーに0.1 M NaOHを充填し、最終体積1 Lにします。
- マグネチックスターバー(例えば、長さ5〜7cm)を加え、試験サンプルが完全に混合されるまで、攪拌板上で急速に(例えば、300〜400rpm)攪拌する。
- 混合物を1L三角フラスコに移し、N2 ガスでヘッドスペースを排気し、フラスコ開口部を気密カバーで覆う。
- 三角フラスコを攪拌板の上に置き、300〜400rpmで1時間混合する。
注:この時点以降、固体サンプルと液体サンプルの取り扱いは同じです。
3.アルカリ性抽出物からの不溶性物質の除去
- 撹拌の終了後、フラスコを撹拌プレートから取り出し、混合物を適切な遠沈管に移し、全容積を4,921 x g で30分間遠心分離する。
- HAおよびFAを含むアルカリ性上清をマグネチックスターバーを入れた清浄な1L三角フラスコに集める。不溶性物質は廃棄する。遠心分離後に残留粒子が沈殿しない場合は、グラスウールまたは定性的な2.5μmの孔径のろ紙によるろ過をお勧めします。
4. FFからのHAの沈殿と分離
- アルカリ性抽出物を撹拌プレート上で300~400rpmで撹拌しながら、溶液の中央部(垂直方向)にpHプローブを挿入し、pH1.0~0.1の安定したpHに達するまでアルカリ抽出物に滴下する±合のHClを加える。
- pH1のpHに達して安定したままになったら、フラスコからpHプローブを取り出し、攪拌子を取り出し、フラスコを気密カバーで覆い、沈殿したHAがフラスコの底に落ち着くまでフラスコを座らせます。
注:HAが沈殿して溶液から脱落するのにかかる時間は、サンプル中のHAの供給源および量によって異なる。通常、HAが完全に沈殿して溶液から脱落するまでに1〜6時間かかります。 - 抽出物を遠心分離し、HAを4921 x g で1時間沈殿させた。遠心分離後、上清FFをきれいな1L三角に注ぎ、気密カバーで覆う。
注:沈殿したHAを一切含まずにFFをデカントできるようにHAをしっかりと詰め込むには、より長い遠心分離時間が必要な場合があります。 - 遠沈管を100°Cで24時間保持した乾燥炉に入れる。
- 乾燥後、チューブを乾燥炉から取り出し、デシケーターに入れて室温まで冷却する。冷却後、チューブの側面と底部からヘラで掻き取ってチューブの残渣を定量的に移し、タールを塗った計量ボートに移し、質量(WEHA)を記録します。この残渣を「抽出HA」とする。
注:HAとFFの分離に50mLを超える遠沈管が使用されている場合は、乾燥プロセスのために沈殿したHAを耐熱性50mL遠沈管に移すのが便利です。また、凍結乾燥機が利用できる場合は、沈殿したHAを凍結乾燥することができる。凍結乾燥状態でのHAの収集は、HAがプラスチックチューブの側面にくっつかず、廃棄する必要がないため、より容易である。
5. 灰分の定量
注:乾燥HAおよびFAサンプルの灰分含有量を測定する手順は同じです。HA の表記を使用する手順を示します。
- 乾燥HA(WHA)の約30mgを、100°Cの乾燥オーブンで予め乾燥させておいた清潔で予め秤量されたセラミック皿(WCDに移し、次いでデシケーター中で室温まで冷却する。加重HAとディッシュ(WHA+CD)の複合質量を記録した後、マッフルオーブンでHAを600°Cで2時間燃焼させる。
注: 各 HA サンプルについて、3 回の反復を処理し、純粋な HA の計算に使用する平均灰分を処理する必要があります。 - 2時間後、マッフルオーブンから皿と内容物を取り出し、乾燥機に入れて冷却する。冷めたら、皿に灰(WASH + CD)を入れて計量し、式1.2を使用して灰分比(アシュラット)を計算します。
フォーミュラ 1.2 アシュラット = (WASH+CD - WCD) / (WHA+CD - WCD)
精製抽出HAの割合の決定
- 式1.3を使用して灰分を補正することにより、純粋なHA(WPHA)の最終質量を決定します。
フォーミュラ 1.3 WPHA = WEHA * (1-アシュラット)
7. 元の供給源サンプル中の純粋なHAの濃度(%)の決定
- 式1.4および1.5を用いて純粋なHAの濃度を決定する:
式1.4:固体サンプル中の純度HA%=(WPHA/Wsamp)*100
式 1.5: 液体サンプル中の純度 % HA = (WPHA/WTL) * 100
HFA精製のためのカラム調製
- ポリメチルメタクリレートDAX-8樹脂を充填した低圧クロマトグラフィーカラムを調製する。樹脂を以前に使用したことがない場合は、樹脂をメタノールに2時間浸してから、すべてのメタノールが除去されるまで脱イオン化されたH2Oで十分にすすいでください。
