Summary
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य मानव अग्नाशय आइलेट एनग्रेफ्टमेंट प्रक्रिया और योगदान मेजबान बनाम दाता कोशिकाओं की गतिशीलता की लगातार निगरानी करना है। यह एक मंजूरी के आंख (ACE) के पूर्ववर्ती कक्ष में मानव आइलेट्स प्रत्यारोपण द्वारा पूरा किया जाता है । (Cg)-gt (ROSA) 26Sortm4-Rag2-/-माउसप्राप्तकर्ता दोहराया 2-फोटॉन इमेजिंग के बाद ।Rag2-/-
Abstract
इमेजिंग बीटा कोशिकाओं आइलेट प्रत्यारोपण को समझने की दिशा में एक महत्वपूर्ण कदम है। हालांकि बीटा सेल जीव विज्ञान की रिकॉर्डिंग के लिए विभिन्न इमेजिंग प्लेटफार्मों को विकसित किया गया है और वीवो मेंउपयोग किया गया है, वे एकल सेल संकल्प और निरंतर देशांतर रिकॉर्डिंग की अनुमति देने के मामले में सीमित हैं। कॉर्निया की पारदर्शिता के कारण, चूहों में आंख (एसीई) का पूर्वकाल कक्ष मानव और माउस अग्नाशय आइलेट सेल जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। यहां इस बात का वर्णन दिया गया है कि व्यक्तिगत मानव आइलेट ग्राफ्ट के ग्राफ्टिंग और पुनर्संवहन की निरंतर देशांतर रिकॉर्डिंग करने के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग कैसे किया जा सकता है। मानव आइलेट ग्राफ्ट को एसीई में डाला जाता है, जो मंजूरी का उपयोग करके होता है। (सीजी)-जीटी(रोजा) 26Sortm4-Rag2-/-प्राप्तकर्ताओं के रूप में चूहों ।Rag2-/-tm4 यह प्राप्तकर्ता बनाम दाता कोशिकाओं के विस्तार की जांच और भ्रष्टाचार के एनकैप्सुलेशन और संवहनी को बढ़ावा देने में प्राप्तकर्ता कोशिकाओं के योगदान के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, आइलेट वॉल्यूम या खंडित वैक्यूलेचर और आइलेट कैप्सूल बनाने वाले प्राप्तकर्ता कोशिकाओं के छवि विश्लेषण और मात्राकरण के लिए एक कदम-दर-कदम दृष्टिकोण रेखांकित किया गया है।
Introduction
मधुमेह मेलिटस मेटाबोलिक रोगों के एक समूह का वर्णन करता है जो रक्त ग्लूकोज के ऊंचा स्तर की विशेषता है, जो अग्नाशय के आइलेट बीटा कोशिकाओं के नुकसान या शिथिलता से अपर्याप्त इंसुलिन उत्पादन के परिणामस्वरूप होता है, अक्सर इंसुलिन प्रतिरोध के साथ। टाइप 1 (T1D) और टाइप 2 डायबिटीज (T2D) जटिल बीमारियां हैं जिनमें बीटा कोशिकाओं की प्रगतिशील शिथिलता रोग विकास का कारण बनती है। T1D बीटा कोशिकाओं पर एक ऑटोइम्यून हमले से उपजी है, जबकि T2D मेटाबोलिक कारकों से प्रेरित माना जाता है, हालांकि कम ग्रेड प्रणालीगत सूजन1के बढ़ते सबूत के साथ । दाता मानव आइलेट्स का प्रत्यारोपण, विशेष रूप से T1D रोगियों के लिए, शारीरिक ग्लाइसेमिक नियंत्रण प्रदान करने की क्षमता प्रदान करता है। हालांकि, ऊतक दाताओं और गरीब आइलेट engraftment की कमी आइलेट प्रत्यारोपण को रोका गया है एक मुख्यधारा के चिकित्सीय विकल्प बन जाते हैं । हाइपोक्सिक, भड़काऊ, इम्यूनोजेनिक होस्टपर्यावरण2,3के कारण तत्काल पोस्टट्रांज्लांटेशन अवधि (24-48 एच) में कार्यात्मक आइलेट भ्रष्टाचार का एक बड़ाहिस्साखो जाता है। आइलेट अस्तित्व में सुधार के लिए हस्तक्षेप विधियों की दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए, ऐसे प्रत्यारोपण की निरंतर निगरानी आवश्यक है।
प्रत्यारोपण के बाद प्रत्यारोपित मानव अग्नाशय के आइलेट्स की छवि और ट्रैक करने के लिए वीवो तकनीकों में अभी भी मधुमेह अनुसंधान के लिए एक चुनौती बनी हुई है4,5 ,5. आज तक, पॉजिट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी (पीईटी), चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई), या अल्ट्रासाउंड (यूएस) सहित गैर-निवास इमेजिंग तकनीकें प्रायोगिक परिस्थितियों में प्रत्यारोपित आइलेट्स के क्वांटिफिकेशन और कार्यात्मक मूल्यांकन के लिए क्षमता दिखाती हैं5। हालांकि, छोटे आइलेट आकारों को देखते हुए, उन तौर-तरीकों द्वारा मात्रात्मक माप अपर्याप्त संकल्प से पीड़ित हैं । अवलोकन के लिए प्रत्यारोपण स्थल के रूप में आंखों का पूर्वकाल कक्ष (एसीई) एक आशाजनक नॉनइनवेसिव इमेजिंग समाधान है जो प्रभावी रूप से उच्च स्थानिक संकल्प और लंबे समय तक लगातार निगरानी की पेशकश करता है6। माउस आइलेट बायोलॉजी (यांग एट अल7में समीक्षा) का अध्ययन करने के लिए इस विधि का सफलतापूर्वक दोहन किया गया है , ऑटोइम्यून प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं8,साथ ही मानव आइलेट ग्राफ्टिंग9,,10।
यहां ऐस प्रत्यारोपण विधि प्रत्यारोपण के बाद 10 महीने तक के लिए व्यक्तिगत आइलेट ग्राफ्ट पर निरंतर और दोहराया रिकॉर्डिंग द्वारा मानव अग्नाशय आइलेट engraftment प्रक्रिया की गतिशीलता की जांच करने के लिए एक 2-फोटॉन इमेजिंग दृष्टिकोण के साथ संयुक्त है । अधिक इमेजिंग गहराई के मल्टीफोटॉन इमेजिंग गुण और समग्र फोटोब्लैचिंग और फोटो क्षति को कम करने से कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी11की इमेजिंग सीमाओं को दूर किया जाता है। फ्लोरोसेंट इमेजिंग के क्वांटिफिकेशन में कई चरण शामिल हैं, जिनमें आइलेट नमूना तैयारी, आइलेट प्रत्यारोपण, छवि अधिग्रहण, आइलेट शोर या पृष्ठभूमि को हटाने के लिए इमेज फ़िल्टरिंग, विभाजन, क्वांटिफिकेशन और डेटा विश्लेषण शामिल हैं। सबसे चुनौतीपूर्ण कदम आमतौर पर कई हिस्सों या क्षेत्रों में एक छवि को विभाजित या विभाजित करना है। इसमें पृष्ठभूमि शोर से सिग्नल को अलग करना, या रंग या आकार में समानताओं के आधार पर स्वरों के क्लस्टरिंग क्षेत्र शामिल हो सकते हैं ताकि 3 डी वॉल्यूम के स्वरों का पता लगाया जा सके और लेबल किया जा सके, जो आइलेट वेक्यूलेचर का प्रतिनिधित्व करता है, उदाहरण के लिए। एक बार खंडित होने के बाद, ऑब्जेक्ट वॉल्यूम आकार जैसे आंकड़े आमतौर पर निकालने के लिए सरल होते हैं। बशर्ते इमेजिंग डेटा की मात्रा और निष्कर्षण के लिए एक विधि है, जैसे विभाजन और डेटा विज़ुअलाइज़ेशन। विशेष ध्यान मानव आइलेट्स में ऑटोफ्लोरेसेंस को हटाने और आइलेट वैक्यूलेचर और आइलेट कैप्सूल बनाने प्राप्तकर्ता कोशिकाओं के बीच अंतर पर ध्यान दिया जाता है।
