La amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) es una prueba de amplificación de ácido nucleico isotérmico (iNAAT) que ha atraído un amplio interés en el campo de detección de patógenos. Aquí, presentamos un protocolo Salmonella LAMP validado multi-laboratorio como un método rápido, confiable y robusto para la detección de Salmonella en alimentos animales y la confirmación de la presunta Salmonella del aislamiento cultural.
La amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) ha surgido como una potente prueba de amplificación de ácido nucleico para la detección rápida de numerosos agentes bacterianos, fúngicas, parásitos y virales. La salmonela es un patógeno bacteriano de importancia mundial en la seguridad alimentaria, incluidos los alimentos para los animales. Aquí se presenta un protocolo lamp de salmonela con múltiples laboratorios validado que se puede utilizar para examinar rápidamente los alimentos de los animales para detectar la presencia de la contaminación por Salmonella y también se puede utilizar para confirmar los presuntos aislados de Salmonella recuperados de todas las categorías de alimentos. El ensayo LAMP se dirige específicamente al gen de invasión Salmonella (invA)y es rápido, sensible y altamente específico. Los DNAs de plantilla se preparan a partir de caldos de enriquecimiento de alimentos para animales o cultivos puros de presuntos aislados salmonela. La mezcla de reactivos LAMP se prepara combinando una mezcla maestra isotérmica, imprimaciones, plantilla de ADN y agua. El ensayo LAMP se ejecuta a una temperatura constante de 65 °C durante 30 min. Los resultados positivos se supervisan a través de la fluorescencia en tiempo real y se pueden detectar tan pronto como 5 min. El ensayo LAMP exhibe una alta tolerancia a los inhibidores en los alimentos o medios de cultivo de los animales, sirviendo como un método rápido, fiable, robusto, rentable y fácil de usar para la detección y confirmación de Salmonella. El método LAMP se ha incorporado recientemente al Capítulo 5 del Manual Analítico Bacteriológico (BAM) de la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos.
La amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) es una nueva prueba de amplificación de ácido nucleico isotérmico (iNAAT) inventada en 2000 por un grupo de científicos japoneses1. A través de la formación de una estructura de ADN de bucle vástago específica del objetivo durante los pasos iniciales, LAMP utiliza una polimerasa de ADN que desplaza las hebras para amplificar eficientemente este material de partida de forma cuasi exponencial, lo que resulta en 109 copias de objetivo en menos de 1 h1. En comparación con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), un NAAT ampliamente utilizado, LAMP posee varias ventajas. En primer lugar, las reacciones LAMP se llevan a cabo en condiciones isotérmicas. Esto obvia la necesidad de un sofisticado instrumento de ciclismo térmico. En segundo lugar, LAMP es altamente tolerante a los medios de cultivo y sustancias biológicas2 con robustez demostrada tanto para aplicaciones clínicas como alimentarias3,4. Esto simplifica la preparación de la muestra y minimiza los resultados negativos falsos5. En tercer lugar, LAMP es apto para múltiples plataformas de detección, como turbidez, colorimetría, bioluminiscencia, fluorescencia y microfluídica6. En cuarto lugar, LAMP es muy específico, ya que utiliza de cuatro a seis imprimaciones especialmente diseñadas para dirigirse a seis a ocho regiones específicas1,7. En quinto lugar, LAMP es ultrasensible y numerosos estudios han informado de su sensibilidad superior a PCR o PCR8en tiempo real. Por último, LAMP es más rápido con muchos ensayos que ahora adoptan un tiempo de ejecución estándar de 30 minutos, mientras que los ensayos de tipo PCR suelen tomar 1-2 h8.
Estas atractivas características alimentaron la aplicación de LAMP en amplias áreas de detección de patógenos, incluyendo diagnóstico in vitro 9,diagnóstico de enfermedades animales10y pruebas alimentarias y ambientales11. En particular, la OMS ha recomendado una TB-LAMP (LAMP for Mycobacterium tuberculosis)como prueba de sustitución válida para la microscopía de frotis de esputo para diagnósticos de tuberculosis pulmonar en entornos periféricos12. La aplicación LAMP también se expande más allá de la identificación microbiana para incluir la detección de alérgenos, especies animales, resistencia a fármacos, organismos genéticamente modificados y pesticidas13.
Salmonella no fofódica es un patógeno zoonótico de considerable seguridad alimentaria y preocupación de salud pública en todo el mundo14. También se ha identificado como un importante peligro microbiano en los alimentos para animales (es decir, alimentos para animales)15,16. Para prevenir enfermedades/brotes de Salmonella de alimentos humanos contaminados y alimentos para animales, es imperativo contar con métodos rápidos, fiables y robustos para probar Salmonella en una variedad de matrices. En la última década, se han realizado considerables esfuerzos internacionales en el desarrollo y aplicación de ensayos de Salmonella LAMP en una amplia gama de matrices de alimentos, como se resumió recientemente en una extensa revisión8. Varios ensayos de Salmonella LAMP, incluido el presentado aquí, han completado con éxito la validación multi-laboratorio siguiendo directrices internacionales bien establecidas17,18,19,20.