- この時点で水に浮かんでいる小さな樹脂粒子を取り除きます。樹脂が以前に使用されていた場合は、セクション 10 の説明に従って再生します。
- 十分にすすぎすぎたら、樹脂ベッドサポート用の 10 μm フリット付きエンドピースを取り付けた 5 x 25 cm ガラスクロマトグラフィーカラムに樹脂を注ぎます。樹脂を含まない溶液のためにカラムの上部に2.5〜5cm放置して、樹脂ベッドに入る前にFFを混合できるようにします。トップピースをカラムにフィットさせ、カラムの上部から脱イオン化されたH2Oをポンプで送り込み、ペリスタルティックポンプを使用してDAX-8樹脂ベッドを充填します。
9. HFAの単離
- 樹脂ベッドが充填されたら、蠕動ポンプを使用して、低圧下でカラムの上部を介してFFをカラムにロードします。35 ~ 40 mL/分の流量を使用してください。樹脂の乾燥と樹脂ベッドへの抽出のチャネリングを防ぐために、カラム内の樹脂の上部がローディングおよびリンス手順全体を通して溶液で覆われたままであることが重要です。
- フルボ画分が樹脂に完全に装填されたら、脱イオン水で樹脂を洗浄し、低圧下でペリスタルティックポンプを使用してカラムの上部からポンピングすることにより、非吸着の「親水性フルボ画分」(HyFF)を除去した。35 ~ 40 mL/分の流量を使用してください。HyFF含有廃液は、分析に使用しない限り廃棄してください。
- カラム廃液の350 nmにおける吸光度がカラムの洗浄に使用した脱イオン化H2Oの吸光度と等しくなる(例えば、0.015吸光度単位以内)まで、脱イオン化H2Oでカラムを洗浄する。脱イオン水を使用して、分光光度計をゼロ(すなわち、ブランク)にする。
- ペリスタルティックポンプを用いてカラムの底部を介して0.1 M NaOHをポンピングすることにより逆溶出によりHFAを脱離させる。35 ~ 40 mL/分の流量を使用してください。ポンプ廃液(Na-fulvateを清潔で十分な大きさの容器(例えば、2L三角)に捕捉する。
メモ: ほとんどの HFA は、DAX-8 樹脂製ベッドの最上部に吸着します。カラムの底部から0.1 M NaOHを導入することによる脱離は、FAを完全に脱離させるのに必要な0.1 M NaOHの量を最小限に抑える。 - カラム流出液の吸光度が350 nmにおける0.1 M NaOH流入の吸光度に等しいとき、全てのHFAが脱離した。分光光度ブランクとして0.1 M NaOHを使用します。除去されたFA溶液の吸光度をチェックするために採取した廃液を追加して、すべてのFAが捕捉されていることを確認します。
10. プロトン化によるHFA脱灰
- 5 × 50 cmカラムに含まれる強カチオンH+-交換樹脂(材料表)をガラスフリットで繰り返し重力供給により通過させ、電気伝導度計で測定して廃液の電気伝導率が<120μS/cmになるまで樹脂を保持する。各パスの前に、H+交換樹脂はセクション11に記載されているように改装が必要です。
- 最終パス後にすべてのFAが樹脂から除去されるようにするには、350nmの廃液の吸光度がカラムの洗浄に使用した脱イオン水と同じ(例えば、0.015吸光度単位以内)になるまで、脱イオン水で樹脂を洗浄します。脱イオン化されたH2Oを分光光度ブランクとして使用します。洗浄液および採取した任意の流出部分を加えて、精製FA溶液に吸光度を確認する。すべてのFAの除去を助けるために、樹脂を数回(例えば、長いガラスまたはプラスチックロッドを使用して)攪拌することができる。
- 55°Cのロータリーエバポレーターを用いてFAを約15±2mLの容量に濃縮する。
- 15 mL FA濃縮物を50 mLプラスチック遠沈管に完全に移し、乾燥オーブンで一定の乾燥まで60±3°Cで乾燥させた。凍結乾燥はオーブン乾燥の代替手段です。乾燥後、チューブをデシケーターに移して冷却する。
- チューブの側面と底部をヘラでこすり取ってチューブからFAを取り出し、集めたFAを予めタールを塗った計量紙で計量します。この素材は「抽出FA」(WEFA)です。
- HA のステップ 6 で説明したように抽出された FA の灰分比 (ASHrat) を決定し、式 1.2 を使用して灰分比を計算します。式1.3を用いて灰を含まない抽出FA(WPFA)の重量を求め、WEFAをWEHAの重量に置き換えた。最後に、WPFAをWPHAに代入する式1.4を用いてサンプル中の純度%FAを決定する。
11. DAX-8 樹脂再生
