Summary
Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol om snel en semiquantitatief ligand-receptor interacties in trans te meten in een heterologe celsysteem met behulp van fluorescentiemicroscopie.
Abstract
Eiwitinteracties op cellulaire interfaces dicteren een veelheid aan biologische uitkomsten, variërend van weefselontwikkeling en kankerprogressie tot synapsvorming en -onderhoud. Veel van deze fundamentele interacties komen voor in trans en worden meestal veroorzaakt door heterofiele of homofiele interacties tussen cellen die membraanverankerde bindingsparen uitdrukken. Het ophelderen hoe ziekterelevante mutaties deze fundamentele eiwitinteracties verstoren, kan inzicht geven in een groot aantal celbiologievelden. Veel eiwit-eiwit interactietests zijn meestal niet disambiguate tussen cis en trans interacties, wat mogelijk leidt tot een overschatting van de mate van binding die optreedt in vivo en omvat arbeidsintensieve zuivering van eiwitten en / of gespecialiseerde bewakingsapparatuur. Hier presenteren we een geoptimaliseerd eenvoudig protocol dat het mogelijk maakt om alleen transinteracties te observeren en te kwantificeren zonder dat langdurige eiwitzuiveringen of gespecialiseerde apparatuur nodig zijn. De HEK-celaggregatietest omvat het mengen van twee onafhankelijke populaties HEK-cellen, die elk membraangebonden cognate liganden uitdrukken. Na een korte incubatieperiode worden monsters in beeld genomen en worden de resulterende aggregaten gekwantificeerd.
Introduction
Synaptische interacties gefaciliteerd door synaptische adhesiemoleculen zijn fundamenteel voor de ontwikkeling, organisatie, specificatie, onderhoud en functie van synapsen en de generatie van neurale netwerken. De identificatie van deze transsynaptische celhechtingsmoleculen neemt snel toe; het is dus van fundamenteel belang om bindende partners te identificeren en te begrijpen hoe deze nieuwe hechtingsmoleculen met elkaar interageren. Bovendien heeft genoomsequentie mutaties geïdentificeerd in veel van deze hechtingsmoleculen die vaak verband houden met een veelheid aan neuroontwikkelings-, neuropsychiatrische en verslavingsstoornissen1. Mutaties in genen die coderen voor synaptische celhechtingsmoleculen kunnen transinteracties nadelig veranderen en kunnen bijdragen aan patofysiologische veranderingen in synapsvorming en of onderhoud.
Er bestaan meerdere tests om eiwit-eiwitinteracties kwantitatief te beoordelen, zoals isothermische calorimetrie, circulair dichroïsme, oppervlakteplasmonresonantie2 en hoewel kwantitatief van aard, hebben ze verschillende beperkingen. Ten eerste hebben ze recombinant eiwit nodig, wat soms lange en vervelende zuiveringsstappen vereist. Ten tweede hebben ze geavanceerde gespecialiseerde apparatuur en technische expertise nodig. Ten derde kunnen ze de mate van binding overschatten, omdat ze zowel cis- als transinteracties mogelijk maken tussen eiwitten die van nature aan een membraan in vivo zijn vastgebonden. Hier stellen we een eenvoudige en relatief snelle test voor die uitsluitend transinteracties test.
Om veel van de complicaties in verband met gezuiverde eiwittests te omzeilen, hebben we een op cellen gebaseerde eiwitinteractietest geoptimaliseerd die transinteracties in een verminderd heterologe celsysteem herkapitaliseert. Deze test is eerder in verschillende vormen gebruikt om transcellulaire interacties te bestuderen. In deze benadering worden kandidaatcelhechtingsmoleculen omgezet in HEK293T-cellen. Bij fysiologische omstandigheden vertonen HEK293T-cellen geen zelfaggregatie, waardoor ze voorbeeldige modellen zijn voor deze test. Echter, wanneer individuele populaties van HEK-cellen die receptor en ligand uitdrukken worden gecombineerd, de binding van de receptor en de ligand krachten aggregatie van HEK cellen optreden. Deze aggregatie wordt uitsluitend bemiddeld door transinteracties en is meestal in tientallen minuten waarneembaar. Er zijn geen eiwitzuiveringsstappen vereist in deze methode, en de efficiëntie van de methode is gebaseerd op het paradigma dat populaties hek-cellen die cognate adhesiemoleculen uitdrukken, worden gecombineerd en vervolgens slechts tientallen minuten later in beeld worden gebracht. Bovendien is deze methode relatief goedkoop, omdat er geen antilichamen of dure apparatuur nodig zijn. De enige apparatuur die nodig is voor het verkrijgen van gegevens is een standaard fluorescerende microscoop. Een bijkomend voordeel van deze celgebaseerde test is het vermogen om het effect van ziekterelevante puntmutaties op transinteracties snel te screenen. Dit kan worden uitgevoerd door HEK-cellen te transfecteren met cDCA's van de mutante varianten van het eiwit van belang.
