Summary
이 프로토콜의 목표는 인간 췌장 이식 과정과 기여 숙주 대 기증자 세포의 역학을 지속적으로 모니터링하는 것입니다. 이것은 NOD의 눈의 전방 챔버 (ACE)에 인간 섬을 이식하여 달성된다. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-마우스 수신자가 반복된 2광자 이미징을 수행합니다.
Abstract
화상 진찰 베타 세포는 아일렛 이식을 이해하는 쪽으로 중요한 단계입니다. 베타 세포 생물학의 기록을 위한 다른 화상 진찰 플랫폼이 개발되고 생체 내에서이용되고 있더라도, 단하나 세포 분해능 및 연속적인 세로 기록을 허용하는 측면에서 제한됩니다. 각막의 투명성 때문에 마우스내 눈의 전방 챔버(ACE)는 인간 및 마우스 췌장 세포 생물학을 연구하기에 적합합니다. 다음은 이 접근법이 개별 인간 적인 아슬렛 이식의 접목 및 개조의 연속적인 세로 기록을 수행하는 데 어떻게 사용될 수 있는지에 대한 설명입니다. 인간 적인 아슬렛 이식편은 NOD를 사용하여 ACE에 삽입됩니다. (Cg)-Gt (ROSA)26Sortm4-Rag2-/-마우스를 받는 사람으로. 이것은 기증자 세포 대 수령인의 확장및 접목의 캡슐화 및 혈관화를 승진시키는 수신자 세포의 기여의 조사를 허용합니다. 또한, 배분부 또는 분할된 혈관분기 및 아슬레 캡슐 형성 수용자 세포의 이미지 분석 및 정량화를 위한 단계별 접근법이 설명된다.
Introduction
당뇨병 mellitus는 종종 인슐린 저항을 동반췌형 연하 베타 세포의 손실 또는 기능 장애에서 불충분 한 인슐린 생산의 결과로 혈당의 높은 수준을 특징으로 하는 대사 질환의 그룹을 설명합니다. 타입-1 (T1D) 및 타입-2 당뇨병 (T2D)는 베타 세포의 진보적인 기능 장애가 질병 발달을 일으키는 원인이 되는 복잡한 질병입니다. T1D는 베타 세포에 대한 자가 면역 공격에 의해 침전되고, T2D는 신진 대사 요인에 의해 구동되는 것으로 간주되는 반면, 저급 전신 염증1의증가 증거이기는하지만. 기증자 인간 섬, 특히 T1D 환자에게 이식은 생리적 혈당 조절을 제공할 수 있는 잠재력을 제공합니다. 그러나, 조직 기증자와 가난한 축 소 이식의 부족은 주류 치료 옵션이 될 수있는 islet 이식을 방지하고있다. 저산소, 염증성, 면역원성 숙주 환경2,,3으로인해 즉각적인 이식 후 기간(24-48h)에서 기능성 축약 이식의 상당 부분이 손실된다. 섬 생존의 개선을 위한 개입 방법의 효율성을 평가하기 위해, 이러한 이식의 지속적인 모니터링이 필요하다.
이식 후 이식된 인간 췌장암의 운명을 이미지화하고 추적하는 생체기술에서 여전히 당뇨병 연구에 대한 도전으로 남아있다 4,,5. 현재까지, 양성선 방출 단층 촬영(PET), 자기 공명 영상(MRI), 또는 초음파(미국)를 포함한 비침습적 이미징 기술은 실험 조건에서 이식된 섬의 정량화 및 기능적 평가가능성을보여준다 5. However, given the small islet sizes, quantitative measurements by those modalities suffer from insufficient resolution. 관찰을 위한 이식 부위로서 눈의 전방 챔버(ACE)는 장기간에 걸쳐 효과적으로 더 높은 공간 해상도와 빈번한 모니터링을 제공하는 유망한 비침습적 이미징 솔루션이다6. 이 방법은 마우스 개강 생물학(양외7에서검토), 자가면역 반응8,인간 유일 접목9,,10을연구하기 위해 성공적으로 악용되었다.
여기서 ACE 이식 방법은 이식 후 최대 10개월 동안 개별 축약 이식에 대한 연속적이고 반복된 기록에 의한 인간 췌장 이식 과정의 역학을 조사하기 위한 2-광자 이미징 접근법과 결합된다. 더 큰 이미징 깊이의 다광 화상 진찰 특성및 감소된 전반적인 광표백 및 사진 손상은 공초점 현미경검사법 11의화상 진찰 한계를 극복합니다. 형광 화상 진찰의 정량화는 islet 견본 준비, islet 이식, 화상 취득, 심상 여과를 포함하여 몇몇 단계를 관련시킵니다, 탈모 소음 또는 배경, 분할, 정량화 및 데이터 분석. 가장 어려운 단계는 일반적으로 이미지를 여러 부품 또는 영역으로 분할하거나 분할하는 것입니다. 예를 들어, 신호와 배경 잡음 또는 색상 또는 모양의 유사성에 따라 복셀의 클러스터링 영역을 분리하여 축화 를 나타내는 3D 볼륨의 복셀을 감지하고 레이블을 지정하는 것이 포함될 수 있습니다. 분할되면 개체 볼륨 크기와 같은 통계는 일반적으로 추출하기 간단합니다. 분할 및 데이터 시각화와 같은 이미징 데이터의 정량화 및 추출을 위한 방법이 제공된다. 특히 인간 섬에서 자가형광을 제거하고 아슬렛 혈관과 섬 캡슐 형성 수용자 세포를 구별하는 데 특별한 주의를 기울입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
스웨덴 룬드의 지역 윤리위원회는 인간과 관련된 연구의 윤리적 검토에 관한 법에 따라 연구를 승인했습니다. 동물 실험은 스웨덴동물 실험윤리에 따라 엄격하게 수행되었으며 말뫼와 룬드의 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 6~8주된 면역결핍 NOD. (Cg)-Gt (ROSA)26Sortm4-Rag2-/ - (NOD. 로사 토마토. Rag2Rag2-/-받는 마우스는 인간섬(10)의이식을 위한 수령인으로 사용되었다.
1. 이식을 위한 아일렛 준비
- CMRL 1066의 문화 인간 섬은 10m HEPES로 보충, 2 mM L-글루타민, 50 μg/mL 젠타마이신, 0.25 μg/mL 균류존, 20 μg/mL 시프록스플로X락사신, 10mMM 니코티나미드(NIC), 10% 열활성 인간 혈청(NIC), 그리고 10% 열활성화 인간 혈청은 5%의 CO2 및 후압공기로12°
참고 : 섬은 외신 조직이 없어야하며 문화에서 서로를 만지지 않아야합니다. 엑소크리엔 조직은 반투명으로 나타납니다. - 이식 당일, 섬이 함유된 배양 배지를 당겨진 유리 모세혈관에 연결된 흡혈관 어셈블리를 사용하여 새로운 페트리 접시로 이송한다.
