Summary
Her præsenterer vi en optimeret protokol til hurtigt og semikvantitativt at måle ligand-receptor interaktioner i trans i et heterologt cellesystem ved hjælp af fluorescensmikroskopi.
Abstract
Protein interaktioner på cellulære grænseflader diktere et væld af biologiske resultater lige fra væv udvikling og kræft progression til synapse dannelse og vedligeholdelse. Mange af disse grundlæggende interaktioner forekommer i trans og er typisk induceret af heterofile eller homofile interaktioner mellem celler udtrykke membran forankret bindende par. Belysning af, hvordan sygdomsrelevante mutationer forstyrrer disse grundlæggende proteininteraktioner, kan give indsigt i et utal af cellebiologiske felter. Mange proteinproteininteraktionsanalyser er typisk ikke entydige mellem cis og transinteraktioner, hvilket potentielt fører til en overvurdering af omfanget af binding, der forekommer in vivo og involverer arbejdsintensiv rensning af protein og / eller specialiseret overvågningsudstyr. Her præsenterer vi en optimeret enkel protokol, der giver mulighed for observation og kvantificering af kun transinteraktioner uden behov for langvarige proteinrensninger eller specialiseret udstyr. HEK cellesammenlægning assay indebærer blanding af to uafhængige populationer af HEK celler, hver udtrykke membran-bundet cognate ligands. Efter en kort inkubationsperiode afbildes prøver, og de resulterende aggregater kvantificeres.
Introduction
Synaptiske interaktioner, der lettes af synaptiske vedhæftningsmolekyler, er grundlæggende for udvikling, organisation, specifikation, vedligeholdelse og funktion af synapser og generering af neurale netværk. Identifikationen af disse transsynaptiske celle vedhæftning molekyler er hastigt stigende; Derfor er det grundlæggende vigtigt at identificere bindende partnere og forstå, hvordan disse nye vedhæftningsmolekyler interagerer med hinanden. Derudover har genomsekvensering identificeret mutationer i mange af disse vedhæftningsmolekyler, der er almindeligt forbundet med et væld af neuroudviklingsmæssige, neuropsykiatriske og afhængighedsforstyrrelser1. Mutationer i gener, der koder for synaptiske cellevedhæftningsmolekyler, kan skade transinteraktioner og kan bidrage til patofysiologiske ændringer i synapsedannelse og eller vedligeholdelse.
Der findes flere analyser til kvantitativ vurdering af proteinproteininteraktioner såsom isotermisk kalorimetri, cirkulær dikhroisme, overfladeplasmonresonans2, og selv om de er kvantitative, har de flere begrænsninger. For det første kræver de rekombinant protein, nogle gange krævende lange og kedelige rensningstrin. For det andet kræver de sofistikeret specialiseret udstyr og teknisk ekspertise. For det tredje kan de overvurdere omfanget af binding, da de giver mulighed for både cis og trans interaktioner mellem proteiner, der er naturligt bundet til en membran in vivo. Her foreslår vi en enkel og relativt hurtig analyse, der udelukkende tester transinteraktioner.
For at omgå mange af de komplikationer, der er forbundet med rensede proteinanalyser, har vi optimeret en cellebaseret proteininteraktionsanalyse, der opsummerer transinteraktioner i et reduceret heterologt cellesystem. Denne analyse har tidligere været brugt i forskellige former til at studere transcellulære interaktioner. I denne tilgang, kandidat celle vedhæftning molekyler er transfected i HEK293T celler. Ved fysiologiske forhold udviser HEK293T-celler ikke selvsammenlægning, hvilket gør dem eksemplariske modeller til denne analyse. Men når individuelle populationer af HEK-celler, der udtrykker receptor og ligand, kombineres, tvinger bindingen af receptoren og ligand sammenlægningen af HEK-celler til at forekomme. Denne sammenlægning formidles udelukkende af transinteraktioner og kan normalt observeres på snesevis af minutter. Der kræves ingen proteinrensningstrin i denne metode, og metodens effektivitet afhænger af det paradigme, at populationer af HEK-celler, der udtrykker cognate-vedhæftningsmolekyler, kombineres og derefter afbildes kun få minutter senere. Derudover er denne metode relativt billig, da hverken antistoffer eller dyrt udstyr er påkrævet. Det eneste udstyr, der kræves til erhvervelse af data, er et standard fluorescerende mikroskop. En yderligere fordel ved denne cellebaserede analyse er evnen til hurtigt at screene effekten af sygdomsrelevante punktmutationer på transinteraktioner. Dette kan gøres ved at transfektere HEK-celler med cDA'er af de mutante varianter af det protein, der er af interesse.
