Summary
Este método proporciona una cuantificación gravimétrica de sustancias húmicas (por ejemplo, ácidos húmicos y fúlvicos) sobre una base libre de cenizas, en materiales secos y líquidos de carbones blandos (es decir, lignito oxidado y no oxidado y carbón subbituminoso), minerales y esquistos de humato, turbas, compost y fertilizantes comerciales y enmiendas del suelo.
Abstract
El propósito de este método es proporcionar una concentración exacta y precisa de ácidos húmicos (HA) y / o fúlvicos (FA) en carbones blandos, minerales húmicos y esquistos, turbas, compost y productos comerciales que contienen sustancias húmicas. El método se basa en la extracción alcalina de materiales de ensayo, utilizando 0,1 N NaOH como extractante, y la separación de las sustancias húmicas solubles alcalinas (HS) de productos no solubles por centrifugación. El pH del extracto alcalino centrifugado se ajusta a pH 1 con conc. HCl, lo que resulta en la precipitación del HA. Los HA precipitados se separan de la fracción fúlvica (FF) (la fracción de HS que permanece en solución) por centrifugación. El HA se seca al horno o liofilizado y se determina el contenido de cenizas del HA seco. El peso del HA puro (es decir, libre de cenizas) se divide por el peso de la muestra y la fracción resultante se multiplica por 100 para determinar el % de HA en la muestra. Para determinar el contenido de FA, el FF se carga sobre una resina hidrofóbica DAX-8, que adsorbe la fracción de FA también conocida como ácido fúlvico hidrófobo (HFA). La fracción de ácido no fúlvico restante, también llamada fracción fúlvica hidrófila (HyFF) se elimina lavando la resina con H2O desionizado hasta que todo el material no absorbido se elimine por completo. El FA se desorbe con 0.1 N NaOH. El Na-fulvato resultante se protona pasándolo sobre una resina fuerte de intercambio H +. El FA resultante es secado al horno o liofilizado, el contenido de cenizas determinado y la concentración en la muestra calculada como se describió anteriormente para HA.
Introduction
Las sustancias húmicas (HS) son residuos dinámicos que resultan de la descomposición microbiana y transformación de tejidos vegetales muertos1,2,3 aumentados con subproductos microbianos y biomasa3,4,5 a través de un proceso que se denomina humificación6. Los HS están presentes en suelos, aguas naturales, sedimentos lacustres, turbas, carbones blandos y esquistos húmicos y representan aproximadamente el 25% del carbono orgánico total en la tierra7. Estas sustancias son mezclas complejas de miles de moléculas únicas que se fraccionan en tres fracciones principales en función de sus diferentes solubilidades en soluciones acuosas fuertemente básicas y ácidas. Estas fracciones son ácidos húmicos (AAS), que comprenden la fracción soluble en álcali pero insoluble en ácido; ácidos fúlvicos (FA), la fracción soluble tanto en álcali como en ácido; y la fracción de humina, que es insoluble en todos los valores de pH6,8. La fracción fúlvica (FF) se subdivide en las fracciones hidrofóbicas FA (HFA) e hidrófilas (HyFA). Estas fracciones se definen como la parte del FF que se une a una resina hidrofóbica DAX-8 (HFA) y la parte que no se une a la resina (HyFA).
Los SA se utilizan cada vez más en la agricultura, donde se utilizan ampliamente como bioestimulantes de cultivos, en la cría de animales, en particular como aditivo para piensos para el ganado, en la minería en lodos de perforación y la remediación ambiental como lanzaderas de electrones. La investigación en el uso de HS en aplicaciones médicas humanas también está aumentando.
Existen muchos métodos para la cuantificación de HA y FA. Sin embargo, la mayoría de estos métodos no son ni exactos ni precisos. Por ejemplo, los dos métodos más utilizados para la determinación de HA en los Estados Unidos son el método colorimétrico9 y el método del Departamento de Alimentación y Agricultura de California (CDFA), los cuales demostraron sobreestimar la cantidad de HA en una variedad de fuentes de mineral y extracto del oeste de los Estados Unidos y Canadá10. El método colorimétrico o espectrofotométrico es inexacto porque se basa en la absorbancia de extractos alcalinos que incluyen, además de HA, FA y otros cromóforos que todos absorben en la longitud de onda utilizada y el estándar no es representativo de los materiales que se están probando10. El método CDFA no es preciso porque no proporciona concentraciones de HA sobre una base libre de cenizas. Debido a que los diferentes minerales tienen diferentes cantidades de cenizas, algunas de las cuales se transportan con la extracción y el proceso de extracción en sí agrega cenizas, este método no proporciona un valor preciso para las concentraciones de HA10. En respuesta a la necesidad de un método exacto y preciso, en 2014 se publicó un procedimiento gravimétrico estandarizado basado en el detallado por11 para abordar la cuantificación de HA y FA sobre una base libre de cenizas12. Este método fue adaptado, con modificaciones menores, por la Organización Internacional de Normalización (ISO) en 2018 bajo Fertilizantes y acondicionadores de suelo como "Determinación de concentraciones de ácidos fúlvicos húmicos e hidrofóbicos en materiales fertilizantes"13.
