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Biology

पशु खाद्य में स्क्रीनिंग साल्मोनेला के लिए लूप-मध्यस्थता Isothermal प्रवर्धन और संस्कृति अलगाव से साल्मोनेला की पुष्टि

Published: May 20, 2020 doi: 10.3791/61239
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Center for Veterinary Medicine, U.S. Food and Drug Administration

Summary

लूप-मध्यस्थता आइसोथर्मल प्रवर्धन (लैंप) एक आइसोथर्मल न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन परीक्षण (iNAAT) है जिसने रोगजनक पहचान क्षेत्र में व्यापक रुचि को आकर्षित किया है। यहां, हम पशु भोजन में साल्मोनेला स्क्रीनिंग और संस्कृति अलगाव से प्रकल्पित साल्मोनेला की पुष्टि के लिए एक त्वरित, विश्वसनीय और मजबूत विधि के रूप में एक बहु-प्रयोगशाला-मान्य साल्मोनेला लैंप प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

लूप-मध्यस्थता आइसोथर्मल प्रवर्धन (लैंप) कई बैक्टीरियल, फंगल, परजीवी और वायरल एजेंटों की तेजी से पता लगाने के लिए एक शक्तिशाली न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन परीक्षण के रूप में उभरा है। साल्मोनेला दुनिया भर में खाद्य सुरक्षा चिंता का एक जीवाणु रोगजनक है, जिसमें जानवरों के लिए भोजन शामिल है । यहां प्रस्तुत एक बहु प्रयोगशाला-मान्य साल्मोनेला लैंप प्रोटोकॉल है जिसका उपयोग साल्मोनेला संदूषण की उपस्थिति के लिए पशु भोजन को तेजी से स्क्रीन करने के लिए किया जा सकता है और इसका उपयोग सभी खाद्य श्रेणियों से बरामद संभावित साल्मोनेला आइसोलेट की पुष्टि करने के लिए भी किया जा सकता है। लैंप परख विशेष रूप से साल्मोनेला आक्रमण जीन(invA)को लक्षित करता है और तेजी से, संवेदनशील और अत्यधिक विशिष्ट है। टेम्पलेट डीएनए पशु भोजन या प्रकल्पित साल्मोनेला आइसोलेट्स की शुद्ध संस्कृतियों के संवर्धन शोरबा से तैयार किए जाते हैं। लैंप रिएजेंट मिश्रण एक आइसोथर्मल मास्टर मिक्स, प्राइमर, डीएनए टेम्पलेट और पानी के संयोजन से तैयार किया जाता है। लैंप परख 30 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस के निरंतर तापमान पर चलता है। वास्तविक समय फ्लोरेसेंस के माध्यम से सकारात्मक परिणामों की निगरानी की जाती है और 5 मिनट के रूप में जल्दी पता लगाया जा सकता है। लैंप परख पशु भोजन या संस्कृति माध्यम में अवरोधकों के लिए उच्च सहिष्णुता प्रदर्शित करता है, जो स्क्रीनिंग और साल्मोनेलाकी पुष्टि के लिए एक तेजी से, विश्वसनीय, मजबूत, लागत प्रभावी और उपयोगकर्ता के अनुकूल विधि के रूप में कार्य करता है। लैंप विधि हाल ही में अमेरिका के खाद्य एवं औषधि प्रशासन के जीवाणु विश्लेषणात्मक मैनुअल (BAM) अध्याय 5 में शामिल किया गया है ।

Introduction

लूप-मध्यस्थता आइसोथर्मल प्रवर्धन (लैंप) जापानीवैज्ञानिकोंके एक समूह द्वारा 2000 में आविष्कार किया गया एक उपन्यास इसोथर्मल न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन परीक्षण (iNAAT) है। प्रारंभिक चरणों के दौरान एक लक्ष्य-विशिष्ट स्टेम-लूप डीएनए संरचना के गठन के माध्यम से, लैंप इस शुरुआती सामग्री अर्ध-तेजी से बढ़ाने के लिए एक स्ट्रैंड-विस्थापित डीएनए पॉलीमरेज का उपयोग करता है, जिसके परिणामस्वरूप 1 घंटे1 से कम समय में लक्ष्य की 109प्रतियां होती हैं। पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर) की तुलना में, एक व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला एनएएट, लैंप के पास कई फायदे हैं। सबसे पहले, लैंप प्रतिक्रियाएं आइसोथर्मल परिस्थितियों में की जाती हैं। यह एक परिष्कृत थर्मल साइकिलिंग उपकरण की आवश्यकता को कम करता है। दूसरा, दीपक संस्कृति मीडिया और जैविक पदार्थों के प्रति अत्यधिक सहिष्णु है2 नैदानिक और खाद्य अनुप्रयोगों दोनों के लिए प्रदर्शन के साथ3,4। यह नमूना तैयार करने को सरल बनाता है और झूठे नकारात्मक परिणामों को कम करता है5. तीसरा, लैंप कई डिटेक्शन प्लेटफार्मों के लिए उत्तरदायी है, जैसे टर्बिडिटी, कोलोरीट्री, बायोल्यूमिनेसेंस, फ्लोरेसेंस, और माइक्रोफ्लुइडिक्स6। चौथा, दीपक अत्यधिक विशिष्ट है क्योंकि यह छह से आठ विशिष्ट क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए चार से छह विशेष रूप से डिजाइन किए गए प्राइमर का उपयोग करता है1,7। पांचवां, लैंप अतिसंवेदनशील है और कई अध्ययनों ने पीसीआर या वास्तविक समय पीसीआर8के प्रति अपनी बेहतर संवेदनशीलता की सूचना दी है । अंत में, लैंप कई परख के साथ तेजी से है अब एक 30 मिनट मानक रन समय अपनाने जबकि पीसीआर प्रकार की परख आमतौर पर 1−2 घंटे8ले ।

इन आकर्षक विशेषताओं ने व्यापक रोगजनक पता लगाने वाले क्षेत्रों में दीपक के अनुप्रयोग को बढ़ावा दिया, जिसमें इन विट्रो डायग्नोस्टिक्स9,पशु रोग निदान10और खाद्य और पर्यावरण परीक्षण11शामिल हैं। विशेष रूप से, डब्ल्यूएचओ द्वारा परिधीय सेटिंग्स12में पल्मोनरी तपेदिक निदान के लिए थूक-धब्बा माइक्रोस्कोपी के लिए एक वैध प्रतिस्थापन परीक्षण के रूप में डब्ल्यूएचओ द्वारा टीबी-लैंप (माइकोबैक्टीरियम तपेदिकके लिए लैंप) की सिफारिश की गई है । लैंप एप्लिकेशन एलर्जी, पशु प्रजातियों, दवा प्रतिरोध, आनुवंशिक रूप से संशोधित जीवों और कीटनाशकों का पता लगाने के लिए माइक्रोबियल पहचान से परे भीफैलताहै।

