Summary
Bu protokolün amacı sürekli insan pankreas adacık engraftment sürecinin dinamikleri ve donör hücrelere karşı katkıda konak izlemektir. Bu bir NOD gözün ön odasına (ACE) insan adacıkları nakli ile gerçekleştirilir. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-fare alıcısı ve ardından tekrarlanan 2-foton görüntüleme.
Abstract
Beta hücrelerinin görüntülenmesi adacık transplantasyonuna yönelik önemli bir adımdır. Beta hücre biyolojisinin kaydı için farklı görüntüleme platformları geliştirilmiş ve in vivokullanılmıştır, tek hücre çözünürlüğü ve sürekli uzunlamasına kayıtlara izin verme açısından sınırlıdır. Korneanın saydamlığı nedeniyle, farelerde gözün ön odası (ACE) iyi insan ve fare pankreas adacık hücre biyolojisi çalışmak için uygundur. Burada bu yaklaşımın aşılama ve bireysel insan adacık greftlerinin revaskülarizasyon sürekli uzunlamasına kayıtları gerçekleştirmek için nasıl kullanılabileceğinibir açıklamasıdır. İnsan adacık greftleri ACE içine yerleştirilir, NOD kullanılarak. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-alıcı olarak fareler. Bu, alıcıya karşı donör hücrelerin genişlemesinin araştırılmasına ve alıcı hücrelerin greftin kapsüllenmesi ve vaskülarizasyonunu teşvik etmedeki katkısına olanak sağlar. Ayrıca, görüntü analizi ve adacık hacmi veya parçalı vaskülatür ve adacık kapsül alıcı hücreleri oluşturan nicelik için adım adım bir yaklaşım özetlenmiştir.
Introduction
Diabetes mellitus, kan şekerinin yükselmesi ile karakterize bir grup metabolik hastalığı pankreas adacık beta hücrelerinin kaybı veya disfonksiyonundan kaynaklanan yetersiz insülin üretiminin sonuçları olarak tanımlar, genellikle insülin direnci ile birlikte. Tip 1 (T1D) ve tip 2 diyabet (T2D) beta hücrelerinin ilerleyici disfonksiyonunun hastalık gelişimine neden olduğu karmaşık hastalıklardır. T1D beta hücrelerine otoimmün bir saldırı ile çökelti, T2D metabolik faktörler tarafından tahrik olarak kabul edilir ken, düşük dereceli sistemik inflamasyon artan kanıtlarla da olsa1. Özellikle T1D hastalarına donör insan adacıklarının nakli fizyolojik glisemik kontrol sağlama potansiyeli sunar. Ancak, doku donörleri ve kötü adacık engraftment bir sıkıntısı bir ana tedavi seçeneği haline adacık nakli engelledi. Fonksiyonel adacık greftinin önemli bir kısmı hipoksik, inflamatuar, immünojenik konakortamı2,3nedeniyle hemen posttransplantasyon sonrası dönemde (24-48 saat) kaybolur. Adacık sağkalımının iyileştirilmesi için müdahale yöntemlerinin etkinliğini değerlendirmek için bu tür transplantasyonların sürekli izlenmesi gerekmektedir.
Transplantasyon sonrası nakledilen insan pankreas adacıklarının kaderini görüntülemek ve izlemek için in vivo teknikleri hala diyabet araştırma4,,5için bir meydan okuma olmaya devam etmektedir . Bugüne kadar pozitron emisyon tomografisi (PET), manyetik rezonans görüntüleme (MRG) veya ultrason (US) dahil olmak üzere noninvaziv görüntüleme teknikleri, deneysel koşullarda nakledilen adacıkların nicelve fonksiyonel değerlendirilmesi için potansiyel göstermektedir5. Ancak, küçük adacık boyutları göz önüne alındığında, bu yöntemlere göre nicel ölçümler yetersiz çözünürlük muzdarip. Gözlem için bir transplantasyon sitesi olarak gözün ön odası (ACE) uzun süreler boyunca etkili bir şekilde daha yüksek mekansal çözünürlük ve sık izleme sunan umut verici bir noninvaziv görüntüleme çözümüdür6. Bu yöntem başarıyla fare adacık biyolojisi (Yang ve ark.7gözden), otoimmün immün yanıtlar8,yanı sıra insan adacık aşılama9,10çalışma için istismar edilmiştir.
Burada ACE transplantasyon yöntemi, transplantasyondan sonra 10 aya kadar bireysel adacık greftleri üzerinde sürekli ve tekrarlanan kayıtlar la insan pankreas adacık engraftment sürecinin dinamiklerini araştırmak için 2-foton görüntüleme yaklaşımı ile birleştirilir. Daha fazla görüntüleme derinliği ve azaltılmış genel fotobeyaztma ve foto hasarı multifoton görüntüleme özellikleri konfokal mikroskopi11görüntüleme sınırlamaları aşmak . Floresan görüntülemenin nicelleştirilmesi, adacık numune hazırlama, adacık nakli, görüntü edinimi, adacık gürültüsünü veya arka planı kaldırmak için görüntü filtreleme, segmentasyon, sayısallaştırma ve veri analizi dahil olmak üzere çeşitli aşamaları içerir. En zorlu adım genellikle bir görüntüyü birden çok parçaya veya bölgeye bölmek veya bölmektir. Bu, sinyali arka plan gürültüsünden ayırmayı veya örneğin adacık vaskülature'u temsil eden bir 3B birimin voksellerini algılamak ve etiketlemek için renk veya şekil benzerliklerine dayalı voxels bölgelerini ayırmayı içerebilir. Bölümlere çıkarıldıktan sonra, nesne hacmi boyutları gibi istatistiklerin ayıklanması genellikle kolaydır. Sağlanan segmentasyon ve veri görselleştirme gibi görüntüleme verilerinin sayısallaştırılması ve ayıklanması için bir yöntemdir. Özellikle dikkat insan adacıkları otofloresan ve adacık vaskülatür ve adacık kapsül alıcı hücreleri oluşturan arasındaki ayrım kaldırılması için ödenir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
İsveç'in Lund kentinde bulunan Bölgesel Etik Komitesi, Çalışmayı, İnsanlarla İlgili Araştırmaların Etik İncelemesini Içeren Yasa'ya göre onayladı. Hayvan deneyleri İsveç hayvan deneyleri etiğine uygun olarak yapıldı ve Malmö ve Lund etik komiteleri tarafından onaylandı. 6 ila 8 haftalık immünoeksik NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/- (NOD. ROSA-domates. Rag2-/-) alıcı fareler insan adacıklarının naklinde alıcı olarak kullanılmıştır10.
