Summary
Här presenterar vi ett optimerat protokoll för att snabbt och semiquantitativt mäta ligandreceptorinteraktioner i trans i ett heterologt cellsystem med fluorescensmikroskopi.
Abstract
Proteininteraktioner vid cellulära gränssnitt dikterar en mängd biologiska resultat som sträcker sig från vävnadsutveckling och cancerprogression till synapsbildning och underhåll. Många av dessa grundläggande interaktioner förekommer i trans och induceras vanligtvis av heterofila eller homofila interaktioner mellan celler som uttrycker membranankare bindande par. Att belysa hur sjukdomsrelevanta mutationer stör dessa grundläggande proteininteraktioner kan ge insikt i en myriad av cellbiologiska fält. Många protein-protein interaktion analyser är vanligtvis inte disambiguate mellan CIS och trans interaktioner, vilket potentiellt leder till en överskattning av omfattningen av bindning som förekommer in vivo och innebär arbetsintensiv rening av protein och/eller specialiserad övervakningsutrustning. Här presenterar vi ett optimerat enkelt protokoll som möjliggör observation och kvantifiering av endast transinteraktioner utan behov av långa proteinreningar eller specialiserad utrustning. HEK-cellaggregationsanalysen innebär blandning av två oberoende populationer av HEK-celler, som var och en uttrycker membranbundna konjaksligands. Efter en kort inkubationsperiod avbildas proverna och de resulterande aggregaten kvantifieras.
Introduction
Synaptiska interaktioner som underlättas av synaptiska vidhäftningsmolekyler är grundläggande för utveckling, organisation, specifikation, underhåll och funktion av synapser och generering av neurala nätverk. Identifieringen av dessa transsynaptiska cell vidhäftningsmolekyler ökar snabbt; Därför är det fundamentalt viktigt att identifiera bindande partners och förstå hur dessa nya vidhäftningsmolekyler interagerar med varandra. Dessutom har genomsekvensering identifierat mutationer i många av dessa vidhäftningsmolekyler som ofta är kopplade till en mängd neurodevelopmental, neuropsykiatriska och beroendestörningar1. Mutationer i gener som kodar för synaptiska cell-vidhäftningsmolekyler kan skadligt förändra transinteraktioner och kan bidra till patofysiologiska förändringar i synapsbildning och eller underhåll.
Det finns flera analyser för att kvantitativt bedöma proteinproteininteraktioner som isotermisk kalorimetri, cirkulär diktroism, ytplasmonresonans2 och även om de är kvantitativa till sin natur har de flera begränsningar. För det första kräver de rekombinant protein, ibland kräver långa och tråkiga reningssteg. För det andra kräver de sofistikerad specialiserad utrustning och teknisk expertis. För det tredje kan de överskatta omfattningen av bindningen eftersom de möjliggör både cis och transinteraktioner mellan proteiner som naturligt är bundna till ett membran in vivo. Här föreslår vi en enkel och relativt snabb analys som uteslutande testar transinteraktioner.
För att kringgå många av de komplikationer som är förknippade med renade proteinanalyser har vi optimerat en cellbaserad proteininteraktionsanalys som rekapitulerar transinteraktioner i ett reducerat heterologt cellsystem. Denna analys har tidigare använts i olika former för att studera transcellulära interaktioner. I detta tillvägagångssätt transfecteras kandidatcells vidhäftningsmolekyler till HEK293T-celler. Vid fysiologiska förhållanden uppvisar HEK293T-celler inte självaggregering, vilket gör dem exemplariska modeller för denna analys. Men när enskilda populationer av HEK-celler som uttrycker receptor och ligand kombineras, tvingar bindningen av receptorn och ligand aggregering av HEK-celler att uppstå. Denna aggregering förmedlas uteslutande av transinteraktioner och kan vanligtvis observeras på tiotals minuter. Inga proteinreningssteg krävs i denna metod, och metodens effektivitet bygger på paradigmet att populationer av HEK-celler som uttrycker konjaks vidhäftningsmolekyler kombineras och sedan avbildas bara tiotals minuter senare. Dessutom är denna metod relativt billig, eftersom varken antikroppar eller dyr utrustning krävs. Den enda utrustning som krävs för att insamlar data är ett standard fluorescerande mikroskop. En ytterligare fördel med denna cellbaserade analys är förmågan att snabbt screena effekten av sjukdomsrelevanta punktmutationer på transinteraktioner. Detta kan utföras genom att transfectera HEK-celler med cDNAs av mutantvarianterna av proteinet av intresse.
