Summary
هنا، نقدم بروتوكول الأمثل لقياس بسرعة وشبه متزامنة التفاعلات مستقبلات رابطة في trans في نظام خلية غير متغايرة باستخدام المجهر الفلورية.
Abstract
التفاعلات البروتينية في الواجهات الخلوية تملي العديد من النتائج البيولوجية التي تتراوح بين تطوير الأنسجة وتطور السرطان إلى تشكيل المشبك العصبي والصيانة. العديد من هذه التفاعلات الأساسية تحدث في مغايرة وعادة ما يتم الناجمة عن التفاعلات غير المتغايرة أو المثلية بين الخلايا التي تعبر عن أزواج الربط الراسية الغشاء. توضيح كيف الطفرات المرض ذات الصلة تعطيل هذه التفاعلات البروتين الأساسية يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في عدد لا يحصى من حقول بيولوجيا الخلايا. العديد من البروتين البروتين التفاعل المقايسة لا عادة توضيح بين رابطة الدول المستقلة والتفاعلات عبر, مما قد يؤدي إلى المبالغة في تقدير مدى الربط الذي يحدث في الجسم الحي وينطوي على تنقية كثيفة العمالة من البروتين و / أو معدات الرصد المتخصصة. هنا، نقدم بروتوكول بسيط الأمثل الذي يسمح لمراقبة وكمية التفاعلات عبر فقط دون الحاجة إلى تنقية البروتين طويلة أو المعدات المتخصصة. يتضمن فحص تجميع خلايا HEK خلط مجموعتين مستقلتين من خلايا HEK، يعبر كل منهما عن أربطة مزدوجة مُلزمة بالغشاء. بعد فترة حضانة قصيرة، يتم تصوير العينات ويتم تحديد المجاميع الناتجة.
Introduction
التفاعلات متشابك تسهيلها من قبل جزيئات التصاق متشابك هي الأساس لتطوير وتنظيم ومواصفات وصيانة وظيفة من نقاط الاشتباك العصبي وتوليد الشبكات العصبية. ويتزايد بسرعة تحديد جزيئات التصاق الخلايا المتحولة؛ وبالتالي، من المهم بشكل أساسي تحديد الشركاء الملزمين وفهم كيفية تفاعل جزيئات الالتصاق الجديدة هذه مع بعضها البعض. بالإضافة إلى ذلك، حددت تسلسل الجينوم الطفرات في العديد من هذه الجزيئات التصاق التي ترتبط عادة إلى العديد من الاضطرابات العصبية النمائية، العصبية والنفسية،والإدمان 1. الطفرات في الجينات التي رمز لجزيئات التصاق الخلايا متشابك قد تغير بشكل ضار التفاعلات عبر وقد تسهم في التعديلات فيزيائية المرضية في تشكيل المشبك أو الصيانة.
توجد مقايسات متعددة لتقييم كمي تفاعلات البروتين والبروتين مثل قياس السعرات الحرارية isothermal، dichroism دائري، الرنين البلازمونالسطحي 2 وعلى الرغم من الكمية في الطبيعة، لديهم عدة قيود. أولاً، تتطلب بروتيناً مؤتلفاً، وتطالب أحياناً بخطوات تنقية طويلة ومملة. ثانيا، تتطلب هذه الكفاءات معدات متخصصة متطورة وخبرة فنية. ثالثاً، يمكن أن تبالغ في تقدير مدى الربط لأنها تسمح لكل من رابطة الدول المستقلة والتفاعلات العابرة بين البروتينات المربوطة بشكل طبيعي إلى غشاء في الجسم الحي. هنا نقترح اختبار بسيط وسريع نسبيا أن الاختبارات حصرا التفاعلات عبر.
للتحايل على العديد من المضاعفات المرتبطة بمقايس البروتين النقي، قمنا بتحسين تحليل تفاعل البروتين القائم على الخلايا الذي يلخص التفاعلات عبر في نظام الخلايا غير المغايرة. وقد سبق استخدام هذا الفحص في أشكال مختلفة لدراسة التفاعلات عبر الخلايا. في هذا النهج، يتم نقل جزيئات التصاق الخلية المرشحة إلى خلايا HEK293T. في الظروف الفسيولوجية، خلايا HEK293T لا تظهر التجميع الذاتي، مما يجعلها نماذج مثالية لهذا الفحص. ومع ذلك، عندما يتم الجمع بين مجموعات من الأفراد من خلايا HEK التعبير عن مستقبلات ويغاند، فإن ربط المستقبلات وقواد ليغاند تجميع خلايا HEK أن يحدث. ويتم هذا التجميع حصرياً عن طريق التفاعلات عبر، وعادة ما يكون قابلاً للملاحظة في عشرات الدقائق. لا يلزم اتخاذ خطوات لتنقية البروتين في هذه الطريقة، وتعتمد كفاءة الطريقة على النموذج الذي يتم فيه دمج مجموعات خلايا HEK التي تعبر عن جزيئات التصاقها، ثم يتم تصويرها بعد عشرات الدقائق فقط. بالإضافة إلى ذلك، هذه الطريقة غير مكلفة نسبيا، حيث لا الأجسام المضادة ولا معدات مكلفة مطلوبة. المعدات الوحيدة المطلوبة للحصول على البيانات هي مجهر فلوري قياسي. ميزة إضافية لهذا المقايسة القائمة على الخلية هي القدرة على فحص بسرعة تأثير الطفرات نقطة ذات الصلة المرض على التفاعلات عبر. ويمكن إجراء ذلك عن طريق نقل خلايا HEK مع cDNAs من المتغيرات المتحولة من البروتين من الفائدة.
