Summary
O objetivo deste protocolo é monitorar continuamente a dinâmica do processo de engrafamento da ilhota pancreática humana e o acolhimento contribuinte versus células doadoras. Isso é feito transplantando ilhotas humanas na câmara anterior do olho (ACE) de um NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-receptor do mouse seguido de repetidas imagens de 2 fótons.
Abstract
As células beta de imagem são um passo fundamental para entender o transplante de ilhotas. Embora diferentes plataformas de imagem para o registro da biologia celular beta tenham sido desenvolvidas e utilizadas in vivo,elas são limitadas em termos de permitir resolução de células únicas e gravações longitudinais contínuas. Devido à transparência da córnea, a câmara anterior do olho (ACE) em camundongos é bem adequada para estudar biologia de células ilhotas pancreáticas humanas e de camundongos. Aqui está uma descrição de como essa abordagem pode ser usada para realizar gravações longitudinais contínuas de enxerto e revascularização de enxertos de ilhotas humanas individuais. Enxertos de ilhotas humanas são inseridos no ACE, usando NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-ratos como destinatários. Isso permite a investigação da expansão das células receptoras versus doadoras e a contribuição das células receptoras na promoção do encapsulamento e vascularização do enxerto. Além disso, é delineada uma abordagem passo a passo para análise de imagens e quantificação do volume de ilhotas ou vasculatura segmentada e cápsula de ilhota formando células receptoras.
Introduction
Diabetes mellitus descreve um grupo de doenças metabólicas caracterizadas por níveis elevados de glicose no sangue como resultado da produção insuficiente de insulina de perda ou disfunção de células beta de ilhotas pancreáticas, muitas vezes acompanhadas pela resistência à insulina. Diabetes tipo 1 (T1D) e tipo 2 (T2D) são doenças complexas nas quais a disfunção progressiva das células beta causa o desenvolvimento da doença. O T1D é precipitado por um ataque autoimune nas células beta, enquanto o T2D é considerado impulsionado por fatores metabólicos, embora com evidências crescentes de inflamação sistêmica de baixo grau1. O transplante de ilhotas humanas doadoras, particularmente para pacientes com T1D, oferece o potencial para fornecer controle fisiológico glicêmico. No entanto, a escassez de doadores de tecidos e o enxerto de ilhotas pobres impediram o transplante de ilhotas para se tornar uma opção terapêutica convencional. Uma proporção substancial do enxerto de ilhota funcional é perdida no período pós-transplantação imediato (24-48 h) devido ao ambiente hospedeiro hipóxico, inflamatório e imunogênico2,3. Para avaliar a eficiência dos métodos de intervenção para a melhoria da sobrevida de ilhotas, é necessário o acompanhamento contínuo desses transplantes.
Técnicas in vivo para imagem e rastrear o destino das ilhotas pancreáticas humanas transplantadas após o transplante ainda permanecem um desafio para a pesquisa sobre diabetes4,5. Até o momento, técnicas não invasivas de imagem, incluindo tomografia de emissão de pósitrons (PET), ressonância magnética (RM) ou ultrassom (EUA) mostram potencial para quantificação e avaliação funcional de ilhotas transplantadas em condições experimentais5. No entanto, dado o pequeno tamanho de ilhotas, as medições quantitativas por essas modalidades sofrem de resolução insuficiente. A câmara anterior do olho (ACE) como local de transplante para observação é uma promissora solução de imagem não invasiva que oferece efetivamente maior resolução espacial e monitoramento frequente ao longo dos longos períodos6. Este método foi explorado com sucesso para estudar a biologia da ilhota do rato (revisada em Yang et al.7), respostas imunes autoimunes8, bem como enxerto de ilhotas humanas9,,10.
Aqui, o método de transplante ACE é combinado com uma abordagem de imagem de 2 fótons para investigar a dinâmica do processo de enxerto de ilhotas pancreáticas humanas por gravações contínuas e repetidas em enxertos de ilhotas individuais por até 10 meses após o transplante. As propriedades de imagem multifotíferas de maiores profundidades de imagem e redução do fotobleaching geral e danos fotográficos superam as limitações de imagem da microscopia confocal11. A quantificação da imagem fluorescente envolve várias etapas, incluindo preparação da amostra de ilhotas, transplante de ilhotas, aquisição de imagens, filtragem de imagens para remover ruído ou fundo de ilhotas, segmentação, quantificação e análise de dados. O passo mais desafiador é geralmente particionar ou segmentar uma imagem em várias partes ou regiões. Isso pode envolver a separação do sinal do ruído de fundo, ou regiões de agrupamento de voxels com base em semelhanças em cor ou forma para detectar e rotular voxels de um volume 3D que representa vasculatura ilhota, por exemplo. Uma vez segmentadas, estatísticas como tamanhos de volume de objeto são tipicamente simples de extrair. Fornecido é um método para quantificação e extração dos dados de imagem, como segmentação e visualização de dados. Atenção especial é dada à remoção da autofluorescência em ilhotas humanas e à distinção entre vasculatura de ilhotas e cápsula de ilhota formando células receptoras.
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Protocol
O Comitê regional de Ética em Lund, Suécia, aprovou o estudo de acordo com o Ato relativo à Revisão Ética da Pesquisa Envolvendo Humanos. Os experimentos em animais foram realizados em estrita conformidade com a ética sueca dos experimentos em animais e aprovados pelos comitês de ética de Malmö e Lund. NOD imunodeficente de 6 a 8 semanas. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/- (NOD. Rosa-tomate. Os camundongos receptores rag2-/-foram utilizados como receptores para transplante de ilhotas humanas10.
