Summary
ここでは、蛍光顕微鏡を用いた異種細胞系におけるトランスにおけるリガンド-受容体相互作用を迅速かつ半定量的に測定するための最適化されたプロトコルを提示する。
Abstract
細胞インターフェースでのタンパク質相互作用は、組織の発達やがんの進行からシナプスの形成と維持に至るまで、多くの生物学的結果を決定します。これらの基本的相互作用の多くは、トランスで起こり、典型的には、膜アンカー結合対を発現する細胞間の異種または同種の相互作用によって誘発される。疾患関連の突然変異がこれらの基本的なタンパク質相互作用をどのように混乱させるかを解明することで、無数の細胞生物学分野への洞察を得ることができます。多くのタンパク質とタンパク質の相互作用アッセイは、通常、シスとトランス相互作用の間のあいまいさを解消せず、生体内で発生している結合の程度を過大評価し、タンパク質および/または特殊なモニタリング装置の労働集約的な精製を伴う可能性があります。ここでは、長いタンパク質精製や特殊な装置を必要とせずにトランス相互作用のみを観察し定量化できる、最適化されたシンプルなプロトコルを提示します。HEK細胞凝集アッセイは、HEK細胞の2つの独立集団の混合を含み、それぞれが膜結合同系リガンドを発現する。短いインキュベーション期間の後、サンプルを画像化し、結果の凝集体を定量化します。
Introduction
シナプス接着分子によって促進されるシナプス相互作用は、シナプスの開発、組織、仕様、維持および機能およびニューラルネットワークの生成の基礎となる。これらのシナプス細胞接着分子の同定は急速に増加しています。したがって、結合パートナーを同定し、これらの新しい接着分子が互いにどのように相互作用するかを理解することが根本的に重要です。さらに、ゲノムシーケンシングは、多くの神経発達、神経精神、および中毒障害に一般的にリンクされているこれらの接着分子の多くの突然変異を同定した1。シナプス細胞接着分子をコードする遺伝子の突然変異は、トランス相互作用を有害に変化させ、シナプス形成および維持における病態生理学的変化に寄与する可能性がある。
等温熱熱量測定、円形二色、表面プラズモン共鳴2 などのタンパク質とタンパク質の相互作用を定量的に評価するために複数のアッセイが存在し、本質的には定量的には、いくつかの制限があります。第一に、それらは組換えタンパク質を必要とし、時には長く、退屈な精製ステップを要求する。第二に、彼らは洗練された専門機器と技術的な専門知識を必要とします。第三に、生体内の膜に自然につながれているタンパク質間のシスとトランスの相互作用の両方を可能にするので、結合の程度を過大評価することができます。ここでは、トランス相互作用を排他的にテストする、単純で比較的迅速なアッセイを提案する。
精製タンパク質アッセイに関連する合併症の多くを回避するために、我々は還元異種細胞系におけるトランス相互作用を再現する細胞ベースのタンパク質相互作用アッセイを最適化した。このアッセイは、細胞間相互作用を研究するために、これまで様々な形で使用されてきました。このアプローチでは、候補細胞接着分子がHEK293T細胞にトランスフェクションされる。生理的条件では、HEK293T細胞は自己凝集を示さないため、このアッセイの模範的なモデルとなっています。しかし、受容体とリガンドを発現するHEK細胞の個体集団が結合されると、受容体とリガンドの結合が生じるようにHEK細胞の凝集が生じる。この凝集はトランス相互作用によって排他的に媒介され、通常は数十分で観察可能である。この方法ではタンパク質精製のステップは必要なく、この方法の効率は、同結合性分子を発現するHEK細胞の集団が結合され、その後数十分後に画像化されるというパラダイムに依存している。さらに、抗体も高価な機器も必要とされないので、この方法は比較的安価です。データの取得に必要な装置は、標準蛍光顕微鏡のみです。この細胞ベースのアッセイに対するさらなる利点は、疾患関連点突然変異がトランス相互作用に及ぼす影響を迅速にスクリーニングする能力である。これは、目的とするタンパク質の変異変異体変異体のcDNAsを有するHEK細胞をトランスフェクトすることによって行うことができる。
