Summary
Målet med denne protokol er løbende at overvåge dynamikken i den menneskelige pancreas ø-indskrivning proces og den bidragende vært versus donorceller. Dette opnås ved at transplantere menneskelige holme ind i forreste kammer i øjet (ACE) af en NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-musmodtager efterfulgt af gentagen 2-fotonbilledbilleder.
Abstract
Imaging betaceller er et vigtigt skridt i retning af at forstå ø-transplantation. Selv om forskellige billedplatforme til optagelse af betacellebiologi er blevet udviklet og udnyttet in vivo, er de begrænsede med hensyn til at tillade enkeltcelleopløsning og kontinuerlige indspilninger i længderetningen. På grund af gennemsigtigheden af hornhinden, den forreste kammer i øjet (ACE) i mus er velegnet til at studere mennesker og mus pancreas ø cellebiologi. Her er en beskrivelse af, hvordan denne fremgangsmåde kan bruges til at udføre kontinuerlige langsgående optagelser af podning og revaskularisering af de enkelte menneskelige øtransplantater. Humane øtransplantater indsættes i ACE ved hjælp af NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-mus som modtagere. Dette giver mulighed for undersøgelse af udvidelsen af recipient versus donorceller og bidrag fra modtagerceller i at fremme indkapsling og vaskularisering af transplantatet. Endvidere skitseres en trinvis tilgang til billedanalyse og kvantificering af øvolumen eller segmenteret vaskulatur og økapsel, der danner recipientceller.
Introduction
Diabetes mellitus beskriver en gruppe af metaboliske sygdomme karakteriseret ved forhøjede niveauer af blodsukker som følge af utilstrækkelig insulinproduktion fra tab eller dysfunktion af pancreas ø betaceller, ofte ledsaget af insulinresistens. Type 1 (T1D) og type 2 diabetes (T2D) er komplekse sygdomme, hvor den progressive dysfunktion af betaceller forårsager sygdomsudvikling. T1D er udfældet af en autoimmun angreb på beta-celler, mens T2D anses for at være drevet af metaboliske faktorer, om end med stigende tegn på lav kvalitet systemisk inflammation1. Transplantation af donor humane holme, især til T1D-patienter, giver mulighed for at give fysiologisk glykæmisk kontrol. Men en mangel på vævdonorer og dårlig ø-indskrivning har forhindret øtransplantation for at blive en almindelig terapeutisk mulighed. En betydelig del af den funktionelle øtransplantat går tabt i den umiddelbare posttransplantationsperiode (24-48 h) på grund af det hypoxiske, inflammatoriske, immungene værtsmiljø2,3. For at vurdere effektiviteten af interventionsmetoder til forbedring af øens overlevelse er det nødvendigt med løbende overvågning af sådanne transplantationer.
In vivo teknikker til at afbilde og spore skæbne transplanterede menneskelige pancreas øer efter transplantation stadig en udfordring for diabetes forskning4,5. Til dato viser ikke-invasive billeddannelsesteknikker, herunder positronemissionstomografi (PET), magnetisk resonansscanning (MR) eller ultralyd (US), potentiale for kvantificering og funktionel evaluering af transplanterede holme under forsøgsbetingelser5. I betragtning af de små østørrelser lider kvantitative målinger af disse modaliteter imidlertid under utilstrækkelig opløsning. Den forreste kammer i øjet (ACE) som en transplantation site for observation er en lovende noninvasive imaging løsning, der tilbyder effektivt højere rumlig opløsning og hyppig overvågning over lange perioder6. Denne metode er blevet udnyttet med succes til at studere museøde biologi (gennemgået i Yang et al.7),autoimmuneimmunrespons 8,samt humane ø podning9,10.
Her er ACE transplantation metode kombineret med en 2-foton billeddannelse tilgang til at undersøge dynamikken i den menneskelige pancreas ø indskrivning proces ved løbende og gentagne optagelser på individuelle øtransplantater i op til 10 måneder efter transplantation. De multifotograferingsegenskaber, der er ved større billeddiaddybder og reduceret samlet fotobleaching og fotoskade, overvinder billedbegrænsningerne ved konfokal mikroskopi11. Kvantificering af fluorescerende billeddannelse omfatter flere faser, herunder forberedelse af øprøve, øtransplantation, billederhvervelse, billedfiltrering for at fjerne østøj eller baggrund, segmentering, kvantificering og dataanalyse. Det mest udfordrende trin er normalt at opdele eller segmentere et billede i flere dele eller områder. Dette kan indebære adskillelse af signal fra baggrundsstøj eller klyngeområder af voxels baseret på ligheder i farve eller form for at detektere og mærke voxels af et 3D-volumen, der repræsenterer f.eks. Når de er segmenteret, er statistik, f.eks. Forudsat er en metode til kvantificering og udtrækning af billeddata, såsom segmentering og datavisualisering. Der lægges særlig vægt på fjernelse af autofluorescens i menneskelige holme og skelnen mellem øvaskulatur og økapsel, der danner recipientceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den regionale etiske komité i Lund, Sverige, godkendte undersøgelsen i henhold til loven om etisk gennemgang af forskning, der involverer mennesker. Dyreforsøg blev udført i nøje overensstemmelse med den svenske etik af dyreforsøg og godkendt af de etiske komitéer i Malmø og Lund. 6 til 8 uger gamle immundefficient NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/- (NOD. ROSA-tomat. Rag2-/-) modtagermus blev brugt som modtagere til transplantation af menneske holme10.
1. Islet forberedelse til transplantation
- Kultur menneske holme i CMRL 1066 suppleret med 10 mM HEPES, 2 mM L-glutamin, 50 μg/mL gentamycin, 0,25 μg/mL fungizone, 20 μg/mL ciproxfloxacin, 10 mM nicotinamid (NIC) og 10 % varmeinaktiveret humant serum ved 37 °C i 5% CO2 og befugtet luft indtil transplantation, som beskrevet tidligere12.