참고: 또는 200 μL 파이펫을 사용하십시오. 페트리 접시의 뒷면을 착색하면 스테레오 현미경으로 섬을 보다 쉽게 구별할 수 있습니다. - 스테레오 현미경을 사용하여 이식당 ~20-40개의 섬을 선택하고 1.5mL 튜브로 옮김합니다. 인큐베이터의 문화 매체로 튜브를 맨 위에 채웁니다.
- 파라핀 필름으로 튜브를 밀봉하고 이식 될 때까지 얼음에 저장합니다. 수행 된 이식 수에 대한 적절한 금액을 준비합니다.
- 또는 수술실에서CO2 인큐베이터를 사용할 수 있도록 배양섬을 유지하고 각 이식 직전에 바로 선택하십시오.
2. 이식 장비 및 수술 테이블 준비
참고: 모든 수술 도구는 자동 으로 사용되어야 하며 수술 테이블과 기기는 70%의 알코올로 소독되어야 합니다.
- 입체 헤드 홀더를 코 마스크를 통해 마취에 연결하고 가열 패드를 켭니다.
- 가스가 단단한 해밀턴 주사기를 폴리에틸렌 튜빙과 무딘 끝 눈 캐뉼라에 연결합니다.
참고: 조립 하기 전에 PBS로 모든 부품을 채우는 것이 좋습니다. 갇힌 기포를 확인하고 있는 경우 제거합니다. - 해밀턴 주사기를테이블(도 1a)또는 이동식 베이스(도1e)에단단히 부착하고 캐뉼라가 매달려 있는 스테레오 현미경에 튜브를 부착합니다(예: 대기 위치).
참고: 제거 및 다시 부착하기 쉽기 때문에 수술 용 테이프를 사용합니다. - 0.1 mg/kg 부프레노르핀 용액으로 채워진 30 G 바늘에 연결된 1mL 주사기를 준비합니다.
- 멸균 PBS로 주사기를 준비합니다. 또는 파이펫을 사용하십시오.
- 가열 램프가있는 깨끗한 모닝케이지를 따로 두십시오.
3. 마취 및 수술을위한 받는 마우스의 위치
참고: 모든 동물은 룬드 대학의 동물 시설에서 병원체가 없는 환경에서 사육되고 유지되었습니다.
- 40% O 2/60% N2/3%로채워진2챔버에서 마우스를 마취시키고 마취된 마우스를 따뜻한 가열 패드(도1a)의헤드 홀더 플랫폼으로 이송한다. 페달 반사 신경의 부족을 확인합니다.
참고: 이소플루란 마취는 수술 후 빠른 회복을 위한 마취의 바람직한 방법입니다. 현미경 방은 이소플루란을 사용하기 위해 제대로 환기해야합니다. - 마우스의 주미를 40% O 2/60% N22/0.9%-1.5% 이소플루란 마취기계에 연결된 마취 마스크에 넣습니다.2 엄지와 손가락을 사용하여 머리를 약간 들어 올리고 측면에있는 금속 조각을 사용하여 고정하십시오. 이어피스가 귀 바로 아래 머리를 고정하도록 합니다. 마우스 뒷면에 피하로 0.1 mg/kg 부프레노르핀 용액을 주입합니다.
참고: 부프레노르핀은 진통제로 사용됩니다. - 머리를 기울여 서 작동할 눈이 위쪽으로 향하고 있으며 연구원과 가깝습니다.
- 눈꺼풀을 부드럽게 철회하여 무딘 집게를 사용하여 이식하고, 눈을 뜨고, 핀셋한 쌍으로 느슨하게 고정합니다. 핀셋의 끝이 헤드 홀더플랫폼(도 1a,삽입)에 부착된 폴리에틸렌 튜브로 덮여 있는지 확인합니다.
- 항상 눈에 멸균 PBS의 액적을 적용하여 두 눈을 젖은 유지.
- 인간 섬은 밀폐된 1.5mL 튜브(section 1)에서 멸균 PBS를 가진 페트리 접시로 옮기고 섬이 서로 가까이 있는지 확인하여 전송된 세포 배양 매체의 양을 최소화한다(도1c).
- 해밀턴 주사기에 폴리에틸렌 튜브를 통해 연결된 눈 캐뉼라에서 ~ 20-30개의 섬을 선택하십시오.
참고: 섬으로 가능한 한 적은 액체를 섭취하십시오. - 튜브를 거꾸로 걸어 스테레오 현미경(도 1d)에부착합니다. 섬이 캐뉼라쪽으로 튜브의 끝에 가라앉을 수 있도록 튜브를 조심스럽게 테이프로 놓습니다.
4. 이식 절차
참고: 이 방법은 이전에 마우스 섬6의이식에 대해 설명되었습니다. 약간 수정된 절차가 여기에 표시됩니다.
- 뒷다리에 패드를 꼬집어 마우스가 잠들어 있는지 확인합니다.
- 혈류를 방해하지 않고 눈을 억제하는 집게를 조이고 멸균 PBS의 액적을 눈에 적용합니다.
- 25 G 바늘을 메스로 사용하여 위쪽으로 구부리며 각막에 있는 팁의 절반만 조심스럽게 침투하여 하나의 측면 절개를 합니다. 위쪽 각도로 구멍을 만듭니다. 구멍은 이식 후 더 쉽게 밀봉됩니다(도 1f).
- 섬이 미리 로드된 캐뉼라로 각막을 조심스럽게 들어 올리고 천천히 눈에 섬으로 바립니다. 홍채의 손상을 방지하기 위해 전방 챔버에 캐뉼라를 삽입하지 말고 각막 개구부(도1g)에조심스럽게 밀어 넣습니다. 에이스에서 캐뉼라를 천천히 철회합니다.
참고: 3-8 μL의 사출 부피를 목표로 합니다. 부피가 너무 크면 불필요하게 높은 내피압에 눈을 노출시키고 전방 챔버에서 주입 된 섬의 역류가 발생할 수 있습니다. - 안구 챔버의 압력 증가로 인해 섬 삽입에 어려움을 겪을 때 측면 절개 부위를 보강하고 섬을 다시 적용하여 절개 부위를 확대합니다.
