Summary
Loop-medieret isotermisk forstærkning (LAMP) er en isotermisk nukleinsyreforstærkningstest (iNAAT), der har tiltrukket sig bred interesse for patogendetektionsfeltet. Her præsenterer vi en multilaboratorie-valideret Salmonella LAMP-protokol som en hurtig, pålidelig og robust metode til screening af Salmonella i dyrefoder og bekræftelse af formodede Salmonella fra kulturisolation.
Abstract
Loop-medieret isotermisk forstærkning (LAMP) har vist sig som en kraftfuld nukleinsyreforstærkningstest til hurtig påvisning af adskillige bakterielle, svampe-, parasitære og virale midler. Salmonella er et bakterielt patogen af verdensomspændende fødevaresikkerhedsproblem, herunder fødevarer til dyr. Præsenteret her er en multi-laboratorium-valideret Salmonella LAMP protokol, der kan bruges til hurtigt at screene animalske fødevarer for tilstedeværelsen af Salmonella forurening og kan også bruges til at bekræfte formodede Salmonella isolater inddrives fra alle fødevarekategorier. LAMP-analysen er specifikt rettet mod Salmonella-invasionsgenet (invA) og er hurtigt, følsomt og meget specifikt. Skabelon-DNO'er fremstilles af berigelses bouillon af dyrefoder eller rene kulturer af formodede Salmonella-isolater. LAMP reagensblandingen fremstilles ved at kombinere en isotermisk masterblanding, primere, DNA-skabelon og vand. LAMP-analysen kører ved en konstant temperatur på 65 °C i 30 min. Positive resultater overvåges via fluorescens i realtid og kan påvises så tidligt som 5 min. LAMP-analysen udviser høj tolerance over for hæmmere i dyrefoder eller kulturmedie, der tjener som en hurtig, pålidelig, robust, omkostningseffektiv og brugervenlig metode til screening og bekræftelse af Salmonella. LAMP-metoden er for nylig blevet indarbejdet i U.S. Food and Drug Administration's Bacteriological Analytical Manual (BAM) kapitel 5.
Introduction
Loop-medieret isotermisk forstærkning (LAMP) er en ny isotermisk nukleinsyreforstærkningstest (iNAAT), der blev opfundet i 2000 af en gruppe japanske forskere1. Gennem dannelsen af en målspecifik stem-loop DNA-struktur i de indledende trin bruger LAMP en strengfortrængende DNA-polymerase til effektivt at forstærke dette udgangsmateriale kvasi-eksponentielt, hvilket resulterer i 109 kopier af målet på mindre end 1 h1. Sammenlignet med polymerase kædereaktion (PCR), en udbredt NAAT, LAMP besidder flere fordele. For det første udføres LAMP-reaktioner under isotermiske forhold. Dette undgår behovet for et sofistikeret termisk cykelinstrument. For det andet er LAMP meget tolerant over for kulturmedier og biologiske stoffer2 med robusthed demonstreret til både kliniske og fødevareapplikationer3,4. Dette forenkler prøveforberedelsen og minimerer falske negative resultater5. For det tredje er LAMP modtagelig for flere detektionsplatforme, såsom uklarhed, colorimetry, bioluminescens, fluorescens og mikrofluidics6. For det fjerde er LAMP meget specifik, da den bruger fire til seks specialdesignede primere til at målrette seks til otte specifikke regioner1,7. For det femte, LAMP er ultrasensitive og talrige undersøgelser har rapporteret sin overlegne følsomhed over for PCR eller real-time PCR8. Endelig lampe er hurtigere med mange assays nu vedtage en 30 min standard køretid, mens PCR-type assays normalt tage 1−2 h8.
Disse attraktive egenskaber gav næring til anvendelsen af LAMP i områder med detektion af bred patogen, herunder in vitro-diagnostik 9, dyresygdomsdiagnostik10og fødevare- og miljøtest11. Who har især anbefalet en TB-LAMP (LAMP for Mycobacterium tuberkulose)som en gyldig erstatningstest for sputum-smearmikroskopi for lungetuberkulosediagnoser i perifere miljøer12. LAMP-applikationen udvides også ud over mikrobiel identifikation til også at omfatte påvisning af allergener, dyrearter, lægemiddelresistens, genetisk modificerede organismer og pesticider13.