1. Transplantasyon için adacık hazırlığı
- CMRL 1066'da 10 mM HEPES ile desteklenen kültür insan adacıkları, 2 mM L-glutamin, 50 μg/mL gentamisin, 0.25 μg/mL fungizone, 20 μg/mL ciproxfloxacin, 10 mM nikotinamid (NIC) ve %10 ısı yalıtımlı insan serumu 37 °C'de %5 CO2 ve transplantasyona kadar nemlendirilmiş hava, daha önce açıklandığı üzere12.
NOT: Adacıklar ekzonrin dokudan arınmalı ve kültürde birbirine dokunmamalıdır. Ekzonrin dokular yarı saydam görünür. - Nakil günü, adacıkları içeren kültür ortamını, çekilen cam kılcal damara bağlı bir aspiratör tüp ütyülü kullanarak yeni bir Petri kabına aktarın.
NOT: Alternatif olarak, 200 μL'lik bir pipet kullanın. Petri kabının arkasını boyamak, adacıkların stereo mikroskop altında daha kolay ayırt edilebilir hale getirmenize yardımcı olur. - Stereo mikroskop kullanarak, transplantasyon başına ~20-40 adacıkları seçin ve 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın. Tüpü en üste, kuvözden gelen kültür medyasıyla doldurun.
- Tüpleri parafin filmile kapatın ve nakil yapılana kadar buzüzerinde saklayın. Yapılan nakil sayısıiçin uygun miktarda hazırlayın.
- Alternatif olarak, adacıkları kültürde tutmak ve her nakilden hemen önce almak için ameliyathanede bir CO2 kuluçka makinesi nin bulunduğundan emin olun.
2. Transplantasyon ekipmanlarının hazırlanması ve cerrahi tablo
NOT: Tüm cerrahi aletler otoklavlı olmalı ve ameliyat masası ve aletler %70 alkol le dezenfekte edilmelidir.
- Stereotaksik bir baş tutucuyu burun maskesi ile anesteziye bağlayın ve ısıtma yastığını açın.
- Bir gaz geçirmez Hamilton şırınga polietilen tüp ve künt uç göz kanül bağlayın.
NOT: Montajdan önce tüm parçaların PBS ile doldurulması önerilir. Sıkışıp hava kabarcıkları için kontrol edin ve varsa kaldırın. - Hamilton şırıngayını masaya sıkıca takın(Şekil 1a)veya hareketli bir taban(Şekil 1e)ve tüpü stereo mikroskoba takın, kanül aşağı asılı (yani bekleme pozisyonu).
NOT: Cerrahi bant kullanın, çünkü kolayca çıkarVe yeniden takın. - 0,1 mg/kg buprenorfin çözeltisi ile doldurulmuş 30 G iğneye bağlı 1 mL şırınga hazırlayın.
- Steril PBS ile bir şırınga hazırlayın. Alternatif olarak, bir pipet kullanın.
- Isıtma lambası ile temiz bir uyandırma kafesi koyun.
3. Ameliyat için alıcı farelerin anestezisi ve konumlandırılması
NOT: Lund Üniversitesi'ndeki hayvan tesislerinde tüm hayvanlar patojensiz bir ortamda yetiştirildi ve bakımını sürdürdü.
- Fareyi %40 O2/60% N2/3 izofluran ile dolu bir odada anesthetize ve sıcak bir ısıtma yastığı üzerinde baş tutucu platforma anestezili fare transfer(Şekil 1a). Pedal refleksleri eksikliği olup olmadığını kontrol edin.
NOT: Isoflurananestezi ameliyat sonrası hızlı iyileşme için tercih edilen anestezi yöntemidir. Mikroskop odası isoflurane kullanmak için düzgün bir şekilde havalandırılmalıdır. - Farenin balığını %40 O 2/60%2N2/0.9%-1.5% isofluran anestezi makinesine bağlı anestezi maskesine yerleştirin. Başparmağı nızı ve parmağınızı kullanarak başı hafifçe yukarı kaldırın ve yanlarda metalik parçaları kullanarak sabitle. Kulaklıkların başLarı doğrudan kulakların altına sabitlediğinden emin olun. Farenin arkasına deri altında 0.1 mg/kg buprenorfin çözeltisi enjekte edin.
NOT: Buprenorfin analjezik olarak kullanılır. - Başını, ameliyat edilecek gözün yukarı bakacak şekilde eğin ve araştırmacıya yakın olun.
- Künt forceps kullanılarak nakledilecek gözün göz kapaklarını hafifçe geri çek, gözü dışarı çıkar ve bir çift cımbızla gevşek bir şekilde düzeltin. Cımbızın uçlarının baş tutucu platforma bağlı polietilen bir tüple kaplı olduğundan emin olun(Şekil 1a,insert).
- Her zaman göz üzerine steril PBS bir damlacık uygulayarak her iki göz ıslak tutun.
- İnsan adacıklarını mühürlü 1,5 mL borudan (bölüm 1) steril PBS'li bir Petri kabına aktarın ve aktarılan hücre kültürü ortamı miktarını en aza indirmek için adacıkların birbirine yakın olduğundan emin olun(Şekil 1c).
- Hamilton şırınga polietilen boru ile bağlı göz kanül ~ 20-30 adacıkları pick up.
NOT: Adacıklarla mümkün olduğunca az sıvı alın. - Tüpü baş aşağı asın ve stereo mikroskoba takın (Şekil 1d). Adacıkların tüpün ucuna kadar kanüle doğru batmasını sağlamak için boruları dikkatlice bantlayın.
4. Transplantasyon prosedürü
NOT: Bu yöntem daha önce fare adacıklarının nakli için tanımlanmıştır6. Burada biraz değiştirilmiş bir yordam sunulmuştur.
- Farenin uyuduklarından emin olmak için arka bacaklardaki pedleri çimdikle.
- Kan akışını bozmadan gözü dizginleyen kasları sıkın ve göze steril PBS damlatın.
- Neşter olarak 25 G iğne kullanarak, yukarı doğru eğilin, dikkatle kornea ucunun sadece yarısını nüfuz ve tek bir lateral kesi yapmak. Deliği yukarı doğru açıyla yapın; delik nakilden sonra daha kolay mühürlenir (Şekil 1f).
- Adacıklarla önceden yüklenmiş kanülile korneayı dikkatlice kaldırın ve göze adacıkları yavaşça uygulayın. Irisin zarar görmesini önlemek için kanülön haznesine kanül takılmaktan kaçının, ancak kornea açıklığı ile dikkatlice itin(Şekil 1g). Yavaşça ACE kanül geri.
NOT: 3-8 μL enjeksiyon hacmini hedefleyin. Hacim çok büyükse, gözü gereksiz yere yüksek göz içi basıncına maruz bırakır ve enjekte edilen adacıkların ön hazneden reflüolmasına neden olabilir. - Göz odasında artan basınç nedeniyle adacıkların takılması ile ilgili zorluklarla karşı karşıya, lateral kesi bölgesitakviye ve adacıklar yeniden uygulayarak kesi bölgesibüyütmek.