本プロトコルでは、深い知的障害とてんかんと診断された患者において同定されたNeurexin3α(Neurexin3αA687T)におけるミスセンス突然変異が、ロイシンリッチリピート膜貫通タンパク質2(LRRTM2)との相互作用を変化させるかどうかを調べる例を提示する。Neurexin3αは、シナプス前細胞接着分子の進化的に保存されたファミリーの一員であり、最近の研究ではシナプス3、4、5、6、7で複数の役割を同定していますが、この分子とノイレクシンファミリーのすべてのメンバーのシナプス理解は不完全なままです。LRRTM2は、シナプス形成および維持8、9、10に関与する興奮性ポストナプティック細胞接着タンパク質である。重要なことに、LRRTM2はスプライスサイト4代替エキソン(SS4-)を欠いているが、スプライスサイト4代替エキソン(SS4+)を含むノイレクシンアイソフォームとは異なっているノイレクシンアイソフォームと排他的に相互作用する。Neurexin3αで同定されたヒトミスセンス変異(A687T)は、進化的に保存され、全てのαニューレクシン7の間で保存されている未研究の細胞外領域に位置する。これら2つの分子間の相互作用が確立されたので、私たちは、Neurexin3α SS4-LRRTM2への結合能力がA687T点突然変異によって変化しているのかという疑問を提起しました。このアッセイは、A687T点突然変異がNeurexin3αのLRRTM2への凝集を予期せず増強したことを明らかにし、その点突然変異が位置する細胞外領域が、シナプス間相互作用を媒介する役割を果たしていることを示唆した。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 細胞培養とトランスフェクション
- DMEM、1x(ダルベッコのイーグル培地の修飾)4.5 g /Lグルコース、L-グルタミン&ピルビン酸ナトリウムおよび10%FBSでHEK細胞培地を作ります。滅菌フィルター。
- 凝集アッセイに適したリガンドおよび受容体を事前に決定する。
注:Neurexin3α SS4+-および既知のリガンドの1つであるLRRTM2がこの研究で使用されました。目的のリガンドおよび受容体は、pcDNA3.1においてcDNAから発現した。ギブソンアセンブリを使用して、ノイレクシン3αをpcDNA3.112に挿入しました。ノイレクシン3α F/R: TTTAAACTTAAGクトラッヒガクククチャクトクコッチョッチョッチョクGCカッカガクタットッタクテクトカックトクチュククチュク/
ガッCGGCCGGCTGGATCTGCAGAATTTタカタアタクトクトクト - HEK293T細胞を準備します。
- HEK293T細胞を1つのT-75フラスコで合流させます。
- コンフルエントになったら、2 mLのトリプシンを使用し、37°Cインキュベーターに2分間置きます。フラスコに6mLのHEK培地を加え、細胞を再懸濁し、8 mLすべてを15 mLの円錐管に移します。
- 500 x g で 5 分間ペレットを 5 分間、HEK 細胞培地で合計 8 mL の再懸濁液を使用します。
- 細胞を数え、6ウェルプレートの各ウェルに735,000個の細胞を追加します。HEKセルメディアを使用して、各ウェルの最終体積を2mLに調整します。
- 37°Cインキュベーターに入れ、細胞が一晩、または50〜60%の合流に達するまで増殖させます。
- リン酸カルシウム法13を用いたHEK293T細胞のトランスフェクト
- 3 μgの目的タンパク質を有するトランスフェクトウェル1、1 μgの蛍光タンパク質(3 μgのpcDNA3.1-Neurexin3αWT SS4-および1 μgのmCherry)を共トランスフェクトします。
- ステップ1.4.1のようにトランスフェクトウェル2。しかし、目的の変異タンパク質(pcDNA3.1-ノイレクシン3αA687T SS4-)を有する。
- 3 μgのリガンドを対象とし、別の蛍光タンパク質の1 μg(3 μgのpcDNA3.1 LRRTM2およびGFP 1 μg)を用いてトランスフェクトウェル3。
- 負のコントロールとして機能するトランスフェクトウェル4とウェル5:GFPの1 μgでウェル4、mCherryの1 μgで井戸5。
- 追加の条件またはコントロール(Neurexin3αWT/A687T SS4+)を必要とする場合は、別のプレート(ステップ1.4.1-1.4.4)を準備します。
注:トランスフェクション効率は、蛍光顕微鏡下でトランスフェクション後24時間分析し、トランスフェクションした蛍光タンパク質を発現する細胞数として定量します。より合理化されたアプローチには、蛍光タンパク質と目的のリガンドをコードする二重体性ベクターを持つHEK細胞のトランスフェクションが含まれ、上記の共同トランスフェクションが推奨されます。本研究の場合、αノイレクシンは約4.3kb、低蛍光強度は、共トランスフェクションを必要とする二酸化システムを用いて観察された。
- トランスフェクションの48時間後、細胞を集積させる。
- PBSで2回よく洗います。
- PBSに10 mM EDTAの1mLを各ウェルに加え、細胞間相互作用を穏やかに解約し、37°Cでプレートを5分間インキュベートします。
注:トリプシンは、研究における接着分子の潜在的なタンパク質分解切断のためにステップ1.5.2のために推奨されていません。さらに、EDTA の追加後、セルが環境条件にさらされるため、プロトコルは完了するまで停止されない場合があります。 - プレートを軽くタップして細胞を取り外し、各ウェルを別々の15 mL円錐形チューブに収穫します。