참고: 때때로 도입된 기포는 공간 홀더로 사용할 수 있습니다. - 눈젤을 눈에 바르고, 눈 절제 포셉을 풀고, 8-10분 동안 같은 위치에 마우스를 그대로 두어 섬이 세팅하도록 합니다.
- 눈꺼풀을 들고 있는 집게를 제거하고 눈꺼풀을 정상 위치로 다시 놓습니다.
- 머리 홀더에서 마우스를 제거하고 깨우기 케이지로 옮습니다.
- 마우스가 깨어 있고 움직일 때 원래 케이지로 다시 옮기고 스캔할 때까지 동물 하우징에 보관하십시오(최소 5일 이상 권장).
5. 2 광자 현미경 검사법에 의해 이식 된 인간 섬의 이미징
참고: 2-광자 이미징 전에 이식 후 4~5일 동안 형광 입체현미경(도 2a–c)을사용하여 눈의 개요 영상을 촬영하여 관심 있는 섬을 국소화하는 것이 좋습니다. 이식 후 일찍 눈을 너무 단단히 억제하지 마십시오. 이식 후 6-7일 동안 2-광자 이미징을 사용하십시오.
- 이미지 수집 소프트웨어를 시작합니다(재료 표참조). "레이저"메뉴에서는 마이타이 레이저(Power"ON")를활성화하고"라이트 패스"메뉴에서 파장을 900nm로 설정하고 5%-10% 레이저 파워(슬라이더 사용)로 시작하는 최소한의 전송 레이저 파워를 적용한다.
참고: 스캔하는 동안 필요에 따라 레이저 전원을 조정합니다. - 녹색, 주황색 및 빨간색 채널을 설정합니다. 다음과 같이 비단열성 거울(LBF 760) 및 배출 필터 정보를 사용하여 3개의 비다산 검출기(NDD)에 동시에 방출 광을 수집합니다: 레드/안지오센스 680, 690-730 nm; 녹색/자동 불발성, 500-550 nm; 오렌지/토마토, 565-610nm(그림 2d).
- 헤드 홀더 스테이지를 전동 현미경 단계에 놓고 방독면을 마취 기계의 튜브및 환기 시스템에 연결된 튜브에 연결합니다. 가열 패드를 켭니다.
- 수신자 마우스를 마취하고, 헤드 홀더 플랫폼으로 이송하고, 이미징을 위해 눈을 억제하고, 위에서 설명한 바와 같이 부프레노르핀 용액을 관리한다(단계 3.1-3.5).
- 필요에 따라 이소플루란 증기를 조정합니다. 분당 ~55-65의 호흡 속도(bpm)는 최적의 마취를 나타냅니다. 마취가 너무 깊으면, 속도는 무거운 호흡 또는 헐떡거리는 것으로 <50 bpm이 될 것입니다. 너무 가벼우면 피상호흡이 있는 >70 bpm이 됩니다. 15분마다 육안 검사를 통해 마취 중 마우스를 주의 깊게 모니터링합니다.
참고: 마취는 마우스에서 마우스, 마우스 균주 사이, 그리고 마취에 따른 시간이13로진행됨에 따라 다릅니다. - 각막과 렌즈 사이에 침지 액체로서 눈에 충분한 눈 젤을 투여하여 천천히 축적할 수있습니다(그림 2f,삽입). 기포를 피하십시오.
참고: 유연한 금속 호스 램프가 있는 측면 조명은 초점을 조정하고 섬 이식편을 국소화하는 것이 좋습니다. - 혈관을 시각화하려면 일회용 인슐린 30 G 주사기를 사용하여 화상 진찰제(예를 들어, Angiosense 680)의 100 μL을 정맥내로 투여한다.
- "획득 모드에서"512 x 512 및 스캔 속도로 프레임 크기를 조정합니다.
참고: 느린 스캔(예: 거주 시간 증가)은 신호 대 잡음 비율을 향상시킵니다. - "채널"메뉴에서는 볼트의 각 PMT에 대한 마스터 게인을 조정하여 라이브 스캐닝 모드에서 이미지가 화면에 보일 때까지 신호를 증폭시합니다. 이 값이 높을수록 검출기가 신호및 소음에 더 민감해집니다.
참고: 바람직하게는 값을 500-800 V 사이로 유지합니다. - "Z-스택"메뉴에서 포커스를 수동으로 아일렛 접목의 맨 위로 이동하여 z 스택의 시작과 끝을 정의합니다. "먼저 설정"을 선택하여 위치를저장합니다. "마지막 설정"을 선택하여 islet 접목에 초점을 맞출 수 있는 마지막 하단 평면으로 이동하여 위치를저장합니다. 2 μm의 z 단계 크기를 사용합니다.
- "실험시작"탭을 클릭하여 최종 이미지 스택을 수집하고 8비트 CZI(즉, 칼 자이스 형식) 파일로 저장합니다.
6. 공초점 현미경 검사법에 의한 이식된 인간 섬 의 이미징
참고: 이식된 섬의 총 부피, 형태 및 가소성은 레이저 백스캐터라이트(10)를검출하여 별도의 스캔(즉, 별도의 트랙)에서 생체 내 산란 신호를 모니터링하여 평가할 수 있다.
- 메인 빔 스플리터(즉, LBF 필터)를 꺼내"라이트 패스"대화 상자에서 공초점 이미징을 위한 별도의 트랙을 설정합니다. 633 nm의 파장이있는 아르곤 레이저를 선택하고 레이저 빛과 동일한 파장에서 감지하십시오. Z 스택은 백스캐터 광 신호를 위해 2-3 μm의 단계 크기로 획득됩니다.
- 전체 이면에 있는 내용을 기록하려면 z 스택 설정을 재조정합니다(5.10단계 참조).
- 이미지 스택을 획득하고 8비트 CZI 파일로 저장합니다.
7. 이미지 분석
참고: 상업용 소프트웨어(재료 표참조)가 이 단계에 사용되었습니다.
- 제거 된 islet 자동 불발(그림 3b)
- 「이미지 처리」에서 탭 선택 「채널 산술 」과타입 「ch1-ch2」. 이렇게 하면 새 채널 4(ch 4)가 생성됩니다. "혈관"으로 이름을바꿉니다.
참고: 녹색/자동 불발 채널은 빨간색/혈관 감각 채널에서 빼됩니다. - 이전 단계를 반복하고"ch3-ch2"를입력하여 새로운 채널(ch 5)을 만듭니다. "토마토 (모두)"로이름을 바꿉니다.
