Summary
L'obiettivo di questo protocollo è quello di monitorare continuamente le dinamiche del processo di innesto dell'isolotto pancreatico umano e delle cellule che contribuiscono tra l'ospite e il donatore. Ciò si ottiene trapiantando isolotti umani nella camera anteriore dell'occhio (ACE) di un NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-destinatario del mouse seguito da ripetute immagini a 2 fotoni.
Abstract
L'imaging delle cellule beta è un passo fondamentale verso la comprensione del trapianto di islet. Anche se diverse piattaforme di imaging per la registrazione della biologia delle cellule beta sono state sviluppate e utilizzate in vivo,sono limitate in termini di possibilità di risoluzione a singola cellula e registrazioni longitudinali continue. A causa della trasparenza della cornea, la camera anteriore dell'occhio (ACE) nei topi è adatta a studiare la biologia delle cellule dell'isolotto pancreatico umano e topo. Ecco una descrizione di come questo approccio può essere utilizzato per eseguire registrazioni longitudinali continue di innesto e revascolarizzazione di singoli innesti di isolotto umano. Gli innesti di isolotto umano vengono inseriti nell'ACE, utilizzando NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-topi come destinatari. Ciò consente di sondare l'espansione delle cellule del ricevente rispetto a quelle del donatore e il contributo delle cellule riceventi nella promozione dell'incapsulamento e della vascolarizzazione dell'innesto. Inoltre, viene delineato un approccio passo-passo per l'analisi delle immagini e la quantificazione del volume dell'isolotto o della vascolatura segmentata e della capsula dell'isolotto che formano le cellule riceventi.
Introduction
Il diabete mellito descrive un gruppo di malattie metaboliche caratterizzate da livelli elevati di glucosio nel sangue come risultato di una produzione insufficiente di insulina da perdita o disfunzione delle cellule beta delle isole pancreatiche, spesso accompagnate da insulino-resistenza. Il diabete di tipo 1 (T1D) e il diabete di tipo 2 (T2D) sono malattie complesse in cui la progressiva disfunzione delle cellule beta causa lo sviluppo della malattia. T1D è precipitato da un attacco autoimmune sulle cellule beta, mentre T2D è considerato guidato da fattori metabolici, anche se con crescente evidenza di infiammazione sistemica di bassogrado 1. Il trapianto di isolotti umani donati, in particolare ai pazienti affetti da T1D, offre il potenziale per fornire un controllo glicemico fisiologico. Tuttavia, la carenza di donatori di tessuti e la scarsa innesto di isoloti ha impedito che il trapianto di isolotto diventasse un'opzione terapeutica tradizionale. Una parte sostanziale dell'innesto dell'isolotto funzionale viene persa nell'immediato periodo post-trapianto (24-48 h) a causa dell'ambiente di ospite ipossico, infiammatorio e immunogenico2,3. Per valutare l'efficienza dei metodi di intervento per il miglioramento della sopravvivenza delle isore, è necessario un monitoraggio continuo di tali trapianti.
Tecniche in vivo per immaginiare e tracciare il destino delle isole pancreatiche umane trapiantate dopo il trapianto rimane ancora una sfida per la ricerca suldiabete 4,5. Ad oggi, le tecniche di imaging non invasive, tra cui la tomografia a emissione di positroni (PET), la risonanza magnetica (RTI) o gli ultrasuoni (US) mostrano il potenziale per la quantificazione e la valutazione funzionale delle isole trapiantate in condizionisperimentali 5. Tuttavia, date le piccole dimensioni degli isocchi, le misurazioni quantitative di tali modalità soffrono di una risoluzione insufficiente. La camera anteriore dell'occhio (ACE) come sito di trapianto per l'osservazione è una promettente soluzione di imaging non invasivo che offre una risoluzione spaziale efficace e un monitoraggio frequente per lunghi periodidi tempo 6. Questo metodo è stato sfruttato con successo per studiare la biologia delle isole dei topi (recensito in Yang et al.7), le risposte immunitarie autoimmuni8, così come l'innesto dell'isolottoumano 9,10.
Qui il metodo di trapianto ACE si combina con un approccio di imaging a 2 fotoni per studiare la dinamica del processo di innesto dell'isolotto pancreatico umano mediante registrazioni continue e ripetute su singoli innesti di isolotto fino a 10 mesi dopo il trapianto. Le proprietà di imaging multifoto di maggiori profondità di imaging e riduzione del fotobleaching complessivo e dei danni fotografici superano i limiti di imaging della microscopia confocale11. La quantificazione dell'imaging fluorescente comporta diverse fasi, tra cui la preparazione del campione di isolotto, il trapianto di isolotto, l'acquisizione di immagini, il filtraggio delle immagini per rimuovere il rumore o lo sfondo delle isole, la segmentazione, la quantificazione e l'analisi dei dati. Il passaggio più impegnativo è in genere il partizionamento o la segmentazione di un'immagine in più parti o aree. Ciò potrebbe comportare la separazione del segnale dal rumore di fondo o il raggruppamento di regioni di voxel in base a somiglianze di colore o forma per rilevare ed etichettare i voxel di un volume 3D che rappresenta la vascolatura dell'isolotto, ad esempio. Una volta segmentate, le statistiche, ad esempio le dimensioni del volume degli oggetti, sono in genere semplici da estrarre. Fornito è un metodo per la quantificazione e l'estrazione dei dati di imaging, ad esempio la segmentazione e la visualizzazione dei dati. Particolare attenzione è prestata alla rimozione dell'autofluorescenza negli isolotti umani e alla distinzione tra vascolatura dell'isolotto e capsula isolotta che forma le cellule riceventi.
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Protocol
Il Comitato Etico Regionale di Lund, Svezia, ha approvato lo studio secondo la legge riguardante la revisione etica della ricerca che coinvolge gli esseri umani. Esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in stretta conformità con l'etica svedese degli esperimenti sugli animali e approvati dai comitati etici di Malma e Lund. NOD immunodeficiente di 6-8 settimane. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/- (NOD. ROSA-pomodoro. Rag2-/-) topi ricevente sono stati utilizzati come destinatari per il trapianto di isolottiumani 10.