I denne protokol præsenterer vi et eksempel, hvor vi undersøger, om en missensemutation i Neurexin3α (Neurexin3αA687T), identificeret hos en patient diagnosticeret med dyb intellektuel handicap og epilepsi, ændrer interaktioner i trans med leucinrigt repeat transmembraneprotein 2 (LRRTM2). Neurexin3α er medlem af den evolutionært bevarede familie af præsynaptiske celle-vedhæftning molekyler og mens de seneste arbejde har identificeret flere roller på synapse3,4,5,6,7, vores synaptiske forståelse af dette molekyle og alle medlemmer af neurexin familien forbliver ufuldstændig. LRRTM2 er et excitatorisk postsynaptisk celle vedhæftningsprotein , der deltager i synapsedannelse og vedligeholdelse8,9,10. Det er vigtigt, at LRRTM2 udelukkende interagerer med neurexin-isoformer, der mangler splejsningsstedet 4 alternative exon (SS4-), men ikke med neurexin-isoformer, der indeholder splejsningsstedet 4 alternative exon (SS4+). Den humane misdannede mutation (A687T), der er identificeret i Neurexin3α, er placeret i en ustudiet ekstracellulær region, der er evolutionært bevaret og bevares mellem alle alfa neurexiner7. Da samspillet mellem disse to molekyler er blevet etableret8,9,11, stillede vi spørgsmålet: Er neurexin3α SS4- til LRRTM2 ændret ved en A687T-punktmutation? Denne analyse afslørede, at A687T-punktmutationen uventet forbedrede sammenlægningen af Neurexin3α til LRRTM2, hvilket tyder på, at den ekstracellulære region, hvor punktmutationen er placeret, spiller en rolle i at formidle transsynaptiske interaktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellekultur og oversættelse
- Gør HEK celle medier med DMEM, 1x (Dulbecco's Ændring af Eagle's Medium) suppleret med 4,5 g / L glukose, L-glutamin & natrium pyruvat og 10% FBS. Sterilt filter.
- Forudbestemme egnede ligands og receptorer til sammenlægning assay.
BEMÆRK: Neurexin3α SS4+/- og en af dens kendte ligands, LRRTM2, blev anvendt i denne undersøgelse. Ligands og receptorer af interesse blev udtrykt fra cDNAAs i pcDNA3.1. En Gibson-samling blev brugt til at indsætte Neurexin3α i pcDNA3.112. Neurexin3α F/R: TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCACCATGAGCTTTACCCTCCACTC/
1984, S. 1333, PRÆMIS 23, OG AF 12.12.1989, NR. - Forbered HEK293T celler.
- Grow HEK293T celler til sammenløb i en T-75 kolbe.
- Når den er sammenløbet, skal du bruge 2 mL trypsin og placere den i 37 °C inkubator i 2 min. Der tilsættes 6 mL HEK-medier til kolben for at genbruge celler og overføre alle 8 mL til et 15 mL konisk rør.
- Pellet ved 500 x g i 5 min og genbruges i HEK celle medier for i alt 8 mL.
- Tæl celler og tilsæt 735.000 celler i hver brønd af en 6-brønds plade. Juster det endelige volumen til 2 mL for hver brønd ved hjælp af HEK-cellemedier.
- Placer i 37 °C inkubator og lad cellerne vokse natten over, eller indtil de når 50-60% sammenløb.
- TransfektEREDE HEK293T-celler ved hjælp af calciumphosphatmetoden13.
- Transfektbrønd-1 med 3 μg af det interessante protein og co-transfect med 1 μg fluorescerende protein (3 μg pcDNA3.1-Neurexin3αWT SS4- og 1 μg mCherry).
- Transfekt godt-2 som i trin 1.4.1. men med det muterede protein af interesse (pcDNA3.1-Neurexin3αA687T SS4-).
- Transfekt godt-3 med 3 μg af ligand af interesse og co-transfect med 1 μg af en anden fluorescerende protein (3 μg pcDNA3.1 LRRTM2 og 1 μg GFP).
- Transfekt godt-4 og godt-5 til at tjene som negative kontroller: godt-4 med 1 μg GFP og godt-5 med 1 μg mCherry.
- Forbered en anden plade (som i trin 1.4.1-1.4.4), hvis der kræves yderligere betingelser eller kontroller (Neurexin3αWT/A687T SS4+).