- 500 x g の遠心円錐管と 5 分間室温。
- 細胞がペレット化されている間、各条件で各マイクロ遠心管の上部にラベルを付けて6インキュベーションチューブを調製する。
注: GFP と mCherry 条件の各順列は、すべての実験条件と適切な制御を包含するために使用されるべきです。例えば:1.GFP/mCherry、2.mCherry/LRRTM2-GFP 3。GFP/ノイレクシン3αWT SS4-mCherry, 4.GFP/ノイレクシン3αA687T SS4- –mCherry, 5.ノイレクシン3αWT SS4-mCherry/LRRTM2—GFP, 6.ノイレクシン3αA687T SS4- –mCherry/LRRTM2—GFP.さらなる条件やコントロールに対応するために、追加のチューブを作ります。 - 上清を取り除き、10 mM CaCl2 と10 mMMgCl2 を37°Cに温めたHEK培地500μLの細胞を再懸濁します。
注:CaCl 2とMgCl2を追加すると、接着分子が結合を再確立することができ、問題の細胞間相互作用パートナーが接着のために二価カチオンを必要とする場合にのみ必要です。 - ヘモサイトメーターとアリコート200,000細胞を使用して各15 mLの円錐管の細胞を、ステップ1.6.1から適切なチューブに数え、合計体積500μLで1:1ミックスします。
注:それは数とアリコートの量に条件ごとに5分かかります。 - 低速チューブ回転器で室温でチューブをインキュベートします。
2. 画像の取得
- 特定のサンプルの顕微鏡取得パラメータを最適化します。この例では、広視野顕微鏡で画像を撮影した。5x 空気の目的を使用します (NA: 0.15;WD:20000 μm)、分析に十分な大きさのフィールドを取得します。
- ステップ1.8でHEK細胞の2つの条件を混合した直後にベースライン凝集を評価する。これらは現在、「タイムゼロ」画像です。
- 各サンプル混合物のピペット40 μLは、488および561チャネルの両方の蛍光下で荷電顕微鏡スライドおよび画像上に置いた。
- サンプルドロップごとに1つのフォーカス面で3つの異なる視野を取得します。
- 「時間60」画像として60分で最終画像を取得します。
- 60分インキュベーション後の混合物の「時間60」画像を得るために、各条件の別の40 μLサンプルを回転管およびピペットから各サンプルを荷電スライドに取り出します。ステップ 2.2.2 のイメージ。
メモ:飽和が発生するまで、セルの集計は 15 分ごとにチェックする必要があります。凝集のタイミングは、試験されるタンパク質に依存します。
- 60分インキュベーション後の混合物の「時間60」画像を得るために、各条件の別の40 μLサンプルを回転管およびピペットから各サンプルを荷電スライドに取り出します。ステップ 2.2.2 のイメージ。
3. 画像J/フィジー分析
- フィジー/ImageJ を使用して集計の範囲を定量化するには、解析ファイルを保存します。
- 提供された補足コーディングファイルをコンピュータの imageJ マクロフォルダに保存します。
- 提供された集計マクロをインストールします (プラグイン、マクロ、インストール、および「AggregationAssay.txt」ファイルを選択します)。
- しきい値を決定します。
- 'time 0' .tifファイルを imageJ にロードし、チャンネルを分割します (イメージ|カラー|チャンネルの分割
注: 「時間ゼロ」画像は、実験全体のしきい値と最小のパンクタサイズを決定するために使用されます。 - 各チャネルをマスクする (プラグイン|マクロ|AggregationAssay_MakeMask)。[イメージからマスクを作成]ウィンドウが表示されます。[イメージのしきい値を決定する] および [ヒストグラムからクラスタ パラメータを決定する] の横にあるチェック ボックスをオンにし、[OK]をクリックします。
- スライド バーを使用してイメージのしきい値を決定し、スライド バーの右側の数値を記録して [OK]をクリックします。
- クラスター サイズのヒストグラムが表示されます。実験に適したクラスター サイズをヒストグラムから選択し、[最小クラスタ サイズ]ボックスにこの数値を入力して、[OK]をクリックします。このサイズより低いクラスタは解析されません。
- 'time 0' .tifファイルを imageJ にロードし、チャンネルを分割します (イメージ|カラー|チャンネルの分割
- 解析を実行します。
- imageJ で条件 1 の 'time 60' イメージを開き、ステップ 3.2.1 のようにチャンネルを分割します。