नॉनटीफोइडल साल्मोनेला दुनिया भर में पर्याप्त खाद्य सुरक्षा और सार्वजनिक स्वास्थ्य चिंता का एक जूनोटिक रोगजनक है14. इसे जानवरों के लिए भोजन (यानी पशु भोजन)15, 16में एक महत्वपूर्ण माइक्रोबियल खतरे के रूप में भीपहचानागया है । दूषित मानव भोजन और पशु भोजन से साल्मोनेला बीमारियों/प्रकोपों को रोकने के लिए, विभिन्न प्रकार के मैट्रिस में साल्मोनेला के परीक्षण के लिए तेजी से, विश्वसनीय और मजबूत तरीके होना अनिवार्य है । पिछले एक दशक में, खाद्य मैट्रिस की एक विस्तृत श्रृंखला में साल्मोनेला लैंप का परख के विकास और अनुप्रयोग पर अंतरराष्ट्रीय स्तर पर काफी प्रयास किए गए हैं, जैसा कि हाल ही में एक व्यापक समीक्षा8में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है। यहां प्रस्तुत किएगए कई साल्मोनेला लैंप काहते हैं, जिन्होंने अच्छी तरह से स्थापित अंतरराष्ट्रीयदिशानिर्देशों 17, 18,19,20के बाद बहु-प्रयोगशाला सत्यापन को सफलतापूर्वक पूरा किया है।

हमारे साल्मोनेला लैंप परख विशेष रूप से साल्मोनेला आक्रमणजीन इनवा (जेनबैंक परिग्रहण संख्या M90846)21 को लक्षित करता है और कई खाद्य मैट्रिस 4,22, 23, 24,25,26में तेजीसे,विश्वसनीय और मजबूत है। इस विधि को छह पशु खाद्य मैट्रिस में एक प्रीकॉलाबोरेटिव अध्ययन26 में और सूखे कुत्ते के भोजन में एक बहु प्रयोगशाला सहयोगात्मक अध्ययन19में मान्य किया गया है । नतीजतन, साल्मोनेला लैंप विधि यहां प्रस्तुत हाल ही में अमेरिका के खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) के जीवाणु विश्लेषणात्मक मैनुअल (BAM) अध्याय 5 साल्मोनेला27 में शामिल किया गया है दो प्रयोजनों की सेवा के लिए, पशु भोजन में साल्मोनेला की उपस्थिति के लिए एक तेजी से स्क्रीनिंग विधि के रूप में एक और दो संभावित साल्मोनेला सभी खाद्य पदार्थों से अलग के लिए एक विश्वसनीय पुष्टि विधि के रूप में ।

Protocol

नोट: एक लैंप रिएक्शन मिक्स में डीएनए पॉलीमरेज, बफर, एमजीएसओ4,डीएनटीपीएस, प्राइमर, डीएनए टेम्पलेट और पानी होता है। पहले चार अभिकर्मकों को एक आइसोथर्मल मास्टर मिक्स(सामग्री की तालिका)में समाहित किया जाता है। प्राइमर को प्राइमर मिक्स (10x) बनने के लिए इन-हाउस प्रीमिक्स किया जाता है। डीएनए टेम्पलेट्स को स्क्रीनिंग उद्देश्य के लिए पशु खाद्य नमूनों के संवर्धन शोरबा से या पुष्टि के उद्देश्य के लिए प्रकल्पित साल्मोनेला आइसोले की संस्कृतियों से तैयार किया जा सकता है। इसके अलावा, एक सकारात्मक नियंत्रण (किसी भी साल्मोनेला संदर्भ उपभेदों से निकाला गया डीएनए, उदाहरण के लिए, साल्मोनेला एंटिका सेरोवर टाइफिमुरियम एटीसीसी 1 9 585 [एलटी 2]) और नो टेम्पलेट कंट्रोल (एनटीसी; बाँझ आणविक ग्रेड पानी) हर लैंप रन में शामिल हैं।