في هذا البروتوكول، نقدم مثالاً نتحقق فيه مما إذا كانت طفرة الميزنس في Neurexin3α (Neurexin3αA687T)،التي تم تحديدها في مريض تم تشخيصه بإعاقة ذهنية عميقة والصرع، يغير التفاعلات في ترانس مع بروتين تكرار الغشاء اللين الغني باليوسين 2 (LRRTM2). Neurexin3α هو عضو في الأسرة المحفوظة تطوريا من الجزيئات presynaptic الخلية التصاق وبينما عمل مؤخرا قد حددت أدوار متعددة في المشبك3,4,5,6,7, فهمنا متشابك من هذا الجزيء وجميع أعضاء الأسرة neurexin لا تزال غير مكتملة. LRRTM2 هو عبارة عن بروتين التصاق الخلايا بعد التصاقات ما بعد التصاقات التي تشارك في تشكيل المشبك العصبي والصيانة8,9,10. الأهم من ذلك، LRRTM2 يتفاعل حصرا مع isoforms neurexin التي تفتقر إلى موقع لصق 4 exon البديل (SS4-) ولكن ليس مع isoforms neurexin التي تحتوي على موقع لصق 4 البديلة exon (SS4 +). يقع الطفرة البشرية (A687T) التي تم تحديدها في Neurexin3α في منطقة خارج الخلية غير مدروسة يتم حفظها تطورياً ويتم الحفاظ عليها بين جميع نويات ألفا7. كما تم تأسيس التفاعل بين هذين الجزيئات8,9,11, طرحنا السؤال: هل القدرة على الربط من Neurexin3α SS4- إلى LRRTM2 غيرت بواسطة A687T نقطة طفرة؟ وكشفت هذه الأقوال أن طفرة نقطة A687T عززت بشكل غير متوقع تجميع Neurexin3α إلى LRRTM2 مما يشير إلى أن المنطقة خارج الخلية التي تقع فيها الطفرة النقطة، تلعب دورا في التوسط التفاعلات عبرسينابتيك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. خلية ثقافة وtransfection
- جعل وسائط الخلية HEK مع DMEM، 1x (تعديل دولبيككو من المتوسط النسر) تكملها مع 4.5 ز / ل الجلوكوز، L-الجلوتامين والصوديوم بيروفات و 10٪ FBS. مرشح معقمة.
- يحدد مسبقاً الأحرف اللينة والمستقبلات المناسبة لتشايس التجميع.
ملاحظة: Neurexin3α SS4+/ - وأحد اليغانات المعروفة، LRRTM2، تم استخدامه في هذه الدراسة. وأعرب عن اليغاندس والمستقبلات من الفائدة من cDNAs في pcDNA3.1. تم استخدام تجميع جيبسون لإدراج Neurexin3α فيpcDNA3.12. Neurexin3α F/R: TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGGCGCATCCCACCATGAGCCTCTCTCACCTCACCCACTC/
GAGCGGCCGCCACTGCTGCTGCTGGGGGGGGGGACCTTACACATAATAATACTCCTTCCTT. - إعداد خلايا HEK293T.
- تنمو خلايا HEK293T إلى التقاء في واحدة T-75 قارورة.
- مرة واحدة التقاء، واستخدام 2 مل من التربسين ومكان في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. إضافة 6 مل من وسائط HEK إلى القارورة لإعادة تعليق الخلايا ونقل جميع 8 مل إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
- بيليه في 500 س ز لمدة 5 دقائق و resuspend في وسائط الخلية HEK لمجموع 8 مل.
- عد الخلايا وإضافة 735،000 الخلايا في كل بئر من لوحة 6-جيدا. ضبط مستوى الصوت النهائي إلى 2 مل لكل بئر باستخدام وسائط خلية HEK.
- وضع في حاضنة 37 درجة مئوية والسماح للخلايا أن تنمو بين عشية وضحاها أو حتى تصل إلى 50-60٪ التقاء.
- Transfect خلايا HEK293T باستخدام طريقة فوسفات الكالسيوم13.
- Transfect جيدا-1 مع 3 ميكروغرام من البروتين من الفائدة وtransfect مع 1 ميكروغرام من البروتين الفلورسنت (3 ميكروغرام من pcDNA3.1-Neurexin3αWT SS4- و 1 ميكروغرام من mCherry).
- Transfect بشكل جيد-2 كما في الخطوة 1.4.1. ولكن مع البروتين المتحول من الفائدة (pcDNA3.1-Neurexin3αA687T SS4-).
- Transfect جيدا-3 مع 3 ميكروغرام من يغاند من الفائدة وtransfect مع 1 ميكروغرام من بروتين آخر الفلورسنت (3 ميكروغرام من pcDNA3.1 LRRTM2 و 1 ميكروغرام من GFP).