Nuestro ensayo Salmonella LAMP se dirige específicamente al gen de invasión Salmonella invA (número de adhesión a GenBank M90846)21 y es rápido, fiable y robusto en múltiples matrices de alimentos4,22,23,24,25,26. El método ha sido validado en seis matrices de alimentos para animales en un estudio precollaborante26 y en alimentos para perros secos en un estudio colaborativo multi-laboratorio19. Como resultado, el método Salmonella LAMP presentado aquí se ha incorporado recientemente al Manual Analítico Bacteriológico (BAM) capítulo 5 salmonella 27 de la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) capítulo 5 Salmonella27 para servir dos propósitos, uno como método de detección rápida para la presencia de Salmonella en alimentos animales y dos como un método de confirmación confiable para la presunta Salmonella aislada de todos los alimentos.
Hemos presentado aquí un método LAMP simple, rápido, específico y sensible para la detección y confirmación de Salmonella en alimentos para animales y cultivo puro, respectivamente. Con la comodidad de una mezcla maestra isotérmica que contiene cuatro reactivos clave, y una mezcla de imprimación preparada internamente lista para usar, el montaje de una reacción LAMP requiere sólo unos pocos pasos de pipeteo (Figura 1). El tiempo total de ejecución, incluidas las fases de amplificación y recocido, es inferior a 38 min(Figura 2A, B y Figura 3A,B). Los resultados positivos se supervisan mediante fluorescencia en tiempo real(Figura 2C y Figura 3C,D)y se pueden detectar tan pronto como 5 min26. La fase de recocido sirve como una confirmación adicional de la especificidad de LAMP ya que sólo las muestras con Tm correcta (alrededor de 90 °C) se notifican como positivas(Figura 2D, E y Figura 3E-G). Previamente se han notificado sensibilidades de 1 célula salmonela en cultivo puro y < 1 CFU/25 g en alimentosanimales.
Como LAMP es bastante eficaz y genera una gran cantidad de ADN1,es fundamental que se utilicen las mejores prácticas de laboratorio para prevenir la contaminación cruzada, que pueden incluir separar físicamente las áreas para preparar la mezcla maestra LAMP y agregar plantillas de ADN, evitar generar aerosoles, usar puntas de pipeta de filtro, cambiar guantes a menudo y abstenerse de abrir tubos de reacción LAMP después de la amplificación.
La especificidad de este método Salmonella LAMP se probó previamente utilizando 300 cepas bacterianas (247 Salmonella de 185 serovars y 53 noSalmonella)y demostró ser 100% específica26. En particular, se observaron diferencias significativas en Tmax entre las dos especies de Salmonella, S. enterica y Salmonella bongori,y entre las subespecies S. enterica, especialmente subsp. arizonae (IIIa)26. No obstante, estos resultados positivos siguen siendo válidos según las normas para interpretar los resultados de LAMP. En nuestro estudio colaborativo multi-laboratorio en alimentos para perros secos en el que participaron 14 analistas19,ocasionalmente se observaron muestras con resultados inconsistentes en corridas duplicadas de LAMP. Estos generalmente implicaban muestras con resultados positivos retrasados(Máx. T> 15 min). Repetir ambas ejecuciones de forma independiente normalmente resuelve el problema. Más raramente, observamos muestras con valoresmáximos T m correctospero no o irregulares T(< 5 min). Esto fue generalmente causado por burbujas de aire en el tubo de reacción.
A lo largo del ciclo de vida del desarrollo de métodos LAMP, evaluación, estudio precolaborante y validación multi-laboratorio, hemos observado alta tolerancia de LAMP a inhibidores en diversos alimentos animales o matrices alimentarias y medios de cultivo4,19,22,23,24,destacando la robustez del método y colaborando numerosos otros estudios a escala global8. Esto es superior en comparación con PCR o PCR en tiempo real, que normalmente requiere un control de amplificación interna para asegurarse de que los resultados negativos no se deben a la inhibición de la matriz28. Además, LAMP demostró una especificidad y sensibilidad similares (o superiores) en comparación con pcr o PCR en tiempo real en la gran mayoría de los estudios8. El costo de los reactivos LAMP es de aproximadamente $1 por reacción. Los instrumentos LAMP utilizados en este protocolo son pequeños, de bajo mantenimiento y portátiles. Pueden manejar cualquier método de amplificación isotérmica que emplee la detección de objetivos mediante la medición de fluorescencia, LAMP incluido. Con el software LAMP, se pueden generar informes completos en varios formatos (pdf, texto e imagen).