BEMÆRK: Holmene skal være fri for eksokrinisk væv og ikke røre hinanden i kultur. Eksokrine væv synes gennemskinnelige. - På transplantationsdagen overføres kulturmedier, der indeholder holmene, til en ny petriskål ved hjælp af en aspiratorrørssamling, der er forbundet til en trukket glaskapillær.
BEMÆRK: Brug alternativt en pipette på 200 μL. Farvelægning bagsiden af Petriskålen hjælper med at gøre holmene lettere at skelne under stereomikroskopet. - Ved hjælp af et stereomikroskop skal du vælge ~20-40 holme pr. transplantation og overføre til et 1,5 ml rør. Fyld røret til toppen med kulturmedier fra kuvøsen.
- Forsegle rør med paraffin film og opbevares på is indtil transplantation. Forbered et passende beløb for antallet af udførte transplantationer.
- Alternativt kan du sikre en CO2-inkubator til rådighed i operationsstuen for at holde holme i kultur og plukke dem umiddelbart før hver transplantation.
2. Udarbejdelse af transplantationsudstyr og operationstabel
BEMÆRK: Alle kirurgiske værktøjer skal autoklaveres, og kirurgi bordet og instrumenter desinficeret med 70% alkohol.
- Tilslut en stereotaxic hovedholder til anæstesi via en næsemaske og tænde for varmepuden.
- Tilslut en gastight Hamilton sprøjte til polyethylen slanger og en stump ende øjenkanel.
BEMÆRK: Det anbefales at fylde alle dele med PBS før montering. Kontroller, om der er fanget luftbobler, og fjern de, hvis de findes. - Hamilton-sprøjten fastgøres tæt til bordet (Figur 1a) eller en bevægelig base (Figur 1e), og fastgør slangen til stereomikroskopet med kanyle hængende ned (dvs. venteposition).
BEMÆRK: Brug kirurgisk tape, fordi det er nemt at fjerne og sætte på igen. - Der klargøres en 1 ml sprøjte, der er tilsluttet en 30 G nål fyldt med 0,1 mg/kg buprenorphinopløsning.
- Tilbered en sprøjte med steril PBS. Alternativt kan du bruge en pipette.
- Sæt et rent wake-up bur til side med varmelampe.
3. Anæstesi og positionering af modtagermus til operation
BEMÆRK: Alle dyr er opdrættet og vedligeholdt i et patogenfrit miljø på dyrefaciliteterne på Lunds Universitet.
- Bedøve musen i et kammer fyldt med 40% O2/60% N2/ 3% isofluran og overføre bedøvet musen til hovedholderen platform på en varm varmepude (Figur 1a). Tjek for manglen på pedal reflekser.
BEMÆRK: Isofluran anæstesi er den foretrukne metode til anæstesi til hurtig genopretning efter operationen. Mikroskoprummet skal være korrekt ventileret for at kunne anvende isofluran. - Stil snuden af musen i anæstesimasken, der er forbundet til 40% O2/60% N2/0,9%-1,5% isoflurane anæstesimaskine. Brug tommelfingeren og fingeren til at løfte hovedet lidt op og fastgør det ved hjælp af de metalliske stykker på siderne. Sørg for, at ørestykkerne fastgører hovedet direkte under ørerne. 0,1 mg/kg buprenorphinopløsning indsprøjtes subkutigt på bagsiden af musen.
BEMÆRK: Buprenorphin anvendes som smertestillende. - Vip hovedet, så det øje, der skal betjenes på, vender opad og er tæt på forskeren.
- Træk forsigtigt øjenlågene i øjet tilbage, der skal transplanteres ved hjælp af stumpe pincet, pop øjet ud, og løst fastsætte med et par pincet. Sørg for, at pincetenes spidser er dækket med et polyethylenrør fastgjort til hovedholderplatformen(figur 1a,indsats).
- Hold altid begge øjne våde ved at påføre en dråbe steril PBS på øjet.
- De menneskelige holme overføres fra det forseglede 1,5 ml rør (punkt 1) til en petriskål med steril PBS, og sørg for, at holmene er tæt på hinanden for at minimere mængden af overført cellekulturmedie (Figur 1c).
- Pick up ~ 20-30 holme i øjet kanyle forbundet via polyethylen slange til Hamilton sprøjten.
BEMÆRK: Tag så lidt væske op som muligt med holmene. - Hæng slangen på hovedet og fastgør til stereomikroskopet(Figur 1d). Op tape slangen omhyggeligt for at lade holmene synke til enden af røret mod kanylen.
4. Transplantationsprocedure
BEMÆRK: Denne metode er tidligere beskrevet for transplantation af muse holme6. En lidt ændret procedure præsenteres her.
- Klem puderne på bagbenene for at sikre, at musen sover.
- Stram de nødvendige snævninger, der fastholder øjet, uden at forstyrre blodgennemstrømningen og påfør en dråbe steril PBS på øjet.
- Ved hjælp af en 25 G nål som skalpel, facet opad, omhyggeligt trænge kun halvdelen af spidsen i hornhinden og gøre en enkelt lateral snit. Gør hullet i en opadgående vinkel; hullet vil forsegle lettere efter transplantationen (Figur 1f).
- Løft forsigtigt hornhinden op med kanylen forinstalleret med holme og anvend langsomt holme i øjet. Undgå indsættelse af kanylen i det forreste kammer for at forhindre beskadigelse af iris, men snarere skubbe forsigtigt mod hornhinde åbning (Figur 1g). Træk langsomt kanylen tilbage fra ACE.
BEMÆRK: Sigt efter et injektionsvolumen på 3-8 μL. Hvis volumen er for stor, vil det udsætte øjet for unødigt højt intraokulært tryk og kan resultere i tilbagesvaling af de injicerede holme ud af det forreste kammer. - Når der opstår problemer med indføring af holmene på grund af øget tryk i øjenkammeret, forstørres indsnitsstedet ved at forstærke det laterale indsnitssted og genanvende holme.
BEMÆRK: Lejlighedsvis kan introducerede luftbobler bruges som pladsholdere. - Påfør øjet gel til øjet, løsne øjet fastholdende scefæcener og lad musen på isofluran i samme position i 8-10 min at lade holmene sæt.