Nontyphoidal Salmonella er et zoonotisk patogen med betydelig fødevaresikkerhed og folkesundhed på verdensplan14. Det er også blevet identificeret som en vigtig mikrobiel fare i fødevarer til dyr (dvs. dyrefoder)15,16. For at forhindre Salmonella-sygdomme/-udbrud fra forurenede fødevarer til mennesker og animalske fødevarer er det bydende nødvendigt at have hurtige, pålidelige og robuste metoder til at teste Salmonella i en række forskellige matricer. I det seneste årti er der gjort en betydelig indsats internationalt med hensyn til udvikling og anvendelse af Salmonella LAMP-analyse i en lang række fødevarematricer, som for nylig opsummeret i en omfattende gennemgang8. Flere Salmonella LAMP assays, herunder den her præsenterede, har med succes afsluttet multi-laboratorium validering efter veletablerede internationale retningslinjer17,18,19,20.
Vores Salmonella LAMP assay specifikt rettet mod Salmonella invasion gen invA (GenBank tiltrædelse nummer M90846)21 og er hurtig, pålidelig og robust i flere fødevarer matricer4,22,23,24,25,26. Metoden er valideret i seks dyrefodermatrixer i en prækoborativ undersøgelse26 og i tør hundemad i et multilaboratoriekooperativt studie19. Som følge heraf er Salmonella LAMP-metoden, der præsenteres her, for nylig blevet indarbejdet i U.S. Food and Drug Administration (FDA)s Bacteriological Analytical Manual (BAM) Kapitel 5 Salmonella27 for at tjene to formål, en som en hurtig screeningsmetode for tilstedeværelsen af Salmonella i dyrefoder og to som en pålidelig bekræftelsesmetode for formodede Salmonella isoleret fra alle fødevarer.
Protocol
BEMÆRK: En LAMP reaktion mix indeholder DNA polymerase, buffer, MgSO4, dNTPs, primere, DNA-skabelon, og vand. De første fire reagenser er indeholdt i en isotermisk masterblanding (Tabel over materialer). Primere er forblandet in-house for at blive en primer mix (10x). DNA-skabeloner kan fremstilles af berigelses bouillon af dyrefoderprøver til screeningsformål eller fra kulturer af formodede Salmonella-isolater til bekræftelsesformål. Desuden indgår en positiv kontrol (DNA udvundet af salmonellareferencestammer, f.eks. Salmonella enterica serovar Typhimurium ATCC 19585 [LT2]) og en no template control (NTC; sterilt molekylært vand) i hver LAMP-kørsel.
1. Udarbejdelse af DNA-skabeloner
- Følg disse trin for at forberede DNA-skabeloner fra dyrefoderberigelser.
- Som aseptisk vejer 25 g foderprøve (f.eks. tør kattefoder, foder til tørre hunde, kvægfoder, hestefoder, fjerkræfoder og svinefoder) i en steril filterpose (Materialetabel) eller tilsvarende. Placer posen i en stor beholder eller rack for støtte under inkubation.
- Der tilsættes 225 mL sterilt bufferet peptonevand (BPW). Bland godt ved hvirvlende og kort håndmassage. Lad stå ved stuetemperatur i 60 ± 5 min.
- Bland godt ved hvirvlende og bestemme pH med en test papir. pH justeres om nødvendigt til 6,8 ± 0,2 med steril 1 N NaOH eller 1 N HCl. Inkuber ved 35 ± 2 °C i 24 ± 2 timer.
- Bland godt ved at hvirvle posen, der indeholder dyrefoderberigelse bouillon. Der overføres 1 mL fra den filtrerede side af posen til et mikrocentrifugerør. Vortex kort.
- Udtræk DNA ved hjælp af et prøvepræparatreagens (Materialetabel) som følger.
- Centrifuge ved 900 x g i 1 minut for at fjerne store partikler og overføre supernatant til et nyt mikrocentrifugerør.
- Centrifuge ved 16.000 x g i 2 min og kassér supernatant.
- Pelletlen suspenderes i 100 μL af prøveforberedelsesreagenset, og der opvarmes ved 100 ± 1 °C i 10 minutter i en tør varmeblok.
- Afkøles til stuetemperatur, og prøve-DNA-ekstrakterne opbevares ved -20 °C.
- Følg disse trin for at forberede DNA-skabeloner fra formodede Salmonella-kulturer.
- Få formodede Salmonella isolater fra kultur isolation i alle fødevarer efter FDA's BAM kapitel 5 Salmonella afsnit D: Isolation af Salmonella27.
- Pode formodede Salmonella-isolater på en ikke-ektiv agarplade (f.eks. blod agar, næringsstof agar og trypticase soja agar) og inkuberes ved 35 ± 2 °C i 24 ± 2 timer.
- Flere enkeltkolonier overføres til 5 mL trypticase soja bouillon (TSB) eller BHI-bouillon (hjernehjerteinfusion) og inkuberes ved 35 ± 2 °C i 16 ± 2 timer.