1. Preparazione dell'isolotto per il trapianto
- Isolotti umani di coltura in CMRL 1066 integrati con 10 mM HEPES, 2 mM L-glutamina, 50 gentamicina 20 g/mL, 0,25 funghi di 2,25 g/mL, 20 g/mL ciproxfloxacin, 10 mM nicotinamide (NIC) e siero umano inattivato al 10% a 37 gradi centigradi nel 5% di CO2 e aria umida fino al trapianto, come descritto inprecedenza 12.
NOTA: Le isole devono essere libere dal tessuto esocrino e non toccarsi in coltura. I tessuti esocrini appaiono traslucidi. - Il giorno del trapianto, trasferire i supporti di coltura contenenti le isole in un nuovo piatto Petri utilizzando un assemblaggio di tubi aspiratori collegato a un capillare di vetro tirato.
NOTA: In alternativa, utilizzare una pipetta da 200 L. Colorare la parte posteriore del piatto Petri aiuta a rendere gli isolotti più facilmente distinguibili al microscopio stereo. - Utilizzando uno stereoscopio, scegliere isolotti da 20 a 40 dollari per trapianto e trasferirli in un tubo da 1,5 mL. Riempire il tubo verso l'alto con i mezzi di coltura dall'incubatore.
- Sigillare i tubi con pellicola di paraffina e conservare sul ghiaccio fino al trapianto. Preparare una quantità adeguata per il numero di trapianti eseguiti.
- In alternativa, assicurarsi che unincubatore di CO 2 sia disponibile nella sala operatoria per mantenere le isole in coltura e raccoglierle immediatamente prima di ogni trapianto.
2. Preparazione delle attrezzature di trapianto e tavolo di chirurgia
NOTA: Tutti gli strumenti chirurgici devono essere autoclavi e il tavolo operatorio e gli strumenti disinfettati con 70% di alcol.
- Collegare un supporto della testa stereotassico all'anestesia tramite una maschera per il naso e accendere il pad di riscaldamento.
- Collegare una siringa Hamilton gastight a tubi in polietilene e una cannula dell'occhio finale smussata.
NOTA: si consiglia di riempire tutte le parti con PBS prima dell'assemblaggio. Controllare le bolle d'aria intrappolate e rimuovere se presente. - Collegare la siringa Hamilton saldamente al tavolo (Figura 1a) o una base mobile (Figura 1e) e collegare il tubo al microscopio stereo, con cannula appesa (cioè posizione di attesa).
NOTA: Utilizzare nastro chirurgico, perché è facile da rimuovere e ricollegare. - Preparare una siringa da 1 mL collegata ad un ago da 30 G riempito con una soluzione di buprenorfina da 0,1 mg/kg.
- Preparare una siringa con PBS sterile. In alternativa, utilizzare una pipetta.
- Mettere da parte una gabbia di sveglia pulita con lampada riscaldante.
3. Anestesia e posizionamento dei topi riceventi per la chirurgia
NOTA: tutti gli animali sono stati allevati e mantenuti in un ambiente privo di agenti patogeni presso le strutture animali dell'Università di Lund.
- Anestetizzare il topo in una camera riempita con 40% O2/60% N2/3% isoflurane e trasferire il mouse anestetizzato alla piattaforma portaodetti su un tampone riscaldante caldo (Figura 1a). Verificare la mancanza di riflessi del pedale.
NOTA: L'anestesia isoflurane è il metodo preferito di anestesia per un rapido recupero dopo l'intervento chirurgico. La stanza del microscopio deve essere adeguatamente ventilata per l'uso di isoflurane. - Posizionare il muso del topo nella maschera di anestesia collegata al 40% O2/60% N2/0.9%–1.5% macchina per anestesia isoflurana. Utilizzare il pollice e il dito per sollevare leggermente la testa e fissarla utilizzando i pezzi metallici sui lati. Assicurarsi che gli auricolari fissino la testa direttamente sotto le orecchie. Iniettare 0,1 mg/kg di soluzione di buprenorfina sottocutaneamente sul retro del mouse.
NOTA: Buprenorphine viene utilizzato come analgesico. - Inclinare la testa in modo che l'occhio da azionare è rivolto verso l'alto ed è vicino al ricercatore.
- Ritrarre delicatamente le palpebre dell'occhio da trapiantare con pinze smussate, far uscire l'occhio e fissare liberamente con un paio di pinzette. Assicurarsi che le punte delle pinzette siano coperte da un tubo politene collegato alla piattaforma portariforme(Figura 1a, inserire).
- Tenere sempre entrambi gli occhi bagnati applicando una gocciolina di PBS sterile sull'occhio.
- Trasferire le isole umane dal tubo sigillato da 1,5 mL (sezione 1) a un piatto Petri con PBS sterile e assicurarsi che le isole siano vicine l'una all'altra per ridurre al minimo la quantità di supporti di coltura cellulare trasferiti(Figura 1c).
- Raccogliere 20-30 isolotti nella cannula dell'occhio collegati tramite tubi di politene alla siringa Hamilton.
NOTA: Prendere il meno liquido possibile con le isole. - Appendere il tubo a testa in giù e attaccare al microscopio stereo (Figura 1d). Nastro il tubo con attenzione per lasciare che le isole affondano alla fine del tubo verso la cannula.
4. Procedura di trapianto
NOTA: Questo metodo è stato precedentemente descritto per il trapianto di isolotti di topo6. Qui viene presentata una procedura leggermente modificata.
- Pizzicare le pastiglie sulle zampe posteriori per assicurarsi che il mouse sia addormentato.
- Stringere le forcepi trattenendo l'occhio senza interrompere il flusso sanguigno e applicare una goccia di PBS sterile sull'occhio.
- Utilizzando un ago di 25 G come bisturi, smussare verso l'alto, penetrare con attenzione solo la metà della punta nella cornea e fare una singola incisione laterale. Fare il foro in un angolo verso l'alto; il foro si sigilla più facilmente dopo il trapianto (Figura 1f).