- Fjern de spån, der holder øjenlåget, og sæt øjenlåget tilbage til sin normale position.
- Fjern musen fra hovedholderen og overføre den til en wake up bur.
- Når musen er vågen og bevæger sig, overføres den tilbage til det oprindelige bur og opbevares i dyrehuset indtil scanningen (anbefales mindst 5 dage).
5. Billeddannelse af implanterede menneske holme ved 2-fotonmikroskopi
BEMÆRK: Det anbefales at tage oversigtsbilleder af øjet ved hjælp af et fluorescensstereooskop(Figur 2a–c)4-5 dage efter transplantationen før 2-fotonbilleddannelse for at lokalisere de øer af interesse. Undgå at fastholde øjet for stramt så tidligt efter transplantation. Brug 2-foton billeddannelse 6-7 dage eftertransplantation.
- Start billedopkøbssoftwaren (se Materialetabel). I menuen "Laser" aktiveres Mai Tai laseren (Power "ON") og i menuen "Light Path" indstille bølgelængden til 900 nm og anvende en minimal transmissionslasereffekt startende med 5%-10% laserkraft (brug skydere).
BEMÆRK: Juster lasereffekten efter behov under scanningen. - Indstil grønne, orange og røde kanaler. Opsaml emissionslys samtidigt på tre ikke-scannede detektorer (NDD) ved hjælp af et dichronspejl (LBF 760) og oplysninger om emissionsfilter som følger: Rød/Angiosense 680, 690-730 nm; Grøn/Autofluorescens, 500-550 nm; og Orange/Tomat, 565-610nm (Figur 2d).
- Anlæste hovedholderens etape på det motoriserede mikroskop, og gasmasken forbindes med anæstesimaskinens slange og slangen, der er tilsluttet ventilationssystemet. Tænd for varmepuden.
- Bedøve modtageren musen, overføre til hovedet indehaveren platform, fastholde øjet for billeddannelse, og administrere buprenorphin løsning som beskrevet ovenfor (trin 3.1-3.5).
- Juster isoflurandampe efter behov. En åndehastighed på ~ 55-65 vejrtrækninger i minuttet (bpm) indikerer optimal anæstesi. Hvis anæstesi er for dyb, vil satsen være <50 bpm med tung vejrtrækning eller gisper; hvis for let, vil satsen være > 70 bpm med overfladisk vejrtrækning. Monitorer omhyggeligt mus under anæstesi ved visuel inspektion hver 15 min.
BEMÆRK: Bedøvelsen varierer fra mus til mus, mellem musestammer og som tiden under anæstesi skriderfrem 13. - Administrere nok øjengel på øjet som en nedsænkning væske mellem hornhinden og linsen, gør det muligt at langsomt ophobes(Figur 2f,indsæt). Undgå luftbobler.
BEMÆRK: Sidebelysning med en fleksibel metalslangelampe anbefales for at justere fokus og lokalisere øtransplantater. - For at visualisere blodkarrene skal der gives 100 μL af billedmidlet (f.eks.
- I "Acquisition mode" justere rammen størrelse til 512 x 512 og scanningshastigheden.
BEMÆRK: Langsommere scanninger (dvs. stigende opholdstid) vil forbedre signal-støj-forholdet. - I menuen "Kanaler" justeres Master Gain for hver YDELSE i Volt for at forstærke signalet, indtil et billede ses på skærmen i livescanningstilstand. Jo højere denne værdi er, jo mere følsom bliver detektoren til at signalere og støje.
BEMÆRK: Du skal helst holde værdier mellem 500-800 V. - I menuen "Z-stack" definerer begyndelsen og slutningen af z-stakken ved manuelt at flytte fokus til toppen af øtransplantatet. Gem position ved at vælge "Sæt først". Flyt til det sidste bundplan, der kan fokuseres i ø-transplantatet, og gem position ved at vælge"Set Last". Brug en z-trins størrelse på 2 μm.
- Indsaml den endelige billedstak ved at klikke på filen "Start Experiment", og gem som 8-bit CZI-format (dvs. Carl Zeiss-format).
6. Billeddannelse af implanterede menneske holme ved konfokal mikroskopi
BEMÆRK: Den samlede mængde, morfologi og plasticitet af transplanterede holme kan vurderes ved at overvåge in vivo spredningssignalet i en separat scanning (dvs. separat spor) ved detektering af laser rygsaktlys 10.
- Tag hovedlyssplitteren (dvs. LBF-filteret ud) og i dialogboksen "Light Path" oprettede du et separat spor til konfokal billeddannelse. Vælg Argon laser med bølgelængde på 633 nm og detektion på samme bølgelængde som laserlyset. Z-stakke er erhvervet med en trinstørrelse på 2-3 μm for backscatter lyssignal.
- Læs z-stack-indstillingerne igen for at sikre, at hele øen registreres (se trin 5.10).
- Anskjjne billedet stak og gemme som 8 bit CZI fil.
7. Billedanalyse
BEMÆRK: Kommerciel software (se Tabel over materialer)blev brugt til dette trin.
- Fjernelse af pjecen autofluorescens (Figur 3b)
- I fanen "Billedbehandling" skal du vælge "Channel aritmetiske"og skrive "ch1-ch2". Dette skaber en ny kanal 4 (ch 4); omdøbe som "Vaskulatur".
BEMÆRK: Den grønne/automatiske fluorescenskanal trækkes fra Rød/Angiosense-kanal. - Gentag det forrige trin, og skriv "ch3-ch2" for at oprette en ny kanal (ch 5); omdøbe som"Tomat (alle)".
BEMÆRK: Den grønne/automatiske fluorescenskanal trækkes fra orange/tomatkanalen.
- I fanen "Billedbehandling" skal du vælge "Channel aritmetiske"og skrive "ch1-ch2". Dette skaber en ny kanal 4 (ch 4); omdøbe som "Vaskulatur".
- Definition af ømaske ved manuel tegning (Figur 3c)
- Opret en ny overflade (blåt symbol), og vælg "Rediger manuelt" i guiden. Hold markøren i tilstanden "Vælg" og i 3D-visning, og klik ikke på "Volume" (under Scene) for at visualisere sektioner.