NOT: Bazen, tanıtılan hava kabarcıkları uzay tutucuolarak kullanılabilir. - Göze göz jeli uygulayın, göz tutma forsepsgevşetin ve adacıklar ayarlamak için 8-10 dakika boyunca aynı pozisyonda izoflurane fare bırakın.
- Göz kapağını tutan pçineleri çıkarın ve göz kapağını normal konumuna geri koyun.
- Fareyi baş tutucudan çıkarın ve uyandırma kafesine aktarın.
- Fare uyanık ken ve hareket ederken, orijinal kafese geri aktarın ve tarama kadar hayvan muhafaza tutmak (en az 5 gün önerilir).
5. İmplante edilen insan adacıklarının 2-foton mikroskopi ile görüntülenmesi
NOT: 2-foton görüntülemeden 4-5 gün önce transplantasyondan 4-5 gün önce floresan stereoskopik mikroskobu kullanarak gözün genel görüntülerinin alınması, ilgi çekici adacıkların lokalize edilmesi önerilir.Figure 2ac Transplantasyondan sonra gözü bu kadar sıkı bir şekilde dizginlemekten kaçının. Transplantasyon sonrası 6-7 gün 2 foton görüntüleme kullanın.
- Görüntü edinme yazılımını başlatın (bkz. Malzeme Tablosu). "Laser" menüsünde Mai Tai lazerini (Power "ON") ve "Işık Yolu" menüsünde dalga boyu 900 nm'ye ayarlayın ve %5-10 lazer gücüyle başlayan minimum iletim lazer gücü uygulayın (sürgü kullanın).
NOT: Tarama sırasında lazer gücünü gerektiği gibi ayarlayın. - Yeşil, turuncu ve kırmızı kanallar ayarlayın. Dikronik bir ayna (LBF 760) ve emisyon filtresi bilgilerini kullanarak üç adet nondetcanned dedektöre (NDD) aynı anda emisyon ışığı toplayın: Red/Angiosense 680, 690-730 nm; Yeşil/Otofloresans, 500-550 nm; ve Portakal / Domates, 565-610nm (Şekil 2d).
- Baş tutucu sahneyi motorlu mikroskop aşamasına yerleştirin ve gaz maskesini anestezi makinesinin ve havalandırma sistemine bağlı boruların borularına bağlayın. Isıtma yastığını açın.
- Alıcı fareyi anesthetize edin, baş tutucu platformuna aktarın, görüntüleme için gözü dizginleve yukarıda açıklandığı gibi buprenorfin çözeltisini uygulayın (3.1-3.5. adım).
- Isofluran buharlarını gerektiği gibi ayarlayın. Dakikada ~55-65 nefes hızı (bpm) optimal anesteziyi gösterir. Anestezi çok derin ise, oranı olacak <50 bpm ağır nefes alma veya nefes alma; çok hafif ise, oranı yüzeysel nefes ile >70 bpm olacaktır. Anestezi sırasında fareleri her 15 dakikada bir görsel muayene ile dikkatle izleyin.
NOT: Anestezi fareden fareye, fare suşları arasında ve anestezi altında zaman ilerledikçe değişir13. - Kornea ve lens arasında bir daldırma sıvı olarak göze yeterli göz jeli uygulayın, yavaş yavaş birikmesine izin(Şekil 2f, eklemek). Hava kabarcıkları kaçının.
NOT: Odak noktasını ayarlamak ve adacık greftlerini lokalize etmek için esnek metal hortum lambası ile yan aydınlatma önerilir. - Kan damarlarını görselleştirmek için, tek kullanımlık insülin 30 G şırınga kullanarak kuyruk damarına intravenöz olarak görüntüleme maddesinin (örneğin, Angiosense 680) 100 μL'sini uygulayın.
- "Edinme modunda" çerçeve boyutunu 512 x 512 ve tetkik hızına ayarlayın.
NOT: Daha yavaş taramalar (yani, çalışma süresini artırmak) sinyal-gürültü oranını artıracaktır. - "Kanallar" menüsünde, Canlı tarama modunda ekranda bir görüntü görülene kadar sinyali yükseltmek için Volt'taki her PMT için Master Gain'i ayarlayın. Bu değer ne kadar yüksekse, dedektör sinyal ve gürültüye o kadar duyarlı hale gelir.
NOT: Tercihen, değerleri 500-800 V arasında tutun. - "Z-stack" menüsünde, odak noktasını adacık greftinin üstüne elle taşıyarak z yığınının başlangıcını ve sonunu tanımlayın. "Önce Ayarla" seçeneğini seçerek konumu kaydedin. Adacık greftine odaklanabilen son alt düzleme geçin ve"Son Set"seçeneğini seçerek konumu kaydedin. 2 μm z-adım boyutu kullanın.
- "Deneyi Başlat" sekmesini tıklatarak son resim yığınını toplayın ve 8 bit czi (yani Carl Zeiss formatı) dosyasını kaydedin.
6. İmplante edilen insan adacıklarının konfokal mikroskopi ile görüntülenmesi
NOT: Nakledilen adacıkların toplam hacmi, morfolojisi ve plastisiteleri, lazer arka saçılmaışığının 10algılanması yla in vivo saçılma sinyalinin ayrı bir taramalarda (yani ayrı parça) izlenmesi yle değerlendirilebilir.
- Ana ışın ayırıcısını (yani LBF Filtresi) ve "Işık Yolu" iletişim kutusunda, konfokal görüntüleme için ayrı bir parça ayarlayın. 633 nm dalga boyuna sahip Argon lazerini seçin ve lazer ışığıyla aynı dalga boyunda algılamayı seçin. Z-yığınları, geri saçılma ışık sinyali için 2-3 μm'lik bir adım boyutuile elde edilir.
- Tüm adacık kaydını yaptığınızdan emin olmak için z yığını ayarlarını düzeltin (bkz. adım 5.10).
- Görüntü yığınını edinin ve 8 bit CZI dosyası olarak kaydedin.
7. Görüntü analizi
NOT: Bu adım için ticari yazılım (bkz. Malzeme Tablosu)kullanılmıştır.
- Adacık otofloresansı çıkarma (Şekil 3b)
- "Görüntü işleme" sekmesinde "Kanal aritmetik" ve "ch1-ch2" yazın. Bu yeni bir kanal 4 (ch 4) oluşturur; olarak yeniden adlandırın "Vasculature".
NOT: Yeşil/Otofloresan kanalı Red/Angiosense kanalından çıkarılır. - Yeni bir kanal (ch 5) oluşturmak için önceki adımı tekrarlayın ve "ch3-ch2" yazın; olarak yeniden adlandırın "Domates (tüm)".
NOT: Yeşil/Otofloresan kanalı Turuncu/Domates kanalından çıkarılır.