1. Preparação de ilhotas para transplante
- Cultura ilhotas humanas em CMRL 1066 suplementadas com 10 mM HEPES, 2 mM L-glutamina, 50 μg/mL gentamicina, 0,25 μg/mL fungizone, 20 μg/mL ciproxfloxacina, 10 mM de nicotinamida (NIC) e soro humano inativado a 37 °C em 5% CO2 e ar umidificado até o transplante, como descrito anteriormente12.
NOTA: As ilhotas devem estar livres de tecido exócrino e não se tocarem na cultura. Os tecidos exócrinos parecem translúcidos. - No dia do transplante, transfira a mídia cultural contendo as ilhotas para uma nova placa de Petri usando um conjunto de tubos aspiradores conectados a um capilar de vidro puxado.
NOTA: Alternativamente, use uma pipeta de 200 μL. Colorir a parte de trás da placa de Petri ajuda a tornar as ilhotas mais facilmente distinguíveis sob o microscópio estéreo. - Usando um microscópio estéreo, escolha ~20-40 ilhotas por transplante e transfira para um tubo de 1,5 mL. Encha o tubo até o topo com mídia cultural da incubadora.
- Sele os tubos com filme de parafina e guarde no gelo até o transplante. Prepare uma quantidade adequada para o número de transplantes realizados.
- Alternativamente, certifique-se de que uma incubadora de CO2 esteja disponível na sala de cirurgia para manter ilhotas na cultura e escolhê-las imediatamente antes de cada transplante.
2. Preparação de equipamentos de transplante e mesa de cirurgia
NOTA: Todas as ferramentas cirúrgicas devem ser autoclavadas, e a mesa de cirurgia e os instrumentos desinfetados com 70% de álcool.
- Conecte um suporte de cabeça estereotaxic à anestesia através de uma máscara de nariz e ligue a almofada de aquecimento.
- Conecte uma seringa Hamilton gasosa à tubulação de polietileno e uma cânula de olho final sem cortes.
NOTA: Recomenda-se encher todas as peças com PBS antes da montagem. Verifique se há bolhas de ar presas e remova se estiver presente. - Conecte a seringa hamilton firmemente à mesa (Figura 1a) ou uma base móvel(Figura 1e) e conecte a tubulação ao microscópio estéreo, com cânula pendurada para baixo (ou seja, posição de espera).
NOTA: Use fita cirúrgica, pois é fácil de remover e recolocar. - Prepare uma seringa de 1 mL conectada a uma agulha de 30 G recheada com solução de buprenorfina de 0,1 mg/kg.
- Prepare uma seringa com PBS estéril. Alternativamente, use uma pipeta.
- Reserve uma gaiola de despertar limpa com lâmpada de aquecimento.
3. Anestesia e posicionamento de camundongos receptores para cirurgia
NOTA: Todos os animais foram criados e mantidos em um ambiente livre de patógenos nas instalações de animais da Universidade de Lund.
- Anestesiar o mouse em uma câmara cheia de 40% O2/60% N2/3% isoflurane e transferir o mouse anestesiado para a plataforma porta-cabeça em uma almofada de aquecimento quente(Figura 1a). Verifique a falta de reflexos do pedal.
NOTA: A anestesia isoflurane é o método preferido da anestesia para recuperação rápida após a cirurgia. A sala do microscópio deve ser devidamente ventilada para o uso de isoflurano. - Coloque o focinho do mouse na máscara de anestesia conectada a 40% O2/60% N2/0,9%-1,5% máquina de anestesia isoflurane. Use o polegar e o dedo para levantar a cabeça ligeiramente e fixá-la usando as peças metálicas nas laterais. Certifique-se de que os fones de ouvido fixam a cabeça diretamente abaixo das orelhas. Injete 0,1 mg/kg de solução de buprenorfina subcutânea na parte de trás do mouse.
NOTA: Buprenorfina é usada como analgésico. - Incline a cabeça para que o olho a ser operado esteja voltado para cima e fique perto do pesquisador.
- Retraia suavemente as pálpebras do olho para serem transplantadas usando fórceps contundentes, estoure o olho para fora e conserte livremente com um par de pinças. Certifique-se de que as pontas das pinças estejam cobertas com um tubo de polietileno preso à plataforma do porta-cabeça(Figura 1a, insira).
- Mantenha sempre os dois olhos molhados aplicando uma gota de PBS estéril no olho.
- Transfira as ilhotas humanas do tubo de 1,5 mL selado (seção 1) para uma placa de Petri com PBS estéril e certifique-se de que as ilhotas estejam próximas umas das outras para minimizar a quantidade de mídia de cultura celular transferida(Figura 1c).
- Pegue ~20-30 ilhotas na cânula do olho conectadas através de tubos de polietileno à seringa Hamilton.
NOTA: Tome o mínimo de líquido possível com as ilhotas. - Pendure o tubo de cabeça para baixo e conecte-se ao microscópio estéreo(Figura 1d). Tape a tubulação cuidadosamente para deixar as ilhotas afundar até o final do tubo em direção à cânula.
4. Procedimento de transplante
NOTA: Este método foi descrito anteriormente para o transplante de ilhotas de camundongos6. Um procedimento ligeiramente modificado é apresentado aqui.
- Aperte as almofadas nas patas traseiras para ter certeza de que o mouse está dormindo.
- Aperte os fórceps que restringem o olho sem interromper o fluxo sanguíneo e aplique uma gota de PBS estéril no olho.
- Usando uma agulha de 25 G como bisturi, bisel para cima, penetrar cuidadosamente apenas metade da ponta na córnea e fazer uma única incisão lateral. Faça o buraco em um ângulo ascendente; o orifício sela mais facilmente após o transplante(Figura 1f).