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Protocol
लुंड, स्वीडन में क्षेत्रीय आचार समिति, मानव शामिल अनुसंधान की नैतिक समीक्षा के विषय में अधिनियम के अनुसार अध्ययन को मंजूरी दे दी । पशु प्रयोगों को स्वीडिश नैतिकता के साथ सख्त अनुसार पशु प्रयोगों के साथ किया गया था और माल्मो और लुंड की आचार समितियों द्वारा अनुमोदित किया गया था। 6 से 8 सप्ताह पुरानी इम्यूनोडिएंसी की कमी को मंजूरी । (सीजी)-जीटी (रोजा) 26Sortm4-Rag2-/--(NOD।tm4Rag2-/- रोजा-टमाटर। रैग 2-/-प्राप्तकर्ता चूहों का उपयोग मानव आइलेट्स10के प्रत्यारोपण के लिए प्राप्तकर्ताओं के रूप में किया जाता था।
1. प्रत्यारोपण के लिए आइलेट तैयारी
- सीएमआरएल 1066 में संस्कृति मानव आइलेट्स 10 एमएम एचईपीई, 2 एमएमएम एल-ग्लूटामाइन के साथ पूरक, 50 μg/mL gentamycin, 0.25 μg/mL कवकजोन, 20 μg/ml सिप्रोक्सफ्लोक्सेसिन, 10 mm निकोटिनामाइड (एनआईसी), और 10% गर्मी में निष्क्रिय मानव सीरम 5% सीओ2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर और प्रत्यारोपण तक आर्द्र हवादार, के रूप में पहले12वर्णित है ।
नोट: आइलेट्स एक्सोक्राइन ऊतक से मुक्त होना चाहिए और संस्कृति में एक दूसरे को छूने नहीं होना चाहिए । एक्सोक्राइन ऊतक पारदर्शी दिखाई देते हैं। - प्रत्यारोपण के दिन, एक खींचा ग्लास केशिका से जुड़े एस्पिरेटर ट्यूब असेंबली का उपयोग करके एक नए पेट्री डिश में आइलेट्स युक्त संस्कृति मीडिया को स्थानांतरित करें।
नोट: वैकल्पिक रूप से, 200 माइक्रोल पिपेट का उपयोग करें। पेट्री डिश के पीछे रंग भरने से आइलेट्स को स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत अधिक आसानी से अलग करने में मदद मिलती है। - स्टीरियो माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, प्रति प्रत्यारोपण ~ 20-40 आइलेट्स चुनें और 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। इनक्यूबेटर से संस्कृति मीडिया के साथ शीर्ष करने के लिए ट्यूब भरें।
- पैराफिन फिल्म के साथ ट्यूबों सील और प्रत्यारोपण तक बर्फ पर स्टोर। किए गए प्रत्यारोपण की संख्या के लिए उचित राशि तैयार करें।
- वैकल्पिक रूप से, सुनिश्चित करें कि एक सीओ2 इनक्यूबेटर सर्जरी कक्ष में उपलब्ध है ताकि संस्कृति में आइलेट्स रखे जा सकें और प्रत्येक प्रत्यारोपण से तुरंत पहले उन्हें चुनें।
2. प्रत्यारोपण उपकरण और सर्जरी टेबल की तैयारी
नोट: सभी सर्जिकल उपकरणों को ऑटोक्लेव किया जाना चाहिए, और सर्जरी टेबल और उपकरणों को 70% शराब से कीटाणुरहित किया जाना चाहिए।
- नाक मास्क के माध्यम से संज्ञाहरण के लिए एक स्टीरियोटैक्सिक हेड होल्डर कनेक्ट करें और हीटिंग पैड चालू करें।
- पॉलीथीन ट्यूबिंग और एक कुंद अंत आंख cannula के लिए एक गैसटाइट हैमिल्टन सिरिंज कनेक्ट करें ।
नोट: विधानसभा से पहले पीबीएस के साथ सभी भागों को भरने की सिफारिश की जाती है। फंसे हुए हवा के बुलबुले की जांच करें और मौजूद होने पर हटा दें। - हैमिल्टन सिरिंज को टेबल(चित्रा 1)या एक चल बेस(चित्रा 1e)में कसकर संलग्न करें और स्टीरियो माइक्रोस्कोप को टयूबिंग संलग्न करें, कैनुला नीचे लटक (यानी, प्रतीक्षा स्थिति) के साथ।
नोट: सर्जिकल टेप का उपयोग करें, क्योंकि इसे हटाना और फिर से संलग्न करना आसान है। - 0.1 मिलीग्राम/किलो बुप्रेनोरफिन समाधान से भरी 30 ग्राम सुई से जुड़ी 1 एमएल सिरिंज तैयार करें।
- बाँझ पीबीएस के साथ एक सिरिंज तैयार करें। वैकल्पिक रूप से, एक पिपेट का उपयोग करें।
- हीटिंग लैंप के साथ एक साफ जगा-अप पिंजरे को अलग करें।
3. संज्ञाहरण और सर्जरी के लिए प्राप्तकर्ता चूहों की स्थिति
नोट: सभी जानवरों को पैदा किया गया और लुंड विश्वविद्यालय में पशु सुविधाओं में एक रोगजनक मुक्त वातावरण में बनाए रखा गया ।
- 40% O2/60%एन2 /3% आइसोफ्लुनाणे से भरे कक्ष में माउस को एनेस्थेटाइज करें और एनेस्थेटाइज्ड माउस को गर्म हीटिंग पैड(चित्रा 1a)पर हेड होल्डर प्लेटफॉर्म पर स्थानांतरित करें। पेडल सजगता की कमी के लिए जांच करें।
नोट: आइसोफ्लारेन एनेस्थीसिया सर्जरी के बाद तेजी से वसूली के लिए संज्ञाहरण का पसंदीदा तरीका है। माइक्रोस्कोप कमरे को आइसोफ्लाणे का उपयोग करने के लिए ठीक से हवादार होना चाहिए। - माउस के थूथन को 40% O2 /60%N2/0.9%-1.5% आइसोफलुने एनेस्थीसिया मशीन से जुड़े एनेस्थीसिया मास्क में रखें। सिर को थोड़ा ऊपर उठाने के लिए अंगूठे और उंगली का उपयोग करें और इसे किनारों पर धातु के टुकड़ों का उपयोग करके जकड़ना। सुनिश्चित करें कि ईयरपीस कान के नीचे सीधे सिर को ठीक करें। माउस के पीछे 0.1 मिलीग्राम/किलो बुप्रेनोरफिन समाधान को चमड़े के साथ इंजेक्ट करें।
नोट: बुप्रेनोरफिन का उपयोग एनाल्जेसिक के रूप में किया जाता है। - सिर को इसलिए झुकाएं ताकि आंख पर ऑपरेशन किया जा सके, ऊपर की ओर सामना करना पड़ रहा है और शोधकर्ता के करीब है।
- धीरे-धीरे आंख की पलकों को कुंद संदंश का उपयोग करके प्रत्यारोपित करने के लिए वापस लेना, आंख को बाहर पॉप करें, और चिमटी की एक जोड़ी के साथ शिथिल रूप से ठीक करें। सुनिश्चित करें कि चिमटी के सुझावों को हेड होल्डर प्लेटफॉर्म(चित्रा 1,डालने) से जुड़ी पॉलीथिन ट्यूब से कवर किया जाता है।
- आंखों पर बाँझ पीबीएस की बूंद लगाकर हमेशा दोनों आंखों को गीला रखें।
- मानव आइलेट्स को सीलबंद 1.5 एमएल ट्यूब (सेक्शन 1) से बाँझ पीबीएस के साथ पेट्री डिश में स्थानांतरित करें और सुनिश्चित करें कि आइलेट्स सेल कल्चर मीडिया ट्रांसफर(चित्रा 1c)की मात्रा को कम करने के लिए एक दूसरे के करीब हैं।
- हैमिल्टन सिरिंज के लिए पॉलीथिन ट्यूबिंग के माध्यम से जुड़े आंख cannula में ~ 20-30 आइलेट उठाओ ।