- "Görüntü işleme" sekmesinde "Kanal aritmetik" ve "ch1-ch2" yazın. Bu yeni bir kanal 4 (ch 4) oluşturur; olarak yeniden adlandırın "Vasculature".
- Adacık maskesinin manuel çizimle tanımlanması (Şekil 3c)
- Yeni bir yüzey (mavi sembol) oluşturun ve sihirbazda "El ile Edit" seçeneğini belirleyin. Bölümleri görselleştirmek için işaretçiyi "Seç" modunda ve 3B görünümde "Volume" (Scenealtında) seçeneğini kdurumunda tutun.
- Daha kolay adacık sınır ayrımcılığı için, ch 1-ch 3 dahil olmak üzere tüm kanalları etkinleştirin.
NOT: Portakal/Domates kanalı, adacık kenarlıklarını Domates kapsülü sinyali ile tanımlamak için yararlıdır. Alternatif olarak, kılavuz olarak çok kanallı adacık otofloresan ve dedektör arka plan sinyalini kullanmak için kanal yoğunluklarını artırın. - "Çizim" sekmesinde "Kontur" seçeneğini belirleyin ve dilim konumundan başlayarak adacık kenarlığı çevresinde kontur çizmeye başlamak için "Çiz "tuşuna basın.
- Yeni bir dilim konumuna geçin ve çizim hatlarını tekrarlayın. Adaçayının üstündeki son dilimle bitirin ve "Yüzey oluştur" sekmesine tıklayarak sona erdirin. Genellikle her10 dilim kontur çizmek için yeterlidir.
- "Adacık vaskülature" ve "Adacık domatesi" floresanının adacık maskesi kullanılarak segmentasyonu (Şekil 3d).
- Önceden tanımlanmış "Adacık maskesi" nesnesini seçin, düzenleme sekmesine(kalem simgesi) gidin ve yeni bir pencere açan "Maske tüm" sekmesine tıklayın.
- Kanal seçimi açılır menüsünde daha önce adlandırılmış "Vasculature" (ch 4) kanal ını seçin vemaskeyi uygulamadan önce" Yinelenen kanal ", "Constant iç/dış" seçeneklerini etkinleştirin ve voxel'leri yüzey dışında "0,000" olarak ayarlayın, bu da yeni bir kanal oluşturur; "Adacık vaskülature" (ch 6) olarak yeniden adlandırın.
- 7.3.1 ve 7.3.2 adımlarını tekrarlayın ve kanal seçiminde daha önce oluşturulmuş "Tomato (all)" (ch 5) kanal ını seçin ve yeni kanalı oluşturmak için menüden açılır; "Adacık domatesi" (ch 7) olarak yeniden adlandırın.
- Adacık vaskülatürünün yüzey işlemesi (Şekil 3e)
- "Scene" menüsünde yeni bir yüzey oluşturun ve sihirbazda "Otomatik oluşturma" seçeneğini belirleyin.
- Kaynak kanalı daha önce oluşturulmuş "Islet vasculature" (ch 6) olarak ayarlayın ve arka plan çıkarma nızı seçin. Gerekirse otomatik eşik tahmini ayarlanabilir. Yanıt veren floresan kanalıyla karşılaştırın (örneğin, yeni oluşturulan yüzey sekmesini karıştırarak/çıkararak). Sihirbaza devam edin.
- İsteğe bağlı olarak, filtreler kullanın. Örneğin, "Birim" seçeneğini belirleyin ve penceredeki filtreyi (sarı) ayarlayarak seçili yüzey nesnelerini kaldırabilen leri ayarlayın. Sihirbazı bitirin ve yeni yüzey nesnesine "Adacık vaskülature" adını verin.
- "Adacık domates vaskülatür" floresan sinyalinin segmentasyonu (Şekil 3f)
- Daha önce oluşturulan "Adacık vaskülature" yüzey nesnesinde düzenleme sekmesine gidin ve yeni bir pencere açan "Maske tüm" sekmesine tıklayın.
- Kanal seçimimenüsünde daha önce adı geçen "Islet tomato" (ch 7) kanalını seçin ve yeni kanalı oluşturan "10.000" olarak yüzeyin dışındaki voxel'leri ayarlayın; "Adacık domates vaskülature" (ch 8) olarak yeniden adlandırın.
- " Domateskapsülü" floresan sinyalinin segmentasyonu (Şekil 3g)
- "Görüntü işleme" sekmesinde "Kanal Aritmetik"seçeneğini seçin ve "ch7-ch8" yazın, yeni kanal oluşturma; " Domateskapsülü" (ch 9) olarak yeniden adlandırın.
NOT: "Adacık domates vaskülature" floresan sinyali toplam "Adacık domates" floresan sinyali çıkarılır.
- "Görüntü işleme" sekmesinde "Kanal Aritmetik"seçeneğini seçin ve "ch7-ch8" yazın, yeni kanal oluşturma; " Domateskapsülü" (ch 9) olarak yeniden adlandırın.
- Yüzey işleme "Adacık domates vaskülature" ve "Domates kapsülü" (Şekil 3h)
- Adım 7.4 izleyin ve sihirbaz kaynak kanalları seçin "Adacık domates vaskülature" (ch 8) veya "Domates kapsülü" (ch 9) buna göre yeni yüzey nesneleri oluşturmak için.
- Toplam adacık yüzeyinin yüzey işlemesi (Şekil 3i)
- Adacık geri dağılım dosyasını açın ve yeni bir yüzey oluşturun.
- Sihirbazda , "Otomatik oluşturma" seçeneğini belirleyin ve " İlgi Alanı " olaraktanımlayın.
NOT: "İlgi bölgesi" birden fazla adacık sinyallerini ayırmak ve analiz edilecek adacık derinliğini tanımlamak için kullanılır (örn. en iyi 75 μm). - "Mutlak yoğunluk" gerekirse eşiği ayarlayın. Yüzey nesnesi, ilgili kanal yoğunluğuyla çapraz kontrol için tıklanabilir veya kapatılabilir. Sihirbazı kapatın.
- Niceleme (Şekil 3j)
- "Scene" menüsünde oluşturulan bir yüzey nesnesini seçin ve "İstatistikler" sekmesine gidin.
- Seçili yüzey nesnesinde ayrıntılı hacim verilerini almak için "Ayrıntılı" sekmesini seçin ve açılır menüden "Belirli değerler" ve "Birim" seçeneğini belirleyin. Seçili yüzey nesnesinin toplam birim değerini almak için "Ayrıntılı" sekmesine gidin ve "Ortalama değerleri" seçin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etiketsiz insan adacıkları 8 haftalık dişi NOD ACE'ye nakledildi. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-(NOD. ROSA-domates. Rag2−/−) alıcı fareler. İnsan dokusunun reddini önlemek için, immün eksik Rag2 nakavt fareler alıcı olarak seçildi. Bu transgenik farelerde, tüm hücre ve dokular alıcı ve donör doku net bir kimlik sağlayan bir membran hedefli domates floresan protein (mT) ifade. Adacık greftlerinin yüksek çözünürlüklü 2-foton mikroskobu ile tekrartekrar görüntülenmesi, engreftasyon sürecinde yer alan mT+ alıcı hücreleri ve bunların dinamik göç paterni belirleyebilir.