- Sollevare con cura la cornea con la cannula precaricata con isolotti e applicare lentamente le isole nell'occhio. Evitare l'inserimento della cannula nella camera anteriore per evitare danni dell'iride, ma piuttosto spingere con attenzione contro l'apertura corneale (Figura 1g). Ritrarre lentamente la cannula dall'ACE.
NOTA: Obiettivo per un volume di iniezione di 3-8 L. Se il volume è troppo grande, esporrà l'occhio a una pressione intraoculare inutilmente elevata e può provocare il reflusso delle isole iniettate dalla camera anteriore. - Quando si affrontano difficoltà con l'inserimento degli isolotti a causa di una maggiore pressione nella camera degli occhi, ingrandire il sito di incisione rafforzando il sito di incisione lateralmente e riapplicare le isole.
NOTA: Occasionalmente, le bolle d'aria introdotte possono essere utilizzate come detentori di spazio. - Applicare il gel per gli occhi all'occhio, allentare le forature che frenano gli occhi e lasciare il mouse sull'isoflurane nella stessa posizione per 8-10 min per far impostare le isole.
- Rimuovere le forcepi tenendo la palpebra e rimettere la palpebra nella sua posizione normale.
- Togliere il mouse dal supporto della testa e trasferirlo in una gabbia di sveglia.
- Quando il mouse è sveglio e in movimento, trasferirlo nella gabbia originale e tenerlo nell'alloggiamento degli animali fino alla scansione (almeno 5 giorni sono raccomandati).
5. Imaging di isolotti umani impiantati mediante microscopia a 2 fotoni
NOTA: Si consiglia di localizzare le immagini panoramiche dell'occhio utilizzando un microscopio stereoscopico a fluorescenza (Figura 2a–c) 4-5 giorni dopo il trapianto prima dell'imaging a 2 fotoni per localizzare gli isolotti di interesse. Evitare di trattenere l'occhio troppo strettamente questo presto dopo il trapianto. Utilizzare l'imaging a 2 fotoni 6-7 giorni dopo il trapiantata.
- Avviare il software di acquisizione delle immagini (vedere Tabella dei materiali). Nel menu "Laser" attivare il laser Mai Tai (Power "ON") e nel menu "Percorso luce" impostare la lunghezza d'onda a 900 nm e applicare una potenza laser di trasmissione minima a partire da 5%-10% potenza laser (utilizzare cursori).
NOTA: durante la scansione, regolare la potenza del laser in base alle esigenze. - Impostare i canali verdi, arancioni e rossi. Raccogliere la luce di emissione simultaneamente su tre rilevatori non scansionati (NDD) utilizzando uno specchio dicronico (LBF 760) e le informazioni sul filtro delle emissioni come segue: Red/Angiosense 680, 690–730 nm; Verde/Autofluorescenza, 500-550 nm; e Arancione/Pomodoro, 565–610nm(Figura 2d).
- Posizionare il supporto della testa sul microscopio motorizzato e collegare la maschera antigas al tubo della macchina di anestesia e tubi collegati al sistema di ventilazione. Accendere il pad di riscaldamento.
- Anestetizzare il mouse destinatario, trasferire alla piattaforma del supporto della testa, trattenere l'occhio per l'imaging e somministrare la soluzione di buprenorfina come descritto sopra (passaggi da 3.1 a 3.5).
- Regolare i vapori isoflurani in base alle esigenze. Una velocità di respiro di 55-65 dollari al minuto (bpm) indica un'anestesia ottimale. Se l'anestesia è troppo profonda, il tasso sarà <50 bpm con respirazione pesante o ansimante; se troppo leggero, il tasso sarà >70 bpm con respirazione superficiale. Monitorare attentamente i topi durante l'anestesia mediante ispezione visiva ogni 15 minuti.
NOTA: l'anestesizzazione varia da mouse a mouse, tra le tensioni del mouse e con il passare del tempo sotto anestesia13. - Amministrare abbastanza gel per gli occhi sull'occhio come liquido di immersione tra la cornea e l'obiettivo, permettendogli di accumularsi lentamente (Figura 2f, inserto). Evitare le bolle d'aria.
NOTA: Si consiglia di regolare la messa a fuoco e localizzare gli innesti di isolotti con una lampada flessibile in metallo. - Per visualizzare i vasi sanguigni, somministrare 100 L dell'agente di imaging (ad esempio, Angiosense 680) per via endovenosa nella vena della coda utilizzando una siringa usa e getta da 30 G.
- In "Modalità di acquisizione" regolare la dimensione del fotogramma a 512 x 512 e la velocità di scansione.
NOTA: scansioni più lente (cioè l'aumento del tempo di dimora) miglioreranno il rapporto segnale-rumore. - Nel menu "Canali" regolare Il guadagno principale per ogni PMT in Volts per amplificare il segnale fino a quando non viene visualizzata un'immagine sullo schermo in modalità di scansione dal vivo. Più alto è questo valore, più il rilevatore diventa sensibile al segnale e al rumore.
NOTA: preferibilmente, mantenere i valori compresi tra 500 e 800 V. - Nel menu "z-stack" definire l'inizio e la fine della z-stack spostando manualmente lo stato attivo sulla parte superiore dell'innesto dell'isolotto. Salvare la posizione selezionando "Imposta prima". Spostarsi sull'ultimo piano inferiore che può essere messo a fuoco nell'innesto dell'isolotto e salvare la posizione selezionando"Imposta ultima". Utilizzare una dimensione del passo z di 2 m.
- Raccogliere la pila di immagini finale facendo clic sulla scheda "Inizia esperimento" e salvare come file C'I a 8 bit (cioè il formato Carl .
6. Imaging di isolotti umani impiantati mediante microscopia confocale
NOTA: Il volume totale, la morfologia e la plasticità degli isolotti trapiantati possono essere valutati monitorando il segnale di dispersione in vivo in una scansione separata (ad esempio, traccia separata) rilevando la luce di backscatter laser10.