नोट: आइलेट्स के साथ जितना संभव हो उतना कम तरल लें। - टयूबिंग को उल्टा लटकाएं और स्टीरियो माइक्रोस्कोप(चित्रा 1d) सेअटैच करें। टयूबिंग को ध्यान से टेप करें ताकि आइलेट्स कैनुला की ओर ट्यूब के अंत तक डूब जाएं।
4. प्रत्यारोपण प्रक्रिया
नोट: इस विधि को पहले माउस आइलेट्स6के प्रत्यारोपण के लिए वर्णित किया गया है । यहां थोड़ा संशोधित प्रक्रिया प्रस्तुत की जाती है ।
- यह सुनिश्चित करने के लिए कि माउस सो रहा है, पिछले पैरों पर पैड चुटकी लें।
- रक्त प्रवाह को बाधित किए बिना आंख को रोकने वाले संदंश को कसें और आंख पर बाँझ पीबीएस की एक बूंद लागू करें।
- एक स्केलपेल के रूप में 25 जी सुई का उपयोग करना, ऊपर की ओर बेवेल, ध्यान से कॉर्निया में टिप का केवल आधा प्रवेश करता है और एक पार्श्व चीरा बनाता है। छेद को ऊपर की ओर कोण में बनाएं; छेद प्रत्यारोपण(चित्रा 1f)के बाद और अधिक आसानी से सील हो जाएगा ।
- सावधानी से आइलेट्स के साथ पूर्वलोडेड कैनुला के साथ कॉर्निया उठाएं और धीरे-धीरे आंखों में आइलेट्स लागू करें। आईरिस के नुकसान को रोकने के लिए पूर्वकाल कक्ष में कैनुला के सम्मिलन से बचें, बल्कि कॉर्नियल खोलने(चित्रा 1g)के खिलाफ ध्यान से धक्का दें। धीरे-धीरे ऐस से कैनुला को वापस लें।
नोट: 3-8 माइक्रोन के इंजेक्शन की मात्रा के लिए लक्ष्य रखें। यदि मात्रा बहुत बड़ी है, तो यह आंख को अनावश्यक रूप से उच्च इंट्राओकुलर दबाव का पर्दाफाश करेगा और इसके परिणामस्वरूप पूर्ववर्ती कक्ष से इंजेक्शन आइलेट्स का भाटा हो सकता है। - आंखों के कक्ष में बढ़ते दबाव के कारण आइलेट्स के सम्मिलन के साथ कठिनाइयों का सामना करते समय, पार्श्व चीरा साइट को मजबूत करके चीरा साइट को बड़ा करें और आइलेट्स को फिर से लागू करें।
नोट: कभी-कभी, पेश किए गए हवा के बुलबुले अंतरिक्ष धारकों के रूप में उपयोग किए जा सकते हैं। - आंखों पर आई जेल लगाएं, आंखों को रोकने वाले संदंश को ढीला करें और आइलेट्स सेट करने के लिए 8-10 मिनट के लिए एक ही स्थिति में आइसोफ्लाणे पर माउस छोड़ दें।
- पलक पकड़े हुए संदंश को निकालें और पलक को वापस अपनी सामान्य स्थिति में डाल दें।
- हेड होल्डर से माउस निकालें और इसे वेक अप पिंजरे में स्थानांतरित करें।
- जब माउस जाग रहा है और आगे बढ़ रहा है, तो इसे मूल पिंजरे में वापस स्थानांतरित करें और स्कैनिंग तक पशु आवास में रखें (कम से कम 5 दिन की सिफारिश की जाती है)।
5. 2-फोटॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रत्यारोपित मानव आइलेट्स की इमेजिंग
नोट: 2-फोटॉन इमेजिंग से पहले प्रत्यारोपण के बाद फ्लोरेसेंस स्टीरियोस्कोपिक माइक्रोस्कोप(चित्रा 2a-c)4-5 दिनों का उपयोग करके आंख की आंखों की अवलोकन छवियों को ब्याज के आइलेट्स को स्थानीयकृत करने की सिफारिश की जाती है। प्रत्यारोपण के बाद इस जल्दी आंख को भी कसकर रोकने से बचें। 2-फोटॉन इमेजिंग 6-7 दिन बाद का इस्तेमाल करें।
- इमेज एक्विजिशन सॉफ्टवेयर शुरू करें (सामग्री की तालिकादेखें)। "लेजर"मेनू में माई ताई लेजर (पावरऑन")को सक्रिय करता है और"लाइट पाथ"मेनू में तरंगदैर्ध्य को 900 एनएम तक सेट किया गया है और 5%-10% लेजर पावर (स्लाइडर्स का उपयोग करें) से शुरू होने वाली न्यूनतम ट्रांसमिशन लेजर पावर लागू करें।
नोट: स्कैनिंग करते समय, आवश्यकतानुसार लेजर पावर को समायोजित करें। - हरे, नारंगी और लाल चैनल सेट करें। एक डिक्रोनिक मिरर (एलबीएफ 760) और उत्सर्जन फ़िल्टर जानकारी का उपयोग करके तीन नॉनडेकैनेड डिटेक्टरों (एनडीडी) पर एक साथ उत्सर्जन प्रकाश एकत्र करें: लाल/एंजियोसेंस 680, 690-730 एनएम; ग्रीन/ऑटोफ्लोरेसेंस, 500-550 एनएम; और ऑरेंज/टमाटर, 565-610nm(चित्रा 2d)।
- सिर धारक चरण को मोटराइज्ड माइक्रोस्कोप चरण पर रखें और गैस्मास्क को संज्ञाहरण मशीन की ट्यूबिंग और वेंटिलेशन सिस्टम से जुड़े ट्यूबिंग से कनेक्ट करें। हीटिंग पैड चालू करें।
- प्राप्तकर्ता माउस को एनेस्थेटाइज करें, हेड होल्डर प्लेटफॉर्म पर स्थानांतरित करें, इमेजिंग के लिए आंख को नियंत्रित करें, और ऊपर वर्णित बुप्रेनोरफिन समाधान को प्रशासित करें (चरण 3.1-3.5)।
- जरूरत के अनुसार आइसोफ्लुरेन वाष्प को समायोजित करें। प्रति मिनट ~55-65 सांस (बीपीएम) की सांस दर इष्टतम संज्ञाहरण को इंगित करती है। यदि संज्ञाहरण बहुत गहरा है, तो दर भारी श्वास या हांफने के साथ & 50 बीपीएम होगी; यदि बहुत हल्का है, तो दर सतही श्वास के साथ >70 बीपीएम होगी। हर 15 मिनट में दृश्य निरीक्षण द्वारा संज्ञाहरण के दौरान चूहों की सावधानीपूर्वक निगरानी करें।
नोट: एनेस्थेटाइजेशन माउस से माउस में, माउस उपभेदों के बीच भिन्न होता है, और जैसे-जैसे एनेस्थीसिया के तहत समय13की प्रगति करता है। - कॉर्निया और लेंस के बीच एक विसर्जन तरल के रूप में आंख पर पर्याप्त आंख जेल प्रशासन, यह धीरे से जमा करने के लिए अनुमति देता है(चित्रा 2f,डालें) । हवा के बुलबुले से बचें।
नोट: एक लचीला धातु नली दीपक के साथ साइड रोशनी ध्यान समायोजित करने और आइलेट ग्राफ्ट स्थानीयकरण करने की सिफारिश की है। - रक्त वाहिकाओं की कल्पना करने के लिए, डिस्पोजेबल इंसुलिन 30 जी सिरिंज का उपयोग करके पूंछ नस में नसों के रूप में इमेजिंग एजेंट (जैसे, एंजियोसेंस 680) के 100 माइक्रोन को प्रशासित करें।
- "एक्विजिशन मोड"में फ्रेम साइज को 512 x 512 और स्कैन स्पीड में एडजस्ट करें।
नोट: धीमी स्कैन (यानी, रहने का समय बढ़ाने) से सिग्नल-टू-शोर अनुपात में सुधार होगा। - "चैनल्स" मेनू में लाइव स्कैनिंग मोड में स्क्रीन पर एक छवि देखे जाने तक सिग्नल को बढ़ाने के लिए वोल्ट में प्रत्येक पीएमटी के लिए मास्टर गेन को समायोजित करें।Channels इस मूल्य जितना अधिक होगा, डिटेक्टर सिग्नल और शोर के लिए उतना ही संवेदनशील हो जाता है।