Genel olarak, alıcı farelerin ACE içine insan adacıklarının transplantasyon kurulumu(Şekil 1a) adacık şekli ve büyüklüğü açısından sinjenenik fare adacık transplantasyonları benzer (Şekil 1b,c). Şekil 1d,e lateral kesi bölgesini gösteren ayrıntılı bir şema ile tipik bir transplantasyon gösterir (Şekil 1f) ve adacıkların göz odasına dağılımı (Şekil 1g) ve enjekte edilmiş fare adacıklarının temsili bir sonucu (Şekil 1h) veya insan adacıkları (Şekil 1i). İnsan adacıklarının aşılama oranı genellikle daha düşüktü (%~30) fare adacıklarından (%50-70) daha fazladır. Bu tutarsızlığın olası bir nedeni, insan adacıklarının bulunabilirliğinin genellikle sadece 1 gün önceden haber veremesiyle öngörülemez olması ve elde edilen adacıkların donör yaşı, donör BMI, saflık (%45-86) ve izolasyon sonrası kültür süresine (2-5 gün) göre değişmesidir. Buna karşılık, farelerden adacık izolasyonları kolayca planlanabilir. Bunlar 6-8 haftalık (yani genç yetişkin) yüksek saflıkta ve kısa, gece kültür zamanlarına sahip farelerden izole edildi. Sonuçlar yorumlanırken fare ve insan adacık greftleri arasındaki bu tutarsızlıklar göz önünde bulundurulmalıdır.
İnsan adacık greftlerinin in vivo floresan görüntülemesi doku otofloresansının önemli bir müdahalesi ile tehlikeye atıldı (Şekil 4). ACE-transplanted insan adacık greftlerinin görünür spektrumda geleneksel dalga boyları kullanılarak görüntüleme ajanları ile revaskülarizasyon sürecinin görüntülenmesi düşük sinyal-gürültü oranı ve yüksek doğal adacık otofloresans düzeyi ile engellenmiştir. 500-700 nm(Şekil 4a)spektral aralığında ki λ-taraması görüntüleri veya dekstran TR (610-675 nm)(Şekil 4b)tespiti için filtreli hassas nondetcanned PMT dedektörü ile gösterilmiştir. Bu yüksek arka plan fare adacık greftlerinde gözlenmedi (Şekil 4c). NIR yayan görüntüleme ajanı Angiosense 680, NIR aralığında ki arka plan gürültüsündeki 690-730 nm'deki düşüşlere bağlı olarak gözle görülür şekilde daha yüksek sinyal-arka plan oranı gösterdi (Şekil 4d, Şekil 3a). "Kullanılmayan" bir kanalın ek kaydı (yani, 500-550 nm) daha sonraki bir görüntü işleme adımında, doğal adacık otofloresansının neden olduğu kalan arka plan gürültüsünü gidermek için kullanılabilir. 2-foton / konfokal görüntüleme kurulum (Şekil 2d–f) daha önce açıklanan olanlar6benzer , 900 nm 2-foton uyarma ve Angiosense 680 floresan tespiti kullanımı için kaydetmek, otofloresan, ve nondetcanned PMTs ile domates kanalları 1-3 (Şekil 2d). Her mikroskop kurulumu için numuneye ulaşan lazer çıkış gücünün ölçülmesi tavsiye edilir(Şekil 2e). Ayrıca, başlangıçta stereomikroskopi ile aşılanmış adacıkların görüntülemesi tavsiye edilir(Şekil 2a–c), hangi ilgi adacıkları seçmek ve başarısız bir transplantasyon 2-foton mikroskopi görüntüleri önlemek yardımcı olacaktır.
Birçok resimden nicel veri ayıklamanın amacı, veri seçimindeki olası önyargıyı ortadan kaldırmak ve deneyleri karşılaştırırken meşru bir etkiyi saptamak için gerekli istatistiksel gücü elde etmekti. Pankreas adacıklarının floresan görüntülemeden niceliksel birkaç adım içeriyordu, her biri başka bir sonuçları etkilemiş olabilir. Burada interaktif görüntüleme yazılımı kullanılmıştır. Hacim görüntülerinin ve nesnelerin görselleştirilmesine ve nesnelerin morfolojilerine veya yoğunluğuna göre tanımlanmasına olanak tanıyan özellikler içerir. Şekil 3, görüntü segmentasyonundaki farklı adımları göstermektedir. "Otofloresans" kanalının çıkarılarak otofloresans çıkarılması sinyal-gürültü oranını iyileştirmiştir(Şekil 3a,b). "Adacık maskesi" (Şekil 3c)adı verilen adacık sınırı ve ilgili kanallar(Şekil 3d)el ile tanımlanmıştır. Domates sinyalinin adacık vaskülatürü ve adacık kapsülüne segmentasyonu (Şekil 3f,g) ve son yüzey işleme (Şekil 3e,h,i) nicel veri ayıklamak için kullanılmıştır.
Şekil 5, aynı insan adacık greftinin 2 hafta, 2 ay, 5 ay ve 8 ay sonra NOD ACE'sine nakledildiği temsili bir uzunlamasına görüntüleme seansını göstermektedir. ROSA-domates. Rag2-/- alıcı fare. Resimli olan, başlangıçta kaydedilmiş RAW verilerinin maksimum yoğunluklu projeksiyonları (MIP) görüntüleridir(Şekil 5a),adacık otofloresan sildikten sonra işlenmiş görüntüler(Şekil 5b–e, f–i),ve kapsül(Şekil 5j,m)veya adacık vaskülatür oluşturan mT+ alıcı hücreleri (kırmızı, Şekil 5n-q) ve toplam vaskülature (yeşil, Şekil 5nq) dahil olmak üzere parçalı adacık nesneleri .
Şekil 1: Göz ön odasına pankreas adacıklarının nakli.
(a) Stereotaksik baş tutucuya sabitlenmiş anestezili fareyi ve hazırlanan Hamilton şırıngasın yanında bulunan gözü (inset) gösteren transplantasyon kurulumu ve fare adacıklarını toplamaya hazır stereomikroskop (b) veya insan adacıkları (c). (d) Adacıklarla dolu göz kanülünün bekleme pozisyonu. (e) Transplantasyon sürecinde, ve (f) tek bir lateral kesi şematik çizim dikkatle göz kanül ucu ile kornea kadar kaldırmak ve ön odasına adacıkları dağıtmak için kullanılır (g). Fare adacıklarınınveyainsan adacıklarının(i)enjeksiyonundan hemen sonra gözün görüntüsü . Ölçek çubuğu = 500 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: ACE implante pankreas adacık greftlerinin görüntülenmesi.