- Levante cuidadosamente a córnea com a cânula pré-carregada com ilhotas e aplique lentamente ilhotas no olho. Evite a inserção da cânula na câmara anterior para evitar danos da íris, mas empurre cuidadosamente contra a abertura da córnea(Figura 1g). Retraia lentamente a cânula do ACE.
NOTA: Aponte para um volume de injeção de 3-8 μL. Se o volume for muito grande, ele vai expor o olho à pressão intraocular desnecessariamente alta e pode resultar em refluxo das ilhotas injetadas para fora da câmara anterior. - Ao enfrentar dificuldades com a inserção das ilhotas devido ao aumento da pressão na câmara ocular, amplie o local da incisão reforçando o local de incisão lateral e reaplicando ilhotas.
NOTA: Ocasionalmente, bolhas de ar introduzidas podem ser usadas como suportes espaciais. - Aplique gel ocular no olho, solte os fórceps de contenção dos olhos e deixe o rato na isoflurano na mesma posição por 8-10 minutos para deixar as ilhotas definidas.
- Remova as pórceps segurando a pálpebra e coloque a pálpebra de volta à sua posição normal.
- Retire o mouse do suporte da cabeça e transfira-o para uma gaiola de despertar.
- Quando o rato estiver acordado e em movimento, transfira-o de volta para a gaiola original e mantenha-o na carcaça dos animais até a varredura (pelo menos 5 dias são recomendados).
5. Imagem de ilhotas humanas implantadas por microscopia de 2 fótons
NOTA: Ter imagens de visão geral do olho usando um microscópio estereoscópico fluorescência(Figura 2a–c)4-5 dias após o transplante antes da imagem de 2 fótons é recomendado para localização das ilhotas de interesse. Evite conter o olho muito fortemente tão cedo após o transplante. Use imagens de 2 fótons de 6 a 7 dias após a transferência.
- Inicie o software de aquisição de imagens (ver Tabela de Materiais). No menu "Laser" ativar o laser Mai Tai (Power "ON") e no menu "Light Path" definir o comprimento de onda para 900 nm e aplicar uma potência laser de transmissão mínima começando com 5%-10% de potência laser (use controles deslizantes).
NOTA: Durante a varredura, ajuste a potência do laser conforme necessário. - Coloque canais verdes, laranjas e vermelhos. Colete a luz de emissão simultaneamente em três detectores não pesquisados (NDD) usando um espelho dicrônico (LBF 760) e informações do filtro de emissão da seguinte forma: Vermelho/Angiosense 680, 690-730 nm; Verde/Autofluorescência, 500-550 nm; e Laranja/Tomate, 565-610nm (Figura 2d).
- Coloque o estágio do porta-cabeça no estágio do microscópio motorizado e conecte a máscara de gás ao tubo da máquina de anestesia e tubos conectados ao sistema de ventilação. Ligue a almofada de aquecimento.
- Anestesiar o mouse receptor, transferir para a plataforma do suporte principal, conter o olho para imagem e administrar a solução de buprenorfina conforme descrito acima (etapas 3.1-3.5).
- Ajuste os vapores isoflurane conforme necessário. Uma taxa de respiração de ~55-65 respirações por minuto (bpm) indica anestesia ideal. Se a anestesia for muito profunda, a taxa será de <50 bpm com respiração pesada ou ofegante; se muito leve, a taxa será >70 bpm com respiração superficial. Monitore cuidadosamente os ratos durante a anestesia por inspeção visual a cada 15 minutos.
NOTA: A anestesia varia de mouse para mouse, entre cepas de camundongos, e à medida que o tempo sob anestesia progride13. - Administre gel ocular suficiente no olho como um líquido de imersão entre a córnea e a lente, permitindo que ele se acumule lentamente(Figura 2f, insira). Evite bolhas de ar.
NOTA: Recomenda-se a iluminação lateral com uma lâmpada de mangueira de metal flexível para ajustar o foco e localização de enxertos de ilhotas. - Para visualizar os vasos sanguíneos, administre 100 μL do agente de imagem (por exemplo, Angiosense 680) por via intravenosa na veia traseira usando uma seringa de insulina descartável de 30 G.
- Em "Modo aquisição" ajuste o tamanho do quadro para 512 x 512 e a velocidade de varredura.
NOTA: As varreduras mais lentas (ou seja, o aumento do tempo de moradia) melhorarão a relação sinal-ruído. - No menu "Canais" ajuste o Ganho Mestre para cada PMT em Volts para amplificar o sinal até que uma imagem seja vista na tela no modo de digitalização ao vivo. Quanto maior esse valor, mais sensível o detector se torna ao sinal e ao ruído.
NOTA: De preferência, mantenha valores entre 500-800 V. - No menu "Z-stack" definir o início e o fim da pilha z movendo manualmente o foco para a parte superior do enxerto de ilhota. Salvar posição selecionando "Definir Primeiro". Mova-se para o último plano inferior que pode ser focado no enxerto de ilhota e salvar a posição selecionando"Set Last". Use um tamanho de passo z de 2 μm.
- Colete a pilha de imagens final clicando na guia "Iniciar experimento" e salvar como arquivo CZI de 8 bits (ou seja, formato Carl Zeiss).
6. Imagem de ilhotas humanas implantadas por microscopia confocal
NOTA: O volume total, a morfologia e a plasticidade das ilhotas transplantadas podem ser avaliados monitorando o sinal de dispersão in vivo em uma varredura separada (ou seja, faixa separada) pela detecção da luz do backscatter laser10.