नोट: अधिमानतः, 500-800 वी के बीच मूल्यों को रखें। - "जेड-स्टैक"मेनू में आइलेट ग्राफ्ट के शीर्ष पर ध्यान केंद्रित करके जेड-स्टैक की शुरुआत और अंत को परिभाषित करते हैं। "पहलेसेट"का चयन करके स्थिति को बचाएं। पिछले नीचे विमान है कि आइलेट भ्रष्टाचार में ध्यान केंद्रित किया जा सकता है और"पिछले सेट"का चयन करके स्थिति को बचाने के लिए ले जाएँ । 2 माइक्रोन के जेड-स्टेप साइज का इस्तेमाल करें।
- "स्टार्टएक्सपेरिमेंट"टैब पर क्लिक करके अंतिम छवि स्टैक ले लीजिए और 8-बिट सीजेआई (यानी, कार्ल ज़ीस प्रारूप) फ़ाइल के रूप में सहेजें।
6. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रत्यारोपित मानव आइलेट्स की इमेजिंग
नोट: कुल मात्रा, आकृति विज्ञान, और प्रत्यारोपित आइलेट्स की प्लास्टिसिटी लेजर बैकस्कैटर लाइट10का पता लगाकर एक अलग स्कैन (यानी, अलग ट्रैक) में वीवो बिखरने वाले सिग्नल की निगरानी करके मूल्यांकन किया जा सकता है ।
- मुख्य बीम स्प्लिटर (यानी, एलबीएफ फिल्टर) को बाहर निकालें और"लाइट पाथ"संवाद में कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए एक अलग ट्रैक स्थापित किया। 633 एनएम की तरंगदैर्ध्य के साथ आर्गन लेजर चुनें और लेजर प्रकाश के समान तरंग दैर्ध्य पर पता लगाया। जेड-स्टैक बैकस्कैटर लाइट सिग्नल के लिए 2-3 माइक्रोन के स्टेप साइज के साथ हासिल किए जाते हैं।
- पूरे आइलेट को रिकॉर्ड करना सुनिश्चित करने के लिए जेड-स्टैक सेटिंग्स को फिर से समायोजित करें (चरण 5.10 देखें)।
- छवि स्टैक प्राप्त करें और 8 बिट सीजेआई फ़ाइल के रूप में सहेजें।
7. छवि विश्लेषण
नोट: वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिकादेखें) इस कदम के लिए इस्तेमाल किया गया था ।
- आइलेट ऑटोफ्लोरेसेंस को हटाना(चित्र 3बी)
- "छविप्रसंस्करण"टैब में"चैनल अंकगणित"और टाइप"ch1-ch2"चुनें। यह एक नया चैनल 4 (ch 4) बनाता है; 'वैक्यूलेचर'के रूप में बदलें।
नोट: ग्रीन/ऑटोफ्लोरेसेंस चैनल लाल/एंजियोसेंस चैनल से घटाया जाता है । - एक नया चैनल (ch 5) बनाने के लिए पिछले चरण को दोहराएं और"ch3-ch2"टाइप करें; 'टमाटर (सभी)के रूप में बदलें।
नोट: ग्रीन/Autofluorescence चैनल ऑरेंज/टमाटर चैनल से घटाया जाता है ।
- "छविप्रसंस्करण"टैब में"चैनल अंकगणित"और टाइप"ch1-ch2"चुनें। यह एक नया चैनल 4 (ch 4) बनाता है; 'वैक्यूलेचर'के रूप में बदलें।
- मैनुअल ड्राइंग द्वारा आइलेट मास्क को परिभाषित करना(चित्रा 3c)
- एक नई सतह (नीली प्रतीक) बनाएं और जादूगर में"मैन्युअल रूप से संपादित करें"। अनुभागों की कल्पना करने के लिए सूचक को"चुनें"मोड में और 3डी दृश्य में अनक्लिक"वॉल्यूम" (दृश्यके तहत) रखें।
- आसान आइलेट सीमा भेदभाव के लिए, ch 1-ch 3 सहित सभी चैनलों को सक्रिय करें।
नोट: ऑरेंज/टमाटर चैनल टमाटर कैप्सूल संकेत द्वारा आइलेट सीमाओं को परिभाषित करने के लिए उपयोगी है । वैकल्पिक रूप से, मार्गदर्शन के रूप में मल्टीचैनल आइलेट ऑटोफ्लोरेसेंस और डिटेक्टर बैकग्राउंड सिग्नल का उपयोग करने के लिए चैनल तीव्रता बढ़ाएं। - "ड्राइंग"टैब में"कंटूर"चुनें और स्लाइस स्थिति 1 में शुरू होने वाले आइलेट सीमा के चारों ओर रूपरेखा तैयार करना शुरू करने के लिए"ड्रा"पर क्लिक करें।
- एक नई स्लाइस स्थिति में जाएं और ड्राइंग आकृति दोहराएं। आइलेट के शीर्ष पर अंतिम टुकड़ा के साथ समाप्त करें और"सतह बनाएं"टैब पर क्लिक करके समाप्त करें। आमतौर पर यह हर 10 टुकड़ा रूपरेखा आकर्षित करनेके लिए पर्याप्त है।
- आइलेट मास्क(चित्र 3 डी)का उपयोग करके"आइलेट वैक्यूलेचर"और"आइलेट टमाटर"फ्लोरेसेंस का विभाजन।
- पहले से परिभाषित"आइलेट मास्क"ऑब्जेक्ट चुनें, एडिटिंग टैब(पेंसिल प्रतीक) पर जाएं, और"मास्क ऑल"टैब पर क्लिक करें, जो एक नई खिड़की खोलता है।
- चैनल चयन ड्रॉपडाउन मेनू में पहले नामित चैनल"वैक्यूलेचर"(ch 4) चुनें औरमुखौटा लगाने से पहले "डुप्लिकेट चैनल","निरंतर अंदर/बाहर"विकल्पों को सक्रिय करें, और सतह के बाहर वोक्सल को"0.000"सेट करें, जो एक नया चैनल बनाता है; "आइलेटवैक्यूलेचर"(ch 6) के रूप में नाम बदलें।
- चरण 7.3.1 और 7.3.2 दोहराएं और नए चैनल बनाने के लिए चैनल चयन ड्रॉप डाउन मेनू में पहले से बनाए गए चैनल"टमाटर (सभी)(ch 5) चुनें; "आइलेटटमाटर"(ch 7) के रूप में नाम बदलें ।
- आइलेट वैक्यूलेचर की सतह प्रतिपादन(चित्र 3e)
- 'दृश्य'मेनू में एक नई सतह बनाएं और जादूगर में"स्वचालित निर्माण"चुनें।
- स्रोत चैनल को पहलेबनाया "आइलेट वेक्यूलेचर"(ch 6) सेट करें और पृष्ठभूमि घटाव चुनें। जरूरत पड़ने पर स्वचालित सीमा अनुमान को समायोजित किया जा सकता है। जवाबी फ्लोरेसेंस चैनल (उदाहरण के लिए, नव निर्मित सतह टैब में मिश्रित करके)। जादूगर में आगे बढ़ें।
- वैकल्पिक रूप से, फिल्टर का उपयोग करें। उदाहरण के लिए,"वॉल्यूम"चुनें और फ़िल्टर (पीला) को खिड़की में समायोजित करें, जो चयनित सतह वस्तुओं को हटा सकता है। जादूगर को समाप्त करें और नई सतह वस्तु"आइलेट वेक्यूलेचर"का नाम दें।
- "आइलेटटमाटर वास्कुलेचर"फ्लोरेसेंस सिग्नल(चित्र 3f) काविभाजन
- पहले बनाए गए'आइलेट वेक्यूलेचर' सरफेस ऑब्जेक्ट में, टैब को एडिट करने के लिए जाएं और"मास्क ऑल"टैब पर क्लिक करें, जो एक नई विंडो खोलता है।
- चैनल चयन ड्रॉप डाउन मेनू में पहले नाम वाले चैनल"आइलेट टमाटर"(ch 7) चुनें और सतह के बाहर वोक्सल को"10.000"सेट करें, जो नया चैनल बनाता है; "आइलेटटमाटर वास्कुलेचर"(ch 8) के रूप में नाम बदलें।
- "टमाटरकैप्सूल"फ्लोरेसेंस सिग्नल का विभाजन(चित्रा 3जी)
- "चैनलअंकगणित"में"छवि प्रसंस्करण"टैब और टाइप"ch7-ch8"चुनें, नया चैनल बनाते हैं; "टमाटरकैप्सूल"(चौधरी 9) के रूप में नाम बदलें।
नोट:"आइलेट टमाटर वास्कुलेचर"फ्लोरेसेंस सिग्नल कुल"आइलेट टमाटर"फ्लोरेसेंस सिग्नल से घटाया जाता है।
- "चैनलअंकगणित"में"छवि प्रसंस्करण"टैब और टाइप"ch7-ch8"चुनें, नया चैनल बनाते हैं; "टमाटरकैप्सूल"(चौधरी 9) के रूप में नाम बदलें।
- "आइलेट टमाटर वास्कुलेचर"और"टमाटर कैप्सूल"(चित्र 3h) कीसतह प्रतिपादन