참고: 녹색/자동 형광 채널은 오렌지/토마토 채널에서 빼됩니다.
- 「이미지 처리」에서 탭 선택 「채널 산술 」과타입 「ch1-ch2」. 이렇게 하면 새 채널 4(ch 4)가 생성됩니다. "혈관"으로 이름을바꿉니다.
- 수동 도면으로 이스릿 마스크 정의(도 3c)
- 새 표면(파란색 기호)을 만들고 마법사에서"수동으로 편집"을 선택합니다. "선택"모드로 포인터를 유지하고 3D 보기에서"볼륨"(장면아래)을 클릭 해제하여 섹션을 시각화합니다. Scene
- 쉽게 이면 국경 차별을 원하기 위해 ch 1-ch 3를 포함한 모든 채널을 활성화하십시오.
참고: 오렌지/토마토 채널은 토마토 캡슐 신호로 이점 테두리를 정의하는 데 유용합니다. 또는 멀티채널 islet 자동 형광 및 검출기 배경 신호를 지침으로 사용하기 위해 채널 강도를 늘립니다. - "드로잉"탭에서"윤곽"을선택하고"그리기"를클릭하여 슬라이스 위치 1에서 시작하여 개국 테두리 주위에 윤곽을 그리기 시작합니다.
- 새 슬라이스 위치로 이동하고 드로잉 윤곽을 반복합니다. "표면만들기"탭을 클릭하여 마지막 슬라이스로 마무리하고 끝작입니다. 일반적으로 10 번째 슬라이스마다 윤곽을 그리는 것으로충분합니다.
- "아슬렛 혈관 "및"아슬렛 토마토"형광을 사용하여 착질(도 3d)의세분화.
- 이전에 정의된"Islet 마스크"객체를 선택하고 편집탭(연필 기호)으로 이동하여 새 창을 여는"모든 "마스크"탭을 클릭합니다.
- 채널 선택 드롭다운 메뉴에서 이전에 명명된 채널"Vasculature"(ch 4)를 선택하고 옵션을 활성화 "중복 채널 마스크를 적용하기 전에","상수 내부/ 외부",그리고"0.000"로외부 의 복셀을 설정, 새로운 채널을 만드는; "이슬화 혈관 "(ch6)으로 이름을 바꿉니다.
- 7.3.1 및 7.3.2 단계를 반복하고 채널 선택 드롭 다운 메뉴에서 이전에 만든 채널"토마토 (모두)"(ch5)를 선택하여 새 채널을 만듭니다.all "아일렛토마토"(ch 7)로 이름을 바꿉니다.
- 아슬렛 혈관의 표면 렌더링(그림 3e)
- "장면"메뉴에서 새 표면을 만들고 마법사에서"자동 생성"을선택합니다.
- 소스 채널을 이전에 만든"Islet vasculature"(ch 6)로 설정하고 배경 빼기를 선택합니다. 필요한 경우 자동 임계값 추정을 조정할 수 있습니다. 응답형광 채널(예: 새로 생성된 표면 탭을 혼합/내)과 비교합니다. 마법사에서 진행합니다.
- 선택적으로 필터를 사용합니다. 예를 들어 "볼륨"을선택하고 선택한 표면 객체를 제거할 수 있는 창에서 필터(노란색)를 조정합니다. 마법사를 완료하고 새 표면 오브젝트"Islet vasculature"의 이름을 지정합니다.
- "아일렛 토마토 혈관 "형광 신호(도 3f)
- 이전에 만든"Islet vasculature" 표면 오브젝트에서 편집 탭으로 이동하여 새 창을 여는"모든 "마스크"탭을 클릭합니다.
- 채널 선택 드롭 다운 메뉴에서 이전에 명명 된 채널"아일렛 토마토"(ch 7)를 선택하고 새로운 채널을 만드는"10.000"로표면 외부 의 복셀을 설정; "아슬렛 토마토 혈관 "(ch8)으로 이름을 바꿉니다.
- "토마토캡슐"형광 신호(도 3g)의세분화
- "채널산술의"를선택 "이미지 처리"탭 및 유형 "ch7-ch8",새로운 채널을 만드는; 「토마토캡슐」(ch 9)으로 이름을 바꿉니다.
참고 :"아슬렛 토마토 혈관 "형광 신호는 총"아슬렛 토마토"형광 신호에서 빼는다.
- "채널산술의"를선택 "이미지 처리"탭 및 유형 "ch7-ch8",새로운 채널을 만드는; 「토마토캡슐」(ch 9)으로 이름을 바꿉니다.
- "아슬렛 토마토 혈관 "과"토마토 캡슐"의표면 렌더링 "(그림3h)
- 7.4단계를 따르고, 마법사에서 소스 채널을 선택하여"아슬렛 토마토 혈관 "(ch 8) 또는"토마토캡슐"(ch 9)을 선택하여 그에 따라 새로운 표면 물체를 만듭니다.
- 총 아틀릿 표면의 표면 렌더링(그림 3i)
- 이스렛 백스캐터 파일을 열고 새 표면을 만듭니다.
- 마법사에서"자동 생성"을선택하고"관심 영역"을정의합니다.
참고 :"관심 영역"은여러 섬의 신호를 분리하고 분석 할 섬의 깊이를 정의하는 데 사용됩니다 (예를 들어, 상위 75 μm). - "절대 강도"가 필요한 경우 임계 값을 조정합니다. 서피스 오브젝트를 클릭하거나 끄면 해당 채널 강도를 교차 확인할 수 있습니다. 마법사를 닫습니다.
- 정량화(그림 3j)
- "장면"메뉴에서 생성된 서피스 오브젝트를 선택하고"통계"탭으로 이동합니다.
- 선택한 표면 개체에서 자세한 볼륨 데이터를 검색하려면"자세한"탭을 선택하고 드롭다운 메뉴에서"특정 값"과"볼륨"을선택합니다. 선택한 표면 오브젝트의 총 볼륨 값을 검색하려면"상세"탭으로 이동하여"평균 값"을 선택합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
표지되지 않은 인간 섬은 8주된 여성 NOD의 ACE로 이식되었다. (Cg)-Gt (ROSA)26Sortm4-Rag2-/ -(NOD. 로사토마토. Rag2-/−)받는 쥐. 인간 조직 거부를 방지하기 위해 면역형 Rag2 녹아웃 마우스를 수령인으로 선택하였다. 이러한 형질전환 마우스에서, 모든 세포와 조직은 수령인과 기증자 조직의 명확한 식별을 허용하는 막 표적 토마토 형광 단백질 (mT)을 표현했습니다. 고해상도 2-광자 현미경 검사법에 의한 islet 이식체의 반복된 화상 진찰은 이식 과정 및 그들의 동적 이동 패턴에 관련시킨 mT+ 수신자 세포를 확인할 수 있었습니다.