- Togliere lo splitter del fascio principale (ad esempio, Filtro LBF) e nella finestra di dialogo "Percorso luce" impostare una traccia separata per l'imaging confocale. Scegliete il laser Argon con lunghezza d'onda di 633 nm e il rilevamento alla stessa lunghezza d'onda della luce laser. Le pile di z vengono acquisite con una dimensione di gradino di 2-3 m per il segnale di luce backscatter.
- Modificare le impostazioni dello z-stack per assicurarsi di registrare l'intero isolotto (vedere il passaggio 5.10).
- Acquisire la pila di immagini e salvare come file A 8 bit C.I.
7. Analisi delle immagini
NOTA: per questo passaggio è stato utilizzato ilsoftware commerciale (vedere Tabella dei materiali).
- Rimozione dell'autofluorescenza dell'isolotto (Figura 3b)
- Nella scheda "Elaborazione immagine" scegliere "Aritmetica canale" e digitare "ch1-ch2". Questo crea un nuovo canale 4 (ch 4); rinominare come "Vasculature".
NOTA: il canale Verde/Autofluorescenza viene sottratto dal canale Rosso/Angiosense. - Ripetere il passaggio precedente e digitare "ch3-ch2" per creare un nuovo canale (ch 5); rinominare come "Pomodoro (tutti)".
NOTA: il canale Verde/Autofluorescenza viene sottratto dal canale Orange/Tomato.
- Nella scheda "Elaborazione immagine" scegliere "Aritmetica canale" e digitare "ch1-ch2". Questo crea un nuovo canale 4 (ch 4); rinominare come "Vasculature".
- Definizione della maschera dell'isolotto mediante disegno manuale (Figura 3c)
- Creare una nuova superficie (simbolo blu) e nella procedura guidata scegliere "Modifica manualmente". Mantenere il puntatore in modalità "Seleziona" e nella vista 3D non fare clic su "Volume" (in Scena) per visualizzare le sezioni.
- Per una discriminazione più facile del confine delle isole, attivare tutti i canali, incluso ch 1–ch 3.
NOTA: Il canale Arancione/Pomodoro è utile per definire i bordi delle isole dal segnale della capsula di pomodoro. In alternativa, aumentate le intensità del canale per utilizzare l'autofluorescence dell'isolotto multicanale e il segnale di fondo del rilevatore come guida. - Nella scheda "Disegno" scegliere " Contorno "efare clic su "Disegna" per iniziare a disegnare i contorni intorno al bordo dell'isolotto a partire dalla posizione della sezione 1.
- Spostarsi in una nuova posizione di sezione e ripetere i contorni del disegno. Terminare con l'ultima sezione nella parte superiore dell'isolotto e terminare facendo clic sulla scheda "Creasuperficie ". Di solito è sufficiente disegnare contorni ogni10 th fetta.
- Segmentazione dellavascolatura" Islet " e del pomodoro "Islet "mediante la maschera dell'isolotto ( Figura3d).
- Scegliere l'oggetto "Maschera islet" definito in precedenza, passare alla scheda di modifica (simbolo dellamatita) e fare clic sulla scheda "Maschera tutto", che apre una nuova finestra.
- Scegliete il canale precedentemente denominato "Vasculature" (ch 4) nel menu a discesa di selezione del canale e attivate le opzioni "Duplica canale prima di applicare la maschera", " Costanteall'interno/esterno", e impostate i voxel all'esterno della superficie su "0.000", che crea un nuovo canale; rinominare come "Vasculature islet" (ch 6).
- Ripetere i passaggi 7.3.1 e 7.3.2 e scegliere il canale creato in precedenza "Pomodoro (tutti)" (ch 5) nel menu a discesa di selezione del canale per creare il nuovo canale; rinominare come "Pomodoro isolotto" (ch 7).
- Rendering superficiale della vascolatura dell'isolotto (Figura 3e)
- Creare una nuova superficie nel menu "Scena" e nella procedura guidata scegliere "Creazione automatica".
- Impostare il canale di origine su "Islet vasculature" (ch 6) creato in precedenza e scegliere la sottrazione dello sfondo. Se necessario, è possibile regolare la stima automatica delle soglie. Confrontare con il canale di fluorescenza di risposta (ad esempio, fondendo o out la scheda della superficie appena creata). Procedere con la procedura guidata.
- Facoltativamente, utilizzare i filtri. Ad esempio, scegliere "Volume" e regolare il filtro (giallo) nella finestra, che può rimuovere gli oggetti di superficie selezionati. Completare la procedura guidata e denominare il nuovo oggetto superficie "Islet vasculature".
- Segmentazione del segnaledi flusculaturadel pomodoro " (Figura3f)
- Nell'oggetto di superficie"Islet vasculature" creato in precedenza, passare alla scheda di modifica e fare clic sulla scheda "Maschera tutto", che apre una nuova finestra.
- Scegliere il canale precedentemente denominato "Pomodoro isolotto" (ch 7) nel menu a discesa di selezione del canale e impostare i voxel esterni alla superficie su "10.000", che crea il nuovo canale; rinominare come "vasculatura di pomodoro isolotto" (ch 8).
- Segmentazione della "capsula di pomodoro" segnale di fluorescenza ( Figura3g)
- Scegliere "Channel Arithmetic" nellascheda "Elaborazione immagine" e digitare "ch7-ch8", creando il nuovo canale; rinominare come "Capsula di pomodoro" (ch 9).
NOTA: il segnale difluorescenza" di pomodoro isolotto " viene sottrattodalsegnale totale di fluorescenza " pomodoro isolotto ".
- Scegliere "Channel Arithmetic" nellascheda "Elaborazione immagine" e digitare "ch7-ch8", creando il nuovo canale; rinominare come "Capsula di pomodoro" (ch 9).
- Rendering superficiale di "Vasculaturedi pomodoro Islet " e "Capsula di pomodoro" ( Figura3h)
- Seguire il passaggio 7.4 e nella procedura guidata scegliere i canali di origine "vasculatura del pomodoro isolotto" (ch 8) o "Capsula di pomodoro" (ch 9) per creare nuovi oggetti di superficie di conseguenza.