- 各チャンネル(プラグイン、マクロ、AggregationAssay_MakeMask)をマスクします。ステップ 3.2.3 およびステップ 3.2.4 で決定したのと同じしきい値とサイズを使用します。[ イメージのしきい値を決定する ] ボックスと [ ヒストグラムからクラスタ パラメータを決定する] の横にあるチェック ボックスをオフにし、サイズとしきい値を適切なフィールドに手動で入力して [OK]をクリックします。
- 集計インデックスを計算する (プラグイン|マクロ|AggregationAssay_CalculateOverlap)。比較するマスクされたチャンネルと、結果のファイルが保存されるディレクトリを選択します。
- すべての条件で「時間60」画像ごとにステップ3.3.1~3.3.3を繰り返します。
注: 集約インデックスは、2 つのチャネル領域からオーバーラップ領域に 100 を掛けた合計で割ったオーバーラップ領域の合計として定義されます (集約インデックス = チャネル 1 の領域 + チャネル 2 の領域 - オーバーラップ領域] x 100)。この正規化は、いずれかのマスクの合計ピクセルを表す 2 つのマスクチャネル間の「OR」操作です。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A687T突然変異は、ノイレクシン3α SS4-LRRTM2 7に結合する増加
知的障害とてんかん患者に見られる点変異の導入によって、2つの既知のシナプスタンパク質の細胞間相互作用がどのように影響を受けるかを調べるため、上記のHEK細胞凝集アッセイを用いた(図1)。細胞はセクション1に従ってトランスフェクトされ、プロトコルのセクション1および2に従ってイメージングのために準備された。細胞は、期待通り(図示せず)に凝集が観察されなかったベースラインで画像化された。60分で取得した画像は、プロトコルのセクション3のように分析された。選択バイアスを最小限に抑えるために、条件を無作為化して実験者を盲目にした。同様の理由から、すべての画像の視野全体がROIとして選択されました。
細胞がシナプスリガンドを発現していない条件(GFP/mCherry)は、60分間のインキュベーション後に最小限の凝集を示した(図2)。同様に、2つの集団のうち1つの細胞のみがシナプスリガンド(mCherry/LRRTM2-GFPまたはGFP/ノイレクシン3αWT/A687T SS4———mCherry)を発現していた条件は、60分インキュベーション後に最小限の凝集を示した(図2)。予想通り、非適合性接着分子を有する細胞の2つの集団を含む条件(Neurexin3αWT/A687T SS4+-mCherry/LRRTM2-GFP)は60分で凝集しなかった(図2B)。これらの条件は、LRRTM2がノイレクシンのアイソフォーム(SS4-)を欠いているSS4に排他的に結合することが知られており、この凝集アッセイの特異性を強調する重要な陰性対照として役立った。
適合接着分子8,9,10(ノイレクシン3αWT SS4--mCherry/LRRTM2-GFP)を有する条件は、60分インキュベーション後に有意な凝集を示した(図2C)。集計は黄色として視覚化でき、セル間の重なりに存在します (図 1と 図2)。驚くべきことに、ノイレクシン3α A687T SS4-がLRRTM2(ノイレクシン3αA687T SS4- --mCherry/LRRTM2-GFP)と共にインキュベートされた状態は、ワイルドタイプの対応する(Neurexin3αWT SS4-mCherry/LRRTM2 GFP;コントロール;対照;対照)と比較して有意に多くの凝集を示した。これは、ノイレクシン3αにおけるA687T点突然変異が、ノイレクシン3α SS4-対LRRTM2の結合能を増強することを示唆している。
図 1.凝集アッセイのワークフロー。(A)HEK293T細胞は、タンパク質-1/mCherry、またはタンパク質2/GFPを使用してトランスフェクトされます。(B)ノイレクシン3αの発現は48時間を要する(C)細胞は10 mM EDTAを用いて収穫され、次いでペレット化される(D)。(E)細胞は1:1の比率で混合され、10 mM CaCl2およびMgCl2を含むHEK培地の500 μLで再懸濁される。(F)細胞は、凝集が起こるまで室温でインキュベートされ、最終的な画像が'time 60'で取得されます。集計は、視野に表示される黄色のパンクタの数として視覚化されます。細胞が正しい受容体リガンドペアを発現しておらず、したがって個々の赤または緑色のパンクタとして見られる場合、凝集は認められない。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.Neurexin3αA687T SS4-はノイレクシン3αWT SS4-と比較して興奮性リガンドLRRTM2との凝集を増強した。