BEMÆRK: Transfekteffektivitet analyseres 24 timer efter transfekt under et epifluorescensmikroskop og kvantificeres som antallet af celler, der udtrykker det fluorescerende protein, de blev transfected med. En mere strømlinet tilgang ville omfatte transfekt af HEK-celler med en biocistronisk vektorkodning for et fluorescerende protein og ligand af interesse og anbefales stærkt over co-transfekt. I forbindelse med denne undersøgelse er alfa Neurexiner ~4,3 kb, og der blev observeret lav fluorescensintensitet ved hjælp af et bicistronisk system, der nødvendiggør co-transfection.
- 48 timer efter transfekt, høst celler til sammenlægning.
- Vask hver brønd to gange med PBS.
- Der tilsættes 1 mL 10 mM EDTA i PBS i hver brønd for forsigtigt at adskille celle-til-celle-interaktioner og inkubere plade ved 37 °C i 5 min.
BEMÆRK: Trypsin anbefales ikke til trin 1.5.2 på grund af potentiel proteolytisk kavalergang af vedhæftningsmolekyler i undersøgelsen. Efter EDTA-tilføjelsen kan protokollen muligvis ikke stoppes, før den er færdig, da celler nu vil blive udsat for omgivende forhold. - Bank forsigtigt plade for at løsne cellerne, og høst hver godt i separate 15 mL koniske rør.
- Centrifuge koniske rør ved 500 x g og stuetemperatur i 5 min.
- Mens cellerne er pelleting, forberede 6 inkubation rør ved at mærke toppen af hver mikrocentrifuge rør med hver betingelse.
BEMÆRK: Hver permutation af GFP- og mCherry-forhold bør bruges til at omfatte alle forsøgsbetingelser og ordentlige kontroller. F.eks.: 1. GFP/mCherry, 2. mCherry/LRRTM2-GFP 3. GFP/Neurexin3αWT SS4-— mCherry, 4. GFP/Neurexin3αA687T SS4- –mCherry, 5. Neurexin3αWT SS4-— mCherry/LRRTM2—GFP, 6. Neurexin3αA687T SS4- –mCherry/LRRTM2—GFP. Lav yderligere rør for at imødekomme yderligere forhold og kontroller. - De supernatant- og genanvendelige celler fjernes i 500 μL HEK-medier med 10 mM CaCl2 og 10 mM MgCl2 opvarmet til 37 °C.
BEMÆRK: Tilsætningen af CaCl2 og MgCl2 gør det muligt for vedhæftningsmolekyler at genetablere binding og er kun påkrævet, hvis de pågældende transcellulære interaktionspartnere kræver divalent cationer til vedhæftning. - Cellerne i hvert 15 mL konisk rør tælles ved hjælp af et hæmocytometer og aliquot 200.000 celler af hver tilstand i passende rør fra trin 1.6.1 for en 1:1 blanding i et samlet volumen på 500 μL.
BEMÆRK: Det bør kun tage 5 min pr betingelse at tælle og aliquot beløb. - Inkuber rør ved stuetemperatur i en langsom rør rotator.
2. Erhvervelse af billeder
- Optimer parametre for erhvervelse af mikroskoper til specifikke prøver. I dette eksempel blev billeder taget på et bredfeltsmikroskop. Brug et 5x luftmål (NA: 0,15; WD: 20000 μm) for at få et stort nok felt til analyse.
- Vurder basissammenlægning umiddelbart efter blanding af de to betingelser for HEK-celler i trin 1.8. Disse er nu 'time zero' billeder.
- Pipette 40 μL af hver prøveblanding på et ladet mikroskopdias og billede under fluorescens i både 488 og 561 kanaler.
- Anskaf tre forskellige synsfelter med ét fokusplan pr. prøvefald.
- Indhent endelige billeder på 60 min som 'tid 60' billede.
- For at få et billede af blandingen på »time 60« efter en inkubation på 60 min udtages der yderligere 40 μL prøve af hver tilstand fra roterende rør og pipette hver prøve på et ladet dias. Billede som i trin 2.2.2.
BEMÆRK: Cellesammenlægning skal kontrolleres hvert 15. minut, indtil mætning opstår. Tidspunktet for sammenlægningen vil afhænge af de proteiner, der testes.
- For at få et billede af blandingen på »time 60« efter en inkubation på 60 min udtages der yderligere 40 μL prøve af hver tilstand fra roterende rør og pipette hver prøve på et ladet dias. Billede som i trin 2.2.2.