- Rendering superficiale della superficie totale dell'isolotto (Figura 3i)
- Aprire il file backscatter dell'isolotto e creare una nuova superficie.
- Nella procedura guidata scegliere "Creazione automatica" e definire " Regionedi interesse".
NOTA: "Regione di interesse" viene utilizzato per separare i segnali di più isolotti e per definire la profondità dell'isolotto da analizzare (ad esempio, i primi 75 m). - In "Intensità assoluta "regolare la soglia se necessario. L'oggetto superficie può essere selezionato o disattivato per eseguire il controllo incrociato con l'intensità del canale corrispondente. Chiudere la procedura guidata.
- Quantificazione (Figura 3j)
- Selezionare un oggetto superficie creato nel menu "Scena" e passare alla scheda"Statistiche ".
- Per recuperare dati dettagliati sul volume nell'oggetto superficie selezionato, scegliere la scheda "Dettagliato" e selezionare "Valori specifici" e "Volume" dal menu a discesa. Per recuperare un valore di volume totale dell'oggetto superficie selezionato, passare alla scheda "Dettagliato" e scegliere "Valori medi".
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Representative Results
Le isole umane non etichettate sono state trapiantate nell'ACE di NOD femmina di 8 settimane. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-(NOD. ROSA- pomodoro. Rag2- / )topi destinatari. Per prevenire il rigetto del tessuto umano, sono stati scelti come destinatari i topi da urlo Rag2 immunodeficienti. In questi topi transgenici, tutte le cellule e i tessuti hanno espresso una proteina di fluorescenza di pomodoro mirata alla membrana (mT) che consente una chiara identificazione del ricevente e del tessuto del donatore. L'imaging ripetuto degli innesti di isolet mediante microscopia ad alta risoluzione a 2 fotoni potrebbe identificare le cellule mT- destinatarie coinvolte nel processo di innesto e il loro modello di migrazione dinamica.
In generale, l'impostazione del trapianto di isolotti umani nell'ACE dei topi ricevente (Figura 1a) era simile ai trapianti di isolotti di topo sinogene per quanto riguarda la forma e le dimensioni delle isole (Figura 1b,c). Nella figura 1d, e viene illustrato un tipico trapianto con uno schema dettagliato che mostra il sito di incisione lateral (Figura 1f) e la dispersione delle isolotti nella camera degli occhi (Figura 1g)e un risultato rappresentativo delle isolotti del mouse iniettati (Figura 1h) o isolotti umani (Figura 1i). Il tasso di innesto delle isole umane era generalmente più basso (30%) rispetto a quello delle isole di topo (50-70%). Una possibile ragione di questa discrepanza è che la disponibilità di isolotti umani è imprevedibile, di solito con un preavviso di 1 giorno, e anche che gli isolotti ottenuti variano in età del donatore, BMI del donatore, purezza (45%-86%) e tempo di coltura postisolazione (2-5 giorni). Al contrario, gli isolani dei topi possono essere facilmente pianificati. Questi sono stati isolati da topi di età di 6-8 settimane (cioè giovani adulti) con alta purezza e tempi di coltura brevi e notturni. Queste discrepanze tra innesti di topi e isoloti umani devono essere prese in considerazione nell'interpretazione dei risultati.
L'imaging a fluorescenza in vivo degli innesti di isolonti umani è stato compromesso da un'interferenza significativa dell'autofluorescenza tissu/tessuto (Figura 4). La visualizzazione del processo di revascolazione degli innesti di isolonti umani trapiantati da ACE da parte di agenti di imaging che utilizzano lunghezze d'onda tradizionali nello spettro visibile è stata ostacolata da un basso rapporto segnale-rumore e da un alto livello di autofluorescenza dell'isolotto naturale, illustrato dalle immagini di una scansione λ nell'intervallo spettrale di 500-700 nm (Figura 4a) o dal rivelatore PMT sensibile non rivelatore con filtro per il rilevamento di dextran TR (610–675 nm) (Figura 4b). Questo sfondo elevato non è stato osservato negli innesti di isolotto del mouse (Figura 4c). L'agente di imaging niR Angiosense 680 ha mostrato un rapporto segnale-fondo visibilmente più elevato a causa della diminuzione del rumore di fondo nell'intervallo NIR 690–730 nm (Figura 4d, Figura 3a). La registrazione aggiuntiva di un canale "inutilizzato" (cioè 500-550 nm) potrebbe essere utilizzata in una fase successiva di elaborazione dell'immagine per rimuovere il rumore di fondo rimanente causato dall'autofluorescenza dell'isolotto naturale. L'impostazione dell'imaging a 2 fotoni/confocali (Figura 2d–f) è simile a quelle descrittein precedenza 6, salvo l'uso di 900 nm 2-photon eccitazione e rilevamento della fluorescenza di Angiosense 680, autofluorescence, e canali di pomodoro con PMT non smassi(Figura 2d). Si consiglia di misurare la potenza di uscita laser raggiungendo il campione per ogni configurazione del microscopio (Figura 2e). Inoltre, si raccomanda di immaginire inizialmente le isole innestate con stereomicroscopia (Figura 2a–c), che aiuterà a selezionare isolotti di interesse ed evitare immagini di microscopia a 2 fotoni di un trapianto non riuscito.