- For lettere ø grænse diskrimination, aktivere alle kanaler, herunder ch 1-ch 3.
BEMÆRK: Orange/Tomat-kanalen er nyttig til at definere øgrænser ved hjælp af tomatkapselsignalet. Alternativt kan du øge kanalintensiteten for at bruge multikanaløs autofluorescens og detektorbagsignal som vejledning. - I fanen "Tegning" skal du vælge "Kontur" og klikke på "Tegn" for at begynde at tegne konturer rundt om økanten, der starter i udsnitsposition 1.
- Flytte til en ny udsnitsposition og gentage tegningsprofiler. Afslut med det sidste udsnit øverst på øen og afslut med at klikke på fanen "Opret overflade". Normalt er det nok at tegneth konturer hver 10.
- Segmentering af "Islet vaskulatur" og "Ø-tomat" fluorescens ved hjælp af ømaske (Figur 3d).
- Vælg det tidligere definerede "Islet-maske"-objekt, gå til fanen Redigering ( blyantsymbol), og klik på fanen "Mask all", som åbner et nyt vindue.pencil
- Vælg den tidligere navngivne kanal "Vasculature" (ch 4) i rullemenuen for kanalvalg og aktivér indstillinger "Dublerkanal, før du anvender maske ", "Constant inside/outside", og sæt voxels udefladen til "0,000", hvilket skaber en ny kanal; omdøbe som "Islet vaskulatur" (ch 6).
- Gentag trin 7.3.1 og 7.3.2, og vælg den tidligere oprettede kanal"Tomat (alle)" (ch 5) i rullemenuen for kanalvalg for at oprette den nye kanal. omdøbe som "Islet tomat" (ch 7).
- Overfladegengivelse af vaskulaturen på øen (figur 3e)
- Opret en ny overflade i menuen "Scene", og vælg " Automatisk oprettelse " iguiden.
- Indstil kildekanalen til tidligere oprettede "Islet vaskulatur" (ch 6) og vælg baggrund subtraktion. Automatisk estimering af tærsklen kan justeres, hvis det er nødvendigt. Sammenlign med den reagerende fluorescenskanal (f.eks. ved at blande den nyoprettede overfladefane ind/ud). Fortsæt i guiden.
- Du kan også bruge filtre. Vælge " Lydstyrke "ogjustere filteret (gult) i vinduet, som kan fjerne markerede overfladeobjekter. Afslut guiden, og navnd det nye overfladeobjekt "Islet-vaskulatur".
- Segmentering af "Islet tomatvaskulatur" fluorescenssignal (Figur 3f)
- I det tidligereoprettede overfladeobjekt "Islet-vaskulatur" skal du gå til fanen Redigering og klikke på fanen "Mask all", som åbner et nyt vindue.
- Vælg den tidligere navngivne kanal "Islet tomat" (ch 7) i rullemenuen for kanalvalg, og indstil voxels uden for overfladen til "10.000", hvilket skaber den nye kanal; omdøbe som "Islet tomatvaskulatur" (ch 8).
- Segmentering af "tomatkapsel" fluorescenssignal (Figur 3g)
- Vælg "Channel Arithmetic's" i "Image processing" fanen og skriv "ch7-ch8", og lav den nye kanal; omdøbe som "Tomatkapsel" (ch 9).
BEMÆRK:Fluorescenssignalet " Islet tomatvaskulatur" trækkes fra det totale fluorescenssignal forIslet-tomat.
- Vælg "Channel Arithmetic's" i "Image processing" fanen og skriv "ch7-ch8", og lav den nye kanal; omdøbe som "Tomatkapsel" (ch 9).
- Overfladegengivelse af "Tomatvaskulatur "og "Tomatkapsel" (Figur 3h)
- Følg trin 7.4, og vælg i guidenkildekanalerne " Islet tomatvaskulatur" (ch 8) eller "Tomatkapsel" (ch 9) for at skabe nye overfladeobjekter i overensstemmelse hermed.
- Overfladegengivelse af den samlede øoverflade (Figur 3i)
- Åbn filen bag sprøjt, og opret en ny overflade.
- I guiden skal du vælge "Automatisk oprettelse" og definere "Interesseområde".
BEMÆRK: "Interesseområde" bruges til at adskille signalerne fra flere holme og til at definere dybden af den ø, der skal analyseres (f.eks. top 75 μm). - I "Absolut intensitet " justeretærskel, hvis det er nødvendigt. Overfladeobjektet kan klikkes til eller fra for at krydstjekke med tilsvarende kanalintensitet. Luk guiden.
- Kvantificering( figur 3j)
- Vælg et oprettet overfladeobjekt i menuen "Scene", og gå til fanen "Statistik".
- Hvis du vil hente detaljerede mængdedata i det markerede overfladeobjekt, skal du vælge fanen "Detaljeret" og vælge "Specifikkeværdier " og "Volume" i rullemenuen. Hvis du vil hente en samlet volumenværdi af det markerede overfladeobjekt, skal dugåtil fanen " Detaljeret " og vælge "Gennemsnitsværdier".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ikke-mærkede menneskelige holme blev transplanteret ind i ACE af 8-ugers gamle kvindelige NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-(NOD. ROSA-tomat. Rag2−/−) modtagermus. For at forhindre afstødning af humant væv blev immundefetødere Rag2 knockoutmus valgt som modtagere. I disse transgene mus udtrykte alle celler og væv et membran målrettet tomatfluorescensprotein (mT), der muliggør klar identifikation af recipienten og donorvævet. Gentagen billeddannelse af øtransplantater ved 2-fotonmikroskopi med høj opløsning kan identificere mT+ modtagerceller, der er involveret i engraftmentprocessen, og deres dynamiske migrationsmønster.