Este documento describe el protocolo para la extracción y cuantificación de ácidos fúlvicos húmicos e hidrofóbicos y proporciona detalles sobre la exactitud y precisión de los datos producidos a partir del método.
Protocol
1. Preparación de muestras sólidas
- Triture aproximadamente 5 g de la muestra a analizar, utilizando un mortero y un mortero, de modo que el 100% de la muestra triturada pase a través de una malla de tamiz estándar de ee. UU. tamaño No. 200 (es decir, 74 μm) asegurándose de que el polvo esté bien mezclado.
- Determine el contenido de humedad del polvo gravimétricamente.
- Pesa un bote de pesaje de aluminio y registra la masa (Wwb).
- Transfiera aproximadamente 2 g de polvo de muestra al bote de pesaje y registre la masa (Wws + wb).
- Coloque el bote de pesaje en un horno de secado durante 24 h a 102 ° C (no exceda de 102 ° C). Después de 24 h, retire el bote de pesaje del horno de secado y colóquelo en un desecador para que se enfríe durante al menos 1 h.
- Pesar y registrar la masa del bote de pesaje y el polvo de muestra seco (Wds+ wb).
- Determine el contenido de humedad utilizando la fórmula 1.1.
Fórmula 1.1 Contenido de humedad del polvo de muestra sólida
% de humedad = (((Wws+wb- Wwb) – (Wds+wb - Wwb))/ (Wws+wb - Wwb)) * 100
2. Procedimiento de extracción
- Muestras sólidas
- Pesar aproximadamente 2,5 g del polvo de muestra tamizado (Wsamp) en un bote de pesaje de plástico o aluminio y registrar el peso con cuatro decimales.
- Cargue la muestra en un cilindro graduado de 1 L y llene el cilindro a 1 L con 0,1 M De NaOH (4 g de NaOH x L-1).
- Agregue una barra de agitación magnética (por ejemplo, de 5 a 7 cm de longitud) y revuelva rápidamente (es decir, 300 a 400 rpm) en una placa de agitación hasta que la muestra se mezcle completamente.
- Transfiera todo el contenido del cilindro graduado a un matraz Erlenmeyer de 1 L, evacue el espacio de cabeza del matraz con gas N2 y cubra la abertura del matraz con una cubierta hermética.
- Coloque el matraz Erlenmeyer en una placa de agitación y mezcle a 300 - 400 rpm durante 16 - 18 h.
- Muestras líquidas
- Para los materiales líquidos, mezcle bien la muestra agitando para asegurarse de que el líquido de prueba se mezcle de manera homogénea. Asegúrese de que cualquier residuo que pueda haber caído al fondo del recipiente esté bien mezclado.
- Agregue aproximadamente 5 g del líquido de prueba, pesado a 4 decimales (WTL), a un cilindro graduado de 1 L.
- Llene el cilindro graduado con 0,1 M de NaOH hasta un volumen final de 1 L.
- Agregue una barra de agitación magnética (por ejemplo, de 5 a 7 cm de longitud) y revuelva rápidamente (por ejemplo, 300 a 400 rpm) en una placa de agitación hasta que la muestra de prueba esté completamente mezclada.
- Transfiera la mezcla a un matraz Erlenmeyer de 1 L, evacue el espacio de cabeza con gas N2 y cubra la abertura del matraz con una cubierta hermética.
- Coloque el matraz Erlenmeyer en una placa de agitación y mezcle a 300 - 400 rpm durante 1 h.
NOTA: Después de este punto, el manejo de muestras sólidas y líquidas es el mismo.
3. Eliminación de materiales no solubles de extractos alcalinos
- Al finalizar la agitación, retire el matraz de la placa de agitación, transfiera la mezcla a los tubos de centrífuga adecuados y centrífique todo el volumen a 4.921 x g durante 30 min.