1. डीएनए टेम्पलेट्स की तैयारी

  1. पशु खाद्य संवर्धन से डीएनए टेम्पलेट तैयार करने के लिए, इन चरणों का पालन करें।
    1. एक बाँझ फिल्टर बैग(सामग्रीकी तालिका), या समकक्ष में 25 ग्राम पशु खाद्य नमूना (उदाहरण के लिए, सूखी बिल्ली का भोजन, सूखा कुत्ता भोजन, पशु चारा, घोड़ा फ़ीड, पोल्ट्री फ़ीड, और सूअर फ़ीड) का वजन करें। इनक्यूबेशन के दौरान समर्थन के लिए बैग को एक बड़े कंटेनर या रैक में रखें।
    2. बाँझ बफर पेप्टोन पानी (BPW) के 225 एमएल जोड़ें। घूमता है और संक्षिप्त हाथ मालिश से अच्छी तरह से मिलाएं। 60 ± 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर खड़े होने दें।
    3. घूमता है और एक परीक्षा के पेपर के साथ पीएच निर्धारित करके अच्छी तरह से मिलाएं। पीएच को समायोजित करें, यदि आवश्यक हो, तो बाँझ 1 एन नाओह या 1 एन एचसीएल के साथ 0.2 ± 6.8 पर समायोजित करें। 24 ± 2 घंटे के लिए 35 ± 2 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    4. पशु खाद्य संवर्धन शोरबा युक्त बैग को घूमता करके अच्छी तरह से मिलाएं। बैग के फ़िल्टर किए गए साइड से 1 एमएल को माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। भंवर संक्षेप में।
    5. एक नमूना तैयारी अभिकर्ण(सामग्री की तालिका) काउपयोग कर डीएनए निकालें इस प्रकार है।
      1. बड़े कणों को हटाने और एक नए माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में सुपरनैंट स्थानांतरित करने के लिए 1 मिनट के लिए 900 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
      2. 2 मिनट के लिए 16,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें और सुपरनेट को त्यागें।
      3. एक सूखी गर्मी ब्लॉक में 10 मिनट के लिए 100 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर नमूना तैयारी रिएजेंट और गर्मी के 100 माइक्रोन में गोली को निलंबित करें।
      4. कमरे के तापमान को ठंडा करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर नमूना डीएनए अर्क स्टोर करें।
  2. प्रकल्पित साल्मोनेला संस्कृतियों से डीएनए टेम्पलेट तैयार करने के लिए, इन चरणों का पालन करें।
    1. एफडीए के बाम अध्याय 5 साल्मोनेला अनुभाग डी: साल्मोनेला 27के अलगाव के बाद सभी खाद्य पदार्थों में संस्कृति अलगाव से प्रकल्पित साल्मोनेला आइसोलेशन प्राप्त करें ।
    2. टीका प्रकल्पित साल्मोनेला एक गैर-विद्युत आगार प्लेट (जैसे, रक्त आगार, पोषक तत्व आगर, और ट्रिप्पिकस सोया आगर) पर अलग होता है और 24 ± 2 घंटे के लिए 35 ± 2 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करता है।
    3. कई एकल कालोनियों को ट्राइप्टिकस सोया शोरबा (टीएसबी) या ब्रेन हार्ट इनफ्यूजन (बीएचआई) शोरबा के 5 एमएल में स्थानांतरित करें और 16 ± 2 घंटे के लिए 35 ± 2 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: यह कदम वैकल्पिक हो सकता है यदि प्रकल्पित साल्मोनेला संस्कृति शुद्ध है। उस स्थिति में टीएसबी के 5 एमएल में कई सिंगल कॉलोनियों को सस्पेंड करके डीएनए टेम्पलेट तैयार किए जा सकते हैं और ड्राई हीट ब्लॉक में 10 मिनट के लिए 1 डिग्री सेल्सियस पर 100 ± सस्पेंशन के 500 माइक्रोन को हीट किया जा सकता है। नीचे चरण 5 के साथ जारी रखें।
    4. एक सूखी गर्मी ब्लॉक में 10 मिनट के लिए 100 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर एक माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब और गर्मी में रात भर संस्कृति के 500 μL स्थानांतरित करें।
    5. कमरे के तापमान को ठंडा करें और डीएनए अर्क को -20 डिग्री सेल्सियस पर अलग करें।
  3. सकारात्मक नियंत्रण डीएनए तैयार करने के लिए, एक अतिरिक्त कमजोर पड़ने के कदम के साथ प्रकल्पित साल्मोनेला संस्कृतियों से डीएनए टेम्पलेट्स तैयार करने के लिए ऊपर के रूप में इसी तरह के कदम का पालन करें ।
    1. टीका एस Typhimurium ATCC 19585 (LT2) या किसी भी साल्मोनेला संदर्भ एक गैर-निर्वाचक आगर प्लेट पर उपभेदों (जैसे, रक्त आगर, पोषक तत्व आगर, और ट्रिप्पिकस सोया आगर) और 24 ± 2 घंटे के लिए 35 ± 2 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    2. कई एकल कॉलोनियों को टीएसबी या बीएचआई शोरबा के 5 एमसीएल में स्थानांतरित करें और ~109 सीएलयू/एमएल तक पहुंचने के लिए 16 ± 2 घंटे के लिए 35 ± 2 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    3. धारावाहिक 0.1% पेप्टोन पानी में रातोंरात संस्कृति पतला ~ 107 CFU/
    4. इस कमजोर पड़ने के 500 माइक्रोल को एक माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और सूखी गर्मी ब्लॉक में 10 मिनट के लिए 1 डिग्री सेल्सियस 1 डिग्री सेल्सियस पर 100 ± गर्मी करें।
    5. कमरे के तापमान को ठंडा करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर सकारात्मक नियंत्रण डीएनए स्टोर करें।

2. प्राइमर मिक्स की तैयारी (10x)

  1. मानक डीसल्टिंग शुद्धिकरण(तालिका 1)के साथ व्यावसायिक रूप से संश्लेषित लैंप प्राइमर (साल4-एफ 3, साल4-बी 3, साल 4-एफआईपी, साल4-बीआईपी, साल 4-एलएफ और साल 4-एलबी) प्राप्त करें।
प्राइमर नाम या क़िस्‍म अनुक्रम (5'-3') लंबाई (बीपी)
साल4-F3 फॉरवर्ड आउटर प्राइमर GAACGTGTCGCGGAGTC 18
साल4-बी 3 बैकवर्ड आउटर प्राइमर सीजीजीसीएएएएजीटीसीटीसीटी 18
साल4-एफआईपी फॉरवर्ड इनर प्राइमर GCGCGGCATCCCCGCATCAATA-TCTGGATGGTATCCCCCCGG 38
साल4-बीआईपी बैकवर्ड इनर प्राइमर GCGAACGGCGAGCGTACTG-TCGCACCGTCAAAGGAAC 38
साल4-वामो लूप फॉरवर्ड प्राइमर TCAAATCGGCATCAATCATCA-TCTG 25
साल4-पौंड लूप बैकवर्ड प्राइमर AAAGGGAAAGCCAGCTTTACG 21

तालिका 1: पशु भोजन में साल्मोनेला स्क्रीनिंग और संस्कृति अलगाव से साल्मोनेला की पुष्टि के लिए दीपक प्राइमर । प्राइमर साल्मोनेला इनवा सीक्वेंस (जेनबैंक परिग्रहण संख्या M90846) के आधार पर डिजाइन किए गए हैं।

  1. बाँझ आणविक ग्रेड पानी की उचित मात्रा के साथ प्राइमर को रीहाइड्रेटिंग करके प्रत्येक प्राइमर (100 माइक्रोनएम) के स्टॉक समाधान तैयार करें। 10 एस के लिए भंवर से अच्छी तरह मिलाएं और -20 डिग्री सेल्सियस (लंबी अवधि के भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस) पर स्टोर करें।
  2. एक वर्कशीट(टेबल 2)के अनुसार प्राइमर मिक्स (10x) तैयार करें। एक माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में प्राइमर स्टॉक समाधान और बाँझ आणविक ग्रेड पानी की उचित मात्रा जोड़ें। 10 एस के लिए भंवर से सभी अभिकर्णों को अच्छी तरह से मिलाएं।
घटक स्टॉक कॉन. (μM) प्राइमर मिक्स कॉन्स( μM) वॉल्यूम (माइक्रोन)
साल4-F3 प्राइमर 100 1 10
साल4-बी 3 प्राइमर 100 1 10
साल4-एफआईपी प्राइमर 100 18 180
साल4-बीआईपी प्राइमर 100 18 180
साल4-वामो प्राइमर 100 10 100
साल4-पौंड प्राइमर 100 10 100
आणविक ग्रेड पानी N/A N/A 420
कुल N/A N/A 1000