3. Analyse af ImageJ/Fiji
- Hvis du vil kvantificere omfanget af sammenlægningen ved hjælp af Fiji/ImageJ, skal du gemme analysefiler.
- Gem de medfølgende supplerende kodningsfiler i mappen imageJ-makroer på computeren.
- Installer den angivne sammenlægningsmakro (Plug-ins, makroer, Installer, og vælg filen "AggregationAssay.txt").
- Fastlæg tærskler.
- Indlæs en 'time zero'-.tif fil i imageJ, og opdel kanalerne (Image | Farve | Opdelte kanaler).
BEMÆRK: Billedet 'time zero' bruges til at bestemme tærskelværdien og den mindste punktlighedsstørrelse for hele eksperimentet. - Mask hver kanal (Plugins | Makroer | AggregationAssay_MakeMask). Vinduet Opret maske fra billede vises. Marker afkrydsningsfelterne ud for Determine Threshold for Image and Determine Cluster Params from Histogram , og klik på OK.
- Bestem tærsklen for billedet ved hjælp af slidelinjen, optag tallet til højre for slidelinjen, og klik på OK.
- Der vises et histogram med klyngestørrelse. Vælg en klyngestørrelse i det histogramme, der passer til eksperimentet, skriv dette tal i feltet Min klyngestørrelse: , og klik på OK. Klynger under denne størrelse analyseres ikke.
- Indlæs en 'time zero'-.tif fil i imageJ, og opdel kanalerne (Image | Farve | Opdelte kanaler).
- Kør analysen.
- Åbn billedet 'time 60' af betingelse 1 i imageJ, og opdel kanalerne som i trin 3.2.1.
- Mask hver kanal (plugins, makroer, AggregationAssay_MakeMask). Brug den samme tærskel og størrelse, der er bestemt i trin 3.2.3 og trin 3.2.4. Fjern markeringen i felterne ud for Determine Threshold for Image and Determine Cluster Params from Histogram , og skriv manuelt størrelsen og tærsklerne i de relevante felter, og klik derefter på OK.
- Beregn akkumuleringsindekset (Plugins | Makroer | AggregationAssay_CalculateOverlap). Vælg de maskerede kanaler, der skal sammenlignes, og den mappe, som de resulterende filer gemmes i.
- Gentag trin 3.3.1-3.3.3 for hvert 'time 60'-billede i alle tilstande.
BEMÆRK: Sammenlægningsindekset defineres som det samlede overlapningsområde divideret med summen af de to kanalområder minus overlapningsområdet ganget med 100 (Sammenlægningsindeks = overlapningsområde/[område af kanal 1 + område af kanal 2 – overlapningsområde] x 100). Denne normalisering er en 'OR'-handling mellem de to maskerede kanaler, der repræsenterer de samlede pixel i en af maskerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A687T-mutationen øger Neurexin3α SS4- binding til LRRTM27
For at undersøge, hvordan intercellulære interaktioner mellem to kendte synaptiske proteiner påvirkes af indførelsen af en punktmutation, der findes hos en patient med intellektuel handicap og epilepsi, brugte vi ovenstående HEK-cellesammenlægningsanalyse (Figur 1). Celler blev transfected i henhold til afsnit 1 og forberedt til billeddannelse i henhold til afsnit 1 og 2 i protokollen. Celler blev afbildet ved baseline, hvor der ikke blev observeret nogen sammenlægning som forventet (ikke vist). Billeder erhvervet på 60 minutter blev analyseret som i afsnit 3 i protokollen. For at minimere bias i udvælgelsen blev forholdene randomiseret for at blænde eksperimentatoren. Af lignende årsager blev hele synsfeltet for hvert billede valgt som et investeringsafkast.
Forhold, hvor cellerne ikke udtrykte synaptiske ligands (GFP/mCherry), viste minimal sammenlægning efter en inkubation på 60 minutter (figur 2). På samme måde udviste forhold, hvor kun en af de to cellepopulationer udtrykte synaptiske ligands (mCherry/LRRTM2-GFP eller GFP/Neurexin3αWT/A687T SS4- —mCherry), minimal sammenlægning efter en 60 min inkubation (Figur 2). Som forventet udviste forhold, der indeholdt to populationer af celler med inkompatible vedhæftninger (Neurexin3αWT/A687T SS4+-mCherry/LRRTM2-GFP), ingen sammenlægning efter 60 minutter (Figur 2B). Disse betingelser tjente som kritiske negative kontroller som LRRTM2 er kendt for at binde udelukkende til SS4 mangler isoformer (SS4-) af Neurexins og fremhæver specificiteten af denne aggregering assay.