- चरण 7.4 का पालन करें, और जादूगर में स्रोत चैनलों का चयन करें"आइलेट टमाटर वाक्यूलेचर"(चौधरी 8) या"टमाटर कैप्सूल"(ch 9) तदनुसार नई सतह वस्तुओं को बनाने के लिए।
- कुल आइलेट सतह की सतह प्रतिपादन(चित्रा 3i)
- आइलेट बैकस्कैटर फाइल खोलें और एक नई सतह बनाएं।
- जादूगर में,"स्वचालित निर्माण"चुनें और"रुचि के क्षेत्र" कोपरिभाषित करें।
नोट:"ब्याज के क्षेत्र" काउपयोग कई आइलेट्स के संकेतों को अलग करने और विश्लेषण किए जाने वाले आइलेट की गहराई को परिभाषित करने के लिए किया जाता है (उदाहरण के लिए, शीर्ष 75 माइक्रोन)। - "निरपेक्षतीव्रता"में यदि आवश्यक हो तो सीमा को समायोजित करें। सतह वस्तु पर या बंद पर क्लिक किया जा सकता है इसी चैनल तीव्रता के साथ पार की जांच करने के लिए । जादूगर बंद करो।
- क्वांटिफिकेशन(चित्र 3जे)
- 'सीन'मेन्यू में बनाई गई सरफेस ऑब्जेक्ट चुनें और'स्टैटिस्टिक्स'टैब पर जाएं।
- चयनित सतह वस्तु में विस्तृत मात्रा डेटा प्राप्त करने के लिए"विस्तृत"टैब चुनें और ड्रॉपडाउन मेनू से"विशिष्ट मूल्यों"और"वॉल्यूम"का चयन करें। चयनित सतह वस्तु के कुल मात्रा मूल्य को पुनः प्राप्त करने के लिए,"विस्तृत"टैब पर जाएं और"औसत मूल्यों"का चयन करें।
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Representative Results
गैर लेबल मानव आइलेट्स 8 सप्ताह पुरानी महिला NOD के इक्का में प्रत्यारोपित किया गया । (सीजी)-जीटी (रोजा) 26Sortm4-Rag2-/--(NOD।tm4Rag2-/- रोजा- टमाटर। Rag2−/−)प्राप्तकर्ता चूहों। मानव ऊतक अस्वीकृति को रोकने के लिए, इम्यूनोडिफिशिएंसी Rag2 नॉकआउट चूहों प्राप्तकर्ताओं के रूप में चुना गया । इन ट्रांसजेनिक चूहों में, सभी कोशिकाओं और ऊतकों ने एक झिल्ली-लक्षित टमाटर फ्लोरेसेंस प्रोटीन (एमटी) व्यक्त किया जो प्राप्तकर्ता और दाता ऊतक की स्पष्ट पहचान की अनुमति देता है। उच्च-रिज़ॉल्यूशन 2-फोटॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा आइलेट ग्राफ्ट की बार-बार इमेजिंग से एनग्रेफ्टमेंट प्रक्रिया में शामिल एमटी+ प्राप्तकर्ता कोशिकाओं और उनके गतिशील माइग्रेशन पैटर्न की पहचान हो सकती है।
सामान्य तौर पर, प्राप्तकर्ता चूहों(चित्रा 1a)के एसीई में मानव आइलेट्स का प्रत्यारोपण सेटअप आइलेट आकार और आकार(चित्रा 1b,सी)के संबंध में सिजेनिक माउस आइलेट प्रत्यारोपण के समान था। चित्रा 1d,ई एक विस्तृत योजनाबद्ध पार्श्व चीरा साइट(चित्रा 1f)और आंख कक्ष(चित्रा 1g)में आइलेट्स के फैलाव और इंजेक्शन माउस आइलेट्स(चित्रा 1h)या मानव आइलेट्स(चित्रा 1i)के एक प्रतिनिधि परिणाम दिखाता है । मानव आइलेट्स की ग्राफ्टिंग दर आम तौर पर कम थी (~ 30%) माउस आइलेट्स (50-70%) की तुलना में। इस विसंगति का एक संभावित कारण यह है कि मानव आइलेट्स की उपलब्धता अप्रत्याशित है, आमतौर पर केवल 1 दिन की सूचना के साथ, और यह भी कि प्राप्त आइलेट्स दाता आयु, दाता बीएमआई, शुद्धता (45%-86%), और पोस्टिसिएलेशन संस्कृति समय (2-5 दिन) में भिन्न होते हैं। इसके विपरीत, चूहों से आइलेट अलगाव आसानी से योजना बनाई जा सकती है। ये उच्च शुद्धता और कम, रातोंरात संस्कृति के समय के साथ 6-8 सप्ताह पुराने (यानी, युवा वयस्क) चूहों से अलग थे । परिणामों की व्याख्या करते समय माउस और मानव आइलेट ग्राफ्ट के बीच इन विसंगतियों पर विचार किया जाना चाहिए।
वीवो फ्लोरेसेंस इमेजिंग में मानव आइलेट ग्राफ्ट के ऊतक ऑटोफ्लोरेसेंस(चित्र 4)के महत्वपूर्ण हस्तक्षेप से समझौता किया गया था। दृश्यमान स्पेक्ट्रम में पारंपरिक तरंगदैर्ध्य का उपयोग करके इमेजिंग एजेंटों द्वारा एसीई-प्रत्यारोपित मानव आइलेट ग्राफ्ट की पुनर्वैस्कुलराइजेशन प्रक्रिया का दृश्य कम सिग्नल-टू-शोर अनुपात और प्राकृतिक आइलेट ऑटोफ्लोरेसेंस के उच्च स्तर से बाधित था, 500-700 एनएम(चित्रा 4ए)की स्पेक्ट्रल रेंज में λ-स्कैन की छवियों या डेक्सट्रान टीआर (610-675 एनएम)(चित्रा 4बी)का पता लगाने के लिए फिल्टर के साथ संवेदनशील नॉनडस्कैन्ड पीएमटी डिटेक्टर द्वारा सचित्र। इस उच्च पृष्ठभूमि माउस आइलेट ग्राफ्ट(चित्रा 4c)में नहीं देखा गया था । एनआईआर उत्सर्जक इमेजिंग एजेंट एंजियोसेंस 680 ने एनआईआर रेंज 690-730 एनएम(चित्रा 4डी, चित्रा 3ए)में पृष्ठभूमि शोर में कमी के कारण एक दिख उच्च सिग्नल-टू-बैकग्राउंड अनुपात दिखाया। प्राकृतिक आइलेट ऑटोफ्लोरेसेंस के कारण शेष पृष्ठभूमि शोर को हटाने के लिए बाद में छवि प्रसंस्करण चरण में "अप्रयुक्त" चैनल (यानी, 500-550 एनएम) की अतिरिक्त रिकॉर्डिंग का उपयोग किया जा सकता है। 2-फोटॉन/कॉन्फोकल इमेजिंग सेटअप(चित्रा 2डी-एफ)पहले वर्णित लोगों के समान है6,900 एनएम 2-फोटॉन उत्तेजन और फ्लोरेसेंस डिटेक्शन ऑफ एंजियोसेन्स 680, ऑटोफ्लोरेसेंस, और नॉनडेस्कैनेड पीएमटीएस 1-3(चित्रा 2d)के साथ टमाटर चैनलों के उपयोग के लिए बचाएं। प्रत्येक माइक्रोस्कोप सेटअप(चित्रा 2e)के लिए नमूने तक पहुंचने वाली लेजर आउटपुट पावर को मापने की सलाह दी जाती है। इसके अलावा, शुरू में स्टीरियोमाइक्रोस्कोपी(चित्रा 2a-सी)के साथ ग्राफ्ट किए गए आइलेट्स को इमेज करने की सिफारिश की जाती है, जो ब्याज के आइलेट्स का चयन करने और एक असफल प्रत्यारोपण की 2-फोटॉन माइक्रोस्कोपी छवियों से बचने में मदद करेगा।
कई छवियों से मात्रात्मक डेटा निकालने का उद्देश्य डेटा चयन में संभावित पूर्वाग्रह को दूर करना और प्रयोगों की तुलना करते समय वैध प्रभाव का पता लगाने के लिए आवश्यक सांख्यिकीय शक्ति प्राप्त करना था। अग्नाशय के आइलेट्स के फ्लोरोसेंट इमेजिंग से क्वांटिफिकेशन में कई चरण शामिल थे, जिनमें से प्रत्येक ने परिणामों को दूसरे में प्रभावित किया हो सकता है। यहां इंटरेक्टिव इमेजिंग सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल किया गया। इसमें वॉल्यूम छवियों और वस्तुओं के दृश्य और उनकी आकृति विज्ञान या तीव्रता के अनुसार वस्तुओं की पहचान की अनुमति देने वाली विशेषताएं शामिल हैं। चित्र 3 छवि विभाजन में विभिन्न चरणों को दिखाता है। "ऑटोफ्लोरेसेंस" चैनल के घटाव द्वारा ऑटोफ्लोरेस को हटाने से सिग्नल-टू-शोर अनुपात(चित्रा 3 ए,बी)में सुधार हुआ। आइलेट सीमा को "आइलेट मास्क"(चित्रा 3सी)और संबंधित चैनल(चित्रा 3 डी)मैन्युअल रूप से परिभाषित किया गया था। टमाटर के संकेत को आइलेट वैक्यूचर और आइलेट कैप्सूल(चित्रा 3f,जी)और अंतिम सतह प्रतिपादन(चित्र 3e,एच,i)में विभाजित करने का उपयोग मात्रात्मक डेटा निकालने के लिए किया गया था।