- Recoja el sobrenadante alcalino que contiene el HA y el FA en un matraz Erlenmeyer limpio de 1 L que contenga una barra de agitación magnética. Deseche el material insoluble. Se recomienda la filtración a través de lana de vidrio o papel de filtro cualitativo de tamaño de poro de 2,5 μm si las partículas residuales no se precipitan después de la centrifugación.
4. Precipitación y separación de HA de FF
- Mientras agita el extracto alcalino a 300 - 400 rpm en una placa de agitación, inserte una sonda de pH en la parte media de la solución (verticalmente) y agregue conc. HCl gota a gota al extracto alcalino hasta que se alcance un pH estable de pH 1.0 ± 0.1.
- Una vez que se alcanza un pH de pH 1 y permanece estable, retire la sonda de pH del matraz, recupere la barra de agitación, cubra el matraz con una cubierta hermética y deje que el matraz se asiente hasta que el HA precipitado se haya asentado en el fondo del matraz.
NOTA: El tiempo que tarda un HA en precipitar y abandonar la solución variará dependiendo de la fuente y la cantidad de HA en la muestra. Por lo general, toma de 1 a 6 h para que el HA precipite completamente y se caiga de la solución. - Centrifugar el extracto y precipitar HA a 4921 x g durante 1 h. Después de la centrifugación, vierta el sobrenadante FF en un Erlenmeyer limpio de 1 L y cúbralo con una cubierta hermética.
NOTA: Puede ser necesario un tiempo de centrifugación más largo para empacar el HA con la firmeza suficiente para permitir la decantación del FF sin incluir ninguno de los HA precipitados. - Coloque los tubos de la centrífuga en un horno de secado mantenido a 100 °C durante 24 h.
- Después del secado, retire los tubos del horno de secado y colóquelos en un desecador para que se enfríen a temperatura ambiente. Después del enfriamiento, transfiera cuantitativamente el residuo del tubo raspándolo desde los lados y la parte inferior del tubo con una espátula, transfiera a un bote de pesaje alquitranado y registre la masa (WEHA). Este residuo es el "HA extraído".
NOTA: Si se han utilizado tubos de centrífuga superiores a 50 mL en la separación de HA y FF, es conveniente transferir el HA precipitado a tubos de centrífuga de 50 mL resistentes a la temperatura para el proceso de secado. Además, si hay un liofilizador disponible, el HA precipitado se puede liofilizar. La recolección de la HA en un estado liofilizado es más fácil porque la HA no se adhiere al costado de los tubos de plástico y no tiene que ser desechada.
5. Determinación del contenido de cenizas
NOTA: El procedimiento para la determinación del contenido de cenizas de muestras secas de HA y FA es el mismo. Se muestra el procedimiento que utiliza la notación para HA.
- Transfiera aproximadamente 30 mg del HA seco (WHA) a un plato de cerámica limpio y prepesado (WCD) que se haya secado previamente en un horno de secado a 100 ° C y luego se haya enfriado en un desecador a temperatura ambiente. Después de registrar la masa combinada del HA ponderado y el plato (WHA + CD), queme el HA en un horno de mufla durante 2 h a 600 ° C.
NOTA: Para cada muestra de HA, se deben procesar tres réplicas y se debe utilizar el contenido promedio de cenizas en el cálculo de HA puro. - Después de 2 h, retire el plato y el contenido del horno de amortiguación y colóquelo en un desecador para que se enfríe. Una vez frío, pesa el plato con ceniza (WASH+CD) y calcula la proporción de cenizas (Ashrat) utilizando la fórmula 1.2:
Fórmula 1.2 Ashrat = (WASH+CD - WCD) / (WHA+CD - WCD)
6. Determinación del porcentaje de HA extraída purificada
- Determine la masa final del HA puro (WPHA) corrigiendo el contenido de cenizas utilizando la Fórmula 1.3:
Fórmula 1.3 WPHA = WEHA * (1- Ashrat)
7. Determinación de la concentración (%) de HA pura en la muestra original de origen
- Determinar la concentración de HA puro utilizando las fórmulas 1.4 y 1.5:
Fórmula 1.4: % de HA puro en muestra sólida = (WPHA/Wsamp) * 100
Fórmula 1.5: % de HA puro en muestra líquida = (WPHA/WTL) * 100
8. Preparación de la columna para la purificación de HFA
- Prepare una columna de cromatografía de baja presión empaquetada con resina de polimetilmetacrilato DAX-8. Si la resina no se ha utilizado previamente, remoje la resina en metanol durante 2 h y luego enjuague bien con H2O desionizado hasta que se elimine todo el metanol.