तालिका 2: लैंप प्राइमर मिक्स (10x) तैयार करने के लिए वर्कशीट। प्राइमर तालिका 1में सूचीबद्ध हैं।

  1. अलीकोट 10x प्राइमर मिक्स 500 माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब पर और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3. एक दीपक प्रतिक्रिया की विधानसभा

नोट: क्रॉस-संदूषण को रोकने के लिए, लैंप मास्टर मिश्रण तैयार करने और डीएनए टेम्पलेट्स को जोड़ने के लिए उपयोग किए जाने वाले क्षेत्रों को शारीरिक रूप से अलग करने की अत्यधिक सिफारिश की जाती है। चित्रा 1 एक दीपक आरेख है।

Figure 1
चित्रा 1: साल्मोनेला लैंप वर्कफ्लो का एक योजनाबद्ध आरेख। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. तैयारी और रन सेटअप
    1. आइसोप्रोपनॉल और डीएनए और डीएनए-अपमानजनक समाधान(सामग्री की तालिका) केसाथ स्वच्छ पीठ। डीएनए और डीएनए-और डीएनए-अपमानजनक समाधान के साथ साफ पिपेट और ट्यूब स्ट्रिप धारक(सामग्रीकी तालिका) ।
    2. आइसोथर्मल मास्टर मिक्स, प्राइमर मिक्स (10x), आणविक ग्रेड पानी, सकारात्मक नियंत्रण डीएनए, और कमरे के तापमान पर डीएनए टेम्पलेट्स पिघलाएं।
    3. लैंप इंस्ट्रूमेंट(सामग्री की तालिका)चालू करें और होम स्क्रीन तक पहुंचने के लिए ओपनिंग स्क्रीन पर टैप करें। एक रन बनाने के लिए इन चरणों का पालन करें।
      नोट: लैंप उपकरण के एक मॉडल में प्रत्येक ब्लॉक में 8 नमूनों के साथ 2 ब्लॉक (ए और बी) होते हैं और एक अन्य मॉडल में एक ब्लॉक होता है जो 8 नमूनों(सामग्रियों की तालिका) कोसमायोजित करता है।
      1. लैंप + एनील पर टैप करें और नमूना जानकारी दर्ज करने के लिए संपादित करें।
        नोट: डिफ़ॉल्ट लैंप रन प्रोफाइल में 30 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर प्रवर्धन और 98 डिग्री सेल्सियस से 80 डिग्री सेल्सियस तक 0.05 डिग्री सेल्सियस डीकक्रिएशन प्रति सेकंड के साथ एक एनील चरण होता है।
      2. कर्सर को सक्रिय करने और दो लैंप इंस्ट्रूमेंट ब्लॉक के बीच स्विच करने के लिए एबी ब्लॉक आइकन का उपयोग करके प्रासंगिक नमूना जानकारी दर्ज करने के लिए प्रत्येक नमूना पंक्ति पर टैप करें।
      3. सभी नमूना जानकारी दर्ज होने पर चेक आइकन पर टैप करें।
        नोट: वैकल्पिक रूप से, रन सेटअप (जिसे "प्रोफाइल" कहा जाता है, जिसमें डिफ़ॉल्ट लैंप रन प्रोफ़ाइल के साथ नमूना जानकारी होती है) को बाद में उपयोग के लिए सहेजा जा सकता है। सेव आइकन पर टैप करें और प्रोफाइल को एक अनोखा नाम दें। अगली बार नमूनों के इसी सेट का परीक्षण करते समय, सेव प्रोफाइल का उपयोग करके एक नया रन शुरू किया जा सकता है। होम स्क्रीन के नीचे बाईं ओर फ़ोल्डर आइकन पर टैप करें और सेव किए गए प्रोफाइल को लोड करने के लिए प्रोफाइल का चयन करें।
  2. दीपक प्रतिक्रिया विधानसभा
    नोट: लैंप इंस्ट्रूमेंट ब्लॉक (ए और बी, कुल 16 नमूनों) दोनों का उपयोग करते समय, 18 नमूनों के लिए लैंप मास्टर मिक्स तैयार करें। यदि केवल एक लैंप इंस्ट्रूमेंट ब्लॉक (कुल 8 नमूने) का उपयोग कर रहे हैं, तो 10 नमूनों के लिए लैंप मास्टर मिश्रण तैयार करें। अन्य नमूना संख्याओं के लिए, पाइपिंग हानि को समायोजित करने के लिए तदनुसार वॉल्यूम को समायोजित करें। हमेशा हर लैंप रन में एक सकारात्मक नियंत्रण और एक एनटीसी शामिल करें। स्वतंत्र लैंप रन में प्रत्येक नमूने के डुप्लीकेट परीक्षण की सिफारिश की जाती है।
    1. एक वर्कशीट(टेबल 3)के अनुसार लैंप मास्टर मिक्स तैयार करें। आइसोथेरमल मास्टर मिक्स, प्राइमर मिक्स और आणविक ग्रेड वॉटर की उचित मात्रा को माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में जोड़ें और भंवर धीरे-धीरे 3 एस सेंट्रलाइज के लिए संक्षेप में।
    2. स्ट्रिप होल्डर में ट्यूब स्ट्रिप रखें और प्रत्येक कुएं में लैंप मास्टर मिक्स के 23 माइक्रोन वितरित करें।
    3. भंवर सभी डीएनए टेम्पलेट्स और अपकेंद्रित्र संक्षेप में । उचित अच्छी तरह से डीएनए टेम्पलेट के 2 माइक्रोन जोड़ें और कसकर टोपी।
    4. धारक और झटका कलाई से ट्यूब पट्टी निकालें सुनिश्चित करने के लिए सभी अभिकर्द ट्यूब के तल पर जमा किया है ।
    5. लैंप इंस्ट्रूमेंट ब्लॉक (एस) में ट्यूब स्ट्रिप लोड करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि ढक्कन बंद करने से पहले टोपियां सुरक्षित हैं।
घटक काम कर रहे conc. अंतिम प्रतिक्रिया conc. प्रति नमूना वॉल्यूम (μL) 18 नमूनों के लिए मात्रा (μL) 10 नमूनों के लिए मात्रा (μL)
आईएसओ-001 आइसोथर्मल मास्टर मिक्स 1.67x 1x 15 270 150
प्राइमर मिक्स 10x 1x 2.5 45 25
आणविक ग्रेड पानी N/A N/A 5.5 99 55
मास्टर मिक्स उपकुल N/A N/A 23 414 230
डीएनए टेम्पलेट N/A N/A 2 N/A N/A