(A)GFPによるmCherryの60分インキュベーション後の陰性コントロールの代表的な画像、LRRTM2のmCherry、ノイレクシン3αWT SS4 +-とGFP、ノイレクシン3αA687T SS4+-とGFP。凝集は、ノイレクシン3αWT SS4-を有するLRRTM2と、ノイレクシン3αA687T SS4-を有するLRRTM2の両方で60分後に観察された。(B) 60 分後の SS4+ 条件の集計インデックスの定量化。集約インデックス = オーバーラップ領域/(チャンネル1の領域 + チャンネル2の領域 - オーバーラップエリア) x 100(C) (B) と同じですが、SS4-.示されているデータは、実験数の平均±SEMを表します(SEM:GFP/mCherry ± 0.0245、mCherry/LRRTM2 ± 0.02465、 GFP/ノイレクシン3αWT SS4- ± 0.02453, GFP/ノイレクシン3αA687T SS4- ± 0.0109, ノイレクシン3αWT SS4-/LRRTM2 ± 0.0538, ノイレクシン3αA687T SS4-/LRRTM ±2 0.017= 0.014=バーに表示される数値は、実施された独立した実験の数を表します。点線は、制御条件のベースラインまたは平均最小集計を表します。統計的有意性は、一方向の分散分析、多重比較によって決定された。*p<0.05;p<0.0001.この図は Restrepo ら7から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足的なコーディング ファイル。これらのファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
細胞接着中にトランスで起こるタンパク質とタンパク質の相互作用を解剖することは、成熟およびリモデリング中のシナプスの形成、機能および維持を含む基本的な細胞プロセスの基礎となる分子メカニズムをよりよく理解することにつながる可能性がある。細胞間相互作用の意味は神経生物学を超えて広がり、シグナル伝達、細胞遊び、組織発達における広範な役割を有する14。細胞接着における収差は、適切な細胞機能のために不可欠な細胞プロセスを破壊し、癌、関節炎、中毒、自閉症および統合失調症1、15、16などの様々な病因を下で破壊することができる。ここでは、TRANSでの細胞接着相互作用のテストを可能にするHEK細胞凝集を含む最適化された詳細プロトコルを提供します。
このHEK細胞凝集プロトコルを使用すると、アグリゲーションの違いを解剖して、シナプス前タンパク質とその心内リガンドとの結合能を概算することができます。したがって、ポイント突然変異の影響を受ける2つの本質的なシナプスタンパク質間の相互作用は次のような質問をすることができます。具体的には、ノイレクシン3αとLRRTM2のトランス相互作用はA687Tの影響を受けていますか?ここで研究したA687Tミスセンス変異は、Neurexin3α7の細胞外ドメインの未研究のリンカー領域に位置する。結果は、A687T突然変異が、LRRTM2を含む細胞に対してNeurexin3αA687Tを含む細胞の凝集を増強することを示す(図2C)。この知見は、LRRTMがLNS617と呼ばれるノイレクシンドメインを介してノイレクシンに結合するだけであることを以前に示されたため重要であり、さらにLNS6の上流の配列がNeurexin3α SS4-およびLRRTM27間のトランス相互作用に対して独立した効果を発揮できることを示唆している。
図2の結果は、このアッセイの特異性を全ての陰性制御(GFP/mCherry;;ノイレクシン3αWT/A687T SS4- --mCherry/GFPまたはLRRTM-GFP/mCherry)は60分後に観測可能な凝集を持っていなかった。本研究で使用された重要なコントロールであるNeurexin3αWT/A687T SS4+ -mCherry/LRRTM-GFPは、LRRTM2がノイレクシンの(SS4-アイソフォーム)を欠いているSS4のみに結合することが知られているため、60分後に凝集を示さなかった。この制御は、膜結合分子の単純な過剰発現が、この系における凝集を強制するのに不十分であることを示し、これはさらにこのアッセイの特異性を示す。