- Retire las pequeñas partículas de resina que flotan en el agua en este momento. Si la resina se ha utilizado anteriormente, regenerarla como se describe en la sección 10.
- Una vez enjuagada a fondo, vierta la resina en una columna de cromatografía de vidrio de 5 x 25 cm equipada con una pieza final con una frita de 10 μm para soporte de lecho de resina. Deje de 2,5 a 5 cm en la parte superior de la columna para una solución libre de resina que permita mezclar el FF antes de entrar en el lecho de resina. Ajuste la pieza superior a la columna y bombee H2O desionizado a través de la parte superior de la columna para empacar el lecho de resina DAX-8 utilizando una bomba peristáltica.
9. Aislamiento de HFA
- Una vez embalado el lecho de resina, cargue el FF en la columna utilizando una bomba peristáltica, a baja presión, a través de la parte superior de la columna. Utilice un caudal de 35 – 40 ml/min. Es fundamental que la parte superior de la resina en la columna permanezca cubierta con solución durante todo el procedimiento de carga y enjuague para evitar el secado de la resina y la canalización del extracto a través del lecho de resina.
- Una vez que la fracción fúlvica se haya cargado completamente sobre la resina, lave la resina con agua desionizada, para eliminar la "fracción fúlvica hidrófila" no adsorbida bombeándola a través de la parte superior de la columna utilizando la bomba peristáltica a baja presión. Utilice un caudal de 35 – 40 ml/min. Deseche el efluente que contiene HyFF a menos que se vaya a utilizar para el análisis.
- Lave la columna con H2O desionizado hasta que la absorbancia a 350 nm del efluente de la columna sea igual (por ejemplo, dentro de 0,015 unidades de absorbancia) a la del H2O desionizado utilizado para lavar la columna. Use agua desionizada a cero (es decir, en blanco) el espectrofotómetro.
- Desorba el HFA por elución posterior bombeando 0,1 M de NaOH a través de la parte inferior de la columna utilizando la bomba peristáltica. Utilice un caudal de 35 – 40 ml/min. Capture el efluente de la bomba (el Na-fulvato en un recipiente limpio de tamaño suficiente (por ejemplo, 2 L Erlenmeyer).
NOTA: La mayor parte del HFA se adsorbe en la parte superior de la cama de resina DAX-8. La desorción mediante la introducción del NaOH de 0,1 M desde la parte inferior de la columna minimiza la cantidad de 0,1 M de NaOH necesaria para desorber completamente el FA. - Todo el HFA se ha desorbido cuando la absorbancia del efluente de columna es igual a la absorbancia de 0,1 M naOH a 350 nm. Utilice 0,1 M de NaOH como espacio en blanco espectrofotométrico. Agregue el efluente tomado para verificar la absorbancia de la solución de FA desorbida para garantizar que se capture todo el FA.
10. Eliminación de HFA por protonación
- Pasar la solución de Na-fulvato, repetidamente, por alimentación por gravedad, a través de resina de intercambio de cationes fuertes H+- (Tabla de Materiales) contenida en una columna de 5 × 50 cm, con fritas de vidrio para retener la resina, hasta que la conductividad eléctrica del efluente sea de <120 μS/cm, medida con un medidor de conductividad eléctrica. Antes de cada pasada, la resina de intercambio H+ requiere renovación como se describe en la Sección 11.
- Para asegurarse de que todo el FA se elimina de la resina después del paso final, lave la resina con agua desionizada hasta que la absorbancia del efluente a 350 nm sea la misma (por ejemplo, dentro de 0.015 unidades de absorbancia) que el agua desionizada utilizada para lavar la columna. Utilice H2O desionizado como espacio en blanco espectrofotométrico. Agregue el lavado y las porciones de efluente tomadas para verificar la absorbancia a la solución de FA purificada. Para ayudar con la eliminación de todo el FA, la resina se puede agitar (por ejemplo, usando una varilla larga de vidrio o plástico) varias veces.
- Concentre el FA a un volumen de aproximadamente 15 ± 2 ml utilizando un evaporador rotativo a 55 °C.
- Transfiera completamente el concentrado de FA de 15 ml a un tubo de centrífuga de plástico de 50 ml y séquelo a 60±3 °C a una sequedad constante en un horno de secado. La liofilización es una alternativa al secado al horno. Después del secado, transfiera el tubo a un desecador para que se enfríe.