तालिका 3: लैंप रिएक्शन मिक्स तैयार करने के लिए वर्कशीट। टेबल 1 में सूचीबद्ध प्राइमर के स्टॉक समाधानों का उपयोग करके टेबल 2 के अनुसार प्राइमर मिक्स (10x)तैयार किया जाता है।

4. दीपक भागो

नोट: एक लैंप रन के दौरान, फ्लोरेसेंस रीडिंग एफएएम चैनल का उपयोग करके प्राप्त की जाती है। समय-से-पीक मान(टीमैक्स,न्यूनतम) समय बिंदु के लिए साधन द्वारा स्वचालित रूप से निर्धारित किए जाते हैं जब फ्लोरेसेंस अनुपात प्रवर्धन दर वक्र के अधिकतम मूल्य तक पहुंच जाता है। टीएम (डिग्री सेल्सियस) अंतिम प्रवर्धित उत्पाद का पिघलने/एनीलिंग तापमान है ।

  1. स्क्रीन के ऊपरी दाईं ओर रन आइकन पर क्लिक करें और लैंप रन शुरू करने के लिए ट्यूब स्ट्रिप युक्त ब्लॉक (ओं) का चयन करें।
  2. वैकल्पिक रूप से, जबकि प्रतिक्रिया प्रगति पर है, लैंप रन के दौरान विभिन्न मापदंडों के गतिशील परिवर्तन देखने के लिए तापमान, प्रवर्धनऔर एनील टैब पर टैप करें।
  3. एक बार रन पूरा हो जाने के बाद, पूर्ण प्रवर्धन और एनील घटता देखने के लिए प्रवर्धन और एनियल टैब पर टैप करें और परिणामों को देखने के लिए परिणाम टैब पर टैप करें।
  4. वैकल्पिक रूप से, रिकॉर्ड रखने के लिए, "इंस्ट्रूमेंट सीरियल number_run नंबर" के प्रारूप का उपयोग करके स्क्रीन के शीर्ष बाईं ओर स्थित रन नंबर रिकॉर्ड करें, उदाहरण के लिए, "GEN2-2209_0030."

5. दीपक परिणामों की व्याख्या

नोट: लैंप परिणाम सीधे लैंप इंस्ट्रूमेंट पैनल पर देखा जा सकता है और/या एक लैंप सॉफ्टवेयर(सामग्री की तालिका) काउपयोग कर ।

  1. साधन पैनल पर दीपक परिणामों की व्याख्या करने के लिए, इन चरणों का पालन करें।
    1. होम स्क्रीन के नीचे बाईं ओर फ़ोल्डर आइकन पर टैप करें और लैंप रन ऑफ इंटरेस्ट लोड करने के लिए फाइल स्थान पर नेविगेट करने के लिए लॉग का चयन करें।
      नोट: लैंप रन तारीख से आयोजित कर रहे हैं, वर्ष के साथ शुरू ।
    2. प्रत्येक रन से जुड़े पांच टैब का निरीक्षण करें: प्रोफाइल, तापमान, प्रवर्धन, एनीलऔर परिणाम।
      नोट: प्रोफ़ाइल और तापमान टैब क्रमशः प्रोग्राम और वास्तविक तापमान, नमूना कुओं में दीपक प्रतिक्रिया आय के रूप में दिखाते हैं । प्रवर्धन और एनील टैब क्रमशः प्रवर्धन और एनील चरणों के दौरान फ्लोरेसेंस रीडिंग और फ्लोरेसेंस में परिवर्तन दिखाते हैं। परिणाम टैब लैंप परिणामों का एक सारणीय दृश्य दिखाता है।
    3. प्रत्येक अच्छी तरह से दीपक परिणामों का निरीक्षण करने के लिए परिणाम टैब टैप करें।
      नोट: तीन कॉलम हैं (ठीक है, प्रवर्धन, और एनील)। "प्रवर्धन" कॉलम प्रत्येक नमूने के लिए समय-से-पीक मूल्यों(टी-मैक्स;न्यूनतम:सेकंड) को दर्शाता है ("वेल") और "एनील" कॉलम उस अच्छी तरह से किसी भी प्रवर्धित उत्पाद के लिए पिघलने/एनीलिंग तापमान(टीएम;डिग्री सेल्सियस) को दर्शाता है ।
    4. लैंप परिणामों की व्याख्या करें और अंतिम लैंप परिणामों की रिपोर्ट इस प्रकार करें।
      1. पहले नियंत्रण कुओं की जांच करें। एनटीसी वेल में ब्लैंक टीमैक्स होनी चाहिए जबकि टीएम या तो ब्लैंक (दोनों लैंप इंस्ट्रूमेंट मॉडल) या <83 डिग्री सेल्सियस (केवल दो ब्लॉकों के साथ लैंप इंस्ट्रूमेंट मॉडल के लिए) हो सकता है। सकारात्मक नियंत्रण अच्छी तरह से 5 और 10 मिनट के बीच टीअधिकतम और 90 डिग्री सेल्सियस के आसपास टीएम होना चाहिए।
      2. सैंपल कुओं की जांच करें। सही टीएम (लगभग 90 डिग्री सेल्सियस) और टीमैक्स (5−30 मिनट के बीच) वाले सभी नमूनों को साल्मोनेलाके लिए सकारात्मक माना जाता है।
      3. डुप्लीकेट रन से परिणामों के आधार पर अंतिम लैंप परिणामों की रिपोर्ट करें। यदि डुप्लिकेट रन लगातार परिणाम है, अंतिम दीपक परिणाम की सूचना दी जा सकती है । यदि डुप्लिकेट रन असंगत हैं, तो दोनों रन स्वतंत्र रूप से दोहराएं। यदि परिणाम अभी भी असंगत हैं, नमूना साल्मोनेला के लिए प्रकल्पित सकारात्मक माना जाना चाहिए और संस्कृति की पुष्टि के माध्यम से जाने की आवश्यकता होगी ।
  2. सॉफ्टवेयर का उपयोग कर दीपक परिणामों की व्याख्या करने के लिए, इन चरणों का पालन करें।
    1. बाएं पैनल पर कंप्यूटर आइकन पर क्लिक करें और ब्याज के लैंप रन लोड करने के लिए फ़ाइल स्थान पर नेविगेट करें।
      नोट: स्थापित सॉफ्टवेयर के साथ कंप्यूटर लैंप परिणामों का विश्लेषण करने के लिए लैंप उपकरण से कनेक्ट होने की आवश्यकता नहीं है, यानी, रिमोट एक्सेस उपलब्ध है। दीपक रन तारीख से आयोजित कर रहे हैं।
    2. प्रत्येक रन से जुड़े सात टैब का निरीक्षण करें: प्रोफाइल, तापमान, प्रवर्धन, प्रवर्धन दर, एनील, एनियल डेरिवेटिवऔर परिणाम।
      नोट: साधन पैनल दृश्य के समान, लैंप प्रतिक्रिया आय के रूप में नमूना कुओं में क्रमशः प्रोग्राम और वास्तविक तापमान दिखाते हैं। प्रवर्धन/प्रवर्धनदर और एनील/एनियलडेरिवेटिव टैब क्रमशः प्रवर्धन और एनील चरणों के दौरान फ्लोरेसेंस रीडिंग या फ्लोरेसेंस में बदलाव दिखाते हैं । परिणाम टैब लैंप परिणामों का एक सारणीय दृश्य दिखाता है जो इंस्ट्रूमेंट पैनल व्यू से थोड़ा अलग होता है।
    3. समय के अनुसार फ्लोरेसेंस अनुपात का ग्राफिक डिस्प्ले देखने के लिए प्रवर्धन दर टैब पर टैप करें। स्क्रीन के शीर्ष दाईं ओर सेटिंग आइकन पर क्लिक करें और "पीक डिटेक्शन थ्रेसहोल्ड रेशियो" को 0.020 से 0.010 तक समायोजित करें।
      नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए समायोजन आवश्यक है कि सभी वैध चोटियों की पहचान की जाए, और उपकरण पैनल पर प्रदर्शित लोगों के साथ सॉफ्टवेयर मिलान का उपयोग करके प्राप्त परिणाम।
    4. प्रत्येक अच्छी तरह से दीपक परिणामों का निरीक्षण करने के लिए परिणाम टैब टैप करें।
      नोट: चार कॉलम हैं (ग्राफ नाम, अच्छी तरह से संख्या, अच्छी तरह से नाम, और पीक वैल्यू)। "पीक वैल्यू" कॉलम के शीर्ष भाग में प्रत्येक नमूने ("वेल नेम") के लिए "एएमपी टाइम"(टीमैक्स;न्यूनतम:सेकंड) दिखाया गया है, जबकि नीचे के हिस्से में किसी भी प्रवर्धित उत्पाद के लिए "एनील डेरिवेटिव"(टीएम;डिग्री सेल्सियस) दिखाई देता है।
    5. लैंप परिणामों की व्याख्या करें और समान चरणों के बाद अंतिम लैंप परिणामों की रिपोर्ट करें, क्योंकि एक अपवाद के साथ इंस्ट्रूमेंट पैनल का उपयोग करते समय एनटीसी वेल और अन्य नकारात्मक नमूनों में खाली टीएम होना चाहिए क्योंकि लैंप सॉफ्टवेयर सेटिंग्स उन टीएम एंड एलटी; 83 डिग्री सेल्सियस परिणामों को खत्म करती हैं। इसी तरह, सही टीएम (लगभग 90 डिग्री सेल्सियस) और टीमैक्स (5−30 मिनट के बीच) वाले सभी नमूनों को साल्मोनेलाके लिए सकारात्मक माना जाता है।