I detta protokoll presenterar vi ett exempel där vi undersöker om en missense mutation i Neurexin3α (Neurexin3αA687T),identifieras hos en patient diagnostiseras med djupgående intellektuell funktionsnedsättning och epilepsi, förändrar interaktioner i trans med leucin-rika upprepa transmembran protein 2 (LRRTM2). Neurexin3α är en medlem av den evolutionärt bevarade familjen av presynaptiska cell-vidhäftningsmolekyler och medan det senaste arbetet har identifierat flera roller vid synapsen 3,4,5,6,7, är vår synaptiska förståelse av dennamolekyloch alla medlemmar av neurexinfamiljen fortfarande ofullständig. LRRTM2 är ett excitatoriskt postsynaptiskt cell vidhäftningsprotein som deltar i synapsbildning och underhåll8,9,10. Viktigt är att LRRTM2 uteslutande interagerar med neurexinisoformer som saknar skarvstället 4 alternativ exon (SS4-) men inte med neurexinisoformer som innehåller skarvstället 4 alternativ exon (SS4+). Den mänskliga missense mutationen (A687T) identifieras i Neurexin3α ligger i en ostudied extracellulär region som är evolutionärt bevarad och bevaras mellan alla alfa neurexiner7. Eftersom interaktionen mellan dessa två molekyler har fastställts8,9,11, ställde vi frågan: är bindningsförmågan hos Neurexin3α SS4- till LRRTM2 förändrad av en A687T punktmutation? Denna analys visade att A687T punkt mutation oväntat förbättrat aggregering av Neurexin3α till LRRTM2 tyder på att regionen extracellulära där punkt mutationen ligger, spelar en roll i medla transsynaptic interaktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellkultur och transfection
- Gör HEK-cellmedia med DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) kompletterat med 4,5 g/L glukos, L-glutamin & natrium pyruvat och 10% FBS. Sterilt filter.
- Förutbestämda lämpliga ligands och receptorer för aggregeringsanalys.
OBS: Neurexin3α SS4+/- och en av dess kända ligands, LRRTM2, användes i denna studie. Ligands och receptorer av intresse uttrycktes från cDNAs i pcDNA3.1. En Gibson montering användes för att sätta in Neurexin3α i pcDNA3.112. Neurexin3α F/R: TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCCCACCATGAGCTTTACCCTCCACTC/
GAGCGGCCGCCACTGTGCTGGATATCTGCAGAATTCTTACACATAATACTCCTTGTCCTT. - Förbered HEK293T-celler.
- Odla HEK293T-celler till confluency i en T-75-kolv.
- När du har konfluent, använd 2 ml trypsin och placera i 37 °C inkubator i 2 min. Tillsätt 6 ml HEK-media till kolven för att återanvända celler och överför alla 8 ml till ett koniskt rör på 15 ml.
- Pellet vid 500 x g i 5 min och återanvänds i HEK-cellmedia för totalt 8 ml.
- Räkna celler och tillsätt 735 000 celler i varje brunn på en 6-brunnsplatta. Justera den slutliga volymen till 2 ml för varje brunn med HEK-cellmedia.
- Placera i 37 °C inkubator och låt cellerna växa över natten eller tills de når 50-60% sammanflöde.
- Transfekta HEK293T-celler med kalciumfosfatmetod13.
- Transfektera brunn-1 med 3 μg av proteinet av intresse och samtransfekt med 1 μg fluorescerande protein (3 μg pcDNA3.1-Neurexin3αWT SS4- och 1 μg mCherry).
- Transfect well-2 som i steg 1.4.1. men med det muterade proteinet av intresse (pcDNA3.1-Neurexin3αA687T SS4-).
- Transfekt väl-3 med 3 μg av ligand av intresse och co-transfect med 1 μg av ett annat fluorescerande protein (3 μg pcDNA3.1 LRRTM2 och 1 μg GFP).
- Transfect well-4 och well-5 för att fungera som negativa kontroller: well-4 med 1 μg GFP och well-5 med 1 μg mCherry.
- Förbered en annan platta (som i steg 1.4.1-1.4.4) om det krävs ytterligare villkor eller kontroller (Neurexin3αWT/A687T SS4+).
