Summary

Längsschnitt in Vivo Bildgebung und Quantifizierung der menschlichen Pankreas-Islet-Grafting- und Beitragenden Wirtszellen in der Vorderen Augenkammer

Published: June 11, 2020
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Summary

Ziel dieses Protokolls ist es, die Dynamik des menschlichen Pankreas-Islet-Entransplantierungsprozesses und des beitragenden Wirts- und Spenderzellen kontinuierlich zu überwachen. Dies wird durch die Transplantation menschlicher Inselchen in die vordere Augenkammer (ACE) eines NOD erreicht. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4Rag2-/-Mausempfänger gefolgt von wiederholter 2-Photonen-Bildgebung.

Abstract

Die Bildgebung von Betazellen ist ein wichtiger Schritt zum Verständnis der Letentransplantation. Obwohl verschiedene Bildgebungsplattformen für die Aufzeichnung der Beta-Zellbiologie entwickelt und in vivogenutzt wurden, sind sie in Bezug auf die Zulassung von Einzelzellauflösung und kontinuierlichen Längsaufnahmen begrenzt. Aufgrund der Transparenz der Hornhaut eignet sich die vordere Augenkammer (ACE) bei Mäusen gut, um die Biologie der menschlichen und Mauspankreasinsel zu untersuchen. Hier ist eine Beschreibung, wie dieser Ansatz verwendet werden kann, um kontinuierliche Längsschnittaufnahmen von Transplantationen und Revaskularisation enterblichen menschlichen Islettransplantaten durchzuführen. Menschliche Islettransplantate werden mit NOD in den ACE eingeführt. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4Rag2-/-Mäuse als Empfänger. Dies ermöglicht die Untersuchung der Expansion von Empfänger- gegen Spenderzellen und den Beitrag von Empfängerzellen zur Förderung der Verkapselung und Vaskularisation des Transplantats. Darüber hinaus wird ein Schritt-für-Schritt-Ansatz für die Bildanalyse und Quantifizierung des Ischenvolumens oder der segmentierten Vaskulatur und der Isletkapsel bildenden Empfängerzellen skizziert.

Introduction

Diabetes mellitus beschreibt eine Gruppe von Stoffwechselerkrankungen, die durch erhöhte Blutzuckerwerte gekennzeichnet sind, als Ergebnis unzureichender Insulinproduktion durch Verlust oder Dysfunktion von Betazellen der Pankreas-Islet, oft begleitet von Insulinresistenz. Typ-1 -Diabetes (T1D) und Typ-2-Diabetes (T2D) sind komplexe Krankheiten, bei denen die fortschreitende Dysfunktion der Betazellen die Entwicklung von Krankheiten verursacht. T1D wird durch einen Autoimmunangriff auf die Beta-Zellen gefällt, während T2D als durch metabolische Faktoren angetrieben wird, wenn auch mit zunehmenden Beweisen für eine niedriggradige systemische Entzündung1. Die Transplantation von menschlichen Spenderinseln, insbesondere für T1D-Patienten, bietet das Potenzial zur physiologischen glykämischen Kontrolle. Ein Mangel an Gewebespendern und eine mangelhafte Islet-Transplantation haben jedoch verhindert, dass die Letentransplantation zu einer gängigen therapeutischen Option wird. Ein erheblicher Teil des funktionellen Islettransplantats geht in der unmittelbaren Posttransplantationsphase (24–48 h) aufgrund der hypoxischen, entzündlichen, immunogenen Wirtsumgebung2,3verloren. Um die Effizienz der Interventionsmethoden zur Verbesserung des Überlebens der Leten zu bewerten, ist eine kontinuierliche Überwachung solcher Transplantationen erforderlich.

In-vivo-Techniken, um das Schicksal transplantierter menschlicher Pankreasinseln nach der Transplantation abzubilden und zu verfolgen, bleibt für die Diabetesforschung nachwie voreine Herausforderung 4,5. Bislang zeigen nichtinvasive bildgebende Verfahren, einschließlich Positronenemissionstomographie (PET), Magnetresonanztomographie (MRT) oder Ultraschall (US), Potenzial für die Quantifizierung und funktionelle Bewertung transplantierter Inselchen unter experimentellen Bedingungen5. Angesichts der geringen Isätsgrößen leiden quantitative Messungen nach diesen Modalitäten jedoch unter unzureichender Auflösung. Die Vorderkammer des Auges (ACE) als Transplantationsstelle zur Beobachtung ist eine vielversprechende nichtinvasive bildgebende Lösung, die eine effektiv höhere räumliche Auflösung und häufige Überwachung über lange Zeiträumebietet 6. Diese Methode wurde erfolgreich genutzt, um Maus Inselbiologie zu studieren (überprüft in Yang et al.7), Autoimmunimmunreaktionen8, sowie menschliche Insel Pfropfung9,10.