चित्रा 5 2 सप्ताह, 2 महीने, 5 महीने, और 8 महीने के बाद एक मंजूरी के इक्का में एक ही मानव आइलेट भ्रष्टाचार के एक प्रतिनिधि देशांतर इमेजिंग सत्र से पता चलता है । रोजा- टमाटर। Rag2Rag2-/-प्राप्तकर्ता माउस । सचित्र अधिकतम तीव्रता अनुमानों (एमआईपी) मूल रूप से दर्ज कच्चे डेटा(चित्रा 5a)की छवियां हैं, आइलेट ऑटोफ्लोरेसेंस हटाने के बाद प्रसंस्कृत छवियां(चित्रा 5b-ई, एफ-i),और कैप्सूल सहित खंडित आइलेट ऑब्जेक्ट्स(चित्रा 5जे, एम)या आइलेट वैकुलेचर बनाने वाली MT+ प्राप्तकर्ता कोशिकाएं (लाल, चित्रा 5n-q)और कुल आइलेट वैक्यूलेचर (हरा, चित्रा 5n-q)।
चित्रा 1: आंख के पूर्वकाल कक्ष में अग्नाशय के आइलेट्स का प्रत्यारोपण।
(क)प्रत्यारोपण सेटअप स्टीरियोटैक्सिक हेड होल्डर में तय एनेस्थेटाइज्ड माउस और टेबल पर तय किए गए हैमिल्टन सिरिंज के बगल में उजागर आंख (इनसेट) और माउस आइलेट्स(बी)या मानव आइलेट्स(ग)लेने के लिए तैयार स्टीरियोमाइक्रोस्कोप दिखा रहा है । (घ)आइलेट्स से भरी आंख के कैनुला की प्रतीक्षा स्थिति । (ङ)प्रक्रिया में प्रत्यारोपण, और(च)एक पार्श्व चीरा की योजनाबद्ध ड्राइंग ध्यान से आंख cannula की नोक के साथ कॉर्निया ऊपर उठाने के लिए इस्तेमाल किया और पूर्वकाल कक्ष(जी)में आइलेट्स बांटना । माउस आइलेट्स(एच)या मानव आइलेट्स(i)के इंजेक्शन के तुरंत बाद आंख की छवि। स्केल बार = 500 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: ऐस प्रत्यारोपित अग्नाशय आइलेट ग्राफ्ट की इमेजिंग।
}aप्रायोगिक फ्लोरोसेंट स्टीरियो माइक्रोस्कोप इमेजिंग सेटअप। बी 6 की वाइडफील्ड(ख)या फ्लोरोसेंट इमेज(c)। रोजा-टमाटरआइलेट ग्राफ्ट। {dएमिशन लाइट पाथ की सरलीकृत योजना। एलबीएफ: लेजर-ब्लॉकिंग फिल्टर (मुख्य बीम स्प्लिटर); एलपी: लांग पास; बीपी: बैंड पास; पीएमटी: फोटोमल्टीप्लायर। 1)लेजर आउटपुट पावर तरंगदैर्ध्य पर दृढ़ता से निर्भर करती है। आरेख लेजर बीम (%), माइक्रोस्कोप सेटअप के लिए मापा के शक्ति स्तर से संबंधित वाट (डब्ल्यू) में वास्तविक लेजर उत्पादन शक्ति से पता चलता है । सर्किल: 800 एनएम, वर्ग: 900 एनएम, त्रिकोण: 1,000 एनएम। (च)प्रायोगिक इमेजिंग सेटअप जो प्राप्तकर्ता माउस को ऐस-ग्राफ्टेड आइलेट्स (डालने) के साथ मोटराइज्ड स्टेज पर एक वाणिज्यिक माइक्रोस्कोप पर घुड़सवार दिखाता है । स्केल बार = 100 माइक्रोन कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: एक मानव आइलेट की छवि विभाजन एक मंजूरी के इक्का में कलम । रोजा- टमाटर। Rag2Rag2-/-प्राप्तकर्ता माउस ।
(क)मूल रिकॉर्डिंग: दिखाया गया है एक मानव आइलेट की एक छवि ढेर का एक 3 डी प्रतिपादन है जिसमें विलय चैनल या स्प्लिट चैनलों एंजियोसेंस 680 (सीएच 1), ऑटोफ्लोरेसेंस (सीएच 2), और टमाटर (ch 3) के ऑप्टिकल सेक्शन हैं। (ख)विभाजित चैनलों के साथ विलय चैनलों या ऑप्टिकल खंडों के साथ छवि स्टैक का 3डी प्रतिपादन"वैक्यूलेचर"(ch 4) और"टमाटर (सभी)" (ch 5) ऑटोफ्लोरेसेंस हटाने के बाद। (ग)आइलेट मास्क (पीला) । (घ)विलय या विभाजन चैनलों के साथ छवि स्टैक के 3 डी प्रतिपादन"आइलेट वेक्यूलेचर"(चौधरी 6, सफेद),"आइलेट टमाटर"(चौधरी 7, लाल) । (ङ)सतह वस्तु 'आइलेट वैक्यूलेचर' सीएच 6 से बनाया गया । (च)विलय चैनलों के साथ छवि स्टैक के 3 डी प्रतिपादन"आइलेट वैक्यूलेचर"(चौधरी 6, हरे) और"आइलेट टमाटर वास्कुलेचर"(चौधरी 8, लाल)। (छ)चैनल घटाव ch 7-ch 8 या विलय चैनलों के साथ ऑप्टिकल अनुभाग के बाद"टमाटरकैप्सूल"(चौधरी 9, सफेद), आइलेट टमाटर वैक्यूलेचर (चौधरी 8, लाल), और आइलेट वैक्यूलेचर (चौधरी 6, हरे) के 3 डी प्रतिपादन । (ज)टमाटर कैप्सूल की सतह प्रतिपादन (चौधरी 9 से बनाया गया) और आइलेट टमाटर वास्कुलेचर (सीएच 8 से बनाया गया)। (i) चैनल तीव्रता(दाएं)की तुलना में"रुचि के क्षेत्र"(बाएं) और खंडित सतह वस्तु (मध्य) के चयन को दिखाते हुए मानव आइलेट बैकस्कैटर सिग्नल से आइलेट सेगमेंटेशन। (j)सांख्यिकी टैब से डेटा की पुनः प्राप्ति । स्केल बार = 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 4: मानव आइलेट्स का ऑटोफ्लोरेसेंस।
मानव आइलेट्स(ए,बी,डी)या बी 6 माउस आइलेट्स(ग)को मंजूरी के एसीई में प्रत्यारोपित किया गया था। रैग 2-/-या B6 प्राप्तकर्ता चूहों और रक्त वाहिकाओं के दृश्य के लिए डेक्सट्रान टीआर(ए-सी)या एंजियोसेंस 680 इमेजिंग एजेंट(डी)के साथ इंजेक्शन दिया जाता है।c (क)900 एनएम पर 2-फोटॉन एक्सटिटेशन के साथ 500-700 एनएम से लेकर रेंज में ह्यूमन आइलेट ग्राफ्ट का λ-स्कैन। अधिकतम छवि प्रक्षेपण (एमआईपी) मानव की छवि(b)या माउस आइलेट ग्राफ(सी)900 एनएम पर उत्साहित है और एनडीडी के टीआर फिल्टर (610-675 एनएम) के साथ पता चला है। (घ)मानव आइलेट भ्रष्टाचार का एमआईपी 900 एनएम पर उत्साहित है और एनडीडी के एंजियोसेंस 680 फिल्टर (690-730 एनएम) के साथ पता लगाना। स्केल बार = 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 5: प्रत्यारोपित मानव आइलेट्स उत्तरोत्तर पुनर्वहनी और प्राप्तकर्ता मूल की कोशिकाओं को व्यक्त करने वाले MT द्वारा समझाया जाता है।