- Transfect جيدا-4 و-5 لتكون بمثابة ضوابط سلبية: جيدا-4 مع 1 ميكروغرام من GFP و-5 جيدا مع 1 ميكروغرام من mCherry.
- إعداد لوحة أخرى (كما هو الحال في الخطوة 1.4.1-1.4.4) إذا تطلبت شروطًا أو عناصر تحكم إضافية (Neurexin3αWT/A687T SS4+).
ملاحظة: يتم تحليل كفاءة النقل 24 ساعة بعد transfection تحت مجهر epifluorescence وكميتها كعدد من الخلايا التي تعبر عن البروتين الفلورسنت أنها كانت مصابة. ومن شأن اتباع نهج أكثر تبسيطا أن يشمل نقل خلايا HEK مع ترميز ناقلات bicistronic لبروتين الفلورسنت ورابطة الاهتمام وينصح بشدة فوق co-transfection. في حالة هذه الدراسة، ألفا Neurexins هي ~ 4.3 كيلوبايت، ولوحظت كثافة الفلوريسنس منخفضة باستخدام نظام bicistronic مما يستلزم co-transfection.
- بعد 48 ساعة من عملية التهيّن، حصاد الخلايا من أجل التجميع.
- غسل كل جيدا مرتين مع برنامج تلفزيوني.
- أضف 1 مل من 10 mM EDTA في برنامج تلفزيوني في كل بئر إلى فصل بلطف التفاعلات بين الخلايا إلى الخلية ولوحة احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: لا ينصح التربسين للخطوة 1.5.2 بسبب الانقسام البروتيني المحتمل لجزيئات التصاق في الدراسة. بالإضافة إلى ذلك، بعد إضافة EDTA قد لا يتم إيقاف البروتوكول حتى اكتمال كما الخلايا الآن سيتم تعرضها للظروف المحيطة. - بلطف اضغط لوحة لفصل الخلايا، وحصاد كل بئر في أنابيب مخروطية 15 مل منفصلة.
- أنابيب مخروطية للطرد المركزي عند 500 x g ودرجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- في حين أن الخلايا هي تعبئة، وإعداد 6 أنابيب الحضانة عن طريق وضع العلامات على الجزء العلوي من كل أنبوب microcentrifuge مع كل حالة.
ملاحظة: ينبغي استخدام كل تبديل في شروط GFP و mCherry لتشمل جميع الظروف التجريبية والضوابط المناسبة. على سبيل المثال: 1. GFP/mCherry، 2. mCherry/LRRTM2-GFP 3. GFP/Neurexin3αWT SS4--mCherry, 4. GFP/Neurexin3αA687T SS4- mCherry, 5. Neurexin3αWT SS4----mCherry/LRRTM2-GFP, 6. Neurexin3αA687T SS4- -mCherry/LRRTM2-GFP. جعل أنابيب إضافية لاستيعاب المزيد من الشروط والضوابط. - إزالة الخلايا فائقة و resuspend في 500 ميكرولتر من وسائط HEK مع 10 mM CaCl2 و 10 mM MgCl2 2 الدفء إلى 37 درجة مئوية.
ملاحظة: إضافة CaCl2 و MgCl2 يسمح جزيئات التصاق لإعادة الربط وهو مطلوب فقط إذا كان الشركاء التفاعل عبر الخلية في السؤال تتطلب الكاتيونات divalent للتصاق. - عد الخلايا في كل أنبوب مخروطي 15 مل باستخدام مقياس للهيمويت و aliquot 200,000 خلية من كل حالة في أنبوب مناسب من الخطوة 1.6.1 لمزيج 1:1 في حجم إجمالي 500 ميكرولتر.
ملاحظة: يجب أن يستغرق 5 دقائق فقط لكل شرط لحساب والمبالغ aliquot. - احتضان الأنابيب في درجة حرارة الغرفة في دوار أنبوب بطيء.
2. الحصول على صورة
- تحسين المعلمات المجهر للحصول على عينات محددة. في هذا المثال، تم التقاط الصور على مجهر واسع المجال. استخدام هدف الهواء 5x (NA: 0.15; WD: 20000 μm) للحصول على حقل كبير بما فيه الكفاية للتحليل.
- تقييم تجميع خط الأساس مباشرة بعد خلط الشرطين خلايا HEK في الخطوة 1.8. هذه هي الآن 'الوقت صفر' الصور.
- Pipette 40 ميكرولتر من كل خليط عينة على شريحة المجهر المشحونة والصورة تحت الفلورانس في كل من القنوات 488 و 561.
- الحصول على ثلاثة حقول مختلفة من الرؤية في مستوى التركيز واحد لكل قطرة العينة.
- الحصول على الصور النهائية في 60 دقيقة كما صورة 'الوقت 60'.
- للحصول على صورة 'الوقت 60' من الخليط بعد 60 دقيقة حضانة، واتخاذ آخر 40 ميكرولتر عينة من كل حالة من أنابيب الدورية والماصات كل عينة على شريحة مشحونة. صورة كما في الخطوة 2.2.2.