Hier beiderageniert wird die ACE-Transplantationsmethode mit einem 2-Photon-Bildgebungsansatz, um die Dynamik des menschlichen Pankreas-Islet-Entransplantatprozesses durch kontinuierliche und wiederholte Aufnahmen an einzelnen Islettransplantaten bis zu 10 Monate nach der Transplantation zu untersuchen. Die Multiphotonen-Bildgebungseigenschaften größerer Bildtiefe und reduzierter Photobleich- und Fotoschäden überwinden die bildgebenden Grenzen der konfokalen Mikroskopie11. Die Quantifizierung der fluoreszierenden Bildgebung umfasst mehrere Phasen, einschließlich der Vorbereitung von Inselproben, der Inseltransplantation, der Bildaufnahme, der Bildfilterung zur Entfernung von Inselrauschen oder -hintergrund, der Segmentierung, Quantifizierung und Datenanalyse. Der schwierigste Schritt ist in der Regel die Partitionierung oder Segmentierung eines Bildes in mehrere Teile oder Regionen. Dies kann die Trennung von Signal und Hintergrundrauschen oder Clustering-Bereiche von Voxeln auf der Grundlage von Ähnlichkeiten in Farbe oder Form beinhalten, um Voxel eines 3D-Volumens zu erkennen und zu kennzeichnen, das beispielsweise die Vaskulatur der Islet darstellt. Nach der Segmentierung sind Statistiken wie Objektvolumengrößen in der Regel einfach zu extrahieren. Zur Verfügung gestellt wird eine Methode zur Quantifizierung und Extraktion der Bilddaten, wie Segmentierung und Datenvisualisierung. Besonderes Augenmerk wird auf die Entfernung der Autofluoreszenz bei menschlichen Inselchen und die Unterscheidung zwischen Inselvaskulatur und Inselkapsel bildenden Empfängerzellen.

Protocol

Die regionale Ethikkommission in Lund, Schweden, genehmigte die Studie gemäß dem Gesetz über die ethische Überprüfung von Forschung unter Einbeziehung von Menschen. Tierversuche wurden in strikter Übereinstimmung mit der schwedischen Ethik der Tierversuche durchgeführt und von den Ethikkommissionen von Malmö und Lund genehmigt. 6 bis 8 Wochen alte immundefiziver NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/- (NOD. ROSA-Tomate. Rag2-/-) Empfängerm?…

Representative Results

Nicht gekennzeichnete menschliche Inselchen wurden in den ACE der 8 Wochen alten Hündin NOD transplantiert. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-(NOD. ROSA-Tomate. Rag2-Empfängermäuse. Um eine Abstoßung menschlichen Gewebes zu verhindern, wurden immundefiziende Rag2-Knockout-Mäuse als Empfänger ausgewählt. Bei diesen transgenen Mäusen exprimierten alle Zellen und Gewebe ein membranspezifisches Tomatenfluoreszenzprotein (mT), das eine klare Iden…

Discussion

Eine Methode wird vorgestellt, um den Prozess der Pfropfzelltransplantation der menschlichen Pankreas-Islet-Zell-Transplantation zu untersuchen, indem die Beteiligung von Empfänger- und Spendergewebe beobachtet wird. Nach einer minimalinvasiven Operation, bei der menschliche Inselchen in die vordere Kammer eines immungeschwächten Mausauges implantiert wurden, erholt sich die Maus innerhalb weniger Minuten nach der Operation schnell. Das Verfahren wird auf einem Auge durchgeführt. In der Regel wird die Hornhaut ab 5–…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Studie wurde vom Schwedischen Forschungsrat, Strategic Research Area Exodiab, Dnr 2009-1039, der Schwedischen Stiftung für Strategische Forschung Dnr IRC15-0067 an LUDC-IRC, der Royal Physiographic Society in Lund, Diabetesförbundet und Barndiabetesförbundet unterstützt.