Lo scopo dell'estrazione di dati quantitativi da molte immagini era quello di rimuovere potenziali pregiudizi nella selezione dei dati e di ottenere il potere statistico necessario per rilevare un effetto legittimo quando si confrontano gli esperimenti. La quantificazione dall'imaging fluorescente delle isole pancreatiche ha comportato diversi passaggi, ognuno dei quali può aver influenzato i risultati in un altro. Qui è stato utilizzato un software di imaging interattivo. Contiene caratteristiche che consentono la visualizzazione di immagini di volume e oggetti e l'identificazione degli oggetti in base alla loro morfologia o intensità. Figura 3 illustra i diversi passaggi nella segmentazione dell'immagine. La rimozione dell'autofluorescenza mediante sottrazione del canale "autofluorescence" ha migliorato il rapporto segnale-rumore (Figura 3a,b). Il limite dell'isolotto denominato "maschera islet" (Figura 3c) e i canali corrispondenti (Figura 3d) sono stati definiti manualmente. La segmentazione del segnale di pomodoro nella vasculatura dell'isolotto e nella capsula dell'isolotto (Figura 3f,g) e nel rendering finale della superficie (Figura 3e,h,i) è stata utilizzata per estrarre dati quantitativi.
La figura 5 mostra una sessione rappresentativa di imaging longitudinale dello stesso innesto dell'isolotto umano a 2 settimane, 2 mesi, 5 mesi e 8 mesi dopo il trapiantamento nell'ACE di un NOD. ROSA- pomodoro. Rag2-/- mouse destinatario. Illustrate le immagini a intensità massima (MIP) di dati RAW originariamente registrati (Figura 5a), le immagini elaborate dopo la rimozione automatica dell'isolotto (Figura 5b– e , f–i) e gli oggetti isoloti segmentati, tra cui capsula (Figura 5j,m) o vascolatura isolotta che forma mT-celle destinatario (rosso, Figura 5n–q)evasculatura totale delle isolole (verde, figura 5n–q).
Figura 1: Trapianto di isolotti pancreatici nella camera anteriore dell'occhio.
(a) Impostazione del trapianto che mostra il mouse anetizzato fissato nel supporto della testa stereotassica e l'occhio esposto (inserito) accanto alla siringa Hamilton preparata fissata al tavolo e lo stereomicroscopio pronto a raccogliere isolotti di topo (b) o isolotti umani (c). (d) Posizione in attesa della cannula dell'occhio caricata con isolotti. ( e ) Trapianto in corso,e(f) disegno schematico di una singola incisione laterale utilizzata per sollevare con cura la cornea con la punta della cannula dell'occhio e dispensare isolotti nella camera anteriore (g). Immagine dell'occhio subito dopo l'iniezione di isolotti ditopo( h ) o isolotti umani (i). Barra della scala : 500 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Imaging degli innesti di isoletto pancreatico impiantati da ACE.
(a) Configurazione sperimentale dell'imaging al microscopio stereo fluorescente. Widefield (b) o immagine fluorescente (c) di B6. ROSA- Innesti di isolotto di pomodoro. (d) Schema semplificato del percorso della luce di emissione. LBF: Filtro di blocco laser (splitter del fascio principale); LP: Passo lungo; BP: Pass di banda; PMT: Fotomoltimolto. (e) La potenza di uscita laser dipende fortemente dalla lunghezza d'onda. Il diagramma mostra la potenza effettiva di uscita laser in Watt (W) relativa al livello di potenza del raggio laser (%), misurata per la configurazione del microscopio. Cerchio: 800 nm, quadrato: 900 nm, triangolo: 1.000 nm. (f) Configurazione sperimentale dell'imaging che mostra il mouse destinatario con isolotti innestati ACE (inserto) montati sullo stadio motorizzato un microscopio commerciale. Barra della scala : 100 m Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: segmentazione dell'immagine di un isolotto umano innestato nell'ACE di un NOD. ROSA- pomodoro. Rag2-/- mouse destinatario.
(a) Registrazione originale: Mostrato è un rendering 3D di una pila di immagini di un isolotto umano con canali uniti o sezioni ottiche di canali divisi Angiosense 680 (ch 1), autofluorescenza (ch 2) e pomodoro (ch 3). (b) Rendering 3D della pila di immagini con canali uniti o sezioni ottiche con canali divisi "Vasculature" (ch 4) e "Tomato(all)" (ch 5) dopo la rimozione dell'autofluorescence. (c) Maschera islet (giallo). (d) Rendering 3D dello stack di immagini con canali uniti o divisi "vasculature islet" (ch 6, bianco), "pomodoro isolotto" (ch 7, rosso). (e) Oggetto di superficie "vasculatura islet" creato da ch 6. (f) Rendering 3D dello stack di immagini con canali uniti "islet vasculature" (ch 6, verde) e "vascolatura del pomodoro isolotto" (ch 8, rosso). (g) Rendering 3D della "capsula di pomodoro" (ch 9) dopo la sottrazione del canale ch 7–ch 8 o sezione ottica con canali fusi " capsula dipomodoro" (ch 9, bianco), vascolatura del pomodoro dell'isolotto (ch 8, rosso) e vasculatura dell'isolotto (ch 6, verde). (h) Rendering superficiale della capsula di pomodoro (creato da ch 9) e vasculatura di pomodoro isolotto (creato da ch 8). (i) Segmentazione dell'isolotto dal segnale di backscatter dell'isolotto umano che mostra la selezione di "Regione di interesse" (a sinistra) e dell'oggetto superficie segmentato (al centro) rispetto all'intensità del canale (a destra). (j) Recupero dei dati dalla scheda Statistiche. Barra della scala : 50 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Autofluorescenza degli isolotti umani.
Isolotti umani (a,b,d) o isolotti di topo B6 (c) sono stati trapiantati nell'ACE di NOD. Rag2-/- o B6 topi riceventi e iniettati con dextran TR (a–c) o Angiosense 680 agente di imaging (d) per la visualizzazione dei vasi sanguigni. ( a ) λ-scan dell'innesto dell'isolotto umano all'intervallo da 500a700 nm con eccitazione a 2 fotoni a 900 nm. Immagine di proiezione massima dell'immagine (MIP) diinnesto umano( b ) o islet del mouse (c) eccitato a 900 nm e rilevato con il filtro TR (610–675 nm) del NDD. (d) MIP di un innesto di isolotto umano eccitato a 900 nm e rilevamento con il filtro Angiosense 680 (690–730 nm) del NDD. Barra della scala : 50 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Le isole umane trapiantate sono progressivamente revascolarizzate e incapsulate da mT che esprimono cellule di origine ricevente.