ここで説明する細胞接着アッセイは、シナプス細胞接着分子8、18、19の相互作用をテストするために広く使用されてきた。しかし、膜につながれたタンパク質の接着細胞間相互作用をテストするために使用され得る。このプロトコルは、時間の経過とともに進化し、3つの実験パラメータを変更することで、元の公開プロトコルとその後のプロトコルのバリエーションから最適化されました。一つは、細胞のインキュベーション温度が変化した。元のプロトコルは、4°Cでステップ1.9の細胞のインキュベーションを必要とします。 この低温は環境ストレスとして作用し、細胞死およびリシスにつながる細胞の生存率を低下させることができる。細胞溶解中、細胞はゲノムDNAと細胞の破片を培地に分泌し、イメージング中に細胞が溶液中に集まり、偽陽性につながる。2つは、1つの条件の細胞数が人口あたり20万個に増加し、客観的なサイズは5倍に変更された。これにより、研究者は、各n内の統計的パワーを増加させるために、視野当たりの相互作用の数を増やすことができます。3つは、集計インデックスを異なる方法で測定した。以前の集計インデックスは、実験者によるクラスターサイズの選択によって制限され、「サブしきい値」クラスターの除外につながった。対照的に、閾値は「時間ゼロ」の個々の細胞サイズに設定され、凝集は2つのチャネル領域からオーバーラップ領域の合計を「時間60」で100倍にして割って計算され、より小さな陽性クラスターを含めることが可能になり、アッセイは他のタンパクリガンド対に対してより敏感になります(図2B,C)。
テストした相互作用タンパク質によっては、トラブルシューティングと最適化が必要な場合があります。最終的な画像取得までの潜伏期間は、試験したタンパク質によって異なりますが、「時間ゼロ」で凝集が見られないことが重要です。集約が 0 の時点で見られる場合、そもそも細胞が正常でないことを意味する可能性があります。これは、37°C以下の温度への突然の暴露または遅い実験手順を含むいくつかの要因に起因する可能性があります。重要なことに、ステップ1.7の再懸濁培地は37°Cで、細胞が急激に温度を下げることなく徐々に室温に達することを可能にする。実験全体を通して最適な細胞の健康を得る1つの方法は、ステップ1.7から1.9までの間に中断のない25分の時間枠内で完了することを保証することです。顕微鏡は、ステップ1.5で細胞を収穫する前に、設定し、使用する準備ができていることをお勧めします。これにより、ステップ 2.2 で真の 「時間ゼロ」イメージをすぐに取得できます。
60分間のインキュベーション後に凝集が認められない場合、この接着性の欠如にはいくつかの要因が寄与している可能性がある。第1に、問題のタンパク質は結合パートナーではないか、またはこのアッセイでは検出できない低親和性相互作用に従事し得る。この場合、より敏感なアッセイが必要になる場合がある。 第二に、目的のタンパク質は、HEK細胞で単独で発現した場合、膜に局部化されない可能性がある。この場合、タンパク質が生化学的手法(表面バイオチン化)を用いて膜局在していることを確認するか、40倍以上の倍率で目的タンパク質を蛍光タグと画像HEK293T細胞に直接タグ付けして表面発現を評価する。しかし、膜局在化が確認された後、天然タンパク質の結合能をより正確に評価するために、このHEK細胞凝集アッセイにタグなしの変異体を使用することをお勧めします。第三に、このプロトコルでは、Neurexin3αを48時間表現することを許可しました。しかし、タンパク質発現時間は、試験したタンパク質によって異なる場合があります。第4に、問題のタンパク質がNeurexinsおよびLRRTM211の例と同様に二価カチオンに依存している場合、MgCl2およびCaCl2でステップ1.7の培地を補うことは重要である。相互作用パートナーが接着のために二価カチオンを必要とするかどうか不明な場合は、EDTAを1つの条件に追加します。EDTAは、カルシウムおよびマグネシウムフリー溶液を確保するDMEMに自然に存在するリマイニングカチズをキレートする必要があります。EDTA添加後に接着が観察された場合、問題のタンパク質は接着のために二価カチオンを必要としません。
タンパク質相互作用をテストする方法は数多く存在します。しかし、ほとんどは細胞から細胞へ起こり、退屈なタンパク質精製ステップを必要とするトランス相互作用のみをテストするためのものではありません。HEK細胞凝集アッセイはアフィニティの直接的な尺度ではなく、解離定数を回復するためのより定量的なアプローチを置き換えるために使用されるべきではありませんが、このアッセイは、半定量的かつ比較的効率的な方法で真のトランス相互作用をテストするアプローチを表しています。さらに、このアッセイの比較的容易性のために、HEK細胞凝集アッセイは、これらのより定量的なアプローチと組み合わせて使用して、起こっている相互作用のより広範かつ完全な特徴付けを得ることができる。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、国立精神衛生研究所(R00MH103531およびR01MH116901からJ.A.への)、国立一般医学研究所(T32GM007635からS.R.への)の博士後期研修グラント、およびリダヒルギリアム高等研究フェローシップ(GT11021からS.R.)によって支えられました。ケビン・ウールフリー博士の顕微鏡の助け、Kウルリッヒ・バイエル博士の蛍光顕微鏡の使用、LRRTM2プラスミドのトーマス・スードホフ(スタンフォード大学)に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL disposable microtubes with snap caps | VWR | 89000-028 | Incubation of mixed population of HEK cells |