मानव आइलेट्स को मंजूरी के पूर्ववर्ती नेत्र कक्ष में प्रत्यारोपित किया गया। रोजा- टमाटर। Rag2−/− प्राप्तकर्ता चूहों, 8 महीने तक के लिए बार-बार छवि थे। वैक्यूलेचर के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए एंजियोसेंस 680 इंजेक्ट किया गया था। (क)5 महीने के बाद के विभाजन पर स्प्लिट (वैक्यूलेचर, ऑटोफ्लोरेसेंस, एमटी) या मर्ज किए गए चैनलों और बैकस्कैटर लाइट सिग्नल के मूल दर्ज कच्चे डेटा के अधिकतम तीव्रता अनुमान (एमआईपी) । अकेले कुल वाक्यूल्चर(बी-ई)के एमआईपी या आइलेट ऑटोफ्लोरेंस हटाने (हरा, ए)के बाद झिल्ली-लक्षित टमाटर फ्लोरेसेंस (एमटी)(एफ-i)के साथ विलय कर दिया गया। खंडित आइलेट टमाटर कैप्सूल(j-m)और आइलेट टमाटर वाक्यूलेचर (लाल) या कुल आइलेट वेक्यूलेचर (हरा)(एन-क्यू)के 3 डी प्रतिपादन संकेत समय अंक के बाद। स्केल बार = 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
प्राप्तकर्ता और दाता ऊतक की भागीदारी को देख कर मानव अग्नाशय आइलेट सेल ग्राफ्टिंग प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत की जाती है। एक इम्यूनोडिफिशिएंसी माउस आंख के पूर्वकाल कक्ष में मानव आइलेट्स प्रत्यारोपित एक न्यूनतम आक्रामक सर्जरी के बाद, माउस सर्जरी के बाद मिनट के भीतर जल्दी से ठीक हो जाता है। प्रक्रिया एक आंख पर किया जाता है। आम तौर पर, 5-7 दिनों के बाद से कॉर्निया को इंट्राविटल इमेजिंग करने के लिए पर्याप्त रूप से चंगा किया जाता है।
इस प्रोटोकॉल में, मानव आइलेट ग्राफ्ट की गुणवत्ता महत्वपूर्ण है। मानव आइलेट गुणवत्ता और इस तरह प्रत्यारोपण परिणाम दाता की उम्र, बीएमआई, और अलगाव की प्रक्रिया के आधार पर भिन्न हो सकते हैं, साथ ही आगमन से पहले और बाद में आइलेट संस्कृति का समय भी भिन्न हो सकता है। नैदानिक प्रत्यारोपण और अनुसंधान प्रयोजनों के लिए अनुमोदित अंग दाता अग्न्याशय से संसाधित मानव आइलेट्स का उपयोग दानदाताओं की सहमति से किया गया था। इन्हें अग्न्याशय पाचन और आइलेट शुद्धि की प्रक्रिया के बाद प्राप्त किया गया था,जो कहीं और वर्णित है . अलग मुरीन आइलेट्स के समान, इन आइलेट्स को इस्केमिया, यांत्रिक तनाव, बेसमेंट प्रोटीन की हानि और एंजाइमेटिक पाचन चरण14,,15के दौरान इंट्रा-आइलेट एंडोथेलियल कोशिकाओं (एनसी) के आंशिक व्यवधान जैसे कई सेलुलर हमलों से गुजरना पड़ता है। लगातार संस्कृति की स्थिति में सुधार और उच्च गुणवत्ता वाले मानव आइलेट्स की बड़ी संख्या की वसूली के बावजूद, प्रत्यारोपण के लिए समय एक महत्वपूर्ण कारक बना हुआ है । संस्कृति के पहले दिनों के दौरान, मानव आइलेट्स इंट्रा-आइलेट ईसीएस का एक महत्वपूर्ण नुकसान दिखाते हैं और संस्कृति के छह दिनों पर केवल आइलेट कोर में छोटे एंडोथेलियल संरचनाओं का पता लगाया जा सकता है16। इंट्रा-आइलेट एंडोथेलियल कोशिकाओं का यह नुकसान मानव आइलेट्स की कम ग्राफ्टिंग में एक महत्वपूर्ण कारक बन सकता है, क्योंकि दाता आइलेट ईसीएस पुनर्वैस्कुलरीकरण प्रक्रिया17में महत्वपूर्ण खिलाड़ी हैं।
प्रत्यारोपण प्रक्रिया के दौरान बंध्यता को बनाए रखना इम्यूनोसमझौता मंजूरी में आंखों के संक्रमण से बचने के लिए महत्वपूर्ण है । रोजा- टमाटर। Rag2Rag2-/-चूहों । आमतौर पर, प्रत्यारोपण प्रक्रियाओं को दस्ताने, प्रयोगशाला कोट, सिर कवर, और मुंह मुखौटा का उपयोग करके साफ परिस्थितियों में किया जाता है, लेकिन जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर नहीं। सभी उपयोग किए गए समाधान बाँझ फ़िल्टर किए जाते हैं, और सीरिंज, कैनुला, ट्यूबिंग और धुंध को 70% इथेनॉल में धोया जाता है। जागो पिंजरों को ऑटोक्लेव किया जाता है। जबकि प्रक्रिया के दौरान माउस की मैन्युअल हैंडलिंग के कारण पूर्ण बंध्यता की गारंटी नहीं दी जा सकती है, आइलेट संदूषण या आंखों के संक्रमण इस प्रक्रिया के साथ समस्याएं नहीं हैं।
स्थिर और पर्याप्त संज्ञाहरण कम फ्रेमरेट डेटा अधिग्रहण के दौरान आंखों की गतिविधियों और बहाव को कम करने के लिए एक महत्वपूर्ण और महत्वपूर्ण कारक है, और प्रभावशीलता विभिन्न एनेस्थेटिक एजेंटों18के बीच भिन्न हो सकती है। प्रकाश के तहत, सामान्य आइसोफ्लुएंज एनेस्थीसिया, आंख कभी-कभी धीमी गति से रोलिंग फैशन में चलती है और संज्ञाहरण की गहराई में वृद्धि होती है (1-2%) आम तौर पर आंखों की गतिविधियों को कम कर सकते हैं। साँस लेने योग्य संज्ञाहरण का उपयोग करने का स्पष्ट लाभ इसका त्वरित प्रभाव और वसूली का समय है। हालांकि, यह बताया जाना चाहिए कि आइसोफ्लुन के उपयोग से इंसुलिन स्राव19में परिवर्तन हो सकता है।
छवि विश्लेषण और विभाजन, या कई क्षेत्रों में एक छवि का विभाजन, चुनौतीपूर्ण और डेटा चयन20में संभावित पूर्वाग्रह के अधीन हैं । विभाजन का उद्देश्य मात्राकरण के लिए "आइलेट वेक्यूलेचर" जैसी वस्तुओं की पहचान करना है। यहां, तीव्रता-सीमा के आधार पर तरीकों को चुनिंदा क्षेत्रों (यानी, "पूर्ण तीव्रता") या किनारों को खोजने के लिए तीव्रता मतभेद (यानी, "पृष्ठभूमि घटाव") पर लागू किया गया था। वर्तमान में, फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी में विभाजन के लिए कोई सार्वभौमिक समाधान नहीं हैं। एक दृष्टिकोण वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर के साथ प्रयोग करना है जो कई तरीकों का समर्थन करता है। यदि पृष्ठभूमि तीव्रता भिन्नता के कारण थ्रेसहोल्डिंग विफल हो जाती है, तो छवि कैप्चर सेटिंग में छोटे परिवर्तन विभाजन परिणामों में सुधार कर सकते हैं।
विधि की एक सीमा इस तथ्य में निहित है कि मानव भ्रष्टाचार को प्राप्तकर्ता कोशिकाओं द्वारा अधिक तेजी से प्रतिस्थापित किया जाता है और वास्तव में, माउस प्राप्तकर्ता एंडोथेलियल कोशिकाओं द्वारा पूरी तरह से पुनर्गठन किया जाता है। यह मानव कोशिका बातचीत के अध्ययन को बाधित करेगा यदि उद्देश्य मानव एंडोथेलियल कोशिकाओं के साथ बातचीत के माध्यम से आइलेट पैरान्चिमा में माइग्रेट करने वाली मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं को अपनाया स्थानांतरित करना है। हालांकि, माउस और मानव आइलेट ग्राफ्ट दोनों में, इसी तरह का पुनर्वैस्कुलरीकरण प्राप्तकर्ता से होता है और प्रजातियों के लिए विशिष्ट विभिन्न शारीरिक 3 डी योजना का अनुसरण करता है।