일반적으로, 인간 섬의 이식 설정은 수신자 마우스의ACE(도 1a)의 아세트(도 1a)는섬 모양 및 크기에 관한 합성 마우스 섬 이식과 유사하였다(도1b,c). 도 1d,e는 측면 절개 부위(도 1f)와 아방 내섬분산(도 1g)및 주입된 마우스 섬(도1h)또는 인간 섬(도1i)의대표적인 결과를 보여주는 상세한 회로도를 가진 전형적인 이식을 나타낸다.Figure 1f 인간 섬의 접목 비율은 일반적으로 낮았다 (~30%) 마우스 섬 (50-70 %)보다. 이러한 불일치에 대한 가능한 이유는 인간 섬의 가용성이 예측할 수 없으며, 보통 1일 전에만 공지되며, 또한 획득한 섬은 기증자 연령, 기증자 BMI, 순도(45%-86%), 및 고립 후 문화 시간(2-5일)에서 다양하기 때문입니다. 대조적으로, 마우스에서 암석 격리는 쉽게 계획될 수 있습니다. 이들은 6-8 주 된에서 격리 되었다 (즉, 젊은 성인) 높은 순도와 짧은, 하룻밤 문화 시간 마우스. 결과를 해석할 때 마우스와 인간 적인 islet 이식편 사이 이러한 불일치를 고려해야 합니다.
인간 이슬 이식편의 생체 내 형광 화상 진찰은 조직 자동 형광으로부터의 상당한 간섭에 의해 손상되었다(도4). 가시 스펙트럼에서 전통적인 파장을 이용한 영상제에 의한 ACE 이식 된 인간 이슬릿 이식과정의 시각화는 낮은 신호 대 잡음 비율과 높은 수준의 천연 적 인 연실 자동 형광에 의해 방해되었다, 500-700 nm(도4a)의스펙트럼 범위에서 λ-scan의 이미지 또는 덱스엑스트라른 TR(610-675 nm)의 검출을 위한 필터를 사용하는 민감한 비descanned PMT 검출기에의해(도 4b). 이 높은 배경은 마우스 이슬 접목(도 4c)에서관찰되지 않았다. NIR 발광 이미징 에이전트 Angiosense 680은 NIR 범위 690-730 nm(도4d, 도 3a)에서배경 잡음이 감소하기 때문에 눈에 띄게 높은 신호 대 배경 비율을 보였다. "사용되지 않는" 채널(예: 500-550 nm)의 추가 기록은 자연적인 점 자동 불광으로 인한 남은 배경 노이즈를 제거하기 위해 이후 이미지 처리 단계에서 사용될 수 있다. 2-광자/공초점 영상설정(도 2d–f)은이전에 설명된 것들6과유사하며, 혈관감각 680, 자동 형광 및 토마토 채널의 900 nm 2-광자 흥분 및 형광 검출을 사용하기 위해 저장1-3(도2d). 각 현미경설정(도 2e)에대한 샘플에 도달하는 레이저 출력 전력을 측정하는 것이 좋습니다. 또한, 처음에 접목된 섬들을 스테레오현미경(도2a–c)으로이미지화하여 관심 있는 섬을 선택하고 이식에 실패한 이식의 2-광자 현미경 이미지를 피하는 것이 좋습니다.
많은 이미지에서 정량적 데이터를 추출하는 목적은 데이터 선택에서 잠재적 편향을 제거하고 실험을 비교할 때 합법적인 효과를 감지하는 데 필요한 통계적 힘을 얻는 것이었습니다. 췌장 적의 형광 화상 진찰에서 정량화는 몇몇 단계를 관련시켰습니다, 각각은 다른 결과에 영향을 미쳤을 지도 모릅니다. 여기서는 대화형 이미징 소프트웨어가 사용되었습니다. 여기에는 볼륨 이미지와 개체를 시각화하고 형태 또는 강도에 따라 개체를 식별할 수 있는 기능이 포함되어 있습니다. 그림 3은 이미지 세분화의 여러 단계를 보여 줍니다. "자동 불발성" 채널의 하수에 의한 자동 불발성의 제거는 신호 대 잡음비(도 3a,b)를개선하였다. "아일렛 마스크"(도3c)및 해당채널(도 3d)이라고불리는 이스렛 경계가 수동으로 정의되었다. 토마토 신호의 분할은 상기 상기 슬레틀 혈관 및 아슬레캡슐(도 3f,g)및 최종 표면 렌더링(도3e,h,i)으로정량적 데이터를 추출하는 데 사용되었다.
도 5는 2주, 2개월, 5개월 및 8개월 후 NOD의 ACE로 이식 후 동일한 인간 적목 이식의 대표적인 종방향 이미징 세션을 나타낸다. 로사토마토. Rag2-/- 받는 사람 마우스. 그림은 원래 기록된 RAW mT데이터(그림5a),애슬레토오일제거 후 처리된 이미지(도 5b –e, f–i)및 캡슐(도5j,m)j,m또는 암테+수신자 셀(빨간색, 그림 5n-q)및 총계의 최대 강도 투영(MIP)Figure 5b이미지(q-q)입니다.+ Figure 5nq
그림 1: 췌장 섬이 눈의 전방 챔버로 이식합니다.
(a)발상지 헤드 홀더에 고정된 마취 마우스를 보여주는 이식 설정 및 준비된 해밀턴 주사기 옆에 있는 노출된 눈(inset)을 테이블에 고정시키고 마우스섬(b)또는 인간 섬(c)을 선택할 준비가 된 스테레오현미경(c).c (d)섬이 적재된 눈 캐뉼라의 대기 위치. (e)이식 과정에서,(f)눈 캐뉼라의 끝으로 각막을 조심스럽게 들어 올리고 전방챔버(g)로섬절을 분배하는 데 사용되는 단일 측면 절개의 회로도도를 조심스럽게 들어 올린다. 마우스 섬(h)또는 인간 섬(i)의주입 직후 눈의 이미지. 스케일 바 = 500 μm. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.
그림 2: ACE 이식된 췌장 암소 이식의 이미징.