Representative Results

चित्रा 2 और चित्रा 3 शो प्रतिनिधि लैंप ग्राफ/टेबल दोनों प्लेटफार्मों पर प्रदर्शित । इस लैंप रन में, नमूने S1 से S6 एस एंटिका सेरोवर इंफैंटिस एटीसीसी 51741 के 1.1 x 106 सीएलयू से लेकर 11 सीएलयू प्रति प्रतिक्रिया के 10 गुना सीरियल कमजोर हैं। सकारात्मक नियंत्रण एस आंत्रप्रेन्योर सेरोवर टाइफिमुरियम एटीसीसी 19585 (एलटी2) 1.7 x 104 सीएफयू प्रति रिएक्शन और एनटीसी आणविक ग्रेड पानी है।

जैसा कि चित्रा 2E और चित्रा 3Gमें दिखाया गया है, एनटीसी और पीसी दोनों कुएं वैध नियंत्रण हैं। एनटीसी वेल में ब्लैंक टीमैक्स है जबकि टीएम है < 83 डिग्री सेल्सियस लैंप इंस्ट्रूमेंट पैनल पर और लैंप सॉफ्टवेयर में ब्लैंक, एक नकारात्मक परिणाम का सुझाव देता है। पीसी वेल में दोनों प्लेटफार्मों पर ~ 90 डिग्री सेल्सियस के टी मैक्स 7 मिनट 45 सेकंड और टीएम है, जो सकारात्मक परिणाम का सुझाव देता है। नमूने S1 से S6 के बीच टीअधिकतम है 6 मिनट 30 सेकंड और 12 मिनट 15 सेकंड, सभी साल्मोनेला-सकारात्मकजा रहा है ।

नमूनों के एक ही सेट के डुप्लीकेट रन के बाद, इन नमूनों के लिए अंतिम लैंप परिणामों की सूचना दी जाती है । इस प्रतिनिधि दीपक रन से पता चलता है कि लैंप सफलतापूर्वक नमूनों में सांद्रता की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ साल्मोनेला का पता लगाता है ।