- Retire el FA del tubo raspando los lados y la parte inferior del tubo con una espátula y pese el FA recogido en papel de pesaje pre-alquitranado. Este material es el "FA Extraído" (WEFA).
- Determine la relación de cenizas (ASHrat) de la AF extraída como se describe en el Paso 6 para HA y calcule la relación de cenizas utilizando la Fórmula 1.2. Determinar el peso del FA extraído sin cenizas (WPFA) utilizando la Fórmula 1.3, sustituyendo el WEFA por el peso de WEHA. Finalmente, determine el % de FA puro en la muestra utilizando la Fórmula 1.4 sustituyendo WPFA por WPHA.
11. Regeneración de resina DAX-8
- Regenere la resina DAX-8 bombeando HCl de 0,1 M (HCl concentrado de 8,33 mL/H2O de volumen final de 1000 mL) a un caudal de 35 – 40 mL/min a través de la parte inferior de la columna hasta que el pH del efluente sea igual al pH del influente. Utilice la bomba peristáltica para bombear todos los reactivos a través de la columna DAX-8 durante la regeneración.
- Enjuague la columna con agua DI bombeándola a la parte superior de la columna hasta que el pH del efluente sea igual al pH del afluente (es decir, agua DI).
12. Regeneración de resina de intercambio catiónico H+
- Regenere la resina de intercambio catiónico H + en un proceso por lotes vertiendo la resina en un vaso de precipitados grande (por ejemplo, vaso de precipitados de plástico de 4 L), enjuague varias veces cubriendo la resina con DI H2O, mezclando y luego vertiendo el agua.
- Cubra la resina con 1 M HCl (83,3 mL de HCl concentrado/1000 ml de agua DI de volumen final). Dejar reposar durante un mínimo de 2 h con agitación ocasional (por ejemplo, una vez cada 30 min).
- Elimine el exceso de ácido de la resina vertiendo el ácido y cubriendo la resina con agua DI. Revuelva vigorosamente con una varilla de agitación durante 15 s, luego deje que la resina caiga al fondo del matraz y luego vierta el agua. Repita el proceso hasta que la conductividad eléctrica del agua de enjuague esté ≤ 0,7 μS/cm.
- Cargue la resina regenerada de nuevo en la columna. Cubra con H2O desionizado para asegurarse de que la resina permanezca húmeda entre usos.
Representative Results
Los datos de rendimiento para el método se proporcionan en las Tablas 1 a 5. La precisión del método para la extracción de HA y FAH a partir de muestras comerciales líquidas con concentraciones muy diferentes de HA y FHA se dan en la Tabla 1.
Las desviaciones estándar relativas (DSR) para HA fueron más bajas que las de HFA, pero el promedio de HFA RSD sobre las tres muestras líquidas fue de 6,83%, lo que indica un alto grado de precisión. La relación de Horwitz (HorRat) es un parámetro de rendimiento normalizado que indica la idoneidad de un método de análisis con respecto a la precisión entre laboratorios. Aquí se utilizó para la precisión dentro del laboratorio. El valor < 0.5 puede indicar un promedio no revelado o un alto nivel de experiencia con el método. Los valores > 2.0 indican heterogeneidad de las muestras de prueba, una necesidad de optimización del método o un entrenamiento más extenso, operando por debajo del límite de detección o un método inaplicable. Para el análisis de muestras líquidas, el HorRat solo fue > 2 para uno de los análisis de HFA (Tabla 1).
Los datos de precisión para la extracción de HA y HFA de tres muestras de mineral húmico se dan en la Tabla 2. Una vez más, con la excepción del HFA extraído del Mineral 2 y el HA del Mineral 3, todos los HorRat estaban por debajo de 2. Esto demuestra un alto grado de precisión de este método para la extracción de HA y HFA para muestras de mineral húmico.
Los fabricantes de bioestimulantes vegetales a menudo formulan productos que contienen HS además de otros ingredientes como algas marinas, fertilizantes inorgánicos, carbones o melaza. La Tabla 3 da los resultados de un análisis de la inclusión de este tipo de aditivos sobre la precisión del método. Ninguno de los aditivos afectó significativamente la recuperación de HA o HFA (Tabla 3).