(a)실험형 형광 스테레오 현미경 이미징 설정. B6의와이드필드(b)또는 형광화상(c)c 로사토마토 아슬렛 이식. (d)방출 광 경로의 단순화 된 방식. LBF: 레이저 차단 필터(메인 빔 스플리터); LP: 긴 패스; BP: 밴드 패스; PMT: 포토승가. (e)레이저 출력 전력은 파장에 크게 의존합니다. 다이어그램은 현미경 설정에 대해 측정된 레이저 빔(%), 레이저 빔의 전력 수준(%)과 관련된 와트(W)의 실제 레이저 출력 전력을 나타낸다. 원 : 800 nm, 사각형 : 900 nm, 삼각형 : 1,000 nm. (f)ACE 접목 섬(insert)을 가진 수신자 마우스를 보여주는 실험 영상 설정은 전동 단계에 장착된 상업적 현미경이다. 스케일 바 = 100 μm이 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: NOD의 ACE에 접목된 인간 적지의 이미지 세분화. 로사토마토. Rag2-/- 받는 사람 마우스.
(a)원본 기록: 도시된 것은 인간 이목의 이미지 스택을 병합채널 또는 분할 채널의 광학 섹션과 함께 3D 렌더링하는 것으로 혈관감각(680), 자동불광(ch2), 토마토(ch3)이다. (b)분할 채널이 있는 병합 채널 또는 광학 섹션과 이미지 스택의 3D 렌더링"혈관화"(ch 4) 및"토마토(모두)" (ch5) 자동 불발 제거 후. (c)이면 마스크(노란색). (d)병합 또는 분할 채널과 이미지 스택의 3D 렌더링 "축 기질" (ch 6, 흰색), "축 토마토" (ch 7, 빨간색). (e)표면 물체 "축색 혈관 "ch 6에서 만든. (f)병합 된 채널"islet vasculature"(ch 6, 녹색) 및"아슬렛 토마토 혈관 "(ch 8, 빨간색)와 이미지 스택의 3D 렌더링. (g)3D 렌더링의"토마토캡슐"(ch 9) 채널 빼기 ch 7-ch 8 또는 광학 섹션 병합 채널"토마토 캡슐"(ch 9, 화이트), 이슬 토마토 혈관분화 (ch 8, 빨간색), 및 축축물 혈관 (ch 6, 녹색). (h)토마토 캡슐 (ch 9에서 만든)과 아슬레 토마토 혈관 (ch 8에서 만든)의 표면 렌더링. (i)인간 축으로부터의 아일렛 분할은 채널 강도(오른쪽)에 비해"관심영역"(왼쪽)과 분할된 표면 오브젝트(가운데)의 선택을 나타내는 신호이다. (j)통계 탭에서 데이터 검색. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 인간 섬의 자동 형광.
인간섬(a,b,d)또는 B6 마우스 섬(c)은 NOD의 ACE로 이식되었다.c Rag2Rag2-/- 또는 B6 수신자 마우스및 혈관의 시각화를 위해 dextran TR(a-c)또는 혈관 감각 680 이미징 에이전트(d)로주입하였다. (a)인간 이슬 이식편이식의 λ-스캔은 500-700 nm에서 900 nm에서 2-광자 내분과 함께 한다. 인간(b)또는 마우스 개소 이식편(c)의c최대 이미지 프로젝션(MIP) 이미지는 900nm에서 흥분되어 NDD의 TR 필터(610-675 nm)로 검출된다. (d)NDD의 혈관감각 680 필터(690-730 nm)로 900nm에서 흥분한 인간 적각 이식편의 MIP. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 이식된 인간 섬은 점진적으로 배반되고 mT가 받는 사람 기원의 세포를 발현함으로써 캡슐화된다.
인간 섬은 NOD의 전방 눈 챔버로 이식. 로사토마토. Rag2-/− 받는 마우스는 최대 8개월 동안 반복적으로 이미지화되었습니다. 혈관 감각 680은 혈관의 시각화를 위해 주입되었다. (a)이식 후 5개월 동안 분할(혈관, 자동발광, mT) 또는 병합된 채널 및 백스캐터 광 신호의 원래 기록된 RAW 데이터의 최대 강도 투영(MIP). 총 혈관 단독(b–e)의MIPS 또는 멤브레인 표적 토마토 형광 (mT)(f–i)후 islet 자동 부동 제거 (녹색, a)와병합. 분할된 아슬렛 토마토캡슐(j–m)과아슬렛 토마토 혈관 (빨간색) 또는 총 아슬레 혈관 (녹색)(n–q)의3D 렌더링은 이식 후 표시된 시간 지점에서. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
수급자와 기증자 조직의 개입을 관찰하여 인간 췌장 세포 이식 과정을 연구하는 방법이 제시된다. 면역 결핍 마우스 눈의 전방 챔버에 인간 섬을 이식 하는 최소한의 침습 수술 후, 마우스 는 수술 후 분 이내에 신속 하 게 복구. 절차는 한쪽 눈에 수행됩니다. 일반적으로, 5-7 일 이후 이식 후 각막은 충분히 인트인트 이미징을 수행 하기 위해 치유.
이 프로토콜에서는 인간 적인 아슬렛 이식의 품질이 중요합니다. 인간 적인 아슬렛 품질 및 따라서 이식 결과 기증자의 나이에 따라 다를 수 있습니다., BMI, 그리고 격리 과정, 도착 전후 에 있는 islet 문화의 시간 뿐만 아니라. 임상 이식 및 연구 목적으로 승인된 장기 기증자 췌장에서 처리된 인간 섬은 기증자의 동의하에 사용되었습니다. 그(것)들은 다른 곳에 기술된 췌장 소화 및 islet 정제의 과정 후에 얻어졌다12. 고립 된 뮤린 섬과 유사하게, 이들 섬은 허혈, 기계적 스트레스, 지하 단백질의 손실 및 효소 소화 단계14,,15동안 내막 내피 세포 (EC)의 부분적 중단과 같은 다수의 세포 공격을 겪는다. 지속적으로 문화 조건을 개선하고 고품질의 인간 섬의 많은 수의 복구에도 불구하고, 이식하는 시간은 중요한 요인으로 남아있다. 문화의 첫 날 동안, 인간 섬은 내 섬 내 EC의 상당한 손실을 나타내며 6 일 간의 문화시에는 섬 코어의 작은 내피 구조만 검출 할 수 있습니다16. 기증자 섬 IC가 개정 과정에서 중요한 선수이기 때문에 내섬 내피 세포의 이러한 손실은 인간 섬의 감소된 접목에 중요한 요인을 구성할 수있다.