Materials

Anasthesia machine, e.g. Anaesthesia Unit U-400 Agnthos 8323001 used for isofluran anasthesia during surgery and imaging
-induction chamber 1.4 L Agnthos 8329002 connect via tubing to U-400
-gas routing switch Agnthos 8433005 connect via tubing to U-400
AngioSense 680 EX Percin Elmer NEV10054EX imaging agent for injection, used to image blood vessels in human islet grafts
Aspirator tubes assemblies Sigma A5177-5EA connect with pulled capillary pipettes for manual islet picking
Buprenorphine (Temgesic) 0.3mg/ml Schering-Plough Europé 64022 fluid, for pain relief
Capillary pipettes VWR 321242C used together with Aspirator tubes assemblies
Dextran-Texas Red (TR), 70kDa Invitrogen D1830 imaging agent for injection
Eye cannula, blunt end , 25 G BVI Visitec/BD BD585107 custom made from Tapered Hydrode lineator [Blumenthal], dimensions: 0.5 x 22mm (25G x 7/8in) (45⁰), tip tapered to 30 G (0.3mm)
Eye gel Novartis Viscotears, contains Carbomer 2 mg/g
Hamilton syringe 0.5 ml, Model 1750 TPLT Hamilton 81242 Plunger type gas-tight syringe for islet injection
Head holder
-Head holding adapter Narishige SG-4N-S assemled onto metal plate
-gas mask Narishige GM-4-S
-UST-2 Solid Universal Joint Narishige UST-2 assemled onto metal plate
-custom made metal plate for head-holder assembly
-Dumont #5, straight Agnthos 0207-5TI-PS or 0208-5-PS attached to UST-2 (custom made)
Heating pad, custom made taped to the stereotaxic platform
Human islet culture media
-CMRL 1066 ICN Biomedicals cell culture media for human islets
-HEPES GIBCO BRL
-L-glutamin GIBCO BRL
-Gentamycin GIBCO BRL
-Fungizone GIBCO BRL
-Ciproxfloxacin Bayer healthcare AG
-Nicotinamide Sigma
Image analysis software Bitplane Imaris 9
Image Aquisition software Zeiss ZEN 2010
Infrared lamp VWR 1010364937 used to keep animals warm in the wake-up cage
Isoflurane Isoflo Abott Scandinavia/Apotek fluid, for anesthesia
Needle 25 G (0.5 x 16mm), orange BD 10442204 used as scalpel
Petri dishes, 90mm VWR 391-0440
2-Photon/confocal microscope
-LSM7 MP upright microscope Zeiss
-Ti:Sapphire laser Tsunami Spectra-Physics, Mai Tai
-long distance water-dipping lens 20x/NA1.0 Zeiss
-ET710/40m (Angiosense 680) Chroma 288003
-ET645/65m-2p (TR) Chroma NC528423
-ET525/50 (GFP) Chroma
-ET610/75 (tomato) Chroma
-main beam splitter T680lpxxr Chroma T680lpxxr Dichroic mirror to transmit 690 nm and above and reflect 440 to 650 nm size 25.5 x 36 x 1 mm
Polythene tubing (0.38mm ID, 1.09 mm OD) Smiths Medical Danmark 800/100/120 to connect with Hamilton syringe and eye canula
Stereomicroscope Nikon Model SMZ645, for islet picking
Stereomicroscope (Flourescence) for islet graft imaging
-AZ100 Multizoom Nikon wide field and long distance
-AZ Plan Apo 1x Nikon
-AZ Plan Apo 4x Nikon
-AZ-FL Epiflourescence with C-LHGFI HG lamp Nikon
-HG Manual New Intensilight Nikon
-Epi-FL Filter Block TEXAS RED Nikon contains EX540-580, DM595 and BA600-660
-Epi-FL Filter Block G-2A Nikon (EX510-560, DM575 and BA590)
-Epi-FL Filter Block B-2A Nikon (EX450-490, DM505 and BA520)
-DS-Fi1 Colour Digital Camera (5MP) Nikon
Syringe 1-ml, Omnitix Braun 9161406V for Buprenorphine injection, used with 27 G needle
Surgical tape 3M