Generelt svarede transplantationsopsætningen af menneskeøer til ACE for recipientmus (figur 1a) til syngeneic museøde transplantationer med hensyn til holmens form og størrelse (Figur 1b,c). Figur 1d,e viser en typisk transplantation med en detaljeret skematisk, der viser det laterale indsnit (figur 1f) og spredning af holme ind i øjenkammeret (Figur 1g) og et repræsentativt resultat af indsprøjtede muse holme (Figur 1h) eller menneskelige holme (Figur 1i). Podningsraten for humane holme var generelt lavere (~30 %) end muse holmene (50-70 %). En mulig årsag til denne uoverensstemmelse er, at tilgængeligheden af menneskelige holme er uforudsigelig, normalt med kun en 1 dages varsel, og også at de opnåede holme varierer i donoralder, donor BMI, renhed (45%-86%), og postisolation kultur tid (2-5 dage). I modsætning hertil kan øisolationer fra mus nemt planlægges. Disse blev isoleret fra 6-8-ugergamle (dvs. unge voksne) mus med høj renhed og korte, natten kultur gange. Disse forskelle mellem mus og humane øtransplantater bør tages i betragtning ved fortolkningen af resultaterne.
In vivo fluorescens imaging af humane øtransplantater blev kompromitteret af betydelig interferens fra vævs autofluorescens (figur 4). Visualiseringen af revaskulariseringsprocessen af ACE-transplanterede humane øtransplantater ved hjælp af billeddannende stoffer ved hjælp af traditionelle bølgelængder i det synlige spektrum blev hindret af et lavt signal-støj-forhold og et højt niveau af naturlig øs autofluorescens, illustreret ved billeder af en λ-scanning i det spektrale område på 500-700 nm (figur 4a) eller af den følsomme ikke-scannede PMT-detektor med filter til detektion af dextran TR (610-675 nm) (Figur 4b). Denne høje baggrund blev ikke observeret i museødeplantater (figur 4c). NIR udsender billedbehandlingsmiddel Angiosense 680 viste et synligt højere signal-til-baggrund-forhold som følge af fald i baggrundsstøj i NIR-området 690-730 nm (Figur 4d, Figur 3a). Den ekstra optagelse af en "ubrugt" kanal (dvs. 500-550 nm) kan bruges i et senere billedbehandlingstrin for at fjerne resterende baggrundsstøj forårsaget af naturlig øs autofluorescens. Den 2-foton/konfokale billeddannelse setup (Figur 2d-f) svarer til tidligere beskrevnedem 6, bortset fra brug af 900 nm 2-foton excitation og fluorescens påvisning af Angiosense 680, autofluorescence, og tomat kanaler med nondescanned PMTs 1-3 (Figur 2d). Det tilrådes at måle den laserudgangseffekt, der når prøven for hvert mikroskopopsætning(figur 2e). Endvidere anbefales det i første omgang at billedet de podede holme med stereomikroskopi (Figur 2a-c), som vil hjælpe med at vælge holme af interesse og undgå 2-foton mikroskopi billeder af en mislykket transplantation.
Formålet med at udtrække kvantitative data fra mange billeder var at fjerne potentielle skævheder i datavalget og at opnå den statistiske effekt, der er nødvendig for at opdage en legitim effekt, når man sammenligner eksperimenter. Kvantificering fra fluorescerende billeddannelse af pancreas holme involveret flere trin, som hver især kan have påvirket resultaterne i en anden. Her blev der brugt interaktiv billedbehandlingssoftware. Den indeholder funktioner, der muliggør visualisering af volumenbilleder og -objekter og identifikation af objekter i henhold til deres morfologi eller intensitet. Figur 3 illustrerer de forskellige trin i billedsegmenteringen. Fjernelse af autofluorescens ved subtraktion af "autofluorescens" kanal forbedret signal-støj-forholdet(Figur 3a,b). Øens grænse kaldet "ømaske" (Figur 3c) og tilsvarende kanaler (Figur 3d) blev defineret manuelt. Segmenteringen af tomatsignalet i øens vaskulatur og økapsel (figur 3f,g) og endelig overfladegengivelse (figur 3e,h,i) blev anvendt til at udtrække kvantitative data.
Figur 5 viser en repræsentativ langsgående billeddannelse session af samme humane øtransplantat på 2 uger, 2 måneder, 5 måneder og 8 måneder eftertransplantation i ACE af en NOD. ROSAROSA-tomat. Rag2-/- modtagermus. Illustreret er maksimale intensitet fremskrivninger (MIP) billeder af oprindeligt indspillede RAW-data (Figur 5a), forarbejdede billeder efter øens autofluorescens fjernelse(Figur 5b–e, f– i ), og segmenteret ø objekter, herunder kapsel (Figur 5j,m) eller ø vaskulatur danner mT+ modtagerceller (rød, Figur 5n-q)ogsamlede ø-vaskulatur (grøn, Figur, Figur 5n–q).
Figur 1: Transplantation af pancreas holme i den forreste kammer i øjet.
aa) Opsætning af transplantation, der viser bedøvet mus fastgjort i stereoaxic hovedholder og det eksponerede øje (indsat) ved siden af den forberedte Hamilton sprøjte fastgjort til bordet og stereomåb klar til at plukke muse holme(b) eller menneskelige holme (c). dd) Øjeylens venteposition fyldt med holme. e) Transplantation i processen og f )skematisktegning af et enkelt lateralt snit, der anvendes til forsigtigt at løfte hornhinden op med spidsen af øjets kanyle og dispensere holme ind i det forreste kammer (g). Billede af øjet umiddelbart efter injektion af museø holme (h) eller menneskeøer (i). Skalalinje = 500 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Billeddannelse af ACE-implanterede pancreas øtransplantater.
aa) Eksperimentel lysstofrørsopstilling til stereomikroskop. Widefield (b) eller fluorescerende billede (c) af B6. ROSA-tomat ø grafts. d) Forenklet skema for emissionslysvejene. LBF: Laserblokeringsfilter (fjernlyssplitter); LP: Lang aflevering; BP: Båndpas; YDELSE: Photomultiplier. (e) Laser udgangseffekt afhænger stærkt af bølgelængden. Diagram viser den faktiske laserudgangseffekt i Watt (W) relateret til laserstrålens effektniveau (%), målt for opsætningen af mikroskopet. Cirkel: 800 nm, kvadrat: 900 nm, trekant: 1.000 nm. ff) Eksperimentel billeddannelsesopsætning, der viser modtagermusen med ACE-podede holme (indsæt) monteret på den motoriserede scene som et kommercielt mikroskop. Skalabar = 100 μm Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Billedsegmentering af en menneskelig ø podet i ACE af en NOD. ROSAROSA-tomat. Rag2-/- modtagermus.