In dit protocol presenteren we een voorbeeld waarin we onderzoeken of een missense mutatie in Neurexin3α (Neurexin3αA687T),geïdentificeerd bij een patiënt gediagnosticeerd met een ernstige verstandelijke beperking en epilepsie, interacties in trans verandert met leucine-rijke herhaalde transmembrane eiwit 2 (LRRTM2). Neurexin3α is een lid van de evolutionair geconserveerde familie van presynaptische celhechtingsmoleculen en hoewel recent werk meerdere rollen heeft geïdentificeerd bij de synaps3,4,5,6,7, blijft ons synaptische begrip van dit molecuul en alle leden van de neurexinefamilie onvolledig. LRRTM2 is een excitatory postsynaptische celhechtingseiwit dat deelneemt aan synapsvorming en -onderhoud8,9,10. Belangrijk is dat LRRTM2 uitsluitend interageert met neurexine isovormen die de splice site 4 alternatieve exon (SS4-) missen, maar niet met neurexine isoformen die de splice site 4 alternatieve exon (SS4+) bevatten. De menselijke missense mutatie (A687T) geïdentificeerd in Neurexin3α bevindt zich in een niet-bestudeerd extracellulair gebied dat evolutionair geconserveerd is en wordt bewaard tussen alle alfaneurexinen7. Aangezien de interactie tussen deze tweemoleculenis vastgesteld 8,9,11, stelden we de vraag: is het bindingsvermogen van Neurexin3α SS4- naar LRRTM2 gewijzigd door een A687T-puntmutatie? Deze test onthulde dat de A687T-puntmutatie onverwacht de aggregatie van Neurexin3α naar LRRTM2 verbeterde, wat suggereert dat het extracellulaire gebied waarin de puntmutatie zich bevindt, een rol speelt bij het bemiddelen van transsynaptische interacties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Celcultuur en transfectie
- Maak HEK celmedia met DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) aangevuld met 4,5 g/L glucose, L-glutamine & natriumpyruvaat en 10% FBS. Steriel filter.
- Bepaal vooraf geschikte liganden en receptoren voor aggregatietest.
OPMERKING: Neurexin3α SS4+/- en een van de bekende liganden, LRRTM2, werden gebruikt in deze studie. Liganden en receptoren van belang werden uitgedrukt uit cDNA's in pcDNA3.1. Een Gibson-assemblage werd gebruikt om Neurexin3α in pcDNA3.112te plaatsen. Neurexin3α F/R: TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCACCATGAGCTTTACCCTCCACTC/
GAGCGGCCGCCACTGTGCTGGATATCTGCAGAATTCTTACACATAATACTCCTTGTCCTT. - Bereid HEK293T-cellen voor.
- Kweek HEK293T cellen tot samenvloeiing in één T-75 kolf.
- Eenmaal samenvloeiend, gebruik 2 ml trypsine en plaats in 37 °C incubator gedurende 2 minuten. Voeg 6 ml HEK-media toe aan de kolf om cellen te resuspenderen en breng alle 8 ml over in een conische buis van 15 ml.
- Pellet bij 500 x g gedurende 5 min en resuspend in HEK celmedia voor een totaal van 8 ml.
- Tel cellen en voeg 735.000 cellen toe aan elke put van een plaat met 6 putten. Pas het uiteindelijke volume aan op 2 ml voor elke put met behulp van HEK-celmedia.
- Plaats in 37 °C incubator en laat cellen 's nachts groeien of totdat ze 50-60% samenvloeiing bereiken.
- Transfecteer HEK293T-cellen met behulp van de calciumfosfaatmethode13.
- Transfecteer goed-1 met 3 μg van het eiwit van belang en co-transfect met 1 μg fluorescerend eiwit (3 μg pcDNA3.1-Neurexin3αWT SS4- en 1 μg mCherry).
- Transfecteer goed-2 zoals in stap 1.4.1. maar met het gemuteerde eiwit van belang (pcDNA3.1-Neurexin3αA687T SS4-).
- Transfecteer goed-3 met 3 μg van de ligand van belang en co-transfecteer met 1 μg van een ander fluorescerend eiwit (3 μg pcDNA3.1 LRRTM2 en 1 μg GFP).
- Transfecteer goed-4 en goed-5 om als negatieve controles te dienen: goed-4 met 1 μg GFP en goed-5 met 1 μg mCherry.