- Pegue o divisor de feixe principal (ou seja, filtro LBF) e no diálogo "Light Path" configure uma faixa separada para imagens confocal. Escolha o laser argon com comprimento de onda de 633 nm e detecção no mesmo comprimento de onda que a luz laser. As pilhas Z são adquiridas com um tamanho de passo de 2-3 μm para sinal de luz backscatter.
- Reajuste as configurações de pilha de z para ter certeza de gravar toda a ilhota (ver passo 5.10).
- Adquira a pilha de imagens e salve como arquivo CZI de 8 bits.
7. Análise de imagem
NOTA: O software comercial (ver Tabela de Materiais) foi utilizado para esta etapa.
- Remoção da autofluorescência da ilhota (Figura 3b)
- Na aba "Processamento de imagem" escolha " Canalaritmética" e digite "ch1-ch2". Isso cria um novo canal 4 (ch 4); renomear como "Vasculatura".
NOTA: O canal Verde/Autofluorescência é subtraído do canal Vermelho/Angiosense. - Repita a etapa anterior e digite "ch3-ch2" para criar um novo canal (ch 5); renomear como "Tomate (todos)".
NOTA: O canal Verde/Autofluorescência é subtraído do canal Laranja/Tomate.
- Na aba "Processamento de imagem" escolha " Canalaritmética" e digite "ch1-ch2". Isso cria um novo canal 4 (ch 4); renomear como "Vasculatura".
- Definição de máscara de ilhota por desenho manual(Figura 3c)
- Crie uma nova superfície (símbolo azul) e no assistente escolha "Editar manualmente". Mantenha o ponteiro no modo "Selecionar" e na exibição 3D despresoar "Volume" (em Cena) para visualizar seções.
- Para facilitar a discriminação na fronteira de ilhéus, ative todos os canais, incluindo ch 1-ch 3.
NOTA: O canal Laranja/Tomate é útil para definir bordas de ilhotas pelo sinal da cápsula de tomate. Alternativamente, aumente a intensidade do canal para usar a autofluorescência de ilhotas multicanais e o sinal de fundo do detector como orientação. - Na aba "Drawing" escolha "Contorno" e clique em "Desenhar" para começar a desenhar contornos ao redor da borda da ilhota começando na posição de fatia 1.
- Mova-se para uma nova posição de fatia e repita os contornos de desenho. Finalize com a última fatia na parte superior da ilhota e finalize clicando na guia "Criar superfície". Normalmente é suficiente para desenhar contornos a cada 10fatias.
- Segmentação de "Vasculatura de ilhotas" e fluorescência detomate ilhotausando máscara de ilhota(Figura 3d).
- Escolha o objeto "Máscara de Ilhota" previamente definido, vá para a guia de edição (símbolode lápis) e clique na guia "Máscara all", que abre uma nova janela.
- Escolha o canal anteriormente nomeado "Vasculatura" (ch 4) no menu suspenso da seleção do canal e ative as opções "Duplicate channel before applying mask", "Constant inside/outside", e defina voxels fora da superfície para "0.000", que cria um novo canal; renomear como "Vasculatura ilhota" (ch 6).
- Repita as etapas 7.3.1 e 7.3.2 e escolha o canal previamente criado "Tomate (todos)" (ch 5) no menu suspenso da seleção do canal para criar o novo canal; renomear como "Tomate ilhota" (ch 7).
- Renderização superficial de vasculatura de ilhotas (Figura 3e)
- Crie uma nova superfície no menu "Cena" e no assistente escolha "Criação automática".
- Defina o canal de origem para "Islet vasculatura" (ch 6) e escolha subtração de fundo. A estimativa automática do limiar pode ser ajustada se necessário. Compare com o canal de fluorescência que responde (por exemplo, misturando entrada/saída da guia de superfície recém-criada). Prossiga no mago.
- Opcionalmente, use filtros. Por exemplo, escolha "Volume" e ajuste o filtro (amarelo) na janela, que pode remover objetos de superfície selecionados. Termine o assistente e nomeie o novo objeto de superfície "Vasculatura de ilhota".
- Segmentação do sinal de fluorescência detomate ilhota(Figura 3f)
- No objeto de superfície "Islet vasculatura" criado anteriormente, vá para a guia de edição e clique na guia "Mascarar tudo", que abre uma nova janela.
- Escolha o canal anteriormente nomeado "Islet tomate" (ch 7) no menu de seleção do canal e defina voxels fora da superfície para "10.000", que cria o novo canal; renomear como "Vasculatura de tomate ilhota" (ch 8).
- Segmentação do sinal de fluorescência da" cápsulade tomate "(Figura 3g)
- Escolha "Channel Aithmetic's" na guia "processamento de imagem" e digite "ch7-ch8", criando o novo canal; renomear como "Cápsula de Tomate" (ch 9).
NOTA: O sinal de fluorescência de tomate deilhotaé subtraído do sinal total de fluorescência de" tomate ilhota".
- Escolha "Channel Aithmetic's" na guia "processamento de imagem" e digite "ch7-ch8", criando o novo canal; renomear como "Cápsula de Tomate" (ch 9).
- Renderização superficial de "Vasculatura de tomate ilhota" e "cápsula de tomate"(Figura 3h)
- Siga o passo 7.4, e no assistente escolha os canais de origem "Vasculatura de tomate ilhota" (ch 8) ou "Cápsula de Tomate" (ch 9) para criar novos objetos de superfície em conformidade.
- Renderização superficial da superfície total da ilhota(Figura 3i)
- Abra o arquivo backscatter da ilhota e crie uma nova superfície.