Betingelser med kompatible vedhæftningsmolekyler8,9,10 (Neurexin3αWT SS4- —mCherry/LRRTM2-GFP) udviste betydelig sammenlægning efter en 60 min inkubation ( Figur2C). Sammenlægning kan visualiseres som gul og er til stede i overlapningen mellem celler (Figur 1 og Figur 2). Overraskende nok udviste den tilstand, hvor Neurexin3α A687T SS4- blev inkuberet sammen med LRRTM2 (Neurexin3αA687T SS4- —mCherry/LRRTM2-GFP), betydeligt mere sammenlægning sammenlignet med dens wildtype-modstykke (Neurexin3αWT SS4- —mCherry/LRRTM2-GFP; positiv kontrol). Dette tyder på, at A687T-punktmutationen i Neurexin3α forbedrer bindingsevnen af Neurexin3α SS4- til LRRTM2.
Figur 1. Arbejdsgang for aggregeringsanalyse. (A) HEK293T-celler transfected ved hjælp af et protein-1/mCherry, eller et protein-2/GFP. (B) Ekspressionen af Neurexin3α tager 48 timer (C) Cellerne høstes ved hjælp af 10 mM EDTA og pelleteres derefter (D). (E) Celler blandes i et 1:1-forhold og genbruges i 500 μL HEK-medier, der indeholder 10 mM CaCl2 og MgCl2. (F) Celler inkuberes ved stuetemperatur, indtil sammenlægningen finder sted, og der erhverves et endeligt billede på »tidspunkt 60«. Sammenlægning visualiseres som antallet af gule punkter, der er synligt i synsfeltet. Der observeres ingen sammenlægning, når cellerne ikke udtrykker de korrekte receptorligalalpar og derfor ses som individuelle røde eller grønne punkter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Neurexin3αA687T SS4- har øget sammenlægningen med excitatorisk ligand LRRTM2 sammenlignet med Neurexin3αWT SS4-. (A) Repræsentative billeder af negative kontroller efter en 60 minutters inkubation af mCherry med GFP, mCherry med LRRTM2, GFP med Neurexin3αWT SS4+/-, og GFP med Neurexin3αA687T SS4+/-. Sammenlægningen blev observeret efter 60 minutter i både LRRTM2 med Neurexin3αWT SS4-, og LRRTM2 med Neurexin3αA687T SS4-. (B) Kvantificering af aggregeringsindekset under alle SS4+-betingelser efter 60 minutter. Aggregeringsindeks = overlappende område/(område af kanal 1 + område af kanal 2 – overlappende område) x 100. (C)Samme som (B), men SS4-. De viste data repræsenterer gennemsnittet ± SEM af antallet af eksperimenter (SEM: GFP/mCherry ± 0,0245, mCherry/LRRTM2 ± 0,02465, GFP/Neurexin3αWT SS4- ± 0,02453, GFP/Neurexin3αA687T SS4- ± 0,0109, Neurexin3αWT SS4-/LRRTM2 ± 0,0538, Neurexin3αA687T SS4-/LRRTM2 ± 0,0174; p= 0,0136). De tal, der præsenteres på søjlerne, repræsenterer antallet af udførte uafhængige forsøg. Syltede linjer repræsenterer oprindelig eller gennemsnitlig minimal sammenlægning af kontrolbetingelser. Statistisk signifikans blev bestemt af envejs-ANOVA, flere sammenligninger; *p<0,05; p<0.0001.Dette tal er ændret fra Restrepo et al.7. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende kodningsfiler. Klik her for at downloade disse filer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dissekering af proteinproteininteraktioner, der forekommer i trans under cellevedhæftning, kan føre til en bedre forståelse af de molekylære mekanismer, der ligger til grund for grundlæggende cellulære processer, herunder dannelse, funktion og vedligeholdelse af synapser under modning og ombygning. Konsekvenserne af celle-til-celle interaktioner udvide ud over neurobiologi og har bredere roller i signaltransduktion, celle migration og væv udvikling14. Afvigelser i celle vedhæftning kan forstyrre cellulære processer bydende nødvendigt for korrekt cellefunktion og kan underly en række etiologier såsom kræft, gigt, afhængighed, autisme og skizofreni1,15,16. Her leverer vi en optimeret detaljeret protokol, der involverer HEK-cellesammenlægning, der giver mulighed for at teste celle vedhæftningsinteraktioner i trans.