- Bereid een andere plaat voor (zoals in stap 1.4.1-1.4.4) indien aanvullende voorwaarden of controles nodig zijn (Neurexin3αWT/A687T SS4+).
OPMERKING: Transfectie-efficiëntie wordt 24 uur na transfectie geanalyseerd onder een epifluorescentiemicroscoop en gekwantificeerd als het aantal cellen dat het fluorescerende eiwit uitdrukt waarmee ze zijn getransfecteerd. Een meer gestroomlijnde aanpak zou de transfectie van HEK-cellen met een bicistronic vectorcodering voor een fluorescerend eiwit en de ligand van belang omvatten en wordt ten zeerste aanbevolen boven co-transfectie. In het geval van deze studie zijn alfa-Neurexinen ~4,3 kb en werd een lage fluorescentie-intensiteit waargenomen met behulp van een bicistronic systeem dat cotransfectie vereist.
- 48 uur na de transfectie, oogst cellen voor aggregatie.
- Was ze twee keer goed met PBS.
- Voeg 1 ml 10 mM EDTA in PBS toe aan elke put om de cel-celinteracties voorzichtig te scheiden en de plaat gedurende 5 minuten te incuberen bij 37 °C.
OPMERKING: Trypsine wordt niet aanbevolen voor stap 1.5.2 vanwege mogelijke proteolytische decolleté van adhesiemoleculen in studie. Bovendien kan het protocol na toevoeging van EDTA niet worden gestopt totdat het is voltooid, omdat cellen nu worden blootgesteld aan omgevingsomstandigheden. - Tik voorzichtig op de plaat om de cellen los te maken en oogst ze elk goed in afzonderlijke conische buizen van 15 ml.
- Centrifugeer conische buizen op 500 x g en kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Terwijl cellen pelleten, bereid 6 incubatiebuizen voor door de bovenkant van elke microcentrifugebuis met elke aandoening te labelen.
OPMERKING: Elke permutatie van GFP- en mCherry-omstandigheden moet worden gebruikt om alle experimentele omstandigheden en de juiste controles te omvatten. Bijvoorbeeld: 1. GFP/mCherry, 2. mCherry/LRRTM2-GFP 3. GFP/Neurexin3αWT SS4-—mCherry, 4. GFP/Neurexin3αA687T SS4- –mCherry, 5. Neurexin3αWT SS4-—mCherry/LRRTM2—GFP, 6. Neurexin3αA687T SS4- –mCherry/LRRTM2—GFP. Maak extra buizen om aan verdere voorwaarden en bedieningselementen te voldoen. - Verwijder de supernatant en resuspend cellen in 500 μL HEK media met 10 mM CaCl2 en 10 mM MgCl2 opgewarmd tot 37 °C.
OPMERKING: De toevoeging van CaCl2 en MgCl2 maakt hechtingsmoleculen in staat om binding te herstellen en is alleen vereist als de transcellulaire interactiepartners in kwestie divalente kationen nodig hebben voor hechting. - Tel de cellen in elke conische buis van 15 ml met behulp van een hemocytometer en aliquot 200.000 cellen van elke aandoening in de juiste buis vanaf stap 1.6.1 voor een 1:1-mix in een totaal volume van 500 μL.
OPMERKING: Het duurt slechts 5 minuten per voorwaarde om te tellen en aliquot bedragen. - Incubeer buizen bij kamertemperatuur in een langzame buisrotator.
2. Beeldverwerving
- Optimaliseer microscoopverwervingsparameters voor specifieke monsters. In dit voorbeeld zijn beelden gemaakt op een breedveldmicroscoop. Gebruik een 5x luchtdoelstelling (NA: 0,15; WD: 20000 μm) om een groot genoeg veld voor analyse te krijgen.
- Beoordeel de aggregatie van de basislijn onmiddellijk na het mengen van de twee omstandigheden van HEK-cellen in stap 1.8. Dit zijn nu de 'time zero' beelden.
- Pipet 40 μL van elk monstermengsel op een geladen microscoopschuif en beeld onder fluorescentie in zowel de 488- als 561-kanalen.
- Verkrijg drie verschillende gezichtsvelden met één scherpstelvlak per voorbeelddaling.
- Verkrijg de laatste beelden op 60 min als het 'time 60' beeld.
- Om het "tijd 60"-beeld van het mengsel na een incubatie van 60 minuten te verkrijgen, neemt u nog eens 40 μL monster van elke toestand uit roterende buizen en pipetteer elk monster op een geladen dia. Afbeelding zoals in stap 2.2.2.
OPMERKING: Celaggregatie moet elke 15 minuten worden gecontroleerd totdat verzadiging optreedt. De timing van aggregatie hangt af van de eiwitten die worden getest.