Isolotti umani trapiantati nella camera oculare anteriore di NOD. ROSA- pomodoro. I topiricevente Rag2sono stati 2-04 per un massimo di 8 mesi. Angiosense 680 è stato iniettato per la visualizzazione della vascolatura. ( a ) Proiezioni di intensità massima (MIP) dei dati RAW registrati originali di divisione (vascolatura, autofluorescenza, mT) o canali fusi e segnale di luce backscattera5 mesi dopo il trapiantata. MIPS di vasculatura totale da solo (b–e) o fusi con fluorescenza di pomodoro mirata a membrana (mT) (f–i) dopo la rimozione dell'autoflourescence dell'isolotto (verde, a). Rendering 3D della capsula di pomodoro dell'isolottosegmentato( j –m) e della vascolatura del pomodoro isolotto (rosso) o della vascolatura totale dell'isolotto (verde) (n–q) nei punti di tempo indicati dopo la trapiantatazione. Barra della scala : 50 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Viene presentato un metodo per studiare il processo di innesto delle cellule dell'isolotto pancreatico umano osservando il coinvolgimento del tessuto del ricevente e del donatore. Dopo un intervento chirurgico mini-invasivo che impianta isolotti umani nella camera anteriore di un occhio di topo immunodeficiente, il topo si riprende rapidamente pochi minuti dopo l'intervento chirurgico. La procedura viene eseguita su un occhio. Generalmente, da 5-7 giorni dopo la postimplantazione in poi la cornea è sufficientemente guarita per eseguire l'imaging intravitale.
In questo protocollo, la qualità degli innesti dell'isolotto umano è fondamentale. La qualità dell'isolotto umano e quindi l'esito del trapianto possono variare a seconda dell'età del donatore, dell'IMC e del processo di isolamento, nonché del tempo di coltura delle isole prima e dopo l'arrivo. Le isole umane trattate da pancreas donatori di organi approvati per il trapianto clinico e scopi di ricerca sono stati utilizzati con il consenso dei donatori. Sono stati ottenuti dopo un processo di digestione del pancreas e purificazione dell'isolotto descritto altrove12. Simile alle isole murine isolate, queste isole subiscono una serie di assalti cellulari come ischemia, stress meccanico, perdita di proteine del seminterrato e interruzione parziale delle cellule endoteliali intra-isolonti (EDC) durante la fase di digestione ezimatica14,15. Nonostante il costante miglioramento delle condizioni di coltura e il recupero di un gran numero di isolotti umani di alta qualità, il tempo di trapianto rimane un fattore critico. Durante i primi giorni di cultura, isolotti umani mostrano una significativa perdita di intra-isolotto ECs e su sei giorni di cultura solo piccole strutture endoteliali nel nucleo dell'isolottopossono essere rilevati 16. Questa perdita di cellule endoteliali intra-isolonti potrebbe costituire un fattore critico nella riduzione dell'innesto delle isole umane, poiché gli IStiglio donatore ECs sono attori importanti nel processo di revascolazione17.
Mantenere la sterilità durante la procedura di trapianto è fondamentale per evitare infezioni oculari nel NOD immunocompromato. ROSA- pomodoro. Rag2-/- topi. Tipicamente, le procedure di trapianto vengono eseguite in condizioni pulite utilizzando guanti, camice da laboratorio, copricapo e maschera bocca, ma non all'interno di un armadio di biosicuità. Tutte le soluzioni utilizzate sono filtrate sterili e siringhe, cannula, tubi e garza vengono sciacquate nel 70% di etanolo. Le gabbie di sveglia sono autoclavi. Mentre la sterilità completa non può essere garantita a causa della manipolazione manuale del mouse durante la procedura, la contaminazione dell'isolotto o le infezioni oculari non sono stati problemi con questa procedura.
L'anestesia stabile e adeguata è un fattore importante e critico per ridurre i movimenti oculari e la deriva durante l'acquisizione di dati a basso tasso di inquadratura, e l'efficacia può variare tra i diversi agenti anestetici18. Sotto la luce, anestesia isoflurana generale, l'occhio si muove occasionalmente in modo lento e una maggiore profondità di anestesia (da 1-2%) può generalmente ridurre i movimenti oculari. Il chiaro vantaggio dell'utilizzo di anestesia inalabile è il suo effetto rapido e il tempo di recupero. Va sottolineato, tuttavia, che l'uso di isoflurane può alterare la secrezione diinsulina 19.
L'analisi e la segmentazione delle immagini, o il partizionamento di un'immagine in più aree, sono impegnative e soggette a potenziali distorsioni nella selezione deidati 20. La segmentazione ha lo scopo di identificare oggetti come la "vasculatura dell'isolotto" per la quantificazione. In questo caso, sono stati applicati metodi basati sulla soglia di intensità per selezionare regioni (ad esempio, "intensità assoluta") o differenze di intensità per trovare i bordi (ad esempio, "sottrazione di fondo"). Attualmente, non esistono soluzioni universali per la segmentazione in microscopia fluorescente. Un approccio è quello di sperimentare con software commerciale che supporta una gamma di metodi. Se la soglia non riesce a causa della variazione dell'intensità dello sfondo, piccole modifiche nelle impostazioni di acquisizione delle immagini possono migliorare i risultati della segmentazione.
Una limitazione del metodo sta nel fatto che l'innesto umano viene più rapidamente sostituito dalle cellule ricevente e, di fatto, completamente ricostituito dalle cellule endoteliali del destinatario del topo. Ciò precluderebbe gli studi sulle interazioni delle cellule umane se l'obiettivo è quello di studiare le cellule immunitarie umane trasferite in modo adottivo che migrano nel parenchyma dell'isolotto attraverso interazioni con le cellule endoteliali umane. Tuttavia, sia negli innesti di murini che in un isolotto umano, una revascolazione simile avviene dal destinatario e segue il diverso piano 3D anatomico specifico per la specie.