- 流出液のpHが流入剤のpHと等しくなるまで、カラムの底部から35~40 mL/分の流量で0.1 M HCl(8.33 mL 濃縮HCl/1000 mL 最終容量脱イオン化H2O)をポンピングして、DAX-8 樹脂を再生します。ペリスタルティックポンプを使用して、再生中にDAX-8カラムを介してすべての試薬をポンプで送ります。
- 廃液のpHが流入水(すなわち、DI水)のpHと等しくなるまでカラムの上部にポンプで送ることによって、カラムをDI水ですすいでください。
12. H+陽イオン交換樹脂再生
- H+ 陽イオン交換樹脂をバッチプロセスで再生するには、樹脂を大きなビーカー(4Lプラスチックビーカーなど)に注ぎ、DI H2Oで樹脂を覆って数回すすぎ、混合してから水を注ぎます。
- 樹脂を 1 M HCl (83.3 mL 濃縮 HCl/1000 mL 最終容量 DI 水) で覆います。時折かき混ぜながら最低2時間放置する(例えば、30分に1回)。
- 酸を注ぎ、DI水で樹脂を覆うことによって、樹脂から余分な酸を除去する。攪拌棒で15秒間激しく攪拌した後、樹脂をフラスコの底に落として水を注ぎます。すすぎ水の電気伝導率が0.7μS/cm≤になるまでこのプロセスを繰り返します。
- 再生した樹脂をカラムにロードし直します。脱イオン化されたH2Oで覆い、使用の合間に樹脂が濡れたままになるようにしてください。
Representative Results
このメソッドのパフォーマンス データを 表 1 ~ 5 に示します。HAおよびFHAの非常に異なる濃度を有する液体市販サンプルからのHAおよびFAHの抽出のための方法の精度を 表1に示す。
HAの相対標準偏差(RSD)はHFAのそれよりも低かったが、3つの液体サンプルの平均HFA RSDは6.83%であり、これは高い精度を示す。Horwitz比(HorRat)は、実験室の精度に関する分析方法の適合性を示す正規化された性能パラメータです。ここでは実験室内の精度のために使用されました。値<0.5は、未開示の平均化または本方法に関する高いレベルの経験を示し得る。2.0>値は、試験サンプルの不均一性、方法の最適化またはより広範なトレーニングの必要性、検出限界以下の動作、または適用できない方法を示す。液体サンプルの分析では、HorRatはHFA分析の1つで2>しかありませんでした(表1)。
3つの腐植鉱石サンプルからHAおよびHFAを抽出するための精度データを 表2に示す。ここでも、鉱石2から抽出されたHFAと鉱石3から抽出されたHAを除いて、HorRatのすべてが2未満でした。これは、腐植質鉱石サンプルに対するHAおよびHFAの抽出のためのこの方法の高度の精度を実証する。
植物生物刺激剤の製造業者は、海藻、無機肥料、石炭または糖蜜のような他の成分に加えてHSを含む製品を処方することが多い。表3は、方法の精度に関するこれらのタイプの添加剤の含有の分析の結果を与える。いずれの添加剤もHAまたはHFAの回収に有意に影響を及ぼさなかった(表3)。
表4および表5は、非常に低濃度の市販製品をシミュレートした液体サンプルからのHAおよびHFAの回収率をそれぞれ報告する。回収率は優れており、HAについては88%〜97%(表4)およびHFAについては92%および104%(表5)の範囲であった。HAおよびHFAの平均回収率はそれぞれ93%および97%であり、両方のHSについて%RSDは5%未満であった。精度は優れていますが、これらのデータは実験室での複製を実行する必要性を示しています。方法検出限界(MDL)および方法定量限界は、HAで4.62および1.47 mg/L、HFAで4.8および1.53 mg/Lであった。
| 腐植質、% | |||||||
| 材料 | L16 · | L17 · | L2 · | ||||
| ティッカー | はは | ティッカー | はは | ティッカー | はは | ||
| 担当者 1 | 1.44 | 17 | 6.59 | 7.76 | 0.36 | 4.46 | |
| 担当者 2 | 1.39 | 16.03 | 6.25 | 7.79 | 0.42 | 4.93 | |
| 担当者 3 | 1.34 | 16.44 | 6.02 | 7.55 | 0.4 | 4.46 | |
| 担当者 4 | 1.54 | 16.75 | 6.2 | 7.69 | 0.33 | 4.53 | |
| 意味する | 1.43 | 16.56 | 6.27 | 7.7 | 0.38 | 4.6 | |
| ティッカー | 0.09 | 0.42 | 0 | 0.11 | 0.04 | 0.23 | |
| 24 | |||||||