La Tabla 4 y la Tabla 5 informan las recuperaciones de HA y HFA, respectivamente, de muestras líquidas que simularon productos comerciales con concentraciones muy bajas. Las recuperaciones fueron excelentes y oscilaron entre el 88% y el 97% para la HA (Tabla 4) y el 92% y el 104% para la HFA (Tabla 5). Las recuperaciones medias de HA y HFA fueron del 93% y 97%, respectivamente, y el % de RSD para ambos HS fue inferior al 5%. Si bien la precisión es excelente, estos datos indican la necesidad de realizar réplicas de laboratorio. El límite de detección del método (MDL) y el límite de cuantificación del método fueron 4,62 y 1,47 mg/L para HA y 4,8 y 1,53 mg/L para HFA.
| Sustancias húmicas, % | |||||||
| Material | L16 | L17 | L2 | ||||
| HFA | JA | HFA | JA | HFA | JA | ||
| Representante 1 | 1.44 | 17 | 6.59 | 7.76 | 0.36 | 4.46 | |
| Representante 2 | 1.39 | 16.03 | 6.25 | 7.79 | 0.42 | 4.93 | |
| Representante 3 | 1.34 | 16.44 | 6.02 | 7.55 | 0.4 | 4.46 | |
| Representante 4 | 1.54 | 16.75 | 6.2 | 7.69 | 0.33 | 4.53 | |
| Significar | 1.43 | 16.56 | 6.27 | 7.7 | 0.38 | 4.6 | |
| SD | 0.09 | 0.42 | 0 | 0.11 | 0.04 | 0.23 | |
| 24 | |||||||
| DSR, % | 6.29 | 2.53 | 3.8 | 1.39 | 10.4 | 4.91 | |
| Hor Rata(r) | 1.58 | 0.72 | 1.25 | 0.47 | 2.31 | 1.55 | |
| un Las condiciones de extracción fueron de 1 g en 1 L 0,1 M NaOH. | |||||||
Tabla 1. Precisión del método en extracción y cuantificación de HA y HFA a partir de muestras comerciales líquidas. Las condiciones de extracción fueron de 1 g en 1 L 0,1 M NaOH.
| Sustancias húmicas, % | ||||||
| Mineral 1 | Mineral 2 | Mineral 3 | ||||
| Material | HFA | JA | HFA | JA | HFA | JA |
| Representante 1 | 1.75 | 67.4 | 1.31 | 27.01 | 1.55 | 8.95 |
| Representante 2 | 1.69 | 67.63 | 1.25 | 27.48 | 1.41 | 7.2 |
| Representante 3 | 1.63 | 67.1 | 1.27 | 27.34 | 1.47 | 8.35 |
| Representante 4 | 1.77 | 67.59 | 1.55 | 26.89 | 1.51 | 7.98 |
| Significar | 1.71 | 67.53 | 1.35 | 27.18 | 1.49 | 8.12 |
| SD | 0.06 | 0.94 | 0.14 | 0.28 | 0.06 | 0.73 |
| DSR, % | 3.7 | 1.39 | 10.33 | 1.02 | 4.02 | 9.02 |
| HorRat(r) | 0.99 | 0.66 | 2.71 | 0.42 | 1.07 | 3.09 |
Tabla 2. Precisión del método en extracción y cuantificación de HA y HFA a partir de minerales húmicos. Las condiciones de extracción fueron de 1 g de muestra en 1 L 0,1 M NaOH. (Datos tomados de Lamar et al., 2014)
| Replicar | Adulterante | HA, % | FA, % | Recuperación relativa HA, % | HFA de recuperación relativa, % |
| 1 | Ninguno | 81.61 | 12.86 | ||
| 2 | Ninguno | 80.16 | 12.78 | ||
| 1 | Algas marinas | 80.21 | 12.85 | ||
| 2 | Algas marinas | 80.72 | 12.79 | 99.5 | 99.6 |
| 1 | Abono | 80.25 | 12.98 | ||
| 2 | Abono | 79.57 | 123.77 | 98.8 | 101.6 |
| 1 | Carbón | 78.79 | 12.92 | ||
| 2 | Carbón | 81.27 | 12.84 | 98.9 | 101.8 |
| 1 | Melaza | 79.38 | 12.99 | ||
| 2 | Melaza | 81.02 | 12.72 | 99.2 | 100.9 |
| Significar | 80.3 | 12.85 | |||
| SD | 0.885 | 0.09 | |||
| a Concentración final de FA + HA de 2,5 g/L añadida a 0,1 M de NaOH. (datos tomados de Lamar et al., 2015) | |||||
Tabla 3. Efecto de los adulterantes sobre la cuantificación de HA y HFA de una leonardita de Gascoyne. (Datos tomados de Lamar et al., 2015)
| JA | |||
| ID de muestra | Extraído, mg | Recuperado, mg | Recuperado, % |
| 1 | 24.6 | 23.7 | 96.3 |
| 2 | 22.6 | 19.9 | 88.1 |
| 3 | 25.2 | 23.6 | 93.7 |
| 4 | 22.5 | 21.5 | 95.6 |
| 5 | 23.9 | 21.8 | 91.2 |
| 6 | 23.2 | 20.8 | 89.7 |
| 7 | 24 | 23.2 | 96.7 |
| Significar | 23.7 | 22.1 | 93 |
| SD | 1.01 | 1.52 | 3.43 |
| DSR, % | 4.35 | 6.88 | 3.67 |
| (datos tomados de Lamar et al., 2014) | |||
Tabla 4. Recuperación de HA de espacios en blanco con picos. (Datos tomados de Lamar et al., 2014)
| FA | |||
| ID de muestra | Extraído, mg | Recuperado, mg | Recuperado, % |
| 1 | 19.9 | 19 | 95.48 |