- No mago, escolha "Criação automática" e defina " Regiãode interesse".
NOTA: "Região de interesse" é usada para separar os sinais de múltiplas ilhotas e para definir a profundidade da ilhota a ser analisada (por exemplo, topo 75 μm). - Em "Intensidade absoluta" ajuste o limiar, se necessário. O objeto de superfície pode ser clicado ligado ou desligado para cruzar com a intensidade correspondente do canal. Feche o feiticeiro.
- Quantificação (Figura 3j)
- Selecione um objeto de superfície criado no menu "Cena" e vá para a guia "Estatísticas".
- Para recuperar dados de volume detalhados no objeto de superfície selecionado, escolha a guia "Detalhada" e selecione "Valores específicos" e "Volume" no menu suspenso. Para recuperar um valor total de volume do objeto de superfície selecionado, vá para a guia "Detalhado" e escolha "Valores médios".
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Representative Results
Ilhotas humanas não rotuladas foram transplantadas no ACE de uma mulher de 8 semanas de idade. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-(NOD. ROSA-tomate. Rag2−/−) camundongos receptores. Para evitar a rejeição do tecido humano, os camundongos de rag2 imunodeficientes foram escolhidos como receptores. Nestes camundongos transgênicos, todas as células e tecidos expressaram uma proteína de fluorescência de tomate (mT) direcionada à membrana que permite a identificação clara do receptor e do tecido doador. Imagens repetidas de enxertos de ilhotas por microscopia de 2 fótons de alta resolução poderiam identificar células mT+ receptoras envolvidas no processo de engraftment e seu padrão dinâmico de migração.
Em geral, a configuração de transplante de ilhotas humanas no ACE dos camundongos receptores (Figura 1a) foi semelhante aos transplantes de ilhotas de camundongos sinénicos no que diz respeito à forma e tamanho da ilhota(Figura 1b,c). Figura 1d,e mostra um transplante típico com um esquema detalhado mostrando o local de incisão lateral (Figura 1f) e dispersão de ilhotas na câmara ocular(Figura 1g) e um resultado representativo de ilhotas de rato injetadas(Figura 1h) ou ilhotas humanas(Figura 1i). A taxa de enxerto de ilhotas humanas foi geralmente menor (~30%) do que a das ilhotas de rato (50 a 70%). Uma possível razão para essa discrepância é que a disponibilidade de ilhotas humanas é imprevisível, geralmente com apenas um dia de aviso prévio, e também que as ilhotas obtidas variam na idade do doador, IMC do doador, pureza (45%-86%) e tempo de cultura de pós-seolação (2 a 5 dias). Em contraste, isolamentos de ilhotas de camundongos podem ser facilmente planejados. Estes foram isolados de camundongos de 6 a 8 semanas de idade (ou seja, jovens adultos) com alta pureza e tempos curtos de cultura durante a noite. Essas discrepâncias entre enxertos de ilhotas de camundongos e humanos devem ser consideradas ao interpretar os resultados.
A imagem de fluorescência in vivo dos enxertos de ilhotas humanas foi comprometida por interferência significativa da autofluorescência tecidual(Figura 4). A visualização do processo de revascularização de enxertos de ilhotas humanas transplantados pela ACE por agentes de imagem usando comprimentos de onda tradicionais no espectro visível foi dificultada por uma baixa relação sinal-ruído e alto nível de autofluorescência de ilhotas naturais, ilustrado por imagens de uma varredura λ na faixa espectral de 500-700 nm(Figura 4a) ou pelo detector pmt sensível não pesquisado com filtro para detecção de dextran TR (610-675 nm)(Figura 4b). Este fundo alto não foi observado em enxertos de ilhotas de rato(Figura 4c). O agente de imagem emissor do NIR Angiosense 680 mostrou uma relação sinal-fundo visivelmente maior devido a reduções no ruído de fundo na faixa NIR 690-730 nm (Figura 4d, Figura 3a). A gravação adicional de um canal "não utilizado" (ou seja, 500-550 nm) poderia ser usada em uma etapa de processamento de imagem posterior para remover o ruído de fundo restante causado pela autofluorescência natural da ilhota. A configuração de imagem de 2 fótons/confocal (Figura 2d–f) é semelhante às descritas anteriormente6, exceto pelo uso de 900 nm 2-fótons de excitação e detecção de fluorescência de Angiosense 680, autofluorescência e canais de tomate com PMTs não-íscritos 1-3(Figura 2d). É aconselhável medir a potência de saída de laser atingindo a amostra para cada configuração do microscópio(Figura 2e). Além disso, recomenda-se inicialmente visualizar as ilhotas enxertadas com estereomicroscopia (Figura 2a–c), que ajudará a selecionar ilhotas de interesse e evitar imagens de microscopia de 2 fótons de um transplante mal sucedido.
O objetivo de extrair dados quantitativos de muitas imagens foi remover viés potencial na seleção de dados e obter o poder estatístico necessário para detectar um efeito legítimo ao comparar experimentos. A quantificação da imagem fluorescente de ilhotas pancreáticas envolveu várias etapas, cada uma das quais pode ter influenciado os resultados em outra. Aqui, foi usado um software interativo de imagem. Contém características que permitem visualização de imagens e objetos de volume e identificação de objetos de acordo com sua morfologia ou intensidade. A Figura 3 ilustra os diferentes passos na segmentação de imagens. A remoção da autofluorescência por subtração do canal "autofluorescência" melhorou a relação sinal-ruído(Figura 3a,b). O limite de ilhotas chamado "máscara de ilhota"(Figura 3c) e os canais correspondentes(Figura 3d) foram definidos manualmente. A segmentação do sinal de tomate na vasculatura de ilhotas e na cápsula de ilhotas(Figura 3f,g) e renderização final da superfície(Figura 3e,h,i) foi utilizada para extrair dados quantitativos.