OBS: Transfection effektivitet analyseras 24 h efter transfection under ett epifluorescens mikroskop och kvantifieras som antalet celler som uttrycker fluorescerande protein de var transfected med. Ett mer strömlinjeformat tillvägagångssätt skulle omfatta transfection av HEK-celler med en bicistronisk vektorkodning för ett fluorescerande protein och ligand av intresse och rekommenderas starkt över samtransfektion. När det gäller denna studie är alfa Neurexins ~4,3 kb och låg fluorescens intensitet observerades med hjälp av ett bicistronic system som kräver samtransfection.
- 48 timmar efter transfektion, skörda celler för aggregering.
- Tvätta varje brunn två gånger med PBS.
- Tillsätt 1 ml 10 mM EDTA i PBS i varje brunn för att försiktigt skilja mellan cell-till-cell-interaktioner och inkubera plattan vid 37 °C i 5 minuter.
OBS: Trypsin rekommenderas inte för steg 1. 5. 2 på grund av potentiell proteolytisk klyvning av vidhäftningsmolekyler i studien. Dessutom, efter EDTA-tillägg protokollet får inte stoppas förrän slutförandet eftersom celler nu kommer att utsättas för omgivningsförhållanden. - Knacka försiktigt på plattan för att lossa cellerna och skörda varje brunn i separata 15 ml koniska rör.
- Centrifugkoniska rör vid 500 x g och rumstemperatur i 5 min.
- Medan celler pelletar, förbered 6 inkubationsrör genom att märka toppen av varje mikrocentrifugrör med varje tillstånd.
OBS: Varje permutation av GFP- och mCherry-förhållanden bör användas för att omfatta alla experimentella tillstånd och korrekta kontroller. Till exempel: 1. GFP/mCherry, 2. mCherry/LRRTM2-GFP 3. GFP/Neurexin3αWT SS4-—mCherry, 4. GFP/Neurexin3αA687T SS4- –mCherry, 5. Neurexin3αWT SS4-—mCherry/LRRTM2–GFP, 6. Neurexin3αA687T SS4- –mCherry/LRRTM2–GFP. Gör ytterligare rör för att tillgodose ytterligare förhållanden och kontroller. - Ta bort de supernata och återanvända cellerna i 500 μL HEK-media med 10 mM CaCl2 och 10 mM MgCl2 värmd till 37 °C.
OBS: Tillsats av CaCl2 och MgCl2 gör det möjligt för vidhäftningsmolekyler att återupprätta bindningen och krävs endast om de transcellulära interaktionspartnerna i fråga kräver divalent cations för vidhäftning. - Räkna cellerna i varje koniskt rör på 15 ml med hjälp av en hemocytometer och alikvot 200 000 celler i varje tillstånd till lämpligt rör från steg 1.6.1 för en 1:1-blandning i en total volym på 500 μL.
OBS: Det bör bara ta 5 min per villkor att räkna och alikvotbelopp. - Inkubera rör vid rumstemperatur i en långsam rörrotator.
2. Bildförvärv
- Optimera parametrar för mikroskopförvärv för specifika prover. I det här exemplet togs bilder på ett mikroskop med brett fält. Använd ett 5x luftmål (NA: 0,15; WD: 20000 μm) för att få ett tillräckligt stort fält för analys.
- Utvärdera baslinjeaggregering omedelbart efter blandning av de två villkoren för HEK-celler i steg 1, 8. Det här är nu "time zero"-bilderna.
- Pipett 40 μL av varje provblandning på en laddad mikroskopbild och bild under fluorescens i både 488- och 561-kanalerna.
- Skaffa tre olika synfält med ett fokusplan per provfall.
- Skaffa slutliga bilder på 60 min som "tid 60"-bilden.
- För att få bilden "tid 60" av blandningen efter en inkubation på 60 minuter, ta ytterligare 40 μL prov av varje villkor från roterande rör och pipett varje prov på en laddad bild. Bild som i steg 2.2.2.
OBS: Cellaggregering ska kontrolleras var 15:e minut tills mättnad sker. Tidpunkten för aggregering beror på de proteiner som testas.
- För att få bilden "tid 60" av blandningen efter en inkubation på 60 minuter, ta ytterligare 40 μL prov av varje villkor från roterande rör och pipett varje prov på en laddad bild. Bild som i steg 2.2.2.