Med denne HEK-cellesammenlægningsprotokol kan vi dissekere forskelle i sammenlægning til omtrentlig bindingskapacitet mellem et presynaptisk protein og dets postsynaptiske ligand. Som sådan kan vi stille spørgsmål som: Er samspillet mellem to væsentlige synaptiske proteiner påvirket af en punktmutation? Mere specifikt, er trans interaktion af Neurexin3α med LRRTM2 påvirket af A687T? Den A687T missense mutation studeret her er placeret i en tidligere ustudiet linker region af ekstracellulære domæne Neurexin3α7. Resultaterne illustrerer, at A687T-mutationen forbedrer sammenlægningen af celler, der indeholder Neurexin3αA687T, til celler, der indeholder LRRTM2 (Figur 2C). Denne konstatering er signifikant , fordi det tidligere blev påvist , at LRRTM'er kun binder sig til Neurexiner via et Neurexin-domæne kaldet LNS617og yderligere antyder, at sekvenser opstrøms for LNS6 kan udøve en uafhængig effekt på transinteraktionerne mellem Neurexin3α SS4- og LRRTM27.
Resultaterne i figur 2 viser denne analyses specificitet som alle negative kontroller (GFP/mCherry; Neurexin3αWT/A687T SS4- —mCherry/GFP eller LRRTM-GFP/mCherry) havde ingen observerbar sammenlægning efter 60 minutter. En kritisk kontrol, der blev anvendt i denne undersøgelse, Neurexin3αWT/A687T SS4+ —mCherry/LRRTM-GFP, udviste heller ingen sammenlægning efter 60 min., fordi LRRTM2 er kendt for udelukkende at binde sig til SS4 mangler (SS4-) isoformer af Neurexin. Denne kontrol viser, at simpel overekspression af membranbundne molekyler er utilstrækkelig til at tvinge sammenlægning i dette system, hvilket yderligere illustrerer specificiteten af denne analyse.
Celle vedhæftningsanalysen, der er beskrevether,har været meget anvendt til at teste samspillet mellem transsynaptiske celle vedhæftningsmolekyler8,18,19; det kan dog anvendes til at teste klæbende celle-til-celle-interaktioner af membranbundede proteiner. Denne protokol, som har udviklet sig over tid, blev optimeret fra den oprindelige offentliggjorte protokol og efterfølgende variationer af protokollen ved at ændre tre eksperimentelle parametre. For det første blev inkubationstemperaturen for cellerne ændret. Den oprindelige protokol kræver inkubation af celler i trin 1.9 ved 4 °C. Denne lave temperatur kan fungere som en miljømæssig stressor og kan mindske celle levedygtighed, der fører til celledød og lysis. Under celle lysis udskiller cellerne genomisk DNA og cellerester i medier, der får celler til at klumpe sig ind i opløsning, der fører til falske positiver under billeddannelse. For det andet blev antallet af celler pr. tilstand øget til 200.000 pr. indbygger, og den objektive størrelse blev ændret til 5x; Dette gør det muligt for forskeren at forestille sig et større antal interaktioner pr. synsfelt for at øge den statistiske effekt inden for hver n. For det tredje blev aggregeringsindekset målt forskelligt. Tidligere aggregeringsindekser blev begrænset af eksperimentatorens udvælgelse af klyngestørrelse, hvilket førte til udelukkelse af "subthreshold"-klynger. Derimod er der nu fastsat tærskler for individuel cellestørrelse til 'tid nul', og sammenlægningen beregnes nu som det overlappende område divideret med summen af de to kanalområder minus overlapningsområdet ganget med 100 på 'tid 60', hvilket gør det muligt at medtage mindre positive klynger, hvilket gør analysen mere følsom over for andre protein-ligand-par(figur 2B,C).
Fejlfinding og optimering kan være nødvendig afhængigt af de interagerende proteiner, der testes. Selvom inkubationsperioden indtil den endelige billedopsamling vil variere afhængigt af de testede proteiner, er det afgørende, at der ikke observeres nogen sammenlægning på 'tid nul'. Hvis sammenlægningen ses på tidspunktet nul, kan det betyde, at cellerne ikke var sunde til at begynde med. Dette kan skyldes flere faktorer, herunder pludselig udsættelse for temperaturer under 37 °C eller langsom forsøgsprocedure. Det er vigtigt, at resuspensionsmediet til trin 1.7 er ved 37 °C, hvilket vil gøre det muligt for cellerne gradvist at nå stuetemperatur uden et pludseligt hårdt fald i temperaturen. En måde at opnå optimal celletilstand på gennem hele eksperimentet er at sikre, at trin 1,7 til 1,9 gennemføres inden for en tidsramme på 25 minutter uden pauser imellem. Det anbefales, at mikroskopet er opstilling og klar til brug før cellehøstceller i trin 1.5; Dette sikrer, at et ægte 'time zero'-billede kan tages med det samme i trin 2.2.