| リザード、% | 6.29 | 2.53 | 3.8 | 1.39 | 10.4 | 4.91 | |
| ホルラット(r) | 1.58 | 0.72 | 1.25 | 0.47 | 2.31 | 1.55 | |
| ある抽出条件は1 L 0.1 M NaOH中1 gとした。 | |||||||
表 1.液体市販試料からのHAおよびHFAの抽出および定量における本方法の精度。 抽出条件は1 L 0.1 M NaOH中1 gとした。
| 腐植質、% | ||||||
| 鉱石1 | 鉱石2 | 鉱石3 | ||||
| 材料 | ティッカー | はは | ティッカー | はは | ティッカー | はは |
| 担当者 1 | 1.75 | 67.4 | 1.31 | 27.01 | 1.55 | 8.95 |
| 担当者 2 | 1.69 | 67.63 | 1.25 | 27.48 | 1.41 | 7.2 |
| 担当者 3 | 1.63 | 67.1 | 1.27 | 27.34 | 1.47 | 8.35 |
| 担当者 4 | 1.77 | 67.59 | 1.55 | 26.89 | 1.51 | 7.98 |
| 意味する | 1.71 | 67.53 | 1.35 | 27.18 | 1.49 | 8.12 |
| ティッカー | 0.06 | 0.94 | 0.14 | 0.28 | 0.06 | 0.73 |
| リザード、% | 3.7 | 1.39 | 10.33 | 1.02 | 4.02 | 9.02 |
| HorRat(r) | 0.99 | 0.66 | 2.71 | 0.42 | 1.07 | 3.09 |
表 2.腐植質鉱石からのHAおよびHFAの抽出および定量における方法の精度。 抽出条件は、1 L 0.1 M NaOH中の1 gサンプルとした。(Lamar et al., 2014より抜粋)
| レプリケート | 姦淫者 | HA, % | FA, % | 相対回復率 HA、% | 相対回復HFA、% |
| 1 | 何一つ | 81.61 | 12.86 | ||
| 2 | 何一つ | 80.16 | 12.78 | ||
| 1 | 海藻 | 80.21 | 12.85 | ||
| 2 | 海藻 | 80.72 | 12.79 | 99.5 | 99.6 |
| 1 | 肥料 | 80.25 | 12.98 | ||
| 2 | 肥料 | 79.57 | 123.77 | 98.8 | 101.6 |
| 1 | 石炭 | 78.79 | 12.92 | ||
| 2 | 石炭 | 81.27 | 12.84 | 98.9 | 101.8 |
| 1 | 糖蜜 | 79.38 | 12.99 | ||
| 2 | 糖蜜 | 81.02 | 12.72 | 99.2 | 100.9 |
| 意味する | 80.3 | 12.85 | |||
| ティッカー | 0.885 | 0.09 | |||
| 2.5 g / LのFA+HAの最終濃度を0.1 M NaOHに加えた。(Lamar et al., 2015より引用) | |||||
表 3.ガスコインレオナルダイトからのHAおよびHFAの定量に対する混入物の影響。 (Lamar et al., 2015より抜粋)
| はは | |||
| サンプル ID | 抽出、mg | 回復した、mg | リカバリ済み、% |
| 1 | 24.6 | 23.7 | 96.3 |
| 2 | 22.6 | 19.9 | 88.1 |
| 3 | 25.2 | 23.6 | 93.7 |
| 4 | 22.5 | 21.5 | 95.6 |
| 5 | 23.9 | 21.8 | 91.2 |
| 6 | 23.2 | 20.8 | 89.7 |
| 7 | 24 | 23.2 | 96.7 |
| 意味する | 23.7 | 22.1 | 93 |
| ティッカー | 1.01 | 1.52 | 3.43 |
| リザード、% | 4.35 | 6.88 | 3.67 |
| (Lamar et al., 2014より引用) | |||
表 4.スパイクブランクからのHAの回復。 (Lamar et al., 2014より抜粋)
| ファ | |||
| サンプル ID | 抽出、mg | 回復した、mg | リカバリ済み、% |
| 1 | 19.9 | 19 | 95.48 |
| 2 | 23.1 | 22.9 | 99.13 |
| 3 | 20.7 | 19.4 | 93.72 |
| 4 | 20.5 | 19.8 | 96.39 |