Figure 2
चित्रा 2: लैंप इंस्ट्रूमेंट पैनल पर प्रदर्शित प्रतिनिधि लैंप परिणाम। (A) प्रोफाइल टैब प्रोग्राम किए गए तापमान प्रोफाइल को दिखाता है । (ख) तापमान टैब नमूना कुओं में वास्तविक तापमान से पता चलता है के रूप में दीपक प्रतिक्रिया आय । (ग) प्रवर्धन टैब लैंप प्रवर्धन के दौरान फ्लोरेसेंस रीडिंग दिखाता है । (घ) एनील टैब एनील फेज के दौरान फ्लोरेसेंस (डेरिवेटिव) में बदलाव दिखाता है । (ई) परिणाम टैब दीपक परिणामों का एक सारणी दृश्य दिखाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: लैंप सॉफ्टवेयर में देखे गए प्रतिनिधि लैंप परिणाम। (A) प्रोफाइल टैब प्रोग्राम किए गए तापमान प्रोफाइल को दिखाता है । (ख) तापमान टैब नमूना कुओं में वास्तविक तापमान से पता चलता है के रूप में दीपक प्रतिक्रिया आय । (ग) प्रवर्धन टैब लैंप प्रवर्धन के दौरान फ्लोरेसेंस रीडिंग दिखाता है । (घ) प्रवर्धन दर टैब लैंप प्रवर्धन के दौरान फ्लोरेसेंस (फ्लोरेसेंस रेशियो) में बदलाव दिखाता है । (ई) एनील टैब एनील फेज के दौरान फ्लोरेसेंस रीडिंग दिखाता है । (एफ) एनील डेरिवेटिव टैब एनील फेज के दौरान फ्लोरेसेंस (डेरिवेटिव) में बदलाव दिखाता है। (जी) रिजल्ट टैब लैंप परिणामों का एक सारणी दृश्य दिखाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

हम यहां स्क्रीनिंग और पशु भोजन और शुद्ध संस्कृति में साल्मोनेला की पुष्टि के लिए एक सरल, तेजी से, विशिष्ट, और संवेदनशील दीपक विधि क्रमशः प्रस्तुत किया है । एक आइसोथर्मल मास्टर मिक्स की सुविधा के साथ जिसमें चार प्रमुख अभिकर्मक होते हैं, और एक रेडी-टू-यूज, इन-हाउस तैयार प्राइमर मिक्स, लैंप रिएक्शन को कोडांतरण करने के लिए केवल कुछ पाइपिंग स्टेप्स(चित्रा 1)की आवश्यकता होती है। प्रवर्धन और एनियल चरणों सहित कुल रन समय 38 मिनट से कम है(चित्रा 2ए, बी और चित्रा 3ए, बी)। वास्तविक समय फ्लोरेसेंस(चित्रा 2 सी और चित्रा 3सी, डी)के माध्यम से सकारात्मक परिणामों की निगरानी की जाती है और 5 मिनट26के रूप में जल्दी पता लगाया जा सकता है। एनील चरण लैंप विशिष्टता की अतिरिक्त पुष्टि के रूप में कार्य करता है क्योंकि केवल सही टीएम (लगभग 90 डिग्री सेल्सियस) वाले नमूनों को सकारात्मक(चित्रा 2डी, ई और चित्रा 3ई−जी)के रूप में सूचित किया जाता है। शुद्ध संस्कृति में 1 साल्मोनेला सेल की संवेदनशीलता और < 1 CFU/25 ग्राम पशु भोजन में पहले26सूचित किया गया है ।

चूंकि लैंप काफी प्रभावी है और बड़ी मात्रा में डीएनए 1 उत्पन्न करता है, यह महत्वपूर्ण है कि क्रॉस-संदूषण को रोकने के लिए सर्वोत्तम प्रयोगशाला प्रथाओं का उपयोग कियाजाताहै, जिसमें लैंप मास्टर मिश्रण तैयार करने और डीएनए टेम्पलेट्स जोड़ने के लिए क्षेत्रों को शारीरिक रूप से अलग करना, फिल्टर पिपेट युक्तियों का उपयोग करके, दस्ताने अक्सर बदलना, और प्रवर्धन के बाद लैंप प्रतिक्रिया ट्यूब खोलने से परहेज करना शामिल हो सकता है।

इस साल्मोनेला लैंप विधि की विशिष्टता का पहले 300 बैक्टीरियल उपभेदों (185 सेवरों के 247 साल्मोनेला और 53गैर-साल्मोनेला)का उपयोग करके परीक्षण किया गया था और 100% विशिष्ट26होने का प्रदर्शन किया गया था। विशेष रूप से, टीमैक्स में महत्वपूर्ण अंतर दो साल्मोनेला प्रजातियों, एस एंटिका और साल्मोनेला बोंगोरीके बीच और एस एंटिका उपप्रजातियों, विशेष रूप से उपएसपी एरिजोना (IIIa) 26के बीच मनाया गया। बहरहाल, ये अभी भी दीपक परिणामों की व्याख्या के लिए नियमों के अनुसार वैध सकारात्मक परिणाम थे । शुष्क कुत्ते के भोजन में हमारे बहु प्रयोगशाला सहयोगात्मक अध्ययन में 14 विश्लेषकों19शामिल, डुप्लिकेट लैंप रन में असंगत परिणाम वाले नमूनों को कभी-कभार देखा गया । ये आमतौर पर देरी सकारात्मक परिणामों के साथ नमूने शामिल(टीअधिकतम और 15 मिनट) । दोहरा दोनों रन स्वतंत्र रूप से आम तौर पर इस मुद्दे को हल किया । अधिक शायद ही कभी, हम सही टीएम लेकिन कोई या अनियमित टीअधिकतम मूल्यों (< 5 मिनट) के साथ नमूनों का अवलोकन किया । यह आमतौर पर प्रतिक्रिया ट्यूब में हवा के बुलबुले के कारण होता था।

दीपक विधि विकास, मूल्यांकन, पूर्वसंचालक अध्ययन, और बहु प्रयोगशाला सत्यापन के जीवनचक्र के दौरान, हमने विभिन्न पशु भोजन या खाद्य मैट्रिस और संस्कृति मीडिया4,19,22, 23, 24में अवरोधकों के लिए लैंप की उच्च सहिष्णुता देखी है, जो विधि की मजबूती को रेखांकित करता है और वैश्विक स्तर पर कई अन्य अध्ययनों को सहयोग करता है8। यह पीसीआर या वास्तविक समय पीसीआर की तुलना में बेहतर है, जिसे आमतौर पर यह सुनिश्चित करने के लिए आंतरिक प्रवर्धन नियंत्रण की आवश्यकता होती है कि नकारात्मक परिणाम मैट्रिक्स अवरोध28के कारण नहीं हैं। इसके अलावा, लैंप ने 8 अध्ययनों के विशालबहुमतमें पीसीआर या वास्तविक समय पीसीआर की तुलना में समान (या बेहतर) विशिष्टता और संवेदनशीलता का प्रदर्शन किया। लैंप रिएजेंट्स की लागत प्रति प्रतिक्रिया लगभग $ 1 पर है। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले लैंप उपकरण छोटे, कम रखरखाव और पोर्टेबल हैं। वे किसी भी आइसोथर्मल प्रवर्धन विधि को संभाल सकते हैं जो फ्लोरेसेंस माप द्वारा लक्ष्य का पता लगाने को नियोजित करता है, दीपक शामिल है। लैंप सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, व्यापक रिपोर्ट कई प्रारूप (पीडीएफ, टेक्स्ट और छवि) में उत्पन्न की जा सकती है।