Hvis der ikke observeres sammenlægning efter 60 minutters inkubation, kan flere faktorer bidrage til denne mangel på vedhæftning. For det første må de pågældende proteiner ikke være bindende partnere eller kan deltage i lav affinitet interaktioner ikke påvises ved denne analyse. I dette tilfælde kan en mere følsom analyse være påkrævet. For det andet må det eller de proteiner, der er af interesse, ikke lokaliseres membranen, når de udtrykkes alene i HEK-celler. I dette tilfælde skal du bekræfte, at proteinet er membran lokaliseret ved hjælp af biokemiske teknikker (overfladebiotinylering) eller direkte mærke det pågældende protein med et fluorescerende mærke og billede HEK293T-celler ved 40x eller højere forstørrelse for at vurdere overfladeudtryk. Men efter at membranlokalisering er bekræftet, anbefaler vi at bruge ukodede varianter til denne HEK-cellesammenlægningsanalyse for mere præcist at vurdere bindingskapaciteten af det oprindelige protein. For det tredje tillod vi i denne protokol Neurexin3α at udtrykke sig i 48 timer; Proteinudtrykstiden kan dog variere afhængigt af de testede proteiner. For det fjerde er det afgørende at supplere medierne i trin 1.7 med MgCl2 og CaCl2, hvis de pågældende proteiner er afhængige af divalent cationer, som det er tilfældet med eksemplet med Neurexins og LRRTM211. Hvis det er uvist, om interaktionspartnerne kræver divalent kationer til vedhæftning, skal du tilføje EDTA i én betingelse. EDTA bør chelat reminering kationer naturligt til stede i DMEM sikre en calcium og magnesium fri opløsning. Hvis vedhæftning observeres efter EDTA-tilsætning, kræver de pågældende proteiner ikke divalent kationer til vedhæftning.
Der findes mange metoder til at teste proteininteraktioner; De fleste er dog ikke specifikke til test af kun transinteraktioner, der forekommer fra celle til celle og kræver kedelige proteinrensningstrin. Selv om HEK celle sammenlægning assay ikke er et direkte mål for affinitet og bør ikke bruges til at erstatte en mere kvantitativ tilgang til at inddrive dissociation konstanter, efter vores bedste overbevisning, denne analyse repræsenterer en tilgang til at teste ægte trans interaktioner i en semi-kvantitativ og relativt effektiv måde. På grund af den relative lethed af denne analyse kan HEK-cellesammenlægningsanalysen desuden bruges sammen med disse mere kvantitative tilgange til at opnå en bredere og mere komplet karakterisering af de interaktioner, der finder sted.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Tilskud fra National Institute of Mental Health (R00MH103531 og R01MH116901 til J.A.), en prædoc-uddannelse Grant fra National Institute of General Medicine (T32GM007635 til S.R.), og en Lyda Hill Gilliam Fellowship for Advanced Study (GT11021 til S.R.). Vi takker Dr. Kevin Woolfrey for hjælp med mikroskopet, Dr. K Ulrich Bayer for brugen af hans epifluorescerende mikroskop, og Thomas Südhof (Stanford University) for LRRTM2 plasmid.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL disposable microtubes with snap caps | VWR | 89000-028 | Incubation of mixed population of HEK cells |
| 1000 mL Rapid—Flow Filter Unit, 0.2 um aPES membrane | Thermo Fisher | 567-0020 | Sterilization of HEK media |
| 15 mL SpectraTube centrifuge tubes | Ward’s Science | 470224-998 | Harvesting HEK cells |
| 6 well sterile tissue culture plates | VWR | 100062-892 | culturing HEK cells |
| Calcium Chloride | Sigma | 223506-500G | Calcium phosphate transfection, HEK cell resuspension |
| Centrifuge- Sorvall Legend RT | Kendro Laboratory Products | 75004377 | Harvesting HEK cells |
| CO2 cell incubator | Thermo Scientific | HERACELL 150i | Incubation of HEK cells during growth |
| DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | HEK cell maintenance |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline PBS (1X) | Gibco | 14190-144 | Passaging/harvesting HEK cell |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | ED-500G | Harvesting HEK cells |
| Falcon Vented culture flasks, 75cm2 growth area | Corning | 9381M26 | Culturing HEK cells |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 17L184 | HEK cell maintenance |
| HEK293T cells | ATCC | Model system | |
| ImageJ | NIH | V: 2.0.0-rc-69/1.52p | Image analysis |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma | M9272-500G | HEK cell resuspension |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Fisher BioReagents | BP332-500 | Calcium phosphate transfection |
| Trypsin 0.25% (1X) Solution | GE Healthcare Life Sciences | SH30042.01 | Passaging HEK cells |
| Tube rotator | Incubation of mixed population of HEK cells | ||
| UltraClear Microscope slides. White Frosted, Positive Charged | Denville Scientific Inc. | M1021 | Image acquisition |
| Wide-field microscope | Zeiss | Axio Vert 200M | Image acquisition |
References
- Südhof, T. C. Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease. Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).