a) Original optagelse: Vist er en 3D-gengivelse af en billedstak af en menneskelig ø med fusionerede kanaler eller optiske dele af opdelte kanaler Angiosense 680 (ch 1), autofluorescens (ch 2) og tomat (ch 3). b) 3D-gengivelse af billedstakken med fusionerede kanaler eller optiske sektioner med opdelte kanaler "Vasculature" (ch 4) og "Tomat(alle)" (ch 5) efter automatisk fjernelse af aflens. cc) Ø-maske (gul). d) 3D-gengivelse af billedstak med fusionerede eller opdelte kanaler "øvaskulatur" (ch 6, hvid), "ø tomat" (ch 7, red). e) Overfladeobjekt "øvaskulatur "skabt af ch 6. ff) 3D-gengivelse af billedstak med fusionerede kanaler "øvaskulatur" (ch 6, grøn) og "ø tomatvaskulatur" (ch 8, red). g) 3D-gengivelse af "tomatkapsel" (ch 9) efter kanalindtraktion ch 7-ch 8 eller optisk sektion med fusionerede kanaler "tomatkapsel" (ch 9, hvid), tomatvaskulatur (ch 8, rød) og vaskulatur (ch 6, grøn). h) Overfladegengivelse af tomatkapsel (skabt af ch 9) og tomatvaskulatur (skabt af ch 8). ii) Ø-segmentering fra humant ø-bagkagesignal, der viser valget af "Interesseområde"(venstre) og det segmenterede overfladeobjekt (i midten) sammenlignet med kanalintensiteten (til højre). jj) Hentning af data fra fanen Statistik. Skalalinje = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Automatisk vanding af menneskeøer.
Menneske holme (a,b,d)eller B6 muse holme (c) blev transplanteret ind i ACE af NOD. Rag2-/- eller B6-recipientmus og injiceres med dextran TR (a–c) eller Angiosense 680 billedbehandlingsmiddel (d) til visualisering af blodkar. a) λ-skænkning af humane øtransplantat i området fra 500-700 nm med 2-foton excitation ved 900 nm. Det maksimale billede af billedprojektion (MIP) af humant (b) eller musepugning (c) ophidset ved 900 nm og detekteret med TR-filteret (610-675 nm) af NDD. d) MIP af et humant øtransplantat ophidset ved 900 nm og detektion med Angiosense 680-filteret (690-730 nm) i NDD. Skalalinje = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Transplanterede menneske holme omvaskes gradvist og indkapslet ved mT, der udtrykker celler af recipientoprindelse.
Menneskelige holme transplanteret ind i det forreste øjenkammer af NOD. ROSAROSA-tomat. Rag2−/− recipientmus, blev afbildet gentagne gange i op til 8 måneder. Angiosense 680 blev injiceret til visualisering af vaskulatur. a)Fremskrivninger af maksimal intensitet (MIP) af originale registrerede RAW-data for split (vaskulatur, autofluorescens, mT) eller fusionerede kanaler og bagkagelyssignal efter 5 måneder eftertransplantation. MIPS af total vaskulatur alene (b–e)eller fusioneret med membran-målrettet tomat fluorescens (mT) (f– i )efterø autoflourescence fjernelse (grøn, a). 3D-gengivelser af segmenterede ø tomatkapsel (j–m) og ø tomatvaskulatur (rød) eller total øvaskulatur (grøn) (n–q) på angivne tidspunkt punkter eftertransplantation. Skalalinje = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En metode præsenteres for at studere den menneskelige pancreas ø celle podning proces ved at observere inddragelse af modtager og donorvæv. Efter en minimal invasiv kirurgi implantering menneskelige holme i den forreste kammer af en immundefekt museøje, musen genopretter hurtigt inden for få minutter efter operationen. Proceduren udføres på det ene øje. Generelt, fra 5-7 dage efterimplantation og fremefter hornhinden er tilstrækkeligt helbredt til at udføre intravital billeddannelse.
I denne protokol er kvaliteten af de menneskelige øtransplantater kritisk. Human ø kvalitet og dermed transplantation resultat kan variere afhængigt af donorens alder, BMI, og isolation proces, samt tidspunktet for øens kultur før og efter ankomsten. Humane holme, der er forarbejdet fra organdonor bugspytkirtel, der er godkendt til klinisk transplantation, og forskningsformål blev anvendt med samtykke fra donorerne. De blev opnået efter en proces med bugspytkirtel fordøjelse og ø rensning beskrevet andetsteds12. Svarende til isolerede murine holme, disse holme gennemgå en række cellulære angreb såsom iskæmi, mekanisk stress, tab af kælder proteiner, og delvis afbrydelse af intra-ø endotelceller (ECs) under enzymatisk fordøjelse trin14,15. På trods af konstant forbedring af kulturforholdene og genopretning af et stort antal menneskelige holme af høj kvalitet er tiden til transplantation fortsat en afgørende faktor. I løbet af de første dage af kulturen, viser menneskelige holme et betydeligt tab af intra-ø ECs og efter seks dages kultur kun små endotel strukturer i øen kerne kan påvises16. Dette tab af intra-ø endotelceller kan udgøre en kritisk faktor i den reducerede podning af menneskelige holme, fordi donorøer er vigtige aktører i revaskulariseringsprocessen17.
Det er afgørende at opretholde steriliteten under transplantationsproceduren for at undgå øjeninfektioner i det immunkompromitterede NOD. ROSAROSA-tomat. Rag2-/- mus. Typisk udføres transplantationsprocedurer under rene forhold ved hjælp af handsker, laboratoriekittel, hoveddæksel og mundmaske, men ikke inde i et biosikkerhedsskab. Alle brugte opløsninger er sterile filtreret, og sprøjter, kanyle, slanger og gaze skylles i 70% ethanol. Wake-up bure er autoclaved. Mens fuld sterilitet ikke kan garanteres på grund af manuel håndtering af musen under proceduren, har kontaminering af øen eller øjeninfektioner ikke været problemer med denne procedure.