3. ImageJ/Fiji Analys
- För att kvantifiera omfattningen av aggregering med Fiji / ImageJ, spara analysfiler.
- Spara de medföljande kompletterande kodningsfilerna i makromappen imageJ på datorn.
- Installera aggregeringsmakroet (plugins, makron, installera och välj filen "Aggregeringassay.txt" ).
- Bestäm tröskelvärden.
- Läs in en "time zero.tif-fil i imageJ och dela kanalerna (Bild | Färg | Delade kanaler).
OBS: Bilden "time zero" används för att bestämma tröskelvärdet och minsta punktlighetsstorlek för hela experimentet. - Maskera varje kanal (Plugins | Makron | AggregationAssay_MakeMask). Fönstret Gör mask från bild visas. Markera rutorna bredvid Bestäm tröskelvärde för bild och Bestäm klusterparem från histogrammet och klicka på OK.
- Bestäm bildens tröskelvärde med hjälp av bildfältet, spela in numret till höger om bildfältet och klicka på OK.
- Ett histogram med klusterstorlek visas. Välj en klusterstorlek i det histogram som passar experimentet, skriv det här numret i rutan Minsta klusterstorlek: och klicka på OK. Kluster under den här storleken kommer inte att analyseras.
- Läs in en "time zero.tif-fil i imageJ och dela kanalerna (Bild | Färg | Delade kanaler).
- Kör analysen.
- Öppna bilden "tid 60" av villkor 1 i bildJ och dela kanalerna enligt steg 3.2.1.
- Maskera varje kanal (plugins, makron, AggregationAssay_MakeMask). Använd samma tröskelvärde och storlek som bestäms i steg 3.2.3 och steg 3.2.4. Avmarkera rutorna bredvid Bestäm tröskelvärde för bild och Bestäm klusterparem från Histogram och skriv manuellt storlek och tröskelvärden i lämpliga fält och klicka sedan på OK.
- Beräkna aggregeringsindexet (Plugins | Makron | AggregationAssay_CalculateOverlap). Välj de maskerade kanaler som ska jämföras och katalogen som de resulterande filerna ska sparas i.
- Upprepa steg 3.3.1–3.3.3 för varje "tid 60"-bild i alla förhållanden.
OBS: Aggregeringsindex definieras som det totala överlappningsområdet dividerat med summan av de två kanalområdena minus överlappningsområdet multiplicerat med 100 (Aggregeringsindex = överlappningsområde/[kanalområde 1 + kanalområde 2 – överlappande område] x 100). Normaliseringen är en "ELLER"-åtgärd mellan de två maskerade kanalerna som representerar de totala pixlarna i endera masken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A687T mutationen ökar Neurexin3α SS4- bindning till LRRTM27
För att undersöka hur intercellulära interaktioner av två kända synaptiska proteiner påverkas av införandet av en punktmutation som finns hos en patient med intellektuell funktionsnedsättning och epilepsi, använde vi ovanstående HEK-cellaggregeringsanalys (Figur 1). Cellerna transfekterades enligt avsnitt 1 och förbereddes för avbildning enligt avsnitten 1 och 2 i protokollet. Cellerna avbildades vid baslinjen där ingen aggregering observerades som förväntat (visas inte). Bilder som förvärvats vid 60 minuter analyserades som i avsnitt 3 i protokollet. För att minimera urvalsbias randomiserades villkoren för att förblinda experimenteraren. Av liknande skäl valdes hela synfältet för varje bild som en ROI.
Förhållanden där celler inte uttryckte några synaptiska ligands (GFP/mCherry) visade minimal aggregering efter en 60-minuters inkubation (figur 2). På samma sätt uppvisade förhållanden under vilka endast en av de två populationerna av celler uttryckte synaptiska ligands (mCherry/LRRTM2-GFP eller GFP/Neurexin3αWT/A687T SS4- – mCherry) minimal aggregering efter en inkubation på 60 minuter (figur 2). Som förväntat uppvisade förhållanden som innehöll två populationer av celler med inkompatibla vidhäftningsmolekyler (Neurexin3αWT/A687T SS4+—mCherry/LRRTM2-GFP) ingen aggregering vid 60 minuter (figur 2B). Dessa villkor fungerade som kritiska negativa kontroller som LRRTM2 är känd för att binda uteslutande till SS4 saknar isoformer (SS4-) av Neurexins och belyser specificiteten i denna aggregeringsanalys.