- Om het "tijd 60"-beeld van het mengsel na een incubatie van 60 minuten te verkrijgen, neemt u nog eens 40 μL monster van elke toestand uit roterende buizen en pipetteer elk monster op een geladen dia. Afbeelding zoals in stap 2.2.2.
3. ImageJ/Fiji Analyse
- Sla analysebestanden op om de mate van aggregatie te kwantificeren met Fiji/ImageJ.
- Sla de meegeleverde aanvullende coderingsbestanden op in de map imageJ-macro's op de computer.
- Installeer de meegeleverde aggregatiemacro (Plug-ins, Macro's, Installeren en selecteer het bestand "AggregationAssay.txt").
- Drempelwaarden bepalen.
- Laad een 'time zero' .tif bestand in imageJ en splits de kanalen (Image | Kleur | Kanalen splitsen).
OPMERKING: De afbeelding 'tijd nul' wordt gebruikt om de drempel en de kleinste punctagrootte voor het hele experiment te bepalen. - Masker elk kanaal(Plug-ins | Macro's | AggregationAssay_MakeMask). Laat het venster Masker uit afbeelding verschijnen. Schakel de selectievakjes naast Drempelwaarde voor afbeelding bepalen en Clusterparams bepalen in histogram in en klik op OK.
- Bepaal de drempelwaarde van de afbeelding met behulp van de diabalk, noteer het nummer rechts van de diabalk en klik op OK.
- Er verschijnt een histogram van clustergrootte. Selecteer een clustergrootte in het histogram dat bij het experiment past, typ dit getal in het vak Min Clustergrootte: en klik op OK. Clusters onder deze grootte worden niet geanalyseerd.
- Laad een 'time zero' .tif bestand in imageJ en splits de kanalen (Image | Kleur | Kanalen splitsen).
- Voer de analyse uit.
- Open de 'time 60'-afbeelding van toestand 1 in imageJ en splits de kanalen zoals in stap 3.2.1.
- Maskeer elk kanaal (plug-ins, macro's AggregationAssay_MakeMask). Gebruik dezelfde drempel en grootte die zijn bepaald in stap 3.2.3 en stap 3.2.4. Schakel de selectievakjes naast Drempel voor afbeelding bepalen en Clusterparams bepalen uit Histogram uit en typ handmatig de grootte en drempelwaarden in de juiste velden en klik op OK.
- Bereken de aggregatie-index (Plugins | Macro's | AggregationAssay_CalculateOverlap). Selecteer de gemaskeerde kanalen die u wilt vergelijken en de map waarin de resulterende bestanden worden opgeslagen.
- Herhaal stap 3.3.1–3.3.3 voor elke 'time 60'-afbeelding in elke voorwaarde.
OPMERKING: De aggregatie-index wordt gedefinieerd als het totale overlappingsgebied gedeeld door de som van de twee kanaalgebieden minus het overlappingsgebied vermenigvuldigd met 100 (Aggregatie-index = overlapgebied/[gebied van kanaal 1 + gebied van kanaal 2 – overlapgebied] x 100). Deze normalisatie is een 'OR'-bewerking tussen de twee gemaskeerde kanalen die de totale pixels in een van beide maskers vertegenwoordigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De A687T-mutatie verhoogt de Neurexin3α SS4-binding aan LRRTM27
Om te onderzoeken hoe intercellulaire interacties van twee bekende synaptische eiwitten worden beïnvloed door de introductie van een puntmutatie gevonden bij een patiënt met een verstandelijke beperking en epilepsie, gebruikten we de bovenstaande HEK-celaggregatietest (figuur 1). Cellen werden getransfecteerd volgens sectie 1 en voorbereid op beeldvorming volgens secties 1 en 2 van het protocol. Cellen werden in beeld gebracht bij de uitgangswaarde waar geen aggregatie werd waargenomen zoals verwacht (niet weergegeven). Beelden die na 60 minuten werden verkregen, werden geanalyseerd zoals in sectie 3 van het protocol. Om selectiebias te minimaliseren, werden de omstandigheden gerandomiseerd om de experimenteerder te verblinden. Om vergelijkbare redenen werd het hele gezichtsveld van elke afbeelding geselecteerd als ROI.
De omstandigheden waarin cellen geen synaptische liganden (GFP/mCherry) uitdrukten, vertoonden een minimale aggregatie na een incubatie van 60 minuten (figuur 2). Evenzo vertoonden de omstandigheden waarin slechts één van de twee populaties cellen synaptische liganden uitdrukte (mCherry/LRRTM2-GFP of GFP/Neurexin3αWT/A687T SS4- —mCherry) minimale aggregatie na een incubatie van 60 minuten (figuur 2). Zoals verwacht vertoonden de omstandigheden die twee populaties cellen met incompatibele hechtingsmoleculen bevatten (Neurexin3αWT/A687T SS4+—mCherry/LRRTM2-GFP) geen aggregatie na 60 minuten (figuur 2B). Deze voorwaarden dienden als kritieke negatieve controles aangezien LRRTM2 uitsluitend aan SS4 zonder isoformen (SS4-) van Neurexins bindt en de specificiteit van deze aggregatietest benadrukt.