| 1000 mL Rapid—Flow Filter Unit, 0.2 um aPES membrane | Thermo Fisher | 567-0020 | Sterilization of HEK media |
| 15 mL SpectraTube centrifuge tubes | Ward’s Science | 470224-998 | Harvesting HEK cells |
| 6 well sterile tissue culture plates | VWR | 100062-892 | culturing HEK cells |
| Calcium Chloride | Sigma | 223506-500G | Calcium phosphate transfection, HEK cell resuspension |
| Centrifuge- Sorvall Legend RT | Kendro Laboratory Products | 75004377 | Harvesting HEK cells |
| CO2 cell incubator | Thermo Scientific | HERACELL 150i | Incubation of HEK cells during growth |
| DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | HEK cell maintenance |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline PBS (1X) | Gibco | 14190-144 | Passaging/harvesting HEK cell |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | ED-500G | Harvesting HEK cells |
| Falcon Vented culture flasks, 75cm2 growth area | Corning | 9381M26 | Culturing HEK cells |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 17L184 | HEK cell maintenance |
| HEK293T cells | ATCC | Model system | |
| ImageJ | NIH | V: 2.0.0-rc-69/1.52p | Image analysis |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma | M9272-500G | HEK cell resuspension |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Fisher BioReagents | BP332-500 | Calcium phosphate transfection |
| Trypsin 0.25% (1X) Solution | GE Healthcare Life Sciences | SH30042.01 | Passaging HEK cells |
| Tube rotator | Incubation of mixed population of HEK cells | ||
| UltraClear Microscope slides. White Frosted, Positive Charged | Denville Scientific Inc. | M1021 | Image acquisition |
| Wide-field microscope | Zeiss | Axio Vert 200M | Image acquisition |
References
- Südhof, T. C. Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease. Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).