Villkor med kompatibla vidhäftningsmolekyler8,9,10 (Neurexin3αWT SS4- –mCherry/LRRTM2-GFP) uppvisade betydande aggregering efter en inkubation på 60 minuter ( figur2C). Aggregering kan visualiseras som gul och finns i överlappningen mellan celler (figur 1 och figur 2). Förvånansvärt nog, Villkoret där Neurexin3α A687T SS4- var saminkuberat med LRRTM2 (Neurexin3αA687T SS4- –mCherry/LRRTM2-GFP) uppvisade betydligt mer aggregering jämfört med dess motsvarighet till vilda typer (Neurexin3αWT SS4- —mCherry/LRRTM2-GFP; Detta tyder på att A687T-punktmutationen i Neurexin3α förbättrar bindningsförmågan hos Neurexin3α SS4- till LRRTM2.
Figur 1. Arbetsflöde för aggregeringsanalys. A)HEK293T-celler transfekteras med ett protein-1/mCherry, eller ett protein-2/GFP. B)Uttrycket neurexin3α tar 48 timmar. (C) Celler skördas med 10 mM EDTA och sedan pelleteras (D). (E) Cellerna blandas i ett 1:1-förhållande och återanvänds i 500 μL HEK-medium som innehåller 10 mM CaCl2 och MgCl2. (F) Cellerna inkuberas i rumstemperatur tills aggregering sker och en slutlig bild förvärvas vid "tid 60". Aggregering visualiseras som antalet gula puncta synliga i synfältet. Ingen aggregering observeras när celler inte uttrycker rätt receptor ligand par och därmed ses som individuell röd eller grön puncta. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2. Neurexin3αA687T SS4- har förbättrat aggregeringen med excitatoriska ligand LRRTM2 jämfört med Neurexin3αWT SS4-. (A) Representativa bilder av negativa kontroller efter en inkubation på 60 minuter av mCherry med GFP, mCherry med LRRTM2, GFP med Neurexin3αWT SS4+/-, och GFP med Neurexin3αA687T SS4+/-. Aggregering observerades efter 60 minuter i både LRRTM2 med Neurexin3αWT SS4- och LRRTM2 med Neurexin3αA687T SS4-. B)Kvantifiering av aggregeringsindexet under alla SS4+-förhållanden efter 60 minuter. Aggregeringsindex = överlappningsområde/(kanalområde 1 + kanalområde 2 – överlappande område) x 100. C)Samma somB,men SS4-. Data som visas representerar medelvärdet ± SEM för antalet experiment (SEM: GFP/mCherry ± 0,0245, mCherry/LRRTM2 ± 0,02465, GFP/Neurexin3αWT SS4- ± 0,02453, GFP/Neurexin3αA687T SS4- ± 0,0109, Neurexin3αWT SS4-/LRRTM2 ± 0,0538, Neurexin3αA687T SS4-/LRRTM2 ± 0,0174; p= 0,0136). Siffror som presenteras i staplar representerar antalet oberoende experiment som utförs. Prickade linjer representerar baslinje eller genomsnittlig minimal aggregering av kontrollförhållanden. Statistisk signifikans bestämdes av enkelvägs ANOVA, flera jämförelser; *p<0,05; p<0.0001.Denna siffra har ändrats från Restrepo et al.7. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Kompletterande kodningsfiler. Klicka här för att ladda ner dessa filer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dissekering av de proteinproteininteraktioner som förekommer i trans under cellens vidhäftning kan leda till en bättre förståelse för de molekylära mekanismer som ligger till grund för grundläggande cellulära processer, inklusive bildandet, funktionen och underhållet av synapser under mognad och ombyggnad. Konsekvenserna av cell-till-cell interaktioner expanderar bortom neurobiologi och har bredare roller i signaltransduktion, cellmigration och vävnadsutveckling14. Avvikelser i cell vidhäftning kan störa cellulära processer som är absolut nödvändiga för korrekt cellfunktion och kan under en mängd etiologier som cancer, artrit, missbruk, autism och schizofreni1,15,16. Här tillhandahåller vi ett optimerat detaljerat protokoll som involverar HEK-cellaggregering som gör det möjligt att testa cell-vidhäftningsinteraktioner i trans.