ملاحظة: يجب التحقق من تجميع الخلايا كل 15 دقيقة حتى يحدث التشبع. وسيتوقف توقيت التجميع على البروتينات التي يجري اختبارها.
- للحصول على صورة 'الوقت 60' من الخليط بعد 60 دقيقة حضانة، واتخاذ آخر 40 ميكرولتر عينة من كل حالة من أنابيب الدورية والماصات كل عينة على شريحة مشحونة. صورة كما في الخطوة 2.2.2.
3. تحليل ImageJ/فيجي
- لتحديد مدى التجميع باستخدام فيجي/ImageJ، احفظ ملفات التحليل.
- حفظ ملفات ترميز إضافية المتوفرة في مجلد imageJ وحدات الماكرو على الكمبيوتر.
- تثبيت ماكرو التجميع المتوفرة (الإضافات، وحدات الماكرو، تثبيت، وحدد ملف "AggregationAssay.txt").
- تحديد العتبات.
- تحميل ملف "وقت الصفر" .tif إلى imageJ وتقسيم القنوات (صورة | | اللون انقسام القنوات).
ملاحظة: يتم استخدام الصورة 'الوقت صفر' لتحديد العتبة وأصغر حجم بونكتا للتجربة بأكملها. - قناع كل قناة(الإضافات | | وحدات الماكرو AggregationAssay_MakeMask). جعل قناع من صورة نافذة سوف تظهر. خانات الاختيار بجوار تحديد عتبة الصورة وتحديد الكتل Params من مدرج التكراري وانقر فوق موافق.
- حدد عتبة الصورة باستخدام شريط الشرائح، وسجل الرقم إلى يمين شريط الشرائح، وانقر فوق موافق.
- سيظهر مدرج بياني لحجم الكتلة. حدد حجم كتلة من الرسم البياني الذي يناسب التجربة، اكتب هذا الرقم في المربع الحد الأدنى من حجم الكتلة: ثم انقر فوق موافق. لن يتم تحليل الكتل التي دون هذا الحجم.
- تحميل ملف "وقت الصفر" .tif إلى imageJ وتقسيم القنوات (صورة | | اللون انقسام القنوات).
- قم بتشغيل التحليل.
- فتح صورة 'الوقت 60' من حالة 1 في imageJ وتقسيم القنوات كما هو الحال في الخطوة 3.2.1.
- قناع كل قناة (الإضافات ، وحدات الماكرو ، AggregationAssay_MakeMask). استخدام نفس عتبة والحجم المحدد في الخطوة 3.2.3 والخطوة 3.2.4. إلغاء تحديد المربعات بجوار تحديد عتبة الصورة وتحديد الكتل Params من الرسم البياني ثم يدوياً اكتب الحجم وعتبات في الحقول المناسبة ثم انقر فوق موافق.
- حساب مؤشر التجميع(الإضافات | | وحدات الماكرو AggregationAssay_CalculateOverlap). حدد القنوات المقنعة التي سيتم مقارنتها والدليل الذي سيتم حفظ الملفات الناتجة فيه.
- كرر الخطوات 3.3.1-3.3.3 لكل صورة 'الوقت 60' في كل حالة.
ملاحظة: يُعرَّف مؤشر التجميع بأنه منطقة التداخل الإجمالي مقسوماً على مجموع منطقتين للقناتين مطروحاً منها منطقة التداخل مضروبة في 100 (مؤشر التجميع = منطقة التداخل/[مساحة القناة 1 + مساحة القناة 2 – منطقة التداخل] x 100). هذا التهيئة عملية 'OR' بين القناتين المقنعين تمثل إجمالي البيكسلات في أي قناع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
طفرة A687T يزيد Neurexin3α SS4- ملزمة LRRTM27
للتحقيق في كيفية تأثر التفاعلات بين الخلايا من اثنين من البروتينات متشابك المعروفة من خلال إدخال طفرة نقطة وجدت في المريض مع الإعاقة الفكرية والصرع، استخدمنا أعلاه هيك خلية تجميع المقايسة(الشكل 1). وقد تم نقل الخلايا وفقا للقسم 1 وأعدت للتصوير وفقا للقسمين 1 و 2 من البروتوكول. تم تصوير الخلايا عند خط الأساس حيث لم يتم ملاحظة أي تجميع كما هو متوقع (غير مبين). وتم تحليل الصور التي تم الحصول عليها في 60 دقيقة كما هو الحال في القسم 3 من البروتوكول. لتقليل التحيز في الاختيار ، تم وضع الشروط بشكل عشوائي لعمية المجرب. لأسباب مماثلة تم اختيار حقل كامل من عرض كل صورة في عائد الاستثمار.