Aandoeningen met compatibele hechtingsmoleculen8,9,10 (Neurexin3αWT SS4- —mCherry/LRRTM2-GFP) vertoonden significante aggregatie na een incubatie van 60 minuten ( figuur2C). Aggregatie kan worden gevisualiseerd als geel en is aanwezig in de overlapping tussen cellen (figuur 1 en figuur 2). Verrassend genoeg vertoonde de aandoening waarbij Neurexin3α A687T SS4- samen met LRRTM2 (Neurexin3αA687T SS4- —mCherry/LRRTM2-GFP) werd geïncubeerd aanzienlijk meer aggregatie in vergelijking met zijn wildtype tegenhanger (Neurexin3αWT SS4- —mCherry/LRRTM2-GFP; positieve controle). Dit suggereert dat de A687T-puntmutatie in Neurexin3α de bindingsmogelijkheden van Neurexin3α SS4- naar LRRTM2 verbetert.
Figuur 1. Workflow van aggregatietest. (A) HEK293T-cellen worden getransfecteerd met behulp van een eiwit-1/mCherry, of een eiwit-2/GFP. (B) Expressie van Neurexin3α duurt 48 uur. (C) Cellen worden geoogst met 10 mM EDTA en vervolgens gekorreld (D). (E) Cellen worden gemengd in een verhouding van 1:1 en geresuspendeerd in 500 μL HEK-media die 10 mM CaCl2 en MgCl2bevatten . (F) Cellen worden geïncubeerd bij kamertemperatuur totdat aggregatie optreedt en een definitief beeld wordt verkregen op 'tijd 60'. Aggregatie wordt gevisualiseerd als het aantal gele puncta dat zichtbaar is in het gezichtsveld. Er wordt geen aggregatie waargenomen wanneer cellen niet de juiste receptor ligand paren uitdrukken en worden dus gezien als individuele rode of groene puncta. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Neurexin3αA687T SS4- heeft verbeterde aggregatie met excitatory ligand LRRTM2 in vergelijking met Neurexin3αWT SS4-. (A) Representatieve beelden van negatieve controles na een incubatie van 60 minuten mCherry met GFP, mCherry met LRRTM2, GFP met Neurexin3αWT SS4+/-, en GFP met Neurexin3αA687T SS4+/-. Aggregatie werd waargenomen na 60 minuten in zowel LRRTM2 met Neurexin3αWT SS4-, als LRRTM2 met Neurexin3αA687T SS4-. (B) Kwantificering van de aggregatie-index in alle SS4+ omstandigheden na 60 minuten. Aggregatie-index = overlapgebied/(gebied van kanaal 1 + gebied van kanaal 2 – overlapgebied) x 100. (C) Hetzelfde als (B) maar SS4-. De getoonde gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde ± SEM van het aantal experimenten (SEM: GFP/mCherry ± 0,0245, mCherry/LRRTM2 ± 0,02465, GFP/Neurexin3αWT SS4- ± 0,02453, GFP/Neurexin3αA687T SS4- ± 0,0109, Neurexin3αWT SS4-/LRRTM2 ± 0,0538, Neurexin3αA687T SS4-/LRRTM2 ± 0,0174; p= 0,0136). Getallen die in staven worden gepresenteerd, vertegenwoordigen het aantal uitgevoerde onafhankelijke experimenten. Stippellijnen vertegenwoordigen basislijn of gemiddelde minimale aggregatie van controleomstandigheden. Statistische significantie werd bepaald door eenrichtings-ANOVA, meerdere vergelijkingen; *p<0,05; p<0.0001.Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Restrepo et al.7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende coderingsbestanden. Klik hier om deze bestanden te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het ontleden van de eiwit-eiwitinteracties die optreden in trans tijdens celhechting kan leiden tot een beter begrip van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan basis cellulaire processen, waaronder de vorming, functie en onderhoud van synapsen tijdens rijping en remodellering. De implicaties van cel-celinteracties breiden zich verder uit dan neurobiologie en hebben een bredere rol in signaaltransductie, celmigratie en weefselontwikkeling14. Aberraties in celhechting kunnen cellulaire processen verstoren die noodzakelijk zijn voor een goede celfunctie en kunnen een verscheidenheid aan etiologieën zoals kanker, artritis, verslaving, autisme en schizofrenie1,15,16te kort zijn. Hier bieden we een geoptimaliseerd gedetailleerd protocol met HEK-celaggregatie waarmee celhechtingsinteracties in trans kunnen wordengetest.