Med detta HEK-cellaggregeringsprotokoll kan vi dissekera skillnader i aggregering till ungefärlig bindningsförmåga mellan ett presynaptiskt protein och dess postsynaptiska ligand. Som sådan kan vi ställa frågor som: påverkas interaktionen mellan två viktiga synaptiska proteiner av en punktmutation? Mer specifikt, påverkas transinteraktionen av Neurexin3α med LRRTM2 av A687T? A687T missense mutationen som studeras här ligger i en tidigare ostudied linker region i den extracellulära domänen Neurexin3α7. Resultaten visar att A687T mutationen förbättrar aggregeringen av celler som innehåller Neurexin3αA687T till celler som innehåller LRRTM2 (Figur 2C). Detta konstaterande är betydelsefullt eftersom det tidigare visats att LRRTMs endast binder till Neurexins via en Neurexin-domän som kallas LNS617, och föreslår vidare att sekvenser uppströms LNS6 kan utöva en oberoende effekt på transinteraktionerna mellan Neurexin3α SS4- och LRRTM27.
Resultaten i figur 2 uppvisar specificiteten hos denna analys som alla negativa kontroller (GFP/mCherry; Neurexin3αWT/A687T SS4- –mCherry/GFP eller LRRTM-GFP/mCherry) hade ingen observerbar aggregering efter 60 minuter. En kritisk kontroll som används i denna studie, Neurexin3αWT/A687T SS4+ — mCherry/LRRTM-GFP, uppvisade också ingen aggregering efter 60 min eftersom LRRTM2 är känt för att binda uteslutande till SS4 saknas (SS4-) isoformer av Neurexin. Denna kontroll visar att enkel överuttryck av membranbundna molekyler är otillräckligt för att tvinga aggregering i detta system, vilket ytterligare illustrerar specificiteten i denna analys.
Cellens vidhäftningsanalys som beskrivs här har använts i stor utsträckning för att testa interaktionerna mellan transsynaptiska cell-vidhäftningsmolekyler8,18,19; Det kan dock användas för att testa självhäftande cell-till-cell-interaktioner av membran tjudrade proteiner. Detta protokoll, som har utvecklats med tiden, optimerades från det ursprungliga publicerade protokollet och efterföljande variationer av protokollet genom att ändra tre experimentella parametrar. För det första ändrades inkubationstemperaturen för cellerna. Det ursprungliga protokollet kräver inkubation av celler i steg 1.9 vid 4 °C. Denna låga temperatur kan fungera som en miljöstressor och kan minska cellens livskraft som leder till celldöd och lys. Under celllys utsöndrar cellerna genomiskt DNA och cellskräp i media som får celler att klumpa ihop sig i lösning vilket leder till falska positiva effekter under avbildning. För det andra ökade antalet celler per tillstånd till 200 000 per population och målstorleken ändrades till en 5x; Detta gör det möjligt för forskaren att avbilda ett större antal interaktioner per synfält för att öka den statistiska kraften inom varje n. För det tredje mättes aggregeringsindexet annorlunda. Tidigare aggregeringsindex begränsades av experimentörens val av klusterstorlek, vilket ledde till att "subthreshold"-kluster utesluts. Däremot fastställs nu tröskelvärden för individuell cellstorlek vid "tid noll", och aggregeringen beräknas nu som det överlappande området dividerat med summan av de två kanalområdena minus överlappningsområdet multiplicerat med 100 vid "tidpunkt 60" vilket gör det möjligt att inkludera mindre positiva kluster som gör analysen mer känslig för andra protein-ligand-par (figur 2B,C).
Felsökning och optimering kan behövas beroende på vilka interagerande proteiner som testas. Även om inkubationsperioden fram till det slutliga bildförvärvet kommer att variera beroende på de testade proteinerna, är det viktigt att ingen aggregering observeras vid "tid noll". Om aggregering ses vid tidpunkten noll kan det innebära att cellerna inte var friska till att börja med. Detta kan bero på flera faktorer, inklusive plötslig exponering för temperaturer under 37 °C eller långsamt experimentellt förfarande. Viktigt är att återsuspensionsmedierna för steg 1,7 bör ligga på 37 °C, vilket gör att cellerna gradvis kan nå rumstemperatur utan en plötslig hård temperatursänkning. Ett sätt att ha optimal cellhälsa under hela experimentet är att se till att steg 1,7 till 1,9 slutförs inom en tidsram på 25 minuter utan avbrott däremellan. Det rekommenderas att mikroskopet är informat och redo att användas före cellskördsceller i steg 1.5. Detta säkerställer att en sann "time zero"-bild kan tas omedelbart i steg 2.2.