| 5 | 20.8 | 21.6 | 103.85 |
| 6 | 21.9 | 20.1 | 91.78 |
| 7 | 22.7 | 22.3 | 98.24 |
| 意味する | 21.37 | 20.73 | 96.94 |
| ティッカー | 1.21 | 1.53 | 3.95 |
| リザード、% | 5.64 | 7.36 | 4.07 |
| (Lamar et al., 2014より抜粋) | |||
表 5.スパイクブランクからのHFAの回収。 (Lamar et al., 2014より抜粋)
Discussion
この方法におけるHAの抽出および単離の初期ステップは比較的単純である。HFAの単離にはカラムクロマトグラフィーが含まれるため、再現性のある結果を得るには、各ステップとプラクティスの詳細を厳守する必要があります。特に、樹脂の正しい調製が最重要事項である。ポリメチルメタクリレートDAX-8樹脂が適切に調製され、充填されることが極めて重要である。樹脂の正しいパッキングは、HFAの歩留まりと品質の両方に影響します。チャネリングが存在する場合、HFAの前処理(すなわち酸性化)または吸着はいずれも完了せず、分離は不正確な結果をもたらす。サンプルローディングの前に樹脂内のチャネルまたはスペースが観察された場合は、カラムを取り出して振とうし、チャネルなしで樹脂ビーズを再分配し、樹脂を通してきれいなDI H2Oをポンピングして再充填する必要があります。さらに、プロトコルで述べたように、FFを樹脂に装填するときに樹脂の上の液体の体積を維持することは、FFが樹脂に入る前に混合することを可能にし、より効果的な吸着をもたらす。強カチオンH+交換樹脂(材料表)の場合、完全な再生を急ぐことはできません。Na+/H+交換には時間がかかるため、樹脂を再酸性化しながら混合できるようにバルク処理を行うのが最善です。DI H2Oですすぎながら樹脂を混合すると、余分なHClを除去するのに役立ちます。酸性化した樹脂を上昇させて過剰の酸を除去する場合、樹脂を混合することはHClの除去を助ける。電気伝導度が≤0.7μS/cmに達するまで酸を除去することは非常に重要です。そうでない場合、HClはHFAに引き継がれます。
最後に、DAX-8 樹脂から HFA を脱離するとき、流入液の吸光度が流出液の吸光度と等しくなったら、カラムを数時間放置して、追加の HFA が放出されるかどうかを確認することをお勧めします。その場合、樹脂の上方の液体の黄変として見られるであろう。これが発生した場合、流入/流出の吸光度が再び等しくなるまで、追加のHFAを継続的な脱着によって除去することができる。
HFA 分離の欠点の 1 つは、プロセス全体に時間がかかることです。DAX-8樹脂からのHFAの完全な脱離およびH+交換樹脂からの完全除去は、両方とも、回転蒸発によって減少しなければならないかなりの量のHFAをもたらす。これは間違いなく分析のボトルネックです。この時間を減らすために、0.1 M NaOHではなくアセトンを使用してDAX-8樹脂からHFAを脱離させることが示唆されている14。著者らは、NaOHの代わりに脱着剤として50%アセトンを使用することによって、同様のHFA結果が得られ、DAX-8が適切に再生され、したがってH+交換ステップを排除できると主張した。この修正により、生成される体積が減少し、アセトンが水と比較してより速く回転蒸発するため、分析時間が大幅に短縮されました。この修正は、さらなる研究を駆逐する。
この方法は、加湿の過程を経た有機物の分析に限定され、泥炭および軟炭の場合、泥炭化のさらなる過程および泥炭化および炭化の両方をそれぞれ行う。保湿は、死んだ、主に植物材料が、ますます反抗的な基質を消費し、修正する一連の微生物によって分解されるプロセスである。非生物的プロセスはまた、分解および再合成反応に関与する。硫化は、最終的に、HSを形成する分子量の範囲および炭素、酸素および水素含有量を形成する数千の分子の不均一な混合物を含む比較的反抗的な材料の生成をもたらす。HSは泥炭化および炭化によってさらに修飾される。したがって、この方法は、化学プロセスによって改変された植物材料には適していない。例えば、リグノスルホネートはHFA混入剤として広く使用されている。リグノスルホネートは、亜硫酸パルプ化プロセスの副産物である。したがって、この材料は、加湿のプロセスによって製造されていない。また、DAX-8樹脂に結合する物質も多く存在する。例えば、DAX-8樹脂は、溶液15から農薬を吸着するために使用されている。明らかに、農薬はHSではありません。したがって、DAX-8樹脂への材料の結合は、それがHFAであるという主張を正当化するものではない。前提条件は、加湿による製造とDAX-8樹脂への結合の両方です。