References

  1. Kharroubi, A. T., Darwish, H. M. Diabetes mellitus: The epidemic of the century. World Journal of Diabetes. 6 (6), 850-867 (2015).
  2. Kanak, M. A., et al. Inflammatory response in islet transplantation. International Journal of Endocrinology. 2014, 451035 (2014).
  3. Nanji, S. A., Shapiro, A. M. Advances in pancreatic islet transplantation in humans. Diabetes, Obesity, Metabolism. 8 (1), 15-25 (2006).
  4. Malaisse, W. J., Maedler, K. Imaging of the beta cells of the islets of Langerhans. Diabetes Research and Clinical Practice. 98 (1), 11-18 (2012).
  5. Kim, D., Jun, H. S. In Vivo Imaging of Transplanted Pancreatic Islets. Frontiers in Endocrinology. 8, 382 (2017).
  6. Speier, S., et al. Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye. Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).
  7. Yang, S. N., Berggren, P. O. The eye as a novel imaging site in diabetes research. Pharmacology, Therapeutics. 197, 103-121 (2019).
  8. Schmidt-Christensen, A., et al. Imaging dynamics of CD11c(+) cells and Foxp3(+) cells in progressive autoimmune insulitis in the NOD mouse model of type 1 diabetes. Diabetologia. 56 (12), 2669-2678 (2013).
  9. Berclaz, C., et al. Longitudinal three-dimensional visualisation of autoimmune diabetes by functional optical coherence imaging. Diabetologia. 59 (3), 550-559 (2016).
  10. Nilsson, J., et al. Recruited fibroblasts reconstitute the peri-islet membrane: a longitudinal imaging study of human islet grafting and revascularisation. Diabetologia. 63 (1), 137-148 (2020).
  11. Benninger, R. K., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Current Protocols in Stem Cell Biology. , 11-24 (2013).
  12. Goto, M., et al. Refinement of the automated method for human islet isolation and presentation of a closed system for in vitro islet culture. Transplantation. 78 (9), 1367-1375 (2004).
  13. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563 (2011).
  14. Jansson, L., Carlsson, P. O. Graft vascular function after transplantation of pancreatic islets. Diabetologia. 45 (6), 749-763 (2002).
  15. Konstantinova, I., Lammert, E. Microvascular development: learning from pancreatic islets. Bioessays. 26 (10), 1069-1075 (2004).
  16. Fransson, M., et al. Mesenchymal stromal cells support endothelial cell interactions in an intramuscular islet transplantation model. Regenerative Medicine Research. 3, 1 (2015).
  17. Nyqvist, D., et al. Donor islet endothelial cells in pancreatic islet revascularization. Diabetes. 60 (10), 2571-2577 (2011).
  18. Nair, G., et al. Effects of common anesthetics on eye movement and electroretinogram. Documenta Ophthalmologica. Advances in Ophthalmology. 122 (3), 163-176 (2011).
  19. Iwasaka, H., et al. Glucose intolerance during prolonged sevoflurane anaesthesia. Canadian Journal of Anaesthesia. 43 (10), 1059-1061 (1996).
  20. Hamilton, N. Quantification and its applications in fluorescent microscopy imaging. Traffic. 10 (8), 951-961 (2009).
  21. Michelotti, F. C., et al. PET/MRI enables simultaneous in vivo quantification of beta-cell mass and function. Theranostics. 10 (1), 398-410 (2020).
  22. Wang, P., et al. Monitoring of Allogeneic Islet Grafts in Nonhuman Primates Using MRI. Transplantation. 99 (8), 1574-1581 (2015).
  23. Gotthardt, M., et al. Detection and quantification of beta cells by PET imaging: why clinical implementation has never been closer. Diabetologia. 61 (12), 2516-2519 (2018).
  24. Joosten, L., et al. Measuring the Pancreatic beta Cell Mass in Vivo with Exendin SPECT during Hyperglycemia and Severe Insulitis. Molecular Pharmaceutics. 16 (9), 4024-4030 (2019).
  25. Virostko, J., et al. Bioluminescence imaging in mouse models quantifies beta cell mass in the pancreas and after islet transplantation. Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 42-53 (2010).

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Cite This Article
Nilsson, J., Holmberg, D., Schmidt-Christensen, A. Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the Anterior Eye Chamber. J. Vis. Exp. (160), e61234, doi:10.3791/61234 (2020).

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