Met dit HEK-celaggregatieprotocol kunnen we verschillen in aggregatie ontleden om de bindingscapaciteit tussen een presynaptisch eiwit en de postsynaptische ligand ervan te benaderen. Als zodanig kunnen we vragen stellen zoals: wordt de interactie tussen twee essentiële synaptische eiwitten beïnvloed door een puntmutatie? Meer specifiek, wordt de transinteractie van Neurexin3α met LRRTM2 beïnvloed door A687T? De hier bestudeerde A687T missense mutatie bevindt zich in een niet eerder bestudeerd linkergebied van het extracellulaire domein van Neurexin3α7. De resultaten illustreren dat de A687T-mutatie de aggregatie van cellen die Neurexin3αA687T bevatten, verbetert naar cellen die LRRTM2 bevatten (figuur 2C). Deze bevinding is belangrijk omdat eerder werd aangetoond dat LRRTMs zich alleen binden aan Neurexin via een Neurexin-domein genaamd LNS617, en suggereert verder dat sequenties stroomopwaarts van LNS6 een onafhankelijk effect kunnen uitoefenen op de transinteracties tussen Neurexin3α SS4- en LRRTM27.
De resultaten in figuur 2 vertonen de specificiteit van deze test als alle negatieve controles (GFP/mCherry; Neurexin3αWT/A687T SS4- —mCherry/GFP of LRRTM-GFP/mCherry) had na 60 minuten geen waarneembare aggregatie. Een kritische controle die in deze studie werd gebruikt, Neurexin3αWT/A687T SS4+ —mCherry/LRRTM-GFP, vertoonde ook geen aggregatie na 60 minuten omdat LRRTM2 bekend is dat het zich uitsluitend bindt aan SS4 zonder (SS4-) isovormen van Neurexine. Deze controle toont aan dat eenvoudige overexpressie van membraangebonden moleculen onvoldoende is om aggregatie in dit systeem te forceren, wat de specificiteit van deze test verder illustreert.
De hier beschreven celhechtingstest is veel gebruikt om de interacties van transsynaptische celhechtingsmoleculen8,18,19te testen; het kan echter worden gebruikt om zelfklevende cel-tot-celinteracties van membraangebonden eiwitten te testen. Dit protocol, dat in de loop van de tijd is geëvolueerd, werd geoptimaliseerd ten opzichte van het oorspronkelijke gepubliceerde protocol en de daaropvolgende variaties van het protocol door drie experimentele parameters te wijzigen. Ten eerste werd de incubatietemperatuur voor de cellen veranderd. Het oorspronkelijke protocol vereist de incubatie van cellen in stap 1.9 bij 4 °C. Deze lage temperatuur kan fungeren als een omgevingsstressor en kan de levensvatbaarheid van cellen verminderen, wat leidt tot celdood en lyse. Tijdens cellyse scheiden de cellen genomisch DNA en celafval af in media die ervoor zorgen dat cellen samenklonteren in oplossing, wat leidt tot valse positieven tijdens beeldvorming. Ten tweede werd het aantal cellen per aandoening verhoogd tot 200.000 per populatie en werd de objectieve grootte gewijzigd in een 5x; hierdoor kan de onderzoeker een groter aantal interacties per gezichtsveld in beeld brengen om de statistische kracht binnen elke n te vergroten. Ten derde werd de aggregatie-index anders gemeten. Eerdere aggregatie-indexen werden beperkt door de selectie van clustergrootte door de experimenteerder, wat leidde tot de uitsluiting van "subthreshold"-clusters. Daarentegen worden nu drempelwaarden ingesteld voor de individuele celgrootte op 'tijd nul', en de aggregatie wordt nu berekend als het overlappende gebied gedeeld door de som van de twee kanaalgebieden minus het overlapgebied vermenigvuldigd met 100 bij 'tijd 60' waardoor kleinere positieve clusters kunnen worden opgenomen waardoor de test gevoeliger wordt voor andere eiwit-ligandparen (figuur 2B,C).