(a) Deneysel floresan stereo mikroskop görüntüleme kurulumu. Geniş alan (b) veya floresan görüntü (c) B6. ROSA-domates adacık greftleri. (d) Emisyon ışık yolunun basitleştirilmiş şeması. LBF: Lazer engelleme filtresi (ana ışın ayırıcı); LP: Uzun pas; BP: Bant geçişi; PMT: Fotoçarpan. (e) Lazer çıkış gücü kuvvetle dalga boyuna bağlıdır. Diyagram, mikroskop kurulumu için ölçülen lazer ışınının güç seviyesi (%) ile ilgili Watt (W) cinsinden gerçek lazer çıkış gücünü gösterir. Daire: 800 nm, kare: 900 nm, üçgen: 1.000 nm. (f) Alıcı fareyi, motorlu etap üzerine monte edilmiş ACE aşılı adacıklarla (insert) gösteren deneysel görüntüleme kurulumu ticari bir mikroskop. Ölçek çubuğu = 100 μm Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: NOD ACE'sinde aşılanmış bir insan adaletinin görüntü segmentasyonu. ROSA-domates. Rag2-/- alıcı fare.
(a) Orijinal kayıt: Angiosense 680 (ch 1), otofloresans (ch 2) ve domates (ch 3) bölünmüş kanalların birleştirilmiş kanalları veya optik bölümleri ile bir insan adacık bir görüntü yığını bir 3D render olduğunu gösterir. (b) Görüntü yığınının, otofloresan salındıktan sonra bölünmüş kanallar "Vasculature" (ch 4) ve "Tomato(all)" (ch 5) kanalları ile birleştirilmiş kanallar veya optik bölümlerle 3Boyutlu olarak işlenmesi. (c) Adacık maskesi (sarı). (d) Görüntü yığınının birleştirilmiş veya bölünmüş kanallara sahip 3B işlemesi "adacık vaskülature" (ch 6, beyaz), "adacık domates" (ch 7, kırmızı). (e) Yüzey nesnesi "adacık vaskülatür" ch 6'dan oluşturulur. (f) Görüntü yığınının birleştirilmiş kanallarla 3Boyutlu işlemesi "adacık vaskülature" (ch 6, yeşil) ve "adacık domates vaskülature" (ch 8, kırmızı). (g) 3D render "domates kapsülü" (ch 9) kanal çıkarma ch 7-ch 8 veya optik bölüm ile birleştirilmiş kanallar ile "domates kapsülü" (ch 9, beyaz), adacık domates vaskülature (ch 8, kırmızı) ve adacık vaskülature (ch 6, yeşil). (h) Domates kapsülünün yüzey işlemesi (ch 9'dan oluşturulmuştur) ve adacık domates vaskülatürü (ch 8'den oluşturulmuş). (i) Kanal yoğunluğuna (sağda) göre "İlgi Bölgesi"(solda) ve parçalı yüzey nesnesi (orta) seçimini gösteren insan adacık geri dağılım sinyalinden adacık segmentasyonu. (j) İstatistik sekmesinden veri alınması. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: İnsan adacıklarının otofloresansı.
İnsan adacıkları (a,b,d) veya B6 fare adacıkları (c) NOD ACE içine nakledildi. Rag2-/- veya B6 alıcı fareler ve dextran TR enjekte (a–c) veya Angiosense 680 görüntüleme ajanı (d) kan damarlarının görselleştirilmesi için. (a) 900 nm'de 2-foton uyarma ile 500-700 nm aralığında insan adacık greftinin λ-tcan. Maksimum görüntü projeksiyonu (MIP) insan görüntüsü (b) veya fare adacık grefti (c) 900 nm'de heyecanlı ve NDD'nin TR filtresi (610-675 nm) ile tespit edileb. (d) Bir insan adacık greftinin MIP'i 900 nm'de heyecanlanır ve NDD'nin Angiosense 680 filtresi (690-730 nm) ile saptanabilir. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Nakledilen insan adacıkları kademeli olarak revkülarize edilir ve alıcı kökenli hücreleri ifade eden mT tarafından kapsüllenir.
NoD'un ön göz odasına nakledilen insan adacıkları. ROSA-domates. Rag2−/− alıcı fareler, 8 aya kadar art arda görüntülendi. Anjiyosense 680 vaskülatür görselleştirme için enjekte edildi. (a)Maksimum yoğunlukprojeksiyonları (MIP) split orijinal kaydedilen RAW veri (vaskülature, otofloresan, mT) veya birleştirilmiş kanallar ve backscatter ışık sinyali 5 ay sonra transplantasyon. Tek başına toplam vaskülatür MIPS(b–e) veya membran hedefli domates floresan (mT) (f–i) adacık otoflourescence kaldırma sonra birleştirilmiş (yeşil, a). Parçalı adacık domates kapsülü 3D render(j–m) ve adacık domates vaskülatür (kırmızı) veya toplam adacık vaskülatür (yeşil) (n–q) belirtilen zaman noktalarında transplantasyon sonrası. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bir yöntem alıcı ve donör doku tutulumu gözlemleyerek insan pankreas adacık hücre greftleme süreci çalışma sunulmaktadır. İnsan adacıklarını immünofif fare gözünün ön odasına yerleştiren minimal invaziv bir ameliyattan sonra fare ameliyattan birkaç dakika sonra hızla iyileşir. İşlem tek göze yapılır. Genellikle, 5-7 gün postimplantasyon itibaren kornea yeterince intravital görüntüleme yapmak için iyileşmiş.
Bu protokolde insan adacık greftlerinin kalitesi çok önemlidir. İnsan adacık kalitesi ve böylelikle nakil sonucu donörün yaşına, BMI'sine ve izolasyon sürecine ve varıştan önce ve sonra adacık kültürünün zamanına bağlı olarak değişebilir. Klinik transplantasyon ve araştırma amaçlı olarak onaylanan organ bağışı pankreasından işlenen insan adacıkları bağışçıların rızası ile kullanılmıştır. Onlar pankreas sindirim ve adacık arıtma başka bir yerde açıklanan bir süreç sonra elde edildi12. İzole murine adacıkları benzer, bu adacıklar gibi hücresel saldırılar bir dizi uğrar iskemi, mekanik stres, bodrum proteinlerinin kaybı, ve intra-adacık endotel hücrelerinin kısmi bozulma (ECs) enzimatik sindirim adım sırasında14,15. Kültür koşullarının sürekli iyileştirilmesine ve çok sayıda yüksek kaliteli insan adacıklarının geri kazanılmasına rağmen, nakil zamanı kritik bir faktör olmaya devam etmektedir. Kültürün ilk günlerinde, insan adacıkları intra-adacık eCs önemli bir kayıp göstermek ve kültür altı gün sonra adacık çekirdeğinde sadece küçük endotel yapıları tespit edilebilir16. Donör adacık ECs revaskülarizasyon sürecinde önemli oyuncular17çünkü intra-adacık endotel hücrelerinin bu kaybı, insan adacıklarının azaltılmış greftleme kritik bir faktör oluşturabilir.