وأظهرت الظروف التي لم تكن الخلايا التعبير عن أي رابطة متشابك (GFP / mCherry) الحد الأدنى من التجميع بعد حضانة لمدة 60 دقيقة(الشكل 2). وبالمثل، فإن الظروف التي كان فيها واحد فقط من مجموعتي الخلايا يعبر عن أربطة متشابك (mCherry/LRRTM2-GFP أو GFP/Neurexin3αWT/A687T SS4- mCherry) أظهرت الحد الأدنى من التجميع بعد حضانة 60 دقيقة(الشكل 2). وكما هو متوقع، فإن الظروف التي تحتوي على مجموعتين من الخلايا ذات جزيئات التصاقات غير متوافقة (Neurexin3αWT/A687T SS4+-mCherry/LRRTM2-GFP) لم تظهر أي تجميع في 60 دقيقة(الشكل 2B). هذه الظروف بمثابة الضوابط السلبية الحرجة كما هو معروف LRRTM2 لربط حصرا إلى SS4 تفتقر إلى isoforms (SS4-) من Neurexins ويسلط الضوء على خصوصية هذا التجميع المقايسة.
الظروف مع جزيئات التصاق متوافقة8,9,10 (Neurexin3αWT SS4- - mCherry/LRRTM2-GFP) أظهرت تجميع كبير بعد 60 دقيقة حضانة(الشكل 2C). يمكن تصور التجميع باللون الأصفر وهو موجود في التداخل بين الخلايا (الشكل 1 والشكل 2). والمثير للدهشة, الحالة حيث Neurexin3α A687T SS4- شارك في احتضان مع LRRTM2 (Neurexin3αA687T SS4- mCherry/LRRTM2-GFP) أظهرت بشكل ملحوظ أكثر تجميعا بالمقارنة مع نظيره wildtype (Neurexin3αWT SS4- mCherry/LRRTM2-GFP; التحكم الإيجابي). وهذا يشير إلى أن طفرة نقطة A687T في Neurexin3α تعزز قدرات الربط من Neurexin3α SS4- إلى LRRTM2.
الشكل 1- الـ 1 سير عمل فحص التجميع. (أ)خلايا HEK293T هي المصابة باستخدام البروتين-1/mCherry، أو بروتين-2/GFP. (B) تعبير Neurexin3α يأخذ 48 ح . (C) يتم حصاد الخلايا باستخدام 10 mM EDTA ثم بيليه (D). (E) تختلط الخلايا في نسبة 1:1 و resuspended في 500 ميكرولتر من وسائط HEK التي تحتوي على 10 mM CaCl2 و MgCl2. ( F)يتم احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة حتى يحدث التجميع ويتم الحصول على صورة نهائية في "الوقت 60". يتم تصور التجميع كرقم من الـ puncta أصفر مرئي في مجال الرؤية. لا يوجد تجميع يلاحظ عندما الخلايا لا تعبر عن أزواج يغاند المستقبلات الصحيحة وبالتالي ينظر إليها على أنها بانكتا حمراء أو خضراء فردية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2- الانبعاثات 2 من 100 Neurexin3αA687T SS4- وقد عززت تجميع مع الليغانية excitatory LRRTM2 مقارنة Neurexin3αWT SS4-. (أ)صور تمثيلية للضوابط السلبية بعد 60 دقيقة من حضانة mCherry مع GFP، mCherry مع LRRTM2، GFP مع Neurexin3αWT SS4+/-، وGFP مع Neurexin3αA687T SS4+/-. وقد لوحظ التجميع بعد 60 دقيقة في كل من LRRTM2 مع Neurexin3αWT SS4-، وLRRTM2 مع Neurexin3αA687T SS4-. (ب) القياس الكمي لمؤشر التجميع في جميع حالات SS4+ بعد 60 دقيقة. مؤشر التجميع = منطقة التداخل/(مساحة القناة 1 + مساحة القناة 2 - منطقة التداخل) x 100. (C) نفس (B) ولكن SS4-. البيانات المعروضة تمثل متوسط ± SEM لعدد التجارب (SEM: GFP/mCherry ± 0.0245، mCherry/LRRTM2 ± 0.02465، GFP/Neurexin3αWT SS4- ± 0.02453، GFP/Neurexin3αA687T SS4- ± 0.0109, Neurexin3αWT SS4-/LRRTM2 ± 0.0538, Neurexin3αA687T SS4-/LRRTM2 ± 0.0174; p= 0.0136). الأرقام المعروضة في الحانات تمثل عدد التجارب المستقلة التي أجريت. تمثل الخطوط المنقطة أساس أو متوسط الحد الأدنى لتجميع شروط التحكم. تم تحديد الأهمية الإحصائية من قبل ANOVA في اتجاه واحد، مقارنات متعددة; *ف<0.05; p<0.0001.تم تعديل هذا الرقم من ريستريبو وآخرون7. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ملفات ترميز تكميلية. الرجاء النقر هنا لتحميل هذه الملفات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تشريح البروتين البروتينية التفاعلات التي تحدث في عبر خلال التصاق الخلية يمكن أن يؤدي إلى فهم أفضل للآليات الجزيئية الكامنة في العمليات الخلوية الأساسية بما في ذلك تشكيل وظيفة وصيانة نقاط الاشتباك العصبي أثناء النضج وإعادة عرض. الآثار المترتبة على التفاعلات من خلية إلى خلية توسيع نطاقها وراء علم الأعصاب ولها أدوار أوسع نطاقا في نقل الإشارات، وهجرة الخلايا وتطوير الأنسجة14. يمكن الانحرافات في التصاق الخلية تعطيل العمليات الخلوية حتمية لوظيفة الخلية السليمة ويمكن الكامنة تحت مجموعة متنوعة من الإلتكولوجيا مثل السرطان والتهاب المفاصل والإدمان والتوحد والفصام1،15،16. هنا، نحن نقدم بروتوكول مفصل الأمثل التي تنطوي على تجميع الخلايا HEK التي تسمح لاختبار التفاعلات التصاق الخلية في trans.