A Figura 5 mostra uma sessão representativa de imagem longitudinal do mesmo enxerto de ilhota humana em 2 semanas, 2 meses, 5 meses e 8 meses de pós-transplantação no ACE de um NOD. ROSA-tomate. Rag2-/ - rato receptor. Ilustradas são ilustradas imagens de projeções de intensidade máxima (MIP) de dados RAW originalmente gravados(Figura 5a),imagens processadas após a remoção da autofluorescência da ilhota(Figura 5b–e, f–ilhota)e objetos de ilhotas segmentados, incluindo cápsulaq(Figura 5j,m)ou vasculatura ilhota formando células mT+ receptores (vermelho, Figura 5n-q) e vasculatura de ilhota total (verde, Figura 5n
Figura 1: Transplante de ilhotas pancreáticas na câmara anterior do olho.
(a) Configuração de transplante mostrando o mouse anestesiado fixado no suporte da cabeça estereotipada e o olho exposto (inset) ao lado da seringa Hamilton preparada fixada à mesa e o estereomicroscope pronto para colher ilhotas de rato(b)ou ilhotas humanas(c). ddPosição de espera da cânula do olho carregada com ilhotas. (e) Transplante em processo, e (f) desenho esquemático de uma única incisão lateral usada para levantar cuidadosamente a córnea com a ponta da cânula do olho e distribuir ilhotas na câmara anterior (g). Imagem do olho imediatamente após a injeção de ilhotas de rato(h)ou ilhotas humanas(i). Barra de escala = 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagem de enxertos de ilhotas pancreáticas implantados pela ACE.
(a) Configuração experimental de imagens de microscópio estéreo fluorescente. Widefield (b) ou imagem fluorescente (c) de B6. Enxertosde ilhota rosa-tomate. ddEsquema simplificado do caminho da luz de emissão. LBF: Filtro de bloqueio a laser (divisor de feixe principal); LP: Passe longo; BP: Passe de banda; Fotomultiplier. (e) A potência de saída a laser depende fortemente do comprimento de onda. O diagrama mostra a potência real de saída do laser em Watts (W) relacionada ao nível de potência do raio laser (%), medida para a configuração do microscópio. Círculo: 800 nm, quadrado: 900 nm, triângulo: 1.000 nm. (f) Configuração experimental de imagem mostrando o mouse receptor com ilhotas enxertadas ace (inserir) montadas no estágio motorizado um microscópio comercial. Barra de escala = 100 μm Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Segmentação de imagem de uma ilhota humana enxertado no ACE de um NOD. ROSA-tomate. Rag2-/ - rato receptor.
(a) Gravação original: Mostrado é uma renderização 3D de uma pilha de imagem de uma ilhota humana com canais mesclados ou seções ópticas de canais divididos Angiosense 680 (ch 1), autofluorescência (ch 2) e tomate (ch 3). (b) renderização 3D da pilha de imagens com canais mesclados ou seções ópticas com canais divididos "Vasculatura" (ch 4) e "Tomate(todos)" (ch 5) após a remoção da autofluorescência. ccMáscara de ilhota (amarelo). (d) renderização 3D da pilha de imagens com canais mesclados ou divididos "vasculatura ilhota" (ch 6, branco), "tomate ilhota" (ch 7, vermelho). (e) Objeto de superfície "vasculatura ilhota" criado a partir de ch 6. (f) renderização 3D da pilha de imagens com canais mesclados "vasculatura ilhota" (ch 6, verde) e "vasculatura de tomate ilhota" (ch 8, vermelho). (g) renderização 3D de " cápsula detomate" (ch 9) após subtração do canal ch 7-ch 8 ou seção óptica com canais mesclados " cápsulade tomate" (ch 9, branco), vasculatura de tomate ilhota (ch 8, vermelho) e vasculatura de ilhota (ch 6, verde). (h) Renderização superficial da cápsula de tomate (criada a partir de ch 9) e vasculatura de tomate ilhota (criada a partir de ch 8). (i) Segmentação de ilhotas a partir do sinal de requescatter de ilhotas humanas mostrando a seleção de "Região de interesse" (esquerda) e o objeto de superfície segmentado (meio) em comparação com a intensidade do canal (direita). (j)Recuperação de dados da guia estatísticas. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Autofluorescência de ilhotas humanas.
Ilhotas humanas (a,b,d) ou ilhotas de rato B6(c) foram transplantadas no ACE de NOD. Camundongosreceptores Rag2-/- ou B6 e injetados com dextran TR (a–c) ou agente de imagem Angiosense 680(d)para visualização de vasos sanguíneos. (a) λ-scan de enxerto de ilhota humana na faixa de 500-700 nm com excitação de 2 fótons a 900 nm. Imagem máxima de projeção de imagem (MIP) de enxerto de ilhota humana (b) ou enxerto de ilhota do rato(c)excitada a 900 nm e detectada com o filtro TR (610-675 nm) do NDD. (d) MIP de um enxerto de ilhota humana animado em 900 nm e detecção com o filtro Angiosense 680 (690-730 nm) do NDD. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Ilhotas humanas transplantadas são progressivamente revascularizadas e encapsuladas por células expressas de mT de origem receptora.