| 2 | 23.1 | 22.9 | 99.13 |
| 3 | 20.7 | 19.4 | 93.72 |
| 4 | 20.5 | 19.8 | 96.39 |
| 5 | 20.8 | 21.6 | 103.85 |
| 6 | 21.9 | 20.1 | 91.78 |
| 7 | 22.7 | 22.3 | 98.24 |
| Significar | 21.37 | 20.73 | 96.94 |
| SD | 1.21 | 1.53 | 3.95 |
| DSR, % | 5.64 | 7.36 | 4.07 |
| (Datos tomados de Lamar et al., 2014) | |||
Tabla 5. Recuperación de HFA de espacios en blanco con picos. (Datos tomados de Lamar et al., 2014)
Discussion
Los pasos iniciales de extracción y aislamiento de la HA en este método son relativamente sencillos. Debido a que el aislamiento del HFA implica cromatografía en columna, la obtención de resultados repetibles viene con una estricta adherencia a los detalles de cada paso y práctica. En particular, la preparación correcta de las resinas es de primordial importancia. Es extremadamente importante que la resina de polimetilmetacrilato DAX-8 se prepare y empaquete adecuadamente. El embalaje correcto de la resina afecta tanto al rendimiento como a la calidad del HFA. Si existe canalización, entonces ni el pretratamiento (es decir, la acidificación) ni la adsorción de HFA serán completos, y la separación conducirá a resultados inexactos. Si se observan canales o espacios en la resina antes de la carga de la muestra, la columna debe retirarse y agitarse para redistribuir las perlas de resina, permitiendo que se asienten sin canales, y luego volver a empaquetarse bombeando DI H2O limpio a través de la resina. Además, como se menciona en el protocolo, mantener un volumen de líquido por encima de la resina al cargar el FF sobre la resina, permitirá que el FF se mezcle antes de ingresar a la resina y dará como resultado una adsorción más efectiva. Para la resina de intercambio de catión fuerte H + (Tabla de materiales), la regeneración completa no se puede apresurar. El intercambio de Na + / H + lleva tiempo y, por lo tanto, esto se hace mejor en un tratamiento a granel para que la resina se pueda mezclar mientras se vuelve a acidificar. Mezclar la resina mientras se enjuaga con DI H2O ayuda a eliminar el exceso de HCl. Al subir la resina acidificada para eliminar el exceso de ácido, mezclar la resina ayuda a eliminar el HCl. Es extremadamente importante eliminar el ácido hasta el punto en que se alcance una conductividad eléctrica de ≤ 0,7 μS / cm. De lo contrario, el HCl se transferirá con el HFA.
Finalmente, al desorber el HFA de la resina DAX-8, una vez que la absorbancia del influente es igual a la absorbancia del efluente, es una buena práctica dejar que la columna se asiente durante un par de horas para ver si se liberará algún HFA adicional. Si es así, se verá como un amarilleo del líquido sobre la resina. Si esto ocurre, el HFA adicional se puede eliminar mediante desorción continua hasta que las absorbancias de influente / efluente sean iguales nuevamente.
Una de las desventajas del aislamiento HFA es que todo el proceso requiere mucho tiempo. La desorción completa de HFA de la resina DAX-8 y la eliminación completa de la resina de intercambio H + dan como resultado un volumen significativo de HFA que debe reducirse mediante evaporación rotativa. Esto es definitivamente un cuello de botella en el análisis. En un esfuerzo por reducir este tiempo, se ha sugerido la desabsorbida del HFA de la resina DAX-8 utilizando acetona en lugar de 0,1 M de NaOH14. Los autores afirmaron que al usar acetona al 50% como desorbente en lugar de NaOH, se obtuvo un resultado HFA similar y el DAX-8 se regeneró adecuadamente y, por lo tanto, se pudo eliminar el paso de intercambio H +. Esta modificación resultó en un tiempo de análisis muy reducido como resultado de la disminución del volumen producido y la evaporación rotativa más rápida de la acetona en comparación con el agua. Esta modificación merece más estudio.