Stabil og tilstrækkelig anæstesi er en vigtig og kritisk faktor til at reducere øjenbevægelser og drift under lav framerate dataindsamling, og effektiviteten kan variere mellem forskellige anæstesimidler18. Under lys, generel isofluran anæstesi, øjet lejlighedsvis bevæger sig i en langsom rullende måde og øget dybde af anæstesi (fra 1-2%) kan generelt reducere øjenbevægelser. Den klare fordel ved at bruge inhalerbar anæstesi er dens hurtige virkning og restitutionstid. Det skal dog påpeges, at brugen af isofluran kan ændre insulinsydretion19.
Billedanalyse og segmentering eller opdeling af et billede i flere områder er udfordrende og underlagt potentiel skævhed i datavalg20. Segmentering har til formål at identificere objekter som "ø vaskulaturen" til kvantificering. Her blev der anvendt metoder baseret på intensitetstærskel for udvalgte regioner (dvs. "absolut intensitet") eller intensitetsforskelle for at finde kanter (dvs. "baggrundsindtraktion"). I øjeblikket er der ingen universelle løsninger til segmentering i fluorescerende mikroskopi. En tilgang er at eksperimentere med kommerciel software, der understøtter en række metoder. Hvis tærskelværdien mislykkes på grund af variation i baggrundsintensiteten, kan små ændringer i billedoptagelsesindstillingerne forbedre segmenteringsresultaterne.
En begrænsning af metoden ligger i det faktum, at den menneskelige transplantat hurtigere erstattes af recipientceller og faktisk fuldstændig rekonstitueret af mus modtager endotelceller. Dette ville udelukke undersøgelser af humane celleinteraktioner, hvis målet er at studere adoptivvæv overført humane immunceller migrerer ind i øen parenkym via interaktioner med humane endotelceller. Men både i mus og menneskelige øtransplantater forekommer lignende revaskularisering fra modtageren og følger den forskellige anatomiske 3D-plan, der er specifik for arten.
Succesraterne for betacellesp substitutionsterapi er fortsat med at blive bedre. Alligevel er forskellige udfordringer i vurderingen af effektiviteten af øpodning og overlevelse in vivo stadig uløste på grund af manglen på passende intravital billeddannelsesteknologier. Den forreste øje kammer er en nyttig transplantation site, støtte den gentagne og langsigtede in vivo billeddannelse af ø-celler til studiet af øens morfologi, vaskularisering mønstre, beta cellefunktion, og beta celledød ved en cellulær opløsning.
Protokollen til undersøgelse af podningsprocessen for transplantationer af mennesker i ACE-transplantationsstedet, der er rapporteret her , giver mulighed for overvågning i længderetningen af humane holmestransplantater med betydeligt højere opløsning end dem , der opnås med andre alternative langsgående platforme som MRI21,22, PET23, SPECT24eller Bioluminescens25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af det svenske forskningsråd, Det Strategiske Forskningsområde Exodiab, Dnr 2009-1039, Den Svenske Fond for Strategisk Forskning Dnr IRC15-0067 til LUDC-IRC, Royal Physiographic Society i Lund, Diabetesförbundet og Barnbetesförbundet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anasthesia machine, e.g. Anaesthesia Unit U-400 | Agnthos | 8323001 | used for isofluran anasthesia during surgery and imaging |
| -induction chamber 1.4 L | Agnthos | 8329002 | connect via tubing to U-400 |
| -gas routing switch | Agnthos | 8433005 | connect via tubing to U-400 |
| AngioSense 680 EX | Percin Elmer | NEV10054EX | imaging agent for injection, used to image blood vessels in human islet grafts |
| Aspirator tubes assemblies | Sigma | A5177-5EA | connect with pulled capillary pipettes for manual islet picking |
| Buprenorphine (Temgesic) 0.3mg/ml | Schering-Plough Europé | 64022 | fluid, for pain relief |
| Capillary pipettes | VWR | 321242C | used together with Aspirator tubes assemblies |
| Dextran-Texas Red (TR), 70kDa | Invitrogen | D1830 | imaging agent for injection |
| Eye cannula, blunt end , 25 G | BVI Visitec/BD | BD585107 | custom made from Tapered Hydrode lineator [Blumenthal], dimensions: 0.5 x 22mm (25G x 7/8in) (45?), tip tapered to 30 G (0.3mm) |
| Eye gel | Novartis | Viscotears, contains Carbomer 2 mg/g | |
| Hamilton syringe 0.5 ml, Model 1750 TPLT | Hamilton | 81242 | Plunger type gas-tight syringe for islet injection |
| Head holder | |||
| -Head holding adapter | Narishige | SG-4N-S | assemled onto metal plate |
| -gas mask | Narishige | GM-4-S | |
| -UST-2 Solid Universal Joint | Narishige | UST-2 | assemled onto metal plate |
| -custom made metal plate for head-holder assembly | |||
| -Dumont #5, straight | Agnthos | 0207-5TI-PS or 0208-5-PS | attached to UST-2 (custom made) |
| Heating pad, custom made | taped to the stereotaxic platform | ||
| Human islet culture media | |||
| -CMRL 1066 | ICN Biomedicals | cell culture media for human islets | |
| -HEPES | GIBCO BRL | ||
| -L-glutamin | GIBCO BRL | ||
| -Gentamycin | GIBCO BRL | ||
| -Fungizone | GIBCO BRL | ||
| -Ciproxfloxacin | Bayer healthcare AG | ||
| -Nicotinamide | Sigma | ||
| Image analysis software | Bitplane | Imaris 9 | |
| Image Aquisition software | Zeiss | ZEN 2010 | |
| Infrared lamp | VWR | 1010364937 | used to keep animals warm in the wake-up cage |
| Isoflurane Isoflo | Abott Scandinavia/Apotek | fluid, for anesthesia | |