Probleemoplossing en optimalisatie kunnen nodig zijn, afhankelijk van de geteste interactie-eiwitten. Hoewel de incubatietijd tot de uiteindelijke beeldverwerving zal verschillen afhankelijk van de geteste eiwitten, is het van cruciaal belang dat er geen aggregatie wordt waargenomen op 'tijd nul'. Als aggregatie op tijd nul wordt gezien, kan dit impliceren dat de cellen om te beginnen niet gezond waren. Dit kan te wijten zijn aan verschillende factoren, waaronder plotselinge blootstelling aan temperaturen onder 37 °C of trage experimentele procedure. Belangrijk is dat de resuspensiemedia voor stap 1.7 bij 37 °C moeten zijn, waardoor de cellen geleidelijk kamertemperatuur kunnen bereiken zonder een plotselinge harde temperatuurdaling. Een manier om tijdens het experiment een optimale celgezondheid te hebben, is ervoor te zorgen dat stappen 1,7 tot en met 1,9 binnen een tijdsbestek van 25 minuten worden voltooid zonder pauzes ertussen. Het wordt aanbevolen dat de microscoop is ingesteld en klaar is voor gebruik vóór celoogstcellen in stap 1.5; dit zorgt ervoor dat in stap 2.2 direct een echte 'time zero' afbeelding genomen kan worden.
Als aggregatie na 60 minuten incubatie niet wordt waargenomen, kunnen verschillende factoren bijdragen aan dit gebrek aan hechting. Ten eerste kunnen de eiwitten in kwestie geen bindende partners zijn of kunnen ze interacties met lage affiniteit hebben die niet detecteerbaar zijn door deze test. In dit geval kan een gevoeligere test nodig zijn. Ten tweede kunnen de eiwit(en) van belang niet lokaliseren in het membraan wanneer ze alleen in HEK-cellen worden uitgedrukt. Bevestig in dit geval dat het eiwit membraan gelokaliseerd is met behulp van biochemische technieken (oppervlaktebiotinylering) of tag het eiwit van belang direct met een fluorescerende tag en afbeelding HEK293T-cellen op 40x of hogere vergroting om oppervlakteexpressie te beoordelen. Nadat de membraanlokalisatie is bevestigd, raden we echter aan om niet-gecodeerde varianten te gebruiken voor deze HEK-celaggregatietest om de bindingscapaciteit van het inheemse eiwit nauwkeuriger te beoordelen. Ten derde hebben we in dit protocol toegestaan dat Neurexin3α 48 uur uitdrukte; de expressietijd van eiwitten kan echter variëren, afhankelijk van de geteste eiwitten. Ten vierde is het van cruciaal belang om de media in stap 1.7 aan te vullen met MgCl2 en CaCl2 als de eiwitten in kwestie afhankelijk zijn van divalente kationen, zoals het geval is met het voorbeeld van Neurexinen en LRRTM211. Als het onbekend is of de interactiepartners divalente kationen nodig hebben voor hechting, voegt u EDTA toe aan één voorwaarde. De EDTA moet chelaatremineringskationen die van nature aanwezig zijn in DMEM en zorgen voor een calcium- en magnesiumvrije oplossing. Als adhesie wordt waargenomen na toevoeging van EDTA, vereisen de eiwitten in kwestie geen divalente kationen voor hechting.
Er bestaan veel methoden om eiwitinteracties te testen; de meeste zijn echter niet specifiek voor het testen van alleen transinteracties die van cel tot cel plaatsvinden en vervelende eiwitzuiveringsstappen vereisen. Hoewel de HEK-celaggregatietest geen directe maatstaf voor affiniteit is en niet mag worden gebruikt om een meer kwantitatieve benadering te vervangen om dissociatieconstanten naar beste weten te herstellen, vertegenwoordigt deze test een benadering om echte transinteracties op een semi-kwantitatieve en relatief efficiënte manier te testen. Bovendien kan de HEK-celaggregatietest vanwege het relatieve gemak van deze test worden gebruikt in combinatie met deze meer kwantitatieve benaderingen om een bredere en completere karakterisering van de interacties te verkrijgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door grants van het National Institute of Mental Health (R00MH103531 en R01MH116901 aan J.A.), een predoctorale training Grant van het National Institute of General Medicine (T32GM007635 to S.R.), en een Lyda Hill Gilliam Fellowship for Advanced Study (GT11021 to S.R.). We danken Dr. Kevin Woolfrey voor hulp met de microscoop, Dr. K Ulrich Bayer voor het gebruik van zijn epifluorescente microscoop, en Thomas Südhof (Stanford University) voor de LRRTM2 plasmide.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL disposable microtubes with snap caps | VWR | 89000-028 | Incubation of mixed population of HEK cells |
| 1000 mL Rapid—Flow Filter Unit, 0.2 um aPES membrane | Thermo Fisher | 567-0020 | Sterilization of HEK media |
| 15 mL SpectraTube centrifuge tubes | Ward’s Science | 470224-998 | Harvesting HEK cells |
| 6 well sterile tissue culture plates | VWR | 100062-892 | culturing HEK cells |
| Calcium Chloride | Sigma | 223506-500G | Calcium phosphate transfection, HEK cell resuspension |
| Centrifuge- Sorvall Legend RT | Kendro Laboratory Products | 75004377 | Harvesting HEK cells |
| CO2 cell incubator | Thermo Scientific | HERACELL 150i | Incubation of HEK cells during growth |
| DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | HEK cell maintenance |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline PBS (1X) | Gibco | 14190-144 | Passaging/harvesting HEK cell |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | ED-500G | Harvesting HEK cells |
| Falcon Vented culture flasks, 75cm2 growth area | Corning | 9381M26 | Culturing HEK cells |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 17L184 | HEK cell maintenance |
| HEK293T cells | ATCC | Model system | |
| ImageJ | NIH | V: 2.0.0-rc-69/1.52p | Image analysis |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma | M9272-500G | HEK cell resuspension |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Fisher BioReagents | BP332-500 | Calcium phosphate transfection |
| Trypsin 0.25% (1X) Solution | GE Healthcare Life Sciences | SH30042.01 | Passaging HEK cells |
| Tube rotator | Incubation of mixed population of HEK cells | ||
| UltraClear Microscope slides. White Frosted, Positive Charged | Denville Scientific Inc. | M1021 | Image acquisition |
| Wide-field microscope | Zeiss | Axio Vert 200M | Image acquisition |
References
- Südhof, T. C. Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease. Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).