Este método se limita al análisis de la materia orgánica que ha sido sometida al proceso de humificación, y para el caso de la turba y los carbones blandos, los procesos posteriores de peatificación y tanto de la peatificación como de la coalificación, respectivamente. La humificación es el proceso por el cual el material muerto, principalmente vegetal, se descompone por una secuencia de microbios que consumen y modifican sustratos cada vez más recalcitrantes. Los procesos abióticos también participan en las reacciones de descomposición y resíntesis. La humificación finalmente resulta en la producción de materiales relativamente recalcitrantes que comprenden mezclas heterogéneas de miles de moléculas que forman un rango de peso molecular y contenidos de carbono, oxígeno e hidrógeno que forman HS. Los SA se modifican aún más mediante la peatificación y la coalificación. Por lo tanto, este método no es apropiado para materiales vegetales que han sido modificados por procesos químicos. Por ejemplo, el lignosulfonato es ampliamente utilizado como adulterante HFA. El lignosulfonato es un subproducto del proceso de pulpa de sulfito. Por lo tanto, este material no ha sido producido por el proceso de humificación. Además, hay muchas sustancias que se unen a la resina DAX-8. Por ejemplo, la resina DAX-8 se ha utilizado para adsorber pesticidas de la solución15. Obviamente, los pesticidas no son HS. Por lo tanto, la unión de un material a la resina DAX-8 no justifica una afirmación de que se trata de un HFA. Los requisitos previos son tanto la producción por humificación como la unión a la resina DAX-8.
A medida que se aprende más sobre la contribución de los diversos componentes del SA en diferentes aplicaciones, puede resultar ventajoso fraccionar aún más el SA y, por lo tanto, modificar el método en consecuencia. Tal como existe, el método no cuantifica el HYFA. Sin embargo, esta fracción también podría tener actividad, por ejemplo, en la bioestimulación de plantas, donde todo el FF se aplica generalmente en tratamientos agrícolas en lugar de HFA purificado.
Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a la Asociación de Comercio de Productos Húmicos (HPTA) por su apoyo en la financiación del trabajo que resultó en la estandarización de los métodos descritos en este documento y también a Lawrence Mayhew y los Dres. Dan Olk y Paul Bloom por el apoyo técnico durante el trabajo de estandarización.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amberlite IR 120 H+-exchange resin | Sigma-Aldrich | 10322 | H+ form |
| Analytical Balance | Ohaus | PA214 | w/ glass draft shield |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-14 | minimum 4300 rpm |
| Centrifuge tubes | Beckman Coulter | To fit rotor selected | |
| Ceramic Combustion Crucibles | Sigma | Z247103 | |
| Chromatography column for DAX-8 | Diba | Omnifit 006EZ-50-25-FF | |
| Chromatography column for IR 120 | Chemglass | CG-1187-21 2 in. by 24 in. | |
| Dessicator | Capitol Scientic | Kimax 21200-250 | Vacuum type |
| Drying Oven | Fisher Scientific | Isotemp | Precision±3?C |
| Electrical conductivity meter | HM Digital | EC-3 | |
| Erlenmeyer Flasks | Amazon | 1L, 2L | |
| HCl concentrated | Sigma-Aldrich | 320331 | |
| Magnetic Stir Plate | Barnstead-Thermolyne | Dataplate 721 | |
| Magnetic Stir bars | These can be obtained at many outlets | ||
| Muffle Furnace | Fisher scientific | Thermolyne Type 47900 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 795429 | |
| Nitrogen gas | Praxair | UNI1066 | 99.99% purity |
| Peristaltic pump | Cole Parmer | Masterflex 7518-00 | |
| Perstaltic tubing | Cole Parmer | Masterflex Pharmed 06508-17 | |
| pH meter | Oakton Instruments | WD-35618--03 | |
| Rotary Evaporator | Buchi | R-210/R-215 | |
| Spectrophotometer | Healthcare SCiences | Ultrospec II | Dual beam 200 to 900 nm with wavelength accuracy of ±1 nm and reproducibility of ±0.5 nm. |
References
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