이식 절차 도중 멸균을 유지하는 것은 면역 손상NOD에 있는 눈 감염을 피하기 위하여 중요합니다. 로사토마토. Rag2-/- 마우스. 일반적으로 이식 절차는 장갑, 실험실 코트, 헤드 커버 및 입 마스크를 사용하여 깨끗한 조건에서 수행되지만 생물 안전 캐비닛 내부는 수행되지 않습니다. 사용된 모든 솔루션은 멸균 여과되며 주사기, 캐뉼라, 튜브 및 거즈는 70 % 에탄올로 헹구습니다. 웨이크업 케이지는 오토클레이브됩니다. 절차 중 마우스를 수동으로 취급하기 때문에 완전한 멸균을 보장 할 수는 없지만, 이 절차에서는 이 절차에 문제가되지 않았습니다.
안정적이고 적절한 마취는 낮은 프레임 레이트 데이터 수집 중에 눈의 움직임과 드리프트를 줄이는 중요하고 중요한 요소이며, 효과는 다른마취제(18)에따라 달라질 수 있다. 빛, 일반 이소플루란 마취에서, 눈은 때때로 느린 롤링 방식으로 이동하고 마취의 증가 깊이 (에서 1-2%) 일반적으로 눈의 움직임을 줄일 수 있습니다. 흡입성 마취를 사용하는 명확한 장점은 빠른 효과와 회복 시간입니다. 그러나 이소플루란의 사용은 인슐린 분비를 바꿀 수 있다는 점을 지적해야 한다19.
이미지 분석 및 세분화 또는 이미지를 여러 영역으로 분할하는 것은 어렵고 데이터선택(20)에서잠재적 편향이 적용됩니다. 세분화는 정량화를 위해 "작은 꽃병"과 같은 객체를 식별하는 것을 목표로합니다. 여기서, 강도 임계값을 기반으로 하는 메서드는 모서리(즉, "배경 빼기")를 찾기 위해 선택 영역(즉, "절대 강도") 또는 강도 차이에 적용되었다. 현재 형광 현미경 검사법의 세분화를 위한 보편적인 해결책은 없습니다. 한 가지 방법은 다양한 방법을 지원하는 상용 소프트웨어를 실험하는 것입니다. 배경 강도 변화로 인해 임계값이 실패하면 이미지 캡처 설정의 작은 변경으로 인해 세분화 결과가 향상될 수 있습니다.
방법의 한계는 인간 이식이 수신자 세포로 더 급속하게 대체되고, 실제로, 마우스 수신자 내피 세포에 의해 완전히 재구성된다는 사실에 있습니다. 이 목표는 인간 내 피 세포와의 상호 작용을 통해 islet parenchyma로 마이그레이션 하는 채택적으로 전송 된 인간의 면역 세포를 연구 하는 경우 인간의 세포 상호 작용의 연구를 배제 할 것 이다. 그러나, 마우스와 인간 적인 아슬렛 이식체에서, 유사한 revascularization는 수신자에서 생기고 종에 특정한 다른 해부학 적인 3D 계획을 따릅니다.
베타 세포 대체 요법의 성공률은 지속적으로 개선되어있습니다. 그럼에도 불구하고, 생체 내 섬 이식 및 생존의 효율성을 평가하는 다양한 과제는 적절한 인트라바이탈 이미징 기술의 부족으로 인해 해결되지 않고 있습니다. 전방 안구 챔버는 세포 분해능에서 유상학, 혈관화 패턴, 베타 세포 기능 및 베타 세포 사멸을 연구하기 위한 islet 세포의 반복적이고 장기적인 생체 내 이미징을 지원하는 유용한 이식 부위이다.
여기에 보고된 ACE 이식 부위에서 인간 섬 이식의 이식 과정을 연구하기 위한 프로토콜은 MRI 21,22,PET23,SPECT24또는 생물,발광(25)과 같은 다른 대체 종로 플랫폼과 함께25얻은 것보다 상당히 높은 해상도의 인간 섬 이식에 대한 경도 모니터링을 허용한다.21
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 스웨덴 연구 위원회, 전략적 연구 지역 외디아브, Dnr 2009-1039, 전략 연구 Dnr IRC15-0067, 룬드의 왕립 물리 학회, 당뇨병퓌르분데트 및 바르니프뢰르분데트에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anasthesia machine, e.g. Anaesthesia Unit U-400 | Agnthos | 8323001 | used for isofluran anasthesia during surgery and imaging |
| -induction chamber 1.4 L | Agnthos | 8329002 | connect via tubing to U-400 |
| -gas routing switch | Agnthos | 8433005 | connect via tubing to U-400 |
| AngioSense 680 EX | Percin Elmer | NEV10054EX | imaging agent for injection, used to image blood vessels in human islet grafts |
| Aspirator tubes assemblies | Sigma | A5177-5EA | connect with pulled capillary pipettes for manual islet picking |
| Buprenorphine (Temgesic) 0.3mg/ml | Schering-Plough Europé | 64022 | fluid, for pain relief |
| Capillary pipettes | VWR | 321242C | used together with Aspirator tubes assemblies |
| Dextran-Texas Red (TR), 70kDa | Invitrogen | D1830 | imaging agent for injection |
| Eye cannula, blunt end , 25 G | BVI Visitec/BD | BD585107 | custom made from Tapered Hydrode lineator [Blumenthal], dimensions: 0.5 x 22mm (25G x 7/8in) (45?), tip tapered to 30 G (0.3mm) |
| Eye gel | Novartis | Viscotears, contains Carbomer 2 mg/g | |
| Hamilton syringe 0.5 ml, Model 1750 TPLT | Hamilton | 81242 | Plunger type gas-tight syringe for islet injection |
| Head holder | |||
| -Head holding adapter | Narishige | SG-4N-S | assemled onto metal plate |
| -gas mask | Narishige | GM-4-S | |
| -UST-2 Solid Universal Joint | Narishige | UST-2 | assemled onto metal plate |
| -custom made metal plate for head-holder assembly | |||
| -Dumont #5, straight | Agnthos | 0207-5TI-PS or 0208-5-PS | attached to UST-2 (custom made) |
| Heating pad, custom made | taped to the stereotaxic platform | ||
| Human islet culture media | |||
| -CMRL 1066 | ICN Biomedicals | cell culture media for human islets | |
| -HEPES | GIBCO BRL | ||
| -L-glutamin | GIBCO BRL | ||
| -Gentamycin | GIBCO BRL | ||
| -Fungizone | GIBCO BRL | ||
| -Ciproxfloxacin | Bayer healthcare AG | ||
| -Nicotinamide | Sigma | ||
| Image analysis software | Bitplane | Imaris 9 | |
| Image Aquisition software | Zeiss | ZEN 2010 | |
| Infrared lamp | VWR | 1010364937 | used to keep animals warm in the wake-up cage |
| Isoflurane Isoflo | Abott Scandinavia/Apotek | fluid, for anesthesia | |
| Needle 25 G (0.5 x 16mm), orange | BD | 10442204 | used as scalpel |
| Petri dishes, 90mm | VWR | 391-0440 | |
| 2-Photon/confocal microscope | |||
| -LSM7 MP upright microscope | Zeiss | ||
| -Ti:Sapphire laser Tsunami | Spectra-Physics, Mai Tai | ||
| -long distance water-dipping lens 20x/NA1.0 | Zeiss | ||
| -ET710/40m (Angiosense 680) | Chroma | 288003 | |
| -ET645/65m-2p (TR) | Chroma | NC528423 | |
| -ET525/50 (GFP) | Chroma | ||
| -ET610/75 (tomato) | Chroma | ||
| -main beam splitter T680lpxxr | Chroma | T680lpxxr | Dichroic mirror to transmit 690 nm and above and reflect 440 to 650 nm size 25.5 x 36 x 1 mm |