I tassi di successo della terapia sostitutiva delle cellule beta hanno continuato a migliorare. Tuttavia, varie sfide nella valutazione dell'efficienza dell'innesto e della sopravvivenza in vivo degli isoloti rimangono irrisolte a causa della mancanza di tecnologie di imaging intravitalizzali adeguate. La camera oculare anteriore è un utile sito di trapianto, che supporta l'imaging ripetuto e a lungo termine in vivo delle cellule delle isole per lo studio della morfologia delle isole, dei modelli di vascolarizzazione, della funzione delle cellule beta e della morte delle cellule beta a una risoluzione cellulare.
Il protocollo per lo studio del processo di innesto dei trapianti di isoloni umani nel sito di trapianto ACE riportato qui consente il monitoraggio longitudinale degli innesti di isolotti umani con una risoluzione notevolmente superiore a quella ottenuta con altre piattaforme longitudinali alternative come21,22, PET23, SPECT24o Bioluminescenza25.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto dal Consiglio svedese per la ricerca, dall'Area strategica di ricerca Exodiab, dal Dnr 2009-1039, dalla Fondazione svedese per la ricerca strategica Dnr IRC15-0067 alla LUDC-IRC, alla Royal Physiographic Society di Lund, Al diabetesf-rbundet e Barndiabetesf-rbundet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anasthesia machine, e.g. Anaesthesia Unit U-400 | Agnthos | 8323001 | used for isofluran anasthesia during surgery and imaging |
| -induction chamber 1.4 L | Agnthos | 8329002 | connect via tubing to U-400 |
| -gas routing switch | Agnthos | 8433005 | connect via tubing to U-400 |
| AngioSense 680 EX | Percin Elmer | NEV10054EX | imaging agent for injection, used to image blood vessels in human islet grafts |
| Aspirator tubes assemblies | Sigma | A5177-5EA | connect with pulled capillary pipettes for manual islet picking |
| Buprenorphine (Temgesic) 0.3mg/ml | Schering-Plough Europé | 64022 | fluid, for pain relief |
| Capillary pipettes | VWR | 321242C | used together with Aspirator tubes assemblies |
| Dextran-Texas Red (TR), 70kDa | Invitrogen | D1830 | imaging agent for injection |
| Eye cannula, blunt end , 25 G | BVI Visitec/BD | BD585107 | custom made from Tapered Hydrode lineator [Blumenthal], dimensions: 0.5 x 22mm (25G x 7/8in) (45?), tip tapered to 30 G (0.3mm) |
| Eye gel | Novartis | Viscotears, contains Carbomer 2 mg/g | |
| Hamilton syringe 0.5 ml, Model 1750 TPLT | Hamilton | 81242 | Plunger type gas-tight syringe for islet injection |
| Head holder | |||
| -Head holding adapter | Narishige | SG-4N-S | assemled onto metal plate |
| -gas mask | Narishige | GM-4-S | |
| -UST-2 Solid Universal Joint | Narishige | UST-2 | assemled onto metal plate |
| -custom made metal plate for head-holder assembly | |||
| -Dumont #5, straight | Agnthos | 0207-5TI-PS or 0208-5-PS | attached to UST-2 (custom made) |
| Heating pad, custom made | taped to the stereotaxic platform | ||
| Human islet culture media | |||
| -CMRL 1066 | ICN Biomedicals | cell culture media for human islets | |
| -HEPES | GIBCO BRL | ||
| -L-glutamin | GIBCO BRL | ||
| -Gentamycin | GIBCO BRL | ||
| -Fungizone | GIBCO BRL | ||
| -Ciproxfloxacin | Bayer healthcare AG | ||
| -Nicotinamide | Sigma | ||
| Image analysis software | Bitplane | Imaris 9 | |
| Image Aquisition software | Zeiss | ZEN 2010 | |
| Infrared lamp | VWR | 1010364937 | used to keep animals warm in the wake-up cage |
| Isoflurane Isoflo | Abott Scandinavia/Apotek | fluid, for anesthesia | |
| Needle 25 G (0.5 x 16mm), orange | BD | 10442204 | used as scalpel |
| Petri dishes, 90mm | VWR | 391-0440 | |
| 2-Photon/confocal microscope | |||
| -LSM7 MP upright microscope | Zeiss | ||
| -Ti:Sapphire laser Tsunami | Spectra-Physics, Mai Tai | ||
| -long distance water-dipping lens 20x/NA1.0 | Zeiss | ||
| -ET710/40m (Angiosense 680) | Chroma | 288003 | |
| -ET645/65m-2p (TR) | Chroma | NC528423 | |
| -ET525/50 (GFP) | Chroma | ||
| -ET610/75 (tomato) | Chroma | ||
| -main beam splitter T680lpxxr | Chroma | T680lpxxr | Dichroic mirror to transmit 690 nm and above and reflect 440 to 650 nm size 25.5 x 36 x 1 mm |
| Polythene tubing (0.38mm ID, 1.09 mm OD) | Smiths Medical Danmark | 800/100/120 | to connect with Hamilton syringe and eye canula |
| Stereomicroscope | Nikon | Model SMZ645, for islet picking | |
| Stereomicroscope (Flourescence) | for islet graft imaging | ||
| -AZ100 Multizoom | Nikon | wide field and long distance | |
| -AZ Plan Apo 1x | Nikon | ||
| -AZ Plan Apo 4x | Nikon | ||
| -AZ-FL Epiflourescence with C-LHGFI HG lamp | Nikon | ||
| -HG Manual New Intensilight | Nikon | ||
| -Epi-FL Filter Block TEXAS RED | Nikon | contains EX540-580, DM595 and BA600-660 | |
| -Epi-FL Filter Block G-2A | Nikon | (EX510-560, DM575 and BA590) | |
| -Epi-FL Filter Block B-2A | Nikon | (EX450-490, DM505 and BA520) | |
| -DS-Fi1 Colour Digital Camera (5MP) | Nikon | ||
| Syringe 1-ml, Omnitix | Braun | 9161406V | for Buprenorphine injection, used with 27 G needle |
| Surgical tape | 3M |
References
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