- Lakey, J. H., Raggett, E. M. Measuring protein-protein interactions. Current Opinion in Structural Biology. 8 (1), 119-123 (1998).
- Aoto, J., Martinelli, D. C., Malenka, R. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. Presynaptic neurexin-3 alternative splicing trans-synaptically controls postsynaptic AMPA receptor trafficking. Cell. 154 (1), 75-88 (2013).
- Aoto, J., Földy, C., Ilcus, S. M. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. Distinct circuit-dependent functions of presynaptic neurexin-3 at GABAergic and glutamatergic synapses. Nature Neuroscience. 18 (7), 997-1007 (2015).
- Südhof, T. C. Synaptic Neurexin Complexes: A Molecular Code for the Logic of Neural Circuits. Cell. 171 (4), 745-769 (2017).
- Dai, J., Aoto, J., Südhof, T. C. Alternative Splicing of Presynaptic Neurexins Differentially Controls Postsynaptic NMDA and AMPA Receptor Responses. Neuron. 102 (5), 993-1008 (2019).
- Restrepo, S., Langer, N. J., Nelson, K. A., Aoto, J. Modeling a Neurexin-3α Human Mutation in Mouse Neurons Identifies a Novel Role in the Regulation of Transsynaptic Signaling and Neurotransmitter Release at Excitatory Synapses. The Journal of Neuroscience. 39 (46), 9065-9082 (2019).
- Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., Südhof, T. C. LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).
- de Wit, J., et al. LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).
- Linhoff, M. W., et al. An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers. Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).
- Siddiqui, T. J., Pancaroglu, R., Kang, Y., Rooyakkers, A., Craig, A. M. LRRTMs and Neuroligins Bind Neurexins with a Differential Code to Cooperate in Glutamate Synapse Development. Journal of Neuroscience. 30 (22), 7495-7506 (2010).
- Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Bacchetti, S., Graham, F. L. Transfer of the gene for thymidine kinase to thymidine kinase-deficient human cells by purified herpes simplex viral DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (4), 1590-1594 (1977).
- Cerchiari, A. E., et al. A strategy for tissue self-organization that is robust to cellular heterogeneity and plasticity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), 2287-2292 (2015).
- Burdick, M. M., McCarty, O. J. T., Jadhav, S., Konstantopoulos, K. Cell-cell interactions in inflammation and cancer metastasis. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 20 (3), 86-91 (2001).
- Fox, D. A., Gizinski, A., Morgan, R., Lundy, S. K. Cell-cell interactions in rheumatoid arthritis synovium. Rheumatic Diseases Clinics of North America. 36 (2), 311-323 (2010).
- Yamagata, A., et al. Structural insights into modulation and selectivity of transsynaptic neurexin-LRRTM interaction. Nature Communications. 9 (1), 3964 (2018).
- Nguyen, T., Südhof, T. C. Binding properties of neuroligin 1 and neurexin 1beta reveal function as heterophilic cell adhesion molecules. The Journal of Biological Chemistry. 272 (41), 26032-26039 (1997).
- Boucard, A. A., Ko, J., Südhof, T. C. High Affinity Neurexin Binding to Cell Adhesion G-protein-coupled Receptor CIRL1/Latrophilin-1 Produces an Intercellular Adhesion Complex. Journal of Biological Chemistry. 287 (12), 9399-9413 (2012).