विधि सत्यापन एक महत्वपूर्ण कदम है इससे पहले कि नियमित उपयोग के लिए एक नई विधि अपनाई जा सकती है। यह उल्लेखनीय है कि यहां रिपोर्ट किए गए लैंप प्रोटोकॉल ने बहु-प्रयोगशाला सत्यापन19को सफलतापूर्वक पूरा कर लिया है। अमेरिकी एफडीए के बाम अध्याय 5 साल्मोनेला27में इस लैंप प्रोटोकॉल के हाल ही में शामिल करने के साथ, यह उम्मीद है कि विधि पशु भोजन में एक तेजी से स्क्रीनिंग विधि के रूप में और सभी खाद्य श्रेणियों से प्रकल्पित साल्मोनेला के लिए एक विश्वसनीय पुष्टि विधि के रूप में बहुत व्यापक उपयोग हासिल करेगी।

Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है । इस पांडुलिपि में व्यक्त विचार लेखकों के हैं और जरूरी स्वास्थ्य और मानव सेवा विभाग, अमेरिकी खाद्य एवं औषधि प्रशासन, या अमेरिकी सरकार की आधिकारिक नीति को प्रतिबिंबित नहीं करते । किसी भी वाणिज्यिक सामग्री, उपकरण, या प्रक्रिया के संदर्भ में किसी भी तरह से खाद्य एवं औषधि प्रशासन द्वारा अनुमोदन, समर्थन, या सिफारिश का गठन नहीं करता है ।

Acknowledgments

लेखक एफडीए के माइक्रोबायोलॉजी विधिध्यध्य उपसमिति (एमएमवीएस) और बैक्टीरियोलॉजिकल एनालिटिकल मैनुअल (बीएएम) परिषद के सदस्यों को गंभीर रूप से साल्मोनेला लैंप विधि सत्यापन अध्ययन की समीक्षा करने के लिए धन्यवाद देते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brain heart infusion (BHI) broth BD Diagnostic Systems, Sparks, MD 299070 Liquid growth medium used in the cultivation of Salmonella.
Buffered peptone water (BPW) BD Diagnostic Systems, Sparks, MD 218105 Preenrichment medium for the recovery of Salmonella from animal food samples.
DNA AWAY Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 7010 Eliminates unwanted DNA and DNase from laboratory bench, glassware, and plasticware without affecting subsequent DNA samples.
Genie Explorer software OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom Version 2.0.6.3 Supports remote operation of Genie instruments including LAMP runs and data analysis.
Genie II or Genie III (LAMP instrument) OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom GEN2-02 or GEN3-02 A small instrument capable of temperature control up to 100 °C with ± 0.1 °C accuracy and simultaneous fluorescence detection via the FAM channel. Genie II has 2 blocks (A and B) with 8 samples in each block. Genie III has a single block that accommodates 8 samples.
Genie strip OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom OP-0008 8-well microtube strips with integral locking caps and a working volume of 10 to 150 µl.
Genie strip holder OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom GBLOCK Used to hold Genie strips when setting up a LAMP reaction, the aluminum holder can also be used as a cool block.
Hydrochloric acid (HCl) solution, 1 N Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA SA48-500 Adjusts pH of animal food samples after adding BPW and prior to overnight enrichment.
Heat block Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 88-860-022 Heats samples at 100 ± 1 oC for DNA extraction.
Incubator Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 3960 Standard laboratory incubator.
ISO-001 isothermal master mix OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom ISO-001 An optimized master mix to simplify the assembly of a LAMP reaction, containing a strand-displacing GspSSD DNA polymerase large fragment from Geobacillus spp., thermostable inorganic pyrophosphatase, reaction buffer, MgSO4, dNTPs, and a double-stranded DNA binding dye (FAM detection channel).
Isopropanol Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA A416 Disinfects work surfaces.
LAMP primers Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, IA Custom LAMP primers with detailed information in Table 1.
Microcentrifuge Eppendorf North America, Hauppauge, NY 22620207 MiniSpin plus personal microcentrifuge.
Microcentrifuge tubes Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 05-408-129 Standard microcentrifuge tubes.
Molecular grade water Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA AM9938 Used in making primer stocks, primer mix, and LAMP reaction mix.
Sodium hydroxide (NaOH) solution, 1 N Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA SS266-1 Adjusts pH of animal food samples after adding BPW and prior to overnight enrichment.
Nonselective agar (e.g., blood agar, nutrient agar, and trypticase soy agar) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA R01202 Solid growth medium used in the cultivation of Salmonella.
Peptone water BD Diagnostic Systems, Sparks, MD 218071 Dilutes overnight Salmonella cultures to make positive control DNA.
Pipettes and tips Mettler-Toledo Rainin LLC, Oakland CA Pipet Lite LTS series Standard laboratory pipettes and tips.
PrepMan Ultra sample preparation reagent Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 4318930 A simple kit used for the rapid preparation of DNA templates for use in a LAMP reaction.
Salmonella reference strain LT2 ATCC, Manassas, VA 700720 Salmonella reference strain used as positive control.
Trypticase soy broth (TSB) BD Diagnostic Systems, Sparks, MD 211768 Liquid growth medium used in the cultivation of Salmonella.
Vortex mixer Scientific Industries, Inc., Bohemia, NY SI-0236 Standard laboratory vortex mixer.
Whirl-pak filter bag Nasco Sampling Brand, Fort Atkinson, WI B01318 Filter bags to hold animal food samples for preenrichment.

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References

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जीव विज्ञान अंक 159 लूप-मध्यस्थता आइसोथर्मल प्रवर्धन साल्मोनेला,आणविक विधि स्क्रीनिंग पशु भोजन पुष्टि
पशु खाद्य में स्क्रीनिंग <em>साल्मोनेला</em> के लिए लूप-मध्यस्थता Isothermal प्रवर्धन और संस्कृति अलगाव से <em>साल्मोनेला</em> की पुष्टि
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Domesle, K. J., Young, S. R., Yang, Q., Ge, B. Loop-Mediated Isothermal Amplification for Screening Salmonella in Animal Food and Confirming Salmonella from Culture Isolation. J. Vis. Exp. (159), e61239, doi:10.3791/61239 (2020).

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