Transplantasyon işlemi sırasında kısırlığın korunması, immünazasyonsuz NOD'de göz enfeksiyonlarını önlemek için çok önemlidir. ROSA-domates. Rag2-/- fareler. Tipik olarak, transplantasyon işlemleri eldiven, laboratuvar önlüğü, baş örtüsü ve ağız maskesi kullanılarak temiz koşullarda gerçekleştirilir, ancak biyogüvenlik kabininde yapılmaz. Kullanılan tüm solüsyonlar steril filtrelenir ve şırıngalar, kanüller, tüp ve gazlı bez %70 etanol içinde durulanır. Uyandırma kafesleri otoklavlanır. İşlem sırasında farenin elle kullanımı nedeniyle tam sterilite garanti edilemezken, adacık kontaminasyonu veya göz enfeksiyonları bu prosedürle ilgili sorunlar olmamıştır.
Stabil ve yeterli anestezi düşük framerate veri toplama sırasında göz hareketlerini ve sürüklenme azaltmak için önemli ve kritik bir faktördür ve etkinliği farklı anestezik ajanlar arasında değişebilir18. Işık altında, genel izofluran anestezi, göz bazen yavaş haddeleme moda ve anestezi derinliği arttı hareket eder (1-2%) genellikle göz hareketlerini azaltabilir. İnhal edilebilir anestezi kullanmanın açık avantajı hızlı etkisi ve iyileşme süresidir. Ancak, isofluran kullanımının insülin salgısını değiştirebileceğine dikkat çekilmelidir19.
Görüntü analizi ve segmentasyonu veya bir görüntünün birden çok bölgeye bölünmesi, zorludur ve veri seçiminde potansiyel önyargıya tabidir20. Segmentasyon, nicelleştirme için "adacık vaskülatür" gibi nesneleri tanımlamayı amaçlar. Burada, kenarları bulmak için belirli bölgelere (yani "mutlak yoğunluk") veya yoğunluk farklılıklarına (yani "arka plan çıkarma") yoğunluk eşiğine dayalı yöntemler uygulandı. Şu anda floresan mikroskopide segmentasyon için evrensel bir çözüm bulunmamaktadır. Bir yaklaşım, çeşitli yöntemleri destekleyen ticari yazılımlarla denemeler yapmaktır. Arka plan yoğunluğu değişimi nedeniyle eşik başarısız olursa, görüntü yakalama ayarlarındaki küçük değişiklikler segmentasyon sonuçlarını artırabilir.
Yöntemin bir sınırlama insan greftdaha hızlı alıcı hücreleri ile değiştirilir ve aslında, tamamen fare alıcı endotel hücreleri tarafından yeniden aslında yatıyor. Amaç insan endotel hücreleri ile etkileşimler yoluyla adacık parankim içine göç evlat edinen insan bağışıklık hücreleri üzerinde çalışmak ise bu insan hücre etkileşimleri çalışmaları engel olacaktır. Ancak, fare ve insan adacık greftleri hem de, benzer revaskülarizasyon alıcı oluşur ve türler için özel farklı anatomik 3D planı izler.
Beta hücre replasman tedavisinin başarı oranları artmaya devametmektedir. Yine de, adacık greftleme ve vivo hayatta kalma verimliliğini değerlendirmede çeşitli zorluklar uygun intravital görüntüleme teknolojilerinin eksikliği nedeniyle çözülmemiş kalır. Anterior göz odası yararlı bir transplantasyon sitesidir, adacık morfolojisi, vaskülarizasyon desenleri, beta hücre fonksiyonu ve hücresel çözünürlükte beta hücre ölümü çalışmaları için adacık hücrelerinin tekrarlanan ve uzun süreli in vivo görüntüleme destekleyen.
ACE transplantasyon sitesinde insan adacık nakli aşılama sürecini incelemek için protokol burada bildirilen diğer alternatif uzunlamasına platformlar ile elde edilen daha çok daha yüksek çözünürlük ile insan adacık greftuzun uzunlamasına izlenmesi için izin verirMRI 21,22, PET23, SPECT24, veya Biyolüminesans25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma İsveç Araştırma Konseyi, Stratejik Araştırma Alanı Exodiab, Dnr 2009-1039, İsveç Stratejik Araştırma Vakfı Dnr IRC15-0067 tarafından LUDC-IRC, Lund, Diabetesförbundet ve Barnförbundet'teki Kraliyet Fizyografik Derneği tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anasthesia machine, e.g. Anaesthesia Unit U-400 | Agnthos | 8323001 | used for isofluran anasthesia during surgery and imaging |
| -induction chamber 1.4 L | Agnthos | 8329002 | connect via tubing to U-400 |
| -gas routing switch | Agnthos | 8433005 | connect via tubing to U-400 |
| AngioSense 680 EX | Percin Elmer | NEV10054EX | imaging agent for injection, used to image blood vessels in human islet grafts |
| Aspirator tubes assemblies | Sigma | A5177-5EA | connect with pulled capillary pipettes for manual islet picking |
| Buprenorphine (Temgesic) 0.3mg/ml | Schering-Plough Europé | 64022 | fluid, for pain relief |
| Capillary pipettes | VWR | 321242C | used together with Aspirator tubes assemblies |
| Dextran-Texas Red (TR), 70kDa | Invitrogen | D1830 | imaging agent for injection |
| Eye cannula, blunt end , 25 G | BVI Visitec/BD | BD585107 | custom made from Tapered Hydrode lineator [Blumenthal], dimensions: 0.5 x 22mm (25G x 7/8in) (45?), tip tapered to 30 G (0.3mm) |
| Eye gel | Novartis | Viscotears, contains Carbomer 2 mg/g | |
| Hamilton syringe 0.5 ml, Model 1750 TPLT | Hamilton | 81242 | Plunger type gas-tight syringe for islet injection |
| Head holder | |||
| -Head holding adapter | Narishige | SG-4N-S | assemled onto metal plate |
| -gas mask | Narishige | GM-4-S | |
| -UST-2 Solid Universal Joint | Narishige | UST-2 | assemled onto metal plate |
| -custom made metal plate for head-holder assembly | |||
| -Dumont #5, straight | Agnthos | 0207-5TI-PS or 0208-5-PS | attached to UST-2 (custom made) |
| Heating pad, custom made | taped to the stereotaxic platform | ||
| Human islet culture media | |||
| -CMRL 1066 | ICN Biomedicals | cell culture media for human islets | |
| -HEPES | GIBCO BRL | ||
| -L-glutamin | GIBCO BRL | ||
| -Gentamycin | GIBCO BRL | ||
| -Fungizone | GIBCO BRL | ||
| -Ciproxfloxacin | Bayer healthcare AG | ||
| -Nicotinamide | Sigma | ||