La validación de métodos es un paso crítico antes de que se pueda adoptar un nuevo método para su uso rutinario. Cabe destacar que el protocolo LAMP notificado aquí ha completado con éxito la validación multi-laboratorio19. Con la reciente incorporación de este protocolo LAMP en el Capítulo 5 de Salmonella27de bam de la FDA de los Estados Unidos, se espera que el método obtenga un uso mucho más amplio, tanto como un método de detección rápida en alimentos para animales como como un método de confirmación confiable para los presuntos aislados salmonela de todas las categorías de alimentos.
The authors have nothing to disclose.
Los autores agradecen a los miembros del Subcomité de Validación de Métodos de Microbiología (MMVS) de la FDA y al Consejo del Manual Analítico Bacteriológico (BAM) por revisar críticamente los estudios de validación del método Salmonella LAMP.
Brain heart infusion (BHI) broth | BD Diagnostic Systems, Sparks, MD | 299070 | Liquid growth medium used in the cultivation of Salmonella. |
Buffered peptone water (BPW) | BD Diagnostic Systems, Sparks, MD | 218105 | Preenrichment medium for the recovery of Salmonella from animal food samples. |
DNA AWAY | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 7010 | Eliminates unwanted DNA and DNase from laboratory bench, glassware, and plasticware without affecting subsequent DNA samples. |
Genie Explorer software | OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom | Version 2.0.6.3 | Supports remote operation of Genie instruments including LAMP runs and data analysis. |
Genie II or Genie III (LAMP instrument) | OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom | GEN2-02 or GEN3-02 | A small instrument capable of temperature control up to 100 °C with ± 0.1 °C accuracy and simultaneous fluorescence detection via the FAM channel. Genie II has 2 blocks (A and B) with 8 samples in each block. Genie III has a single block that accommodates 8 samples. |
Genie strip | OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom | OP-0008 | 8-well microtube strips with integral locking caps and a working volume of 10 to 150 µl. |
Genie strip holder | OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom | GBLOCK | Used to hold Genie strips when setting up a LAMP reaction, the aluminum holder can also be used as a cool block. |
Hydrochloric acid (HCl) solution, 1 N | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | SA48-500 | Adjusts pH of animal food samples after adding BPW and prior to overnight enrichment. |
Heat block | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 88-860-022 | Heats samples at 100 ± 1 oC for DNA extraction. |
Incubator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 3960 | Standard laboratory incubator. |
ISO-001 isothermal master mix | OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom | ISO-001 | An optimized master mix to simplify the assembly of a LAMP reaction, containing a strand-displacing GspSSD DNA polymerase large fragment from Geobacillus spp., thermostable inorganic pyrophosphatase, reaction buffer, MgSO4, dNTPs, and a double-stranded DNA binding dye (FAM detection channel). |
Isopropanol | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | A416 | Disinfects work surfaces. |
LAMP primers | Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, IA | Custom | LAMP primers with detailed information in Table 1. |
Microcentrifuge | Eppendorf North America, Hauppauge, NY | 22620207 | MiniSpin plus personal microcentrifuge. |
Microcentrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 05-408-129 | Standard microcentrifuge tubes. |
Molecular grade water | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | AM9938 | Used in making primer stocks, primer mix, and LAMP reaction mix. |
Sodium hydroxide (NaOH) solution, 1 N | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | SS266-1 | Adjusts pH of animal food samples after adding BPW and prior to overnight enrichment. |
Nonselective agar (e.g., blood agar, nutrient agar, and trypticase soy agar) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | R01202 | Solid growth medium used in the cultivation of Salmonella. |
Peptone water | BD Diagnostic Systems, Sparks, MD | 218071 | Dilutes overnight Salmonella cultures to make positive control DNA. |
Pipettes and tips | Mettler-Toledo Rainin LLC, Oakland CA | Pipet Lite LTS series | Standard laboratory pipettes and tips. |
PrepMan Ultra sample preparation reagent | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 4318930 | A simple kit used for the rapid preparation of DNA templates for use in a LAMP reaction. |
Salmonella reference strain LT2 | ATCC, Manassas, VA | 700720 | Salmonella reference strain used as positive control. |
Trypticase soy broth (TSB) | BD Diagnostic Systems, Sparks, MD | 211768 | Liquid growth medium used in the cultivation of Salmonella. |
Vortex mixer | Scientific Industries, Inc., Bohemia, NY | SI-0236 | Standard laboratory vortex mixer. |
Whirl-pak filter bag | Nasco Sampling Brand, Fort Atkinson, WI | B01318 | Filter bags to hold animal food samples for preenrichment. |