| Needle 25 G (0.5 x 16mm), orange | BD | 10442204 | used as scalpel |
| Petri dishes, 90mm | VWR | 391-0440 | |
| 2-Photon/confocal microscope | |||
| -LSM7 MP upright microscope | Zeiss | ||
| -Ti:Sapphire laser Tsunami | Spectra-Physics, Mai Tai | ||
| -long distance water-dipping lens 20x/NA1.0 | Zeiss | ||
| -ET710/40m (Angiosense 680) | Chroma | 288003 | |
| -ET645/65m-2p (TR) | Chroma | NC528423 | |
| -ET525/50 (GFP) | Chroma | ||
| -ET610/75 (tomato) | Chroma | ||
| -main beam splitter T680lpxxr | Chroma | T680lpxxr | Dichroic mirror to transmit 690 nm and above and reflect 440 to 650 nm size 25.5 x 36 x 1 mm |
| Polythene tubing (0.38mm ID, 1.09 mm OD) | Smiths Medical Danmark | 800/100/120 | to connect with Hamilton syringe and eye canula |
| Stereomicroscope | Nikon | Model SMZ645, for islet picking | |
| Stereomicroscope (Flourescence) | for islet graft imaging | ||
| -AZ100 Multizoom | Nikon | wide field and long distance | |
| -AZ Plan Apo 1x | Nikon | ||
| -AZ Plan Apo 4x | Nikon | ||
| -AZ-FL Epiflourescence with C-LHGFI HG lamp | Nikon | ||
| -HG Manual New Intensilight | Nikon | ||
| -Epi-FL Filter Block TEXAS RED | Nikon | contains EX540-580, DM595 and BA600-660 | |
| -Epi-FL Filter Block G-2A | Nikon | (EX510-560, DM575 and BA590) | |
| -Epi-FL Filter Block B-2A | Nikon | (EX450-490, DM505 and BA520) | |
| -DS-Fi1 Colour Digital Camera (5MP) | Nikon | ||
| Syringe 1-ml, Omnitix | Braun | 9161406V | for Buprenorphine injection, used with 27 G needle |
| Surgical tape | 3M |
References
- Kharroubi, A. T., Darwish, H. M. Diabetes mellitus: The epidemic of the century. World Journal of Diabetes. 6 (6), 850-867 (2015).
- Kanak, M. A., et al. Inflammatory response in islet transplantation. International Journal of Endocrinology. 2014, 451035 (2014).
- Nanji, S. A., Shapiro, A. M. Advances in pancreatic islet transplantation in humans. Diabetes, Obesity, Metabolism. 8 (1), 15-25 (2006).
- Malaisse, W. J., Maedler, K. Imaging of the beta cells of the islets of Langerhans. Diabetes Research and Clinical Practice. 98 (1), 11-18 (2012).
- Kim, D., Jun, H. S. In Vivo Imaging of Transplanted Pancreatic Islets. Frontiers in Endocrinology. 8, 382 (2017).
- Speier, S., et al. Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye. Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).
- Yang, S. N., Berggren, P. O. The eye as a novel imaging site in diabetes research. Pharmacology, Therapeutics. 197, 103-121 (2019).
- Schmidt-Christensen, A., et al. Imaging dynamics of CD11c(+) cells and Foxp3(+) cells in progressive autoimmune insulitis in the NOD mouse model of type 1 diabetes. Diabetologia. 56 (12), 2669-2678 (2013).
- Berclaz, C., et al. Longitudinal three-dimensional visualisation of autoimmune diabetes by functional optical coherence imaging. Diabetologia. 59 (3), 550-559 (2016).
- Nilsson, J., et al. Recruited fibroblasts reconstitute the peri-islet membrane: a longitudinal imaging study of human islet grafting and revascularisation. Diabetologia. 63 (1), 137-148 (2020).
- Benninger, R. K., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapteer 4 Unit 4 11-24 (2013).
- Goto, M., et al. Refinement of the automated method for human islet isolation and presentation of a closed system for in vitro islet culture. Transplantation. 78 (9), 1367-1375 (2004).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563 (2011).
- Jansson, L., Carlsson, P. O. Graft vascular function after transplantation of pancreatic islets. Diabetologia. 45 (6), 749-763 (2002).
- Konstantinova, I., Lammert, E. Microvascular development: learning from pancreatic islets. Bioessays. 26 (10), 1069-1075 (2004).
- Fransson, M., et al. Mesenchymal stromal cells support endothelial cell interactions in an intramuscular islet transplantation model. Regenerative Medicine Research. 3, 1 (2015).
- Nyqvist, D., et al. Donor islet endothelial cells in pancreatic islet revascularization. Diabetes. 60 (10), 2571-2577 (2011).
- Nair, G., et al. Effects of common anesthetics on eye movement and electroretinogram. Documenta Ophthalmologica. Advances in Ophthalmology. 122 (3), 163-176 (2011).
- Iwasaka, H., et al. Glucose intolerance during prolonged sevoflurane anaesthesia. Canadian Journal of Anaesthesia. 43 (10), 1059-1061 (1996).
- Hamilton, N. Quantification and its applications in fluorescent microscopy imaging. Traffic. 10 (8), 951-961 (2009).
- Michelotti, F. C., et al. PET/MRI enables simultaneous in vivo quantification of beta-cell mass and function. Theranostics. 10 (1), 398-410 (2020).
- Wang, P., et al. Monitoring of Allogeneic Islet Grafts in Nonhuman Primates Using MRI. Transplantation. 99 (8), 1574-1581 (2015).
- Gotthardt, M., et al. Detection and quantification of beta cells by PET imaging: why clinical implementation has never been closer. Diabetologia. 61 (12), 2516-2519 (2018).
- Joosten, L., et al. Measuring the Pancreatic beta Cell Mass in Vivo with Exendin SPECT during Hyperglycemia and Severe Insulitis. Molecular Pharmaceutics. 16 (9), 4024-4030 (2019).
- Virostko, J., et al. Bioluminescence imaging in mouse models quantifies beta cell mass in the pancreas and after islet transplantation. Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 42-53 (2010).