| Image analysis software | Bitplane | Imaris 9 | |
| Image Aquisition software | Zeiss | ZEN 2010 | |
| Infrared lamp | VWR | 1010364937 | used to keep animals warm in the wake-up cage |
| Isoflurane Isoflo | Abott Scandinavia/Apotek | fluid, for anesthesia | |
| Needle 25 G (0.5 x 16mm), orange | BD | 10442204 | used as scalpel |
| Petri dishes, 90mm | VWR | 391-0440 | |
| 2-Photon/confocal microscope | |||
| -LSM7 MP upright microscope | Zeiss | ||
| -Ti:Sapphire laser Tsunami | Spectra-Physics, Mai Tai | ||
| -long distance water-dipping lens 20x/NA1.0 | Zeiss | ||
| -ET710/40m (Angiosense 680) | Chroma | 288003 | |
| -ET645/65m-2p (TR) | Chroma | NC528423 | |
| -ET525/50 (GFP) | Chroma | ||
| -ET610/75 (tomato) | Chroma | ||
| -main beam splitter T680lpxxr | Chroma | T680lpxxr | Dichroic mirror to transmit 690 nm and above and reflect 440 to 650 nm size 25.5 x 36 x 1 mm |
| Polythene tubing (0.38mm ID, 1.09 mm OD) | Smiths Medical Danmark | 800/100/120 | to connect with Hamilton syringe and eye canula |
| Stereomicroscope | Nikon | Model SMZ645, for islet picking | |
| Stereomicroscope (Flourescence) | for islet graft imaging | ||
| -AZ100 Multizoom | Nikon | wide field and long distance | |
| -AZ Plan Apo 1x | Nikon | ||
| -AZ Plan Apo 4x | Nikon | ||
| -AZ-FL Epiflourescence with C-LHGFI HG lamp | Nikon | ||
| -HG Manual New Intensilight | Nikon | ||
| -Epi-FL Filter Block TEXAS RED | Nikon | contains EX540-580, DM595 and BA600-660 | |
| -Epi-FL Filter Block G-2A | Nikon | (EX510-560, DM575 and BA590) | |
| -Epi-FL Filter Block B-2A | Nikon | (EX450-490, DM505 and BA520) | |
| -DS-Fi1 Colour Digital Camera (5MP) | Nikon | ||
| Syringe 1-ml, Omnitix | Braun | 9161406V | for Buprenorphine injection, used with 27 G needle |
| Surgical tape | 3M |
References
- Kharroubi, A. T., Darwish, H. M. Diabetes mellitus: The epidemic of the century. World Journal of Diabetes. 6 (6), 850-867 (2015).
- Kanak, M. A., et al. Inflammatory response in islet transplantation. International Journal of Endocrinology. 2014, 451035 (2014).
- Nanji, S. A., Shapiro, A. M. Advances in pancreatic islet transplantation in humans. Diabetes, Obesity, Metabolism. 8 (1), 15-25 (2006).
- Malaisse, W. J., Maedler, K. Imaging of the beta cells of the islets of Langerhans. Diabetes Research and Clinical Practice. 98 (1), 11-18 (2012).
- Kim, D., Jun, H. S. In Vivo Imaging of Transplanted Pancreatic Islets. Frontiers in Endocrinology. 8, 382 (2017).
- Speier, S., et al. Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye. Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).
- Yang, S. N., Berggren, P. O. The eye as a novel imaging site in diabetes research. Pharmacology, Therapeutics. 197, 103-121 (2019).
- Schmidt-Christensen, A., et al. Imaging dynamics of CD11c(+) cells and Foxp3(+) cells in progressive autoimmune insulitis in the NOD mouse model of type 1 diabetes. Diabetologia. 56 (12), 2669-2678 (2013).
- Berclaz, C., et al. Longitudinal three-dimensional visualisation of autoimmune diabetes by functional optical coherence imaging. Diabetologia. 59 (3), 550-559 (2016).
- Nilsson, J., et al. Recruited fibroblasts reconstitute the peri-islet membrane: a longitudinal imaging study of human islet grafting and revascularisation. Diabetologia. 63 (1), 137-148 (2020).
- Benninger, R. K., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapteer 4 Unit 4 11-24 (2013).
- Goto, M., et al. Refinement of the automated method for human islet isolation and presentation of a closed system for in vitro islet culture. Transplantation. 78 (9), 1367-1375 (2004).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563 (2011).
- Jansson, L., Carlsson, P. O. Graft vascular function after transplantation of pancreatic islets. Diabetologia. 45 (6), 749-763 (2002).
- Konstantinova, I., Lammert, E. Microvascular development: learning from pancreatic islets. Bioessays. 26 (10), 1069-1075 (2004).
- Fransson, M., et al. Mesenchymal stromal cells support endothelial cell interactions in an intramuscular islet transplantation model. Regenerative Medicine Research. 3, 1 (2015).
- Nyqvist, D., et al. Donor islet endothelial cells in pancreatic islet revascularization. Diabetes. 60 (10), 2571-2577 (2011).
- Nair, G., et al. Effects of common anesthetics on eye movement and electroretinogram. Documenta Ophthalmologica. Advances in Ophthalmology. 122 (3), 163-176 (2011).
- Iwasaka, H., et al. Glucose intolerance during prolonged sevoflurane anaesthesia. Canadian Journal of Anaesthesia. 43 (10), 1059-1061 (1996).
- Hamilton, N. Quantification and its applications in fluorescent microscopy imaging. Traffic. 10 (8), 951-961 (2009).
- Michelotti, F. C., et al. PET/MRI enables simultaneous in vivo quantification of beta-cell mass and function. Theranostics. 10 (1), 398-410 (2020).
- Wang, P., et al. Monitoring of Allogeneic Islet Grafts in Nonhuman Primates Using MRI. Transplantation. 99 (8), 1574-1581 (2015).
- Gotthardt, M., et al. Detection and quantification of beta cells by PET imaging: why clinical implementation has never been closer. Diabetologia. 61 (12), 2516-2519 (2018).
- Joosten, L., et al. Measuring the Pancreatic beta Cell Mass in Vivo with Exendin SPECT during Hyperglycemia and Severe Insulitis. Molecular Pharmaceutics. 16 (9), 4024-4030 (2019).
- Virostko, J., et al. Bioluminescence imaging in mouse models quantifies beta cell mass in the pancreas and after islet transplantation. Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 42-53 (2010).