| Polythene tubing (0.38mm ID, 1.09 mm OD) | Smiths Medical Danmark | 800/100/120 | to connect with Hamilton syringe and eye canula |
| Stereomicroscope | Nikon | Model SMZ645, for islet picking | |
| Stereomicroscope (Flourescence) | for islet graft imaging | ||
| -AZ100 Multizoom | Nikon | wide field and long distance | |
| -AZ Plan Apo 1x | Nikon | ||
| -AZ Plan Apo 4x | Nikon | ||
| -AZ-FL Epiflourescence with C-LHGFI HG lamp | Nikon | ||
| -HG Manual New Intensilight | Nikon | ||
| -Epi-FL Filter Block TEXAS RED | Nikon | contains EX540-580, DM595 and BA600-660 | |
| -Epi-FL Filter Block G-2A | Nikon | (EX510-560, DM575 and BA590) | |
| -Epi-FL Filter Block B-2A | Nikon | (EX450-490, DM505 and BA520) | |
| -DS-Fi1 Colour Digital Camera (5MP) | Nikon | ||
| Syringe 1-ml, Omnitix | Braun | 9161406V | for Buprenorphine injection, used with 27 G needle |
| Surgical tape | 3M |
References
- Kharroubi, A. T., Darwish, H. M. Diabetes mellitus: The epidemic of the century. World Journal of Diabetes. 6 (6), 850-867 (2015).
- Kanak, M. A., et al. Inflammatory response in islet transplantation. International Journal of Endocrinology. 2014, 451035 (2014).
- Nanji, S. A., Shapiro, A. M. Advances in pancreatic islet transplantation in humans. Diabetes, Obesity, Metabolism. 8 (1), 15-25 (2006).
- Malaisse, W. J., Maedler, K. Imaging of the beta cells of the islets of Langerhans. Diabetes Research and Clinical Practice. 98 (1), 11-18 (2012).
- Kim, D., Jun, H. S. In Vivo Imaging of Transplanted Pancreatic Islets. Frontiers in Endocrinology. 8, 382 (2017).
- Speier, S., et al. Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye. Nature Protocols. 3 (8), 1278-1286 (2008).
- Yang, S. N., Berggren, P. O. The eye as a novel imaging site in diabetes research. Pharmacology, Therapeutics. 197, 103-121 (2019).
- Schmidt-Christensen, A., et al. Imaging dynamics of CD11c(+) cells and Foxp3(+) cells in progressive autoimmune insulitis in the NOD mouse model of type 1 diabetes. Diabetologia. 56 (12), 2669-2678 (2013).
- Berclaz, C., et al. Longitudinal three-dimensional visualisation of autoimmune diabetes by functional optical coherence imaging. Diabetologia. 59 (3), 550-559 (2016).
- Nilsson, J., et al. Recruited fibroblasts reconstitute the peri-islet membrane: a longitudinal imaging study of human islet grafting and revascularisation. Diabetologia. 63 (1), 137-148 (2020).
- Benninger, R. K., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapteer 4 Unit 4 11-24 (2013).
- Goto, M., et al. Refinement of the automated method for human islet isolation and presentation of a closed system for in vitro islet culture. Transplantation. 78 (9), 1367-1375 (2004).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563 (2011).
- Jansson, L., Carlsson, P. O. Graft vascular function after transplantation of pancreatic islets. Diabetologia. 45 (6), 749-763 (2002).
- Konstantinova, I., Lammert, E. Microvascular development: learning from pancreatic islets. Bioessays. 26 (10), 1069-1075 (2004).
- Fransson, M., et al. Mesenchymal stromal cells support endothelial cell interactions in an intramuscular islet transplantation model. Regenerative Medicine Research. 3, 1 (2015).
- Nyqvist, D., et al. Donor islet endothelial cells in pancreatic islet revascularization. Diabetes. 60 (10), 2571-2577 (2011).
- Nair, G., et al. Effects of common anesthetics on eye movement and electroretinogram. Documenta Ophthalmologica. Advances in Ophthalmology. 122 (3), 163-176 (2011).
- Iwasaka, H., et al. Glucose intolerance during prolonged sevoflurane anaesthesia. Canadian Journal of Anaesthesia. 43 (10), 1059-1061 (1996).
- Hamilton, N. Quantification and its applications in fluorescent microscopy imaging. Traffic. 10 (8), 951-961 (2009).
- Michelotti, F. C., et al. PET/MRI enables simultaneous in vivo quantification of beta-cell mass and function. Theranostics. 10 (1), 398-410 (2020).
- Wang, P., et al. Monitoring of Allogeneic Islet Grafts in Nonhuman Primates Using MRI. Transplantation. 99 (8), 1574-1581 (2015).
- Gotthardt, M., et al. Detection and quantification of beta cells by PET imaging: why clinical implementation has never been closer. Diabetologia. 61 (12), 2516-2519 (2018).
- Joosten, L., et al. Measuring the Pancreatic beta Cell Mass in Vivo with Exendin SPECT during Hyperglycemia and Severe Insulitis. Molecular Pharmaceutics. 16 (9), 4024-4030 (2019).
- Virostko, J., et al. Bioluminescence imaging in mouse models quantifies beta cell mass in the pancreas and after islet transplantation. Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 42-53 (2010).