مع بروتوكول تجميع خلايا HEK هذا، يمكننا تشريح الاختلافات في التجميع إلى قدرة الربط التقريبية بين بروتين presynaptic و ligand ما بعد المينابك. على هذا النحو، يمكننا أن نطرح أسئلة مثل: هل التفاعل بين اثنين من البروتينات متشابك الأساسية تتأثر طفرة نقطة؟ وبشكل أكثر تحديداً، هل يتأثر التفاعل عبرية Neurexin3α مع LRRTM2 بـ A687T؟ إنّ طفرة الـ A687T missense التي تمت دراستها هنا تقع في منطقة رابط غير مدروسة سابقًا في المجال خارج الخلية من Neurexin3α7. وتوضح النتائج أن طفرة A687T تعزز تجميع الخلايا التي تحتوي على Neurexin3αA687T إلى خلايا تحتوي على LRRTM2(الشكل 2C). هذه النتيجة هامة لأنه كان قد تبين سابقا أن LRRTMs ربط فقط إلى Neurexins عبر نطاق Neurexin دعا LNS617، ويشير كذلك إلى أن تسلسل المنبع LNS6 يمكن أن تمارس تأثيرا مستقلا على التفاعلات عبر بين Neurexin3α SS4 - و LRRTM27.
النتائج في الشكل 2 تظهر خصوصية هذا الفحص كجميع الضوابط السلبية (GFP/mCherry; Neurexin3αWT/A687T SS4- -mCherry/GFP أو LRRTM-GFP/mCherry) لم يكن لديه تجميع ملحوظ بعد 60 دقيقة. وهناك سيطرة حرجة المستخدمة في هذه الدراسة, Neurexin3αWT/A687T SS4+ -mCherry/LRRTM-GFP, كما أظهرت أي تجميع بعد 60 دقيقة لأن من المعروف LRRTM2 لربط حصرا إلى SS4 تفتقر (SS4-) isoforms من Neurexin. هذا التحكم يوضح أن الإفراط في التعبير البسيط عن الجزيئات المقيدة بالغشاء غير كاف لفرض التجميع في هذا النظام، مما يوضح كذلك خصوصية هذا الفحص.
الخلية التصاق اختبار الموصوفة هنا وقد استخدمت على نطاق واسع لاختبار تفاعلات transsynaptic جزيئات الخلايا التصاق8,18,19; ومع ذلك، يمكن استخدامه لاختبار التفاعلات اللاصقة بين الخلايا والخلية من البروتينات المربوطة بالأغشية. وقد تم تحسين هذا البروتوكول، الذي تطور مع مرور الوقت، من البروتوكول الأصلي المنشور والاختلافات اللاحقة للبروتوكول عن طريق تغيير ثلاثة معلمات تجريبية. الأول، تم تغيير درجة حرارة الحضانة للخلايا. يدعو البروتوكول الأصلي لاحتضان الخلايا في الخطوة 1.9 عند 4 درجة مئوية. يمكن أن تكون درجة الحرارة المنخفضة بمثابة إجهاد بيئي ويمكن أن تقلل من صلاحية الخلية مما يؤدي إلى موت الخلايا وتحللها. أثناء تحلل الخلايا، تفرز الخلايا الحمض النووي الجينومي ومخلفات الخلايا في وسائل الإعلام التي تسبب الخلايا تكتل في حل مما يؤدي إلى إيجابيات كاذبة أثناء التصوير. ثانياً، زاد عدد الخلايا لكل حالة إلى 000 200 لكل نسمة، وتم تغيير الحجم الموضوعي إلى 5x؛ وهذا يسمح للباحث صورة أكبر لعدد من التفاعلات في مجال الرؤية من أجل زيادة القوة الإحصائية داخل كل ن. ثالثاً، تم قياس مؤشر التجميع بشكل مختلف. وكانت مؤشرات التجميع السابقة محدودة بسبب اختيار حجم الكتلة من قبل المُجرّب مما أدى إلى استبعاد مجموعات "subthreshold". على النقيض من عتبات الآن يتم تعيين حجم الخلية الفردية في 'الوقت صفر'، ويتم حساب التجميع الآن كمنطقة متداخلة مقسومة على مجموع المنطقتين قناة ناقص منطقة التداخل مضروبا في 100 في 'الوقت 60' الذي يسمح لإدراج مجموعات صغيرة إيجابية مما يجعل مقايسة أكثر حساسية للأزواج البروتين يغاند الأخرى(الشكل 2B، C).