- Lakey, J. H., Raggett, E. M. Measuring protein-protein interactions. Current Opinion in Structural Biology. 8 (1), 119-123 (1998).
- Aoto, J., Martinelli, D. C., Malenka, R. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. Presynaptic neurexin-3 alternative splicing trans-synaptically controls postsynaptic AMPA receptor trafficking. Cell. 154 (1), 75-88 (2013).
- Aoto, J., Földy, C., Ilcus, S. M. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. Distinct circuit-dependent functions of presynaptic neurexin-3 at GABAergic and glutamatergic synapses. Nature Neuroscience. 18 (7), 997-1007 (2015).
- Südhof, T. C. Synaptic Neurexin Complexes: A Molecular Code for the Logic of Neural Circuits. Cell. 171 (4), 745-769 (2017).
- Dai, J., Aoto, J., Südhof, T. C. Alternative Splicing of Presynaptic Neurexins Differentially Controls Postsynaptic NMDA and AMPA Receptor Responses. Neuron. 102 (5), 993-1008 (2019).
- Restrepo, S., Langer, N. J., Nelson, K. A., Aoto, J. Modeling a Neurexin-3α Human Mutation in Mouse Neurons Identifies a Novel Role in the Regulation of Transsynaptic Signaling and Neurotransmitter Release at Excitatory Synapses. The Journal of Neuroscience. 39 (46), 9065-9082 (2019).
- Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., Südhof, T. C. LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).
- de Wit, J., et al. LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).
- Linhoff, M. W., et al. An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers. Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).
- Siddiqui, T. J., Pancaroglu, R., Kang, Y., Rooyakkers, A., Craig, A. M. LRRTMs and Neuroligins Bind Neurexins with a Differential Code to Cooperate in Glutamate Synapse Development. Journal of Neuroscience. 30 (22), 7495-7506 (2010).
- Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Bacchetti, S., Graham, F. L. Transfer of the gene for thymidine kinase to thymidine kinase-deficient human cells by purified herpes simplex viral DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (4), 1590-1594 (1977).
- Cerchiari, A. E., et al. A strategy for tissue self-organization that is robust to cellular heterogeneity and plasticity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), 2287-2292 (2015).
- Burdick, M. M., McCarty, O. J. T., Jadhav, S., Konstantopoulos, K. Cell-cell interactions in inflammation and cancer metastasis. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 20 (3), 86-91 (2001).
- Fox, D. A., Gizinski, A., Morgan, R., Lundy, S. K. Cell-cell interactions in rheumatoid arthritis synovium. Rheumatic Diseases Clinics of North America. 36 (2), 311-323 (2010).
- Yamagata, A., et al. Structural insights into modulation and selectivity of transsynaptic neurexin-LRRTM interaction. Nature Communications. 9 (1), 3964 (2018).
- Nguyen, T., Südhof, T. C. Binding properties of neuroligin 1 and neurexin 1beta reveal function as heterophilic cell adhesion molecules. The Journal of Biological Chemistry. 272 (41), 26032-26039 (1997).
- Boucard, A. A., Ko, J., Südhof, T. C. High Affinity Neurexin Binding to Cell Adhesion G-protein-coupled Receptor CIRL1/Latrophilin-1 Produces an Intercellular Adhesion Complex. Journal of Biological Chemistry. 287 (12), 9399-9413 (2012).