Om aggregering inte observeras efter 60 minuters inkubation kan flera faktorer bidra till denna brist på vidhäftning. För det första kan proteinerna i fråga inte vara bindande partner eller delta i interaktioner med låg affinitet som inte kan upptäckas genom denna analys. I detta fall kan en känsligare analys krävas. För det andra får proteinet/proteinet av intresse inte lokaliseras till membranet när det uttrycks ensamt i HEK-celler. I detta fall, bekräfta att proteinet är membran lokaliserat med hjälp av biokemiska tekniker (ytbiotinylering) eller direkt märka proteinet av intresse med en fluorescerande tagg och bild HEK293T celler vid 40x eller högre förstoring för att bedöma ytuttryck. Efter membranlokalisering bekräftas rekommenderar vi dock att du använder ouppföljda varianter för denna HEK-cellaggregeringsanalys för att mer exakt bedöma bindningskapaciteten hos det inhemska proteinet. För det tredje, i detta protokoll tillät vi Neurexin3α att uttrycka för 48 h; Proteinuttryckstiden kan dock variera beroende på vilka proteiner som testas. För det fjärde är det viktigt att komplettera medierna i steg 1.7 med MgCl2 och CaCl2 om proteinerna i fråga är beroende av divalent cations som är fallet med exemplet neurexiner och LRRTM211. Om det är okänt om interaktionspartnerna kräver divalent cations för vidhäftning, lägg till EDTA i ett villkor. EDTA bör chelate remining cations naturligt närvarande i DMEM säkerställa en kalcium- och magnesiumfri lösning. Om vidhäftning observeras efter EDTA-tillsats kräver proteinerna i fråga inte divalent cations för vidhäftning.
Det finns många metoder för att testa proteininteraktioner; De flesta är dock inte specifika för att testa endast transinteraktioner som uppstår från cell till cell och kräver tråkiga proteinreningssteg. Även om HEK-cellaggregationsanalysen inte är ett direkt mått på affinitet och inte bör användas för att ersätta ett mer kvantitativt tillvägagångssätt för att återställa dissociationskonstanter, så gott vi vet, representerar denna analys ett tillvägagångssätt för att testa verkliga transinteraktioner på ett semikvantitativt och relativt effektivt sätt. På grund av den relativa lättheten i denna analys kan DESSUTOM HEK-cellaggregationstestet användas tillsammans med dessa mer kvantitativa metoder för att få en bredare och mer fullständig karakterisering av de interaktioner som äger rum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Grants from the National Institute of Mental Health (R00MH103531 och R01MH116901 till J.A.), ett predoctoral training Grant från National Institute of General Medicine (T32GM007635 till S.R.) och ett Lyda Hill Gilliam Fellowship for Advanced Study (GT11021 till S.R.). Vi tackar Dr. Kevin Woolfrey för hjälp med mikroskopet, Dr. K Ulrich Bayer för användningen av hans epifluorescerande mikroskop och Thomas Südhof (Stanford University) för LRRTM2-plasmiden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL disposable microtubes with snap caps | VWR | 89000-028 | Incubation of mixed population of HEK cells |
| 1000 mL Rapid—Flow Filter Unit, 0.2 um aPES membrane | Thermo Fisher | 567-0020 | Sterilization of HEK media |
| 15 mL SpectraTube centrifuge tubes | Ward’s Science | 470224-998 | Harvesting HEK cells |
| 6 well sterile tissue culture plates | VWR | 100062-892 | culturing HEK cells |
| Calcium Chloride | Sigma | 223506-500G | Calcium phosphate transfection, HEK cell resuspension |
| Centrifuge- Sorvall Legend RT | Kendro Laboratory Products | 75004377 | Harvesting HEK cells |
| CO2 cell incubator | Thermo Scientific | HERACELL 150i | Incubation of HEK cells during growth |
| DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate | Corning | 10-013-CV | HEK cell maintenance |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline PBS (1X) | Gibco | 14190-144 | Passaging/harvesting HEK cell |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | ED-500G | Harvesting HEK cells |
| Falcon Vented culture flasks, 75cm2 growth area | Corning | 9381M26 | Culturing HEK cells |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 17L184 | HEK cell maintenance |
| HEK293T cells | ATCC | Model system | |
| ImageJ | NIH | V: 2.0.0-rc-69/1.52p | Image analysis |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma | M9272-500G | HEK cell resuspension |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Fisher BioReagents | BP332-500 | Calcium phosphate transfection |
| Trypsin 0.25% (1X) Solution | GE Healthcare Life Sciences | SH30042.01 | Passaging HEK cells |
| Tube rotator | Incubation of mixed population of HEK cells | ||
| UltraClear Microscope slides. White Frosted, Positive Charged | Denville Scientific Inc. | M1021 | Image acquisition |
| Wide-field microscope | Zeiss | Axio Vert 200M | Image acquisition |
References
- Südhof, T. C. Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease. Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).