قد تكون هناك حاجة إلى استكشاف الأخطاء وإصلاحها والتحسين اعتمادا على البروتينات التفاعل اختبارها. على الرغم من أن فترة الحضانة حتى الحصول النهائي على الصورة سوف تختلف اعتمادا على البروتينات المختبرة، فمن المهم أن لا يتم ملاحظة أي تجميع في "الوقت صفر". إذا كان التجميع ينظر في الوقت صفر، قد يعني أن الخلايا لم تكن صحية في البداية. قد يكون هذا بسبب عدة عوامل بما في ذلك التعرض المفاجئ لدرجات حرارة أقل من 37 درجة مئوية أو الإجراء التجريبي البطيء. الأهم من ذلك، يجب أن تكون وسائط إعادة النياسيبوسين للخطوة 1.7 عند 37 درجة مئوية، مما سيسمح للخلايا بالوصول تدريجيا إلى درجة حرارة الغرفة دون انخفاض مفاجئ في درجة الحرارة القاسية. إحدى الطرق للحصول على صحة الخلايا المثلى طوال التجربة هي التأكد من أن الخطوات من 1.7 إلى 1.9 يتم إكمالها في غضون 25 دقيقة إطار زمني مع عدم وجود فواصل بين. من المستحسن أن المجهر هو الإعداد وجاهزة للاستخدام قبل خلايا الحصاد الخلية في الخطوة 1.5; هذا يضمن أن يمكن التقاط صورة 'الوقت صفر' صحيح في الخطوة 2.2 مباشرة.
إذا لم يتم ملاحظة التجميع بعد 60 دقيقة من الحضانة، قد تكون هناك عدة عوامل تساهم في عدم الالتصاق هذا. أولاً، قد لا تكون البروتينات المعنية شريكة ملزمة أو قد تنخرط في تفاعلات تقارب منخفضة لا يمكن اكتشافها من خلال هذا الفحص. في هذه الحالة، قد يكون مطلوباً إجراء فحص أكثر حساسية. ثانياً، البروتين (البروتينات) ذات الأهمية قد لا تُحلّل إلى الغشاء عندما يتم التعبير عنه وحده في خلايا HEK. في هذه الحالة، تأكد من أن البروتين هو غشاء موضعي باستخدام التقنيات الكيميائية الحيوية (بيوتينيليشن السطح) أو علامة مباشرة على البروتين من الفائدة مع علامة الفلورسنت وصورة خلايا HEK293T في 40x أو أعلى التكبير لتقييم التعبير السطحي. ومع ذلك، بعد تأكيد توطين الغشاء، نوصي باستخدام المتغيرات غير الموسومة لهذا الـ HEK تجميع الخلية من أجل تقييم أكثر دقة القدرة على الربط من البروتين الأصلي. ثالثاً، في هذا البروتوكول سمحنا لـ Neurexin3α بالتعبير عن 48 ساعة؛ ومع ذلك، قد يختلف وقت التعبير البروتيني حسب البروتينات التي تم اختبارها. رابعاً، من الأهمية بمكان أن تكمل الوسائط في الخطوة 1.7 مع MgCl2 و CaCl2 إذا كانت البروتينات المعنية تعتمد على الكاتيونات المكافلية كما هو الحال مع مثال Neurexins و LRRTM211. إذا كان من غير المعروف ما إذا كان الشركاء التفاعل تتطلب الكاتيونات divalent للالتصاق، إضافة EDTA في شرط واحد. وEDTA ينبغي أن يلخي التكبيل التكميم الالات موجودة بشكل طبيعي في DMEM ضمان حل خال من الكالسيوم والمغنيسيوم. إذا لوحظ التصاق بعد إضافة EDTA، والبروتينات في السؤال لا تتطلب الكاتيونات divalent للتصاق.
العديد من الأساليب موجودة لاختبار التفاعلات البروتين; ومع ذلك، معظم غير محددة لاختبار التفاعلات عبر فقط التي تحدث من خلية إلى خلية وتتطلب خطوات تنقية البروتين مملة. على الرغم من أن اختبار تجميع خلايا HEK ليس مقياسًا مباشرًا للتقارب ولا ينبغي استخدامه لاستبدال نهج أكثر كميًا لاسترداد ثوابت الانفصام ، على حد علمنا ، فإن هذا الاختبار يمثل نهجًا لاختبار التفاعلات العابرة الحقيقية بطريقة شبه كمية وفعالة نسبيًا. وعلاوة على ذلك، ونظرا للسهولة النسبية لهذه المقايسة، يمكن استخدام تحليل تجميع خلايا HEK بالاقتران مع هذه الأساليب الكمية للحصول على توصيف أوسع وأكثر اكتمالا للتفاعلات الجارية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا العمل من قبل المنح من المعهد الوطني للصحة العقلية (R00MH103531 و R01MH116901 إلى J.A.) ، ومنحة تدريب ما قبل الدكتوراه من المعهد الوطني للطب العام (T32GM007635 إلى S.R.) ، وزمالات ليدا هيل جيليام للدراسة المتقدمة (GT11021 إلى S.R.). نشكر الدكتور كيفن وولفري على المساعدة في المجهر، والدكتور ك أولريش باير لاستخدام مجهره النيففلورسنت، وتوماس سودهوف (جامعة ستانفورد) لLRRTM2 بلاسميد.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL disposable microtubes with snap caps | VWR | 89000-028 | Incubation of mixed population of HEK cells |
| 1000 mL Rapid—Flow Filter Unit, 0.2 um aPES membrane | Thermo Fisher | 567-0020 | Sterilization of HEK media |
| 15 mL SpectraTube centrifuge tubes | Ward’s Science | 470224-998 | Harvesting HEK cells |
| 6 well sterile tissue culture plates | VWR | 100062-892 | culturing HEK cells |
| Calcium Chloride | Sigma | 223506-500G | Calcium phosphate transfection, HEK cell resuspension |
| Centrifuge- Sorvall Legend RT | Kendro Laboratory Products | 75004377 | Harvesting HEK cells |
| CO2 cell incubator | Thermo Scientific | HERACELL 150i | Incubation of HEK cells during growth |
| DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | HEK cell maintenance |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline PBS (1X) | Gibco | 14190-144 | Passaging/harvesting HEK cell |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | ED-500G | Harvesting HEK cells |