- Lakey, J. H., Raggett, E. M. Measuring protein-protein interactions. Current Opinion in Structural Biology. 8 (1), 119-123 (1998).
- Aoto, J., Martinelli, D. C., Malenka, R. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. Presynaptic neurexin-3 alternative splicing trans-synaptically controls postsynaptic AMPA receptor trafficking. Cell. 154 (1), 75-88 (2013).
- Aoto, J., Földy, C., Ilcus, S. M. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. Distinct circuit-dependent functions of presynaptic neurexin-3 at GABAergic and glutamatergic synapses. Nature Neuroscience. 18 (7), 997-1007 (2015).
- Südhof, T. C. Synaptic Neurexin Complexes: A Molecular Code for the Logic of Neural Circuits. Cell. 171 (4), 745-769 (2017).
- Dai, J., Aoto, J., Südhof, T. C. Alternative Splicing of Presynaptic Neurexins Differentially Controls Postsynaptic NMDA and AMPA Receptor Responses. Neuron. 102 (5), 993-1008 (2019).
- Restrepo, S., Langer, N. J., Nelson, K. A., Aoto, J. Modeling a Neurexin-3α Human Mutation in Mouse Neurons Identifies a Novel Role in the Regulation of Transsynaptic Signaling and Neurotransmitter Release at Excitatory Synapses. The Journal of Neuroscience. 39 (46), 9065-9082 (2019).
- Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., Südhof, T. C. LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).
- de Wit, J., et al. LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).
- Linhoff, M. W., et al. An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers. Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).
- Siddiqui, T. J., Pancaroglu, R., Kang, Y., Rooyakkers, A., Craig, A. M. LRRTMs and Neuroligins Bind Neurexins with a Differential Code to Cooperate in Glutamate Synapse Development. Journal of Neuroscience. 30 (22), 7495-7506 (2010).
- Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Bacchetti, S., Graham, F. L. Transfer of the gene for thymidine kinase to thymidine kinase-deficient human cells by purified herpes simplex viral DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (4), 1590-1594 (1977).
- Cerchiari, A. E., et al. A strategy for tissue self-organization that is robust to cellular heterogeneity and plasticity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), 2287-2292 (2015).
- Burdick, M. M., McCarty, O. J. T., Jadhav, S., Konstantopoulos, K. Cell-cell interactions in inflammation and cancer metastasis. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 20 (3), 86-91 (2001).
- Fox, D. A., Gizinski, A., Morgan, R., Lundy, S. K. Cell-cell interactions in rheumatoid arthritis synovium. Rheumatic Diseases Clinics of North America. 36 (2), 311-323 (2010).
- Yamagata, A., et al. Structural insights into modulation and selectivity of transsynaptic neurexin-LRRTM interaction. Nature Communications. 9 (1), 3964 (2018).
- Nguyen, T., Südhof, T. C. Binding properties of neuroligin 1 and neurexin 1beta reveal function as heterophilic cell adhesion molecules. The Journal of Biological Chemistry. 272 (41), 26032-26039 (1997).
- Boucard, A. A., Ko, J., Südhof, T. C. High Affinity Neurexin Binding to Cell Adhesion G-protein-coupled Receptor CIRL1/Latrophilin-1 Produces an Intercellular Adhesion Complex. Journal of Biological Chemistry. 287 (12), 9399-9413 (2012).