- Lakey, J. H., Raggett, E. M. Measuring protein-protein interactions. Current Opinion in Structural Biology. 8 (1), 119-123 (1998).
- Aoto, J., Martinelli, D. C., Malenka, R. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. Presynaptic neurexin-3 alternative splicing trans-synaptically controls postsynaptic AMPA receptor trafficking. Cell. 154 (1), 75-88 (2013).
- Aoto, J., Földy, C., Ilcus, S. M. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. Distinct circuit-dependent functions of presynaptic neurexin-3 at GABAergic and glutamatergic synapses. Nature Neuroscience. 18 (7), 997-1007 (2015).
- Südhof, T. C. Synaptic Neurexin Complexes: A Molecular Code for the Logic of Neural Circuits. Cell. 171 (4), 745-769 (2017).
- Dai, J., Aoto, J., Südhof, T. C. Alternative Splicing of Presynaptic Neurexins Differentially Controls Postsynaptic NMDA and AMPA Receptor Responses. Neuron. 102 (5), 993-1008 (2019).
- Restrepo, S., Langer, N. J., Nelson, K. A., Aoto, J. Modeling a Neurexin-3α Human Mutation in Mouse Neurons Identifies a Novel Role in the Regulation of Transsynaptic Signaling and Neurotransmitter Release at Excitatory Synapses. The Journal of Neuroscience. 39 (46), 9065-9082 (2019).
- Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., Südhof, T. C. LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).
- de Wit, J., et al. LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation. Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).
- Linhoff, M. W., et al. An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers. Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).
- Siddiqui, T. J., Pancaroglu, R., Kang, Y., Rooyakkers, A., Craig, A. M. LRRTMs and Neuroligins Bind Neurexins with a Differential Code to Cooperate in Glutamate Synapse Development. Journal of Neuroscience. 30 (22), 7495-7506 (2010).
- Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Bacchetti, S., Graham, F. L. Transfer of the gene for thymidine kinase to thymidine kinase-deficient human cells by purified herpes simplex viral DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (4), 1590-1594 (1977).
- Cerchiari, A. E., et al. A strategy for tissue self-organization that is robust to cellular heterogeneity and plasticity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), 2287-2292 (2015).
- Burdick, M. M., McCarty, O. J. T., Jadhav, S., Konstantopoulos, K. Cell-cell interactions in inflammation and cancer metastasis. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 20 (3), 86-91 (2001).
- Fox, D. A., Gizinski, A., Morgan, R., Lundy, S. K. Cell-cell interactions in rheumatoid arthritis synovium. Rheumatic Diseases Clinics of North America. 36 (2), 311-323 (2010).
- Yamagata, A., et al. Structural insights into modulation and selectivity of transsynaptic neurexin-LRRTM interaction. Nature Communications. 9 (1), 3964 (2018).
- Nguyen, T., Südhof, T. C. Binding properties of neuroligin 1 and neurexin 1beta reveal function as heterophilic cell adhesion molecules. The Journal of Biological Chemistry. 272 (41), 26032-26039 (1997).
- Boucard, A. A., Ko, J., Südhof, T. C. High Affinity Neurexin Binding to Cell Adhesion G-protein-coupled Receptor CIRL1/Latrophilin-1 Produces an Intercellular Adhesion Complex. Journal of Biological Chemistry. 287 (12), 9399-9413 (2012).