| Falcon Vented culture flasks, 75cm2 growth area | Corning | 9381M26 | Culturing HEK cells |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 17L184 | HEK cell maintenance |
| HEK293T cells | ATCC | Model system | |
| ImageJ | NIH | V: 2.0.0-rc-69/1.52p | Image analysis |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma | M9272-500G | HEK cell resuspension |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Fisher BioReagents | BP332-500 | Calcium phosphate transfection |
| Trypsin 0.25% (1X) Solution | GE Healthcare Life Sciences | SH30042.01 | Passaging HEK cells |
| Tube rotator | Incubation of mixed population of HEK cells | ||
| UltraClear Microscope slides. White Frosted, Positive Charged | Denville Scientific Inc. | M1021 | Image acquisition |
| Wide-field microscope | Zeiss | Axio Vert 200M | Image acquisition |
References
- Südhof, T. C. Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease. Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).
- Lakey, J. H., Raggett, E. M. Measuring protein-protein interactions. Current Opinion in Structural Biology. 8 (1), 119-123 (1998).
- Aoto, J., Martinelli, D. C., Malenka, R. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. Presynaptic neurexin-3 alternative splicing trans-synaptically controls postsynaptic AMPA receptor trafficking. Cell. 154 (1), 75-88 (2013).
- Aoto, J., Földy, C., Ilcus, S. M. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. Distinct circuit-dependent functions of presynaptic neurexin-3 at GABAergic and glutamatergic synapses. Nature Neuroscience. 18 (7), 997-1007 (2015).
- Südhof, T. C. Synaptic Neurexin Complexes: A Molecular Code for the Logic of Neural Circuits. Cell. 171 (4), 745-769 (2017).
- Dai, J., Aoto, J., Südhof, T. C. Alternative Splicing of Presynaptic Neurexins Differentially Controls Postsynaptic NMDA and AMPA Receptor Responses. Neuron. 102 (5), 993-1008 (2019).
- Restrepo, S., Langer, N. J., Nelson, K. A., Aoto, J. Modeling a Neurexin-3α Human Mutation in Mouse Neurons Identifies a Novel Role in the Regulation of Transsynaptic Signaling and Neurotransmitter Release at Excitatory Synapses. The Journal of Neuroscience. 39 (46), 9065-9082 (2019).
- Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., Südhof, T. C. LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).
- de Wit, J., et al. LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).
- Linhoff, M. W., et al. An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers. Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).
- Siddiqui, T. J., Pancaroglu, R., Kang, Y., Rooyakkers, A., Craig, A. M. LRRTMs and Neuroligins Bind Neurexins with a Differential Code to Cooperate in Glutamate Synapse Development. Journal of Neuroscience. 30 (22), 7495-7506 (2010).
- Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Bacchetti, S., Graham, F. L. Transfer of the gene for thymidine kinase to thymidine kinase-deficient human cells by purified herpes simplex viral DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (4), 1590-1594 (1977).
- Cerchiari, A. E., et al. A strategy for tissue self-organization that is robust to cellular heterogeneity and plasticity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), 2287-2292 (2015).
- Burdick, M. M., McCarty, O. J. T., Jadhav, S., Konstantopoulos, K. Cell-cell interactions in inflammation and cancer metastasis. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 20 (3), 86-91 (2001).
- Fox, D. A., Gizinski, A., Morgan, R., Lundy, S. K. Cell-cell interactions in rheumatoid arthritis synovium. Rheumatic Diseases Clinics of North America. 36 (2), 311-323 (2010).
- Yamagata, A., et al. Structural insights into modulation and selectivity of transsynaptic neurexin-LRRTM interaction. Nature Communications. 9 (1), 3964 (2018).
- Nguyen, T., Südhof, T. C. Binding properties of neuroligin 1 and neurexin 1beta reveal function as heterophilic cell adhesion molecules. The Journal of Biological Chemistry. 272 (41), 26032-26039 (1997).
- Boucard, A. A., Ko, J., Südhof, T. C. High Affinity Neurexin Binding to Cell Adhesion G-protein-coupled Receptor CIRL1/Latrophilin-1 Produces an Intercellular Adhesion Complex. Journal of Biological Chemistry. 287 (12), 9399-9413 (2012).