Ilhotas humanas transplantadas na câmara ocular anterior do NOD. ROSA-tomate. Os camundongos rag2-/− receptores foram imageados repetidamente por até 8 meses. Angiosense 680 foi injetado para a visualização da vasculatura. (a) Projeções de intensidade máxima (MIP) de dados RAW registrados originais de split (vasculatura, autofluorescência, mT) ou canais mesclados e sinal de luz de backscatter em 5 meses pós-transplantação. MIPS de vasculatura total sozinho (b–e) ou fundido com fluorescência de tomate direcionada à membrana (mT) (f–i) após a remoção da autoflourescência da ilhota (verde, a). Renderizações 3D de cápsula de tomate ilhota segmentada (j–m) e vasculatura de tomate ilhota (vermelho) ou vasculatura de ilhota total (verde) (n–q) nos pontos de tempo indicados pós-transplantação. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Um método é apresentado para estudar o processo de enxerto de células de ilhotas pancreáticas humanas, observando o envolvimento do receptor e do tecido doador. Após uma cirurgia invasiva mínima implantando ilhotas humanas na câmara anterior de um olho de rato imunodeficente, o rato se recupera rapidamente em poucos minutos após a cirurgia. O procedimento é realizado em um olho. Geralmente, de 5 a 7 dias de postimplantação em diante a córnea é suficientemente curada para realizar imagens intravitais.
Neste protocolo, a qualidade dos enxertos de ilhotas humanas é crítica. A qualidade da ilhota humana e, assim, o resultado do transplante podem variar dependendo da idade do doador, IMC e processo de isolamento, bem como tempo de cultura de ilhotas antes e depois da chegada. Ilhotas humanas processadas a partir de pâncreas doadores de órgãos aprovados para transplante clínico e fins de pesquisa foram utilizadas com consentimento dos doadores. Eles foram obtidos após um processo de digestão do pâncreas e purificação de ilhotas descritas em outros lugares12. Semelhantes às ilhotas murinas isoladas, essas ilhotas sofrem uma série de ataques celulares, como isquemia, estresse mecânico, perda de proteínas do porão e interrupção parcial das células endotelias intra-iletas (CE) durante a digestão enzimática passo14,15. Apesar de melhorar constantemente as condições culturais e a recuperação de um grande número de ilhotas humanas de alta qualidade, o tempo para o transplante continua sendo um fator crítico. Durante os primeiros dias de cultura, as ilhotas humanas mostram uma perda significativa de CEs intra-ilhotas e após seis dias de cultura apenas pequenas estruturas endoteliais no núcleo da ilhota podem ser detectadas16. Essa perda de células endoteliais intra-ilhotas pode constituir um fator crítico na redução do enxerto de ilhotas humanas, pois as CEs de ilhotas doadoras são atores importantes no processo de revascularização17.
Manter a esterilidade durante o procedimento de transplante é fundamental para evitar infecções oculares no NOD imunocomprometido. ROSA-tomate. Rag2-- ratos. Normalmente, os procedimentos de transplante são realizados em condições limpas usando luvas, jaleco, capa da cabeça e máscara bucal, mas não dentro de um armário de biossegurança. Todas as soluções utilizadas são filtradas estéreis, e seringas, cânula, tubulação e gaze são enxaguadas em 70% de etanol. As gaiolas de despertar são autoclavadas. Embora a esterilidade total não possa ser garantida devido ao manuseio manual do camundongo durante o procedimento, a contaminação da ilhota ou infecções oculares não foram problemas com este procedimento.
A anestesia estável e adequada é um fator importante e crítico para a redução dos movimentos oculares e a deriva durante a aquisição de dados de baixo framerate, e a eficácia pode variar entre diferentes agentes anestésicos18. Sob a anestesia geral isoflurane, o olho ocasionalmente se move de forma lenta e maior profundidade de anestesia (de 1 a 2%) geralmente pode reduzir os movimentos dos olhos. A clara vantagem do uso da anestesia inalável é seu rápido efeito e tempo de recuperação. Deve-se ressaltar, no entanto, que o uso de isofânuree pode alterar a secreção da insulina19.
A análise e segmentação de imagens, ou o particionamento de uma imagem em várias regiões, são desafiadores e sujeitos a viés potencial na seleção de dados20. A segmentação visa identificar objetos como a "vasculatura de ilhotas" para quantificação. Aqui, métodos baseados no limiar de intensidade foram aplicados a regiões selecionadas (ou seja, "intensidade absoluta") ou diferenças de intensidade para encontrar bordas (ou seja, "subtração de fundo"). Atualmente, não há soluções universais para segmentação em microscopia fluorescente. Uma abordagem é experimentar com softwares comerciais que suportam uma gama de métodos. Se o limiar falhar por causa da variação de intensidade de fundo, pequenas alterações nas configurações de captura de imagem podem melhorar os resultados de segmentação.
Uma limitação do método reside no fato de que o enxerto humano é mais rapidamente substituído por células receptoras e, de fato, completamente reconstituído por células endoteliais receptoras de camundongos. Isso impediria estudos de interações celulares humanas se o objetivo é estudar células imunes humanas adotadas que migram para o parenchyma ilhota através de interações com células endoteliais humanas. No entanto, tanto nos enxertos de ilhotas de camundongos quanto humanos, a revascularização semelhante ocorre a partir do receptor e segue o plano 3D anatômico diferente específico para a espécie.
As taxas de sucesso da terapia de substituição de células beta continuaram a melhorar. Ainda assim, vários desafios na avaliação da eficiência do enxerto de ilhotas e da sobrevivência in vivo permanecem por resolver devido à falta de tecnologias adequadas de imagem intravital. A câmara ocular anterior é um local útil de transplante, apoiando a imagem in vivo repetida e de longo prazo das células ilhotas para o estudo da morfologia da ilhota, padrões de vascularização, função celular beta e morte de células beta em uma resolução celular.