बीटा सेल रिप्लेसमेंट थेरेपी की सफलता दरों में सुधार जारी है। फिर भी, वीवो में आइलेट ग्राफ्टिंग और अस्तित्व की दक्षता का मूल्यांकन करने में विभिन्न चुनौतियां उपयुक्त इंट्राविटल इमेजिंग प्रौद्योगिकियों की कमी के कारण अनसुलझी रहती हैं। पूर्वकाल नेत्र कक्ष एक उपयोगी प्रत्यारोपण स्थल है, जो आइलेट आकृति विज्ञान, संवहनी पैटर्न, बीटा सेल फ़ंक्शन और एक सेलुलर संकल्प पर बीटा सेल मृत्यु के अध्ययन के लिए आइलेट कोशिकाओं के वीवो इमेजिंग में दोहराया और दीर्घकालिक समर्थन करता है।
यहां सूचित एसीई प्रत्यारोपण स्थल में मानव आइलेट प्रत्यारोपण की ग्राफ्टिंग प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए प्रोटोकॉल मानव आइलेट्स ग्राफ्ट की देशांतर निगरानी के लिए अनुमति देता है, जो अन्य वैकल्पिक देशांतर प्लेटफार्मों जैसे एमआरआई21,22,पीईटी23 , स्पेक्ट 24या बायोल्यूमिनेसेंस25के साथ प्राप्त की तुलना में काफी अधिक संकल्प के साथ है ।25
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस अध्ययन को स्वीडिश रिसर्च काउंसिल, स्ट्रैटेजिक रिसर्च एरिया पलायन, डीएनआर 2009-1039, स्वीडिश फाउंडेशन फॉर स्ट्रैटेजिक रिसर्च डीएनआर आईआरसी15-0067 को लुंड-आईआरसी, लुंड में रॉयल फिजियोग्राफिक सोसायटी, डायबिटीजफ्रबंडडेट और बार्नडायबिटेसफोर्डेट द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anasthesia machine, e.g. Anaesthesia Unit U-400 | Agnthos | 8323001 | used for isofluran anasthesia during surgery and imaging |
| -induction chamber 1.4 L | Agnthos | 8329002 | connect via tubing to U-400 |
| -gas routing switch | Agnthos | 8433005 | connect via tubing to U-400 |
| AngioSense 680 EX | Percin Elmer | NEV10054EX | imaging agent for injection, used to image blood vessels in human islet grafts |
| Aspirator tubes assemblies | Sigma | A5177-5EA | connect with pulled capillary pipettes for manual islet picking |
| Buprenorphine (Temgesic) 0.3mg/ml | Schering-Plough Europé | 64022 | fluid, for pain relief |
| Capillary pipettes | VWR | 321242C | used together with Aspirator tubes assemblies |
| Dextran-Texas Red (TR), 70kDa | Invitrogen | D1830 | imaging agent for injection |
| Eye cannula, blunt end , 25 G | BVI Visitec/BD | BD585107 | custom made from Tapered Hydrode lineator [Blumenthal], dimensions: 0.5 x 22mm (25G x 7/8in) (45?), tip tapered to 30 G (0.3mm) |
| Eye gel | Novartis | Viscotears, contains Carbomer 2 mg/g | |
| Hamilton syringe 0.5 ml, Model 1750 TPLT | Hamilton | 81242 | Plunger type gas-tight syringe for islet injection |
| Head holder | |||
| -Head holding adapter | Narishige | SG-4N-S | assemled onto metal plate |
| -gas mask | Narishige | GM-4-S | |
| -UST-2 Solid Universal Joint | Narishige | UST-2 | assemled onto metal plate |
| -custom made metal plate for head-holder assembly | |||
| -Dumont #5, straight | Agnthos | 0207-5TI-PS or 0208-5-PS | attached to UST-2 (custom made) |
| Heating pad, custom made | taped to the stereotaxic platform | ||
| Human islet culture media | |||
| -CMRL 1066 | ICN Biomedicals | cell culture media for human islets | |
| -HEPES | GIBCO BRL | ||
| -L-glutamin | GIBCO BRL | ||
| -Gentamycin | GIBCO BRL | ||
| -Fungizone | GIBCO BRL | ||
| -Ciproxfloxacin | Bayer healthcare AG | ||
| -Nicotinamide | Sigma | ||
| Image analysis software | Bitplane | Imaris 9 | |
| Image Aquisition software | Zeiss | ZEN 2010 | |
| Infrared lamp | VWR | 1010364937 | used to keep animals warm in the wake-up cage |
| Isoflurane Isoflo | Abott Scandinavia/Apotek | fluid, for anesthesia | |
| Needle 25 G (0.5 x 16mm), orange | BD | 10442204 | used as scalpel |
| Petri dishes, 90mm | VWR | 391-0440 | |
| 2-Photon/confocal microscope | |||
| -LSM7 MP upright microscope | Zeiss | ||
| -Ti:Sapphire laser Tsunami | Spectra-Physics, Mai Tai | ||
| -long distance water-dipping lens 20x/NA1.0 | Zeiss | ||
| -ET710/40m (Angiosense 680) | Chroma | 288003 | |
| -ET645/65m-2p (TR) | Chroma | NC528423 | |
| -ET525/50 (GFP) | Chroma | ||
| -ET610/75 (tomato) | Chroma | ||
| -main beam splitter T680lpxxr | Chroma | T680lpxxr | Dichroic mirror to transmit 690 nm and above and reflect 440 to 650 nm size 25.5 x 36 x 1 mm |
| Polythene tubing (0.38mm ID, 1.09 mm OD) | Smiths Medical Danmark | 800/100/120 | to connect with Hamilton syringe and eye canula |
| Stereomicroscope | Nikon | Model SMZ645, for islet picking | |
| Stereomicroscope (Flourescence) | for islet graft imaging | ||
| -AZ100 Multizoom | Nikon | wide field and long distance | |
| -AZ Plan Apo 1x | Nikon | ||
| -AZ Plan Apo 4x | Nikon | ||
| -AZ-FL Epiflourescence with C-LHGFI HG lamp | Nikon | ||
| -HG Manual New Intensilight | Nikon | ||
| -Epi-FL Filter Block TEXAS RED | Nikon | contains EX540-580, DM595 and BA600-660 | |
| -Epi-FL Filter Block G-2A | Nikon | (EX510-560, DM575 and BA590) | |
| -Epi-FL Filter Block B-2A | Nikon | (EX450-490, DM505 and BA520) | |
| -DS-Fi1 Colour Digital Camera (5MP) | Nikon | ||
| Syringe 1-ml, Omnitix | Braun | 9161406V | for Buprenorphine injection, used with 27 G needle |
| Surgical tape | 3M |
References
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