異なる用途におけるHSの様々な成分の寄与についてより多くが学習されるにつれて、HSをさらに分画し、したがってそれに応じて方法を修正することが有利になり得る。存在するので、この方法はHHYFAを定量化しない。しかしながら、この画分はまた、例えば、FF全体が精製HFAではなく農業処理において一般的に適用される植物の生体刺激において活性を有する可能性がある。
Disclosures
著者は宣言する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
著者らは、フミック製品貿易協会(HPTA)が、この論文に記載されている方法の標準化をもたらした作業に資金を提供し、ローレンス・メイヒュー博士とダン・オルク博士とポール・ブルーム博士が標準化作業中に技術支援を行ったことに感謝したい。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amberlite IR 120 H+-exchange resin | Sigma-Aldrich | 10322 | H+ form |
| Analytical Balance | Ohaus | PA214 | w/ glass draft shield |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-14 | minimum 4300 rpm |
| Centrifuge tubes | Beckman Coulter | To fit rotor selected | |
| Ceramic Combustion Crucibles | Sigma | Z247103 | |
| Chromatography column for DAX-8 | Diba | Omnifit 006EZ-50-25-FF | |
| Chromatography column for IR 120 | Chemglass | CG-1187-21 2 in. by 24 in. | |
| Dessicator | Capitol Scientic | Kimax 21200-250 | Vacuum type |
| Drying Oven | Fisher Scientific | Isotemp | Precision±3?C |
| Electrical conductivity meter | HM Digital | EC-3 | |
| Erlenmeyer Flasks | Amazon | 1L, 2L | |
| HCl concentrated | Sigma-Aldrich | 320331 | |
| Magnetic Stir Plate | Barnstead-Thermolyne | Dataplate 721 | |
| Magnetic Stir bars | These can be obtained at many outlets | ||
| Muffle Furnace | Fisher scientific | Thermolyne Type 47900 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 795429 | |
| Nitrogen gas | Praxair | UNI1066 | 99.99% purity |
| Peristaltic pump | Cole Parmer | Masterflex 7518-00 | |
| Perstaltic tubing | Cole Parmer | Masterflex Pharmed 06508-17 | |
| pH meter | Oakton Instruments | WD-35618--03 | |
| Rotary Evaporator | Buchi | R-210/R-215 | |
| Spectrophotometer | Healthcare SCiences | Ultrospec II | Dual beam 200 to 900 nm with wavelength accuracy of ±1 nm and reproducibility of ±0.5 nm. |
References
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