O protocolo de estudo do processo de enxerto de transplante de ilhotas humanas no local de transplante ace relatado aqui permite o monitoramento longitudinal de enxertos de ilhotas humanas com resolução consideravelmente maior do que a obtida com outras plataformas longitudinais alternativas como MRI21,,22, PET23, SPECT24, ou Bioluminescência25.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pelo Conselho Sueco de Pesquisa, Área de Pesquisa Estratégica Exodiab, Dnr 2009-1039, fundação sueca de pesquisa estratégica Dnr IRC15-0067 para ludc-IRC, a Royal Physiographic Society em Lund, Diabetesförbundet e Barndiabetesförbundet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anasthesia machine, e.g. Anaesthesia Unit U-400 | Agnthos | 8323001 | used for isofluran anasthesia during surgery and imaging |
| -induction chamber 1.4 L | Agnthos | 8329002 | connect via tubing to U-400 |
| -gas routing switch | Agnthos | 8433005 | connect via tubing to U-400 |
| AngioSense 680 EX | Percin Elmer | NEV10054EX | imaging agent for injection, used to image blood vessels in human islet grafts |
| Aspirator tubes assemblies | Sigma | A5177-5EA | connect with pulled capillary pipettes for manual islet picking |
| Buprenorphine (Temgesic) 0.3mg/ml | Schering-Plough Europé | 64022 | fluid, for pain relief |
| Capillary pipettes | VWR | 321242C | used together with Aspirator tubes assemblies |
| Dextran-Texas Red (TR), 70kDa | Invitrogen | D1830 | imaging agent for injection |
| Eye cannula, blunt end , 25 G | BVI Visitec/BD | BD585107 | custom made from Tapered Hydrode lineator [Blumenthal], dimensions: 0.5 x 22mm (25G x 7/8in) (45?), tip tapered to 30 G (0.3mm) |
| Eye gel | Novartis | Viscotears, contains Carbomer 2 mg/g | |
| Hamilton syringe 0.5 ml, Model 1750 TPLT | Hamilton | 81242 | Plunger type gas-tight syringe for islet injection |
| Head holder | |||
| -Head holding adapter | Narishige | SG-4N-S | assemled onto metal plate |
| -gas mask | Narishige | GM-4-S | |
| -UST-2 Solid Universal Joint | Narishige | UST-2 | assemled onto metal plate |
| -custom made metal plate for head-holder assembly | |||
| -Dumont #5, straight | Agnthos | 0207-5TI-PS or 0208-5-PS | attached to UST-2 (custom made) |
| Heating pad, custom made | taped to the stereotaxic platform | ||
| Human islet culture media | |||
| -CMRL 1066 | ICN Biomedicals | cell culture media for human islets | |
| -HEPES | GIBCO BRL | ||
| -L-glutamin | GIBCO BRL | ||
| -Gentamycin | GIBCO BRL | ||
| -Fungizone | GIBCO BRL | ||
| -Ciproxfloxacin | Bayer healthcare AG | ||
| -Nicotinamide | Sigma | ||
| Image analysis software | Bitplane | Imaris 9 | |
| Image Aquisition software | Zeiss | ZEN 2010 | |
| Infrared lamp | VWR | 1010364937 | used to keep animals warm in the wake-up cage |
| Isoflurane Isoflo | Abott Scandinavia/Apotek | fluid, for anesthesia | |
| Needle 25 G (0.5 x 16mm), orange | BD | 10442204 | used as scalpel |
| Petri dishes, 90mm | VWR | 391-0440 | |
| 2-Photon/confocal microscope | |||
| -LSM7 MP upright microscope | Zeiss | ||
| -Ti:Sapphire laser Tsunami | Spectra-Physics, Mai Tai | ||
| -long distance water-dipping lens 20x/NA1.0 | Zeiss | ||
| -ET710/40m (Angiosense 680) | Chroma | 288003 | |
| -ET645/65m-2p (TR) | Chroma | NC528423 | |
| -ET525/50 (GFP) | Chroma | ||
| -ET610/75 (tomato) | Chroma | ||
| -main beam splitter T680lpxxr | Chroma | T680lpxxr | Dichroic mirror to transmit 690 nm and above and reflect 440 to 650 nm size 25.5 x 36 x 1 mm |
| Polythene tubing (0.38mm ID, 1.09 mm OD) | Smiths Medical Danmark | 800/100/120 | to connect with Hamilton syringe and eye canula |
| Stereomicroscope | Nikon | Model SMZ645, for islet picking | |
| Stereomicroscope (Flourescence) | for islet graft imaging | ||
| -AZ100 Multizoom | Nikon | wide field and long distance | |
| -AZ Plan Apo 1x | Nikon | ||
| -AZ Plan Apo 4x | Nikon | ||
| -AZ-FL Epiflourescence with C-LHGFI HG lamp | Nikon | ||
| -HG Manual New Intensilight | Nikon | ||
| -Epi-FL Filter Block TEXAS RED | Nikon | contains EX540-580, DM595 and BA600-660 | |
| -Epi-FL Filter Block G-2A | Nikon | (EX510-560, DM575 and BA590) | |
| -Epi-FL Filter Block B-2A | Nikon | (EX450-490, DM505 and BA520) | |
| -DS-Fi1 Colour Digital Camera (5MP) | Nikon | ||
| Syringe 1-ml, Omnitix | Braun | 9161406V | for Buprenorphine injection, used with 27 G needle |
| Surgical tape | 3M |
References
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