BEMÆRK: Dette trin kan være valgfrit, hvis den formodede Salmonella-kultur er ren. I så fald kan DNA-skabeloner fremstilles ved at suspendere flere enkeltkolonier i 5 mL TSB og opvarme 500 μL af suspensionen ved 100 ± 1 °C i 10 minutter i en tør varmeblok. Fortsæt med trin 5 nedenfor. - 500 μL af nattens kultur overføres til et mikrocentrifugerør og opvarmes ved 100 ± 1 °C i 10 minutter i en tør varmeblok.
- Afkøles til stuetemperatur og opbevares isolere DNA-ekstrakter ved -20 °C.
- For at forberede positivt kontrol-DNA skal du følge lignende trin som ovenfor for at forberede DNA-skabeloner fra formodede Salmonella-kulturer med et ekstra fortyndingstrin.
- Inokulere S. Typhimurium ATCC 19585 (LT2) eller salmonellareferencestammer på en ikke-ektiv agarplade (f.eks. blod agar, næringsstof agar og trypticase soja agar) og inkubere ved 35 ± 2 °C i 24 ± 2 timer.
- Flere enkeltkolonier overføres til 5 mL TSB- eller BHI-bouillon, og der inkuberes ved 35 ± 2 °C i 16 ± 2 timer for at nå ~109 CFU/mL.
- Serielt fortynde natten kultur i 0,1% peptone vand for at opnå ~ 107 CFU / mL.
- 500 μL af denne fortynding overføres til et mikrocentrifugerør og opvarmes ved 100 ± 1 °C i 10 minutter i en tør varmeblok.
- Afkøles til stuetemperatur, og der opbevares et positivt kontrol-DNA ved -20 °C.
2. Forberedelse af primer mix (10x)
- Få kommercielt syntetiserede LAMP primere (Sal4-F3, Sal4-B3, Sal4-FIP, Sal4-BIP, Sal4-LF og Sal4-LB) med standard afsaltningsrensning (tabel 1).
| Primer navn | Beskrivelse | Sekvens (5'-3') | Længde (bp) |
| Sal4-F3 | Fremad ydre primer | GAACGTGTCGCGGAAGTC | 18 |
| Sal4-B3 | Bagud ydre primer | CGGCAATAGCGTCACCTT | 18 |
| Sal4-FIP | Fremad indre primer | GCGCGGCATCCGCATCAATA-TCTGGATGGTATGCCCGG | 38 |
| Sal4-BIP | Baglæns inderprimer | GCGAACGGCGAAGCGTACTG-TCGCACCGTCAAAGGAAC | 38 |
| Sal4-LF | Sløjfe fremad primer | TCAAATCGGCATCAATACTCA-TCTG | 25 |
| Sal4-LB | Sløjfe bagudrettet primer | AAAGGGAAAGCCAGCTTTACG | 21 |
Tabel 1: LAMP primere til screening salmonella i animalske fødevarer og bekræftelse af Salmonella fra kultur isolation. Primerne er udformet på grundlag af Salmonella invA-sekvensen (GenBanks tiltrædelsesnummer M90846).
- Forbered stamopløsninger af hver primer (100 μM) ved at rehydrere primeren med passende mængde sterilt molekylært vand. Bland godt ved hvirvelstrømning i 10 s og opbevar ved -20 °C (-80 °C til langtidsopbevaring).
- Forbered primerblandingen (10x) i henhold til et regneark (tabel 2). Tilsæt passende mængder primerbestandopløsninger og sterilt molekylært vand i et mikrocentrifugerør. Bland alle reagenser godt ved hvirvelstrømning i 10 s.
| Komponent | Lagerkonk. (μM) | Primer mix conc. (μM) | Volumen (μL) |
| Sal4-F3 primer | 100 | 1 | 10 |
| Sal4-B3 primer | 100 | 1 | 10 |
| Sal4-FIP primer | 100 | 18 | 180 |
| Sal4-BIP primer | 100 | 18 | 180 |
| Sal4-LF primer | 100 | 10 | 100 |
| Sal4-LB primer | 100 | 10 | 100 |
| Molekylært vand | Nielsen | Nielsen | 420 |
| Samlede | Nielsen | Nielsen | 1000 |
Tabel 2: Regneark til forberedelse af LAMP primer mix (10x). Primerne er anført i tabel 1.
- 10x primerblandingen til 500 μL pr. mikrocentrifugerør og opbevares ved -20 °C.
3. Samling af en LAMP-reaktion
BEMÆRK: For at undgå krydskontaminering anbefales det på det kraftigste at adskille de områder, der bruges til at forberede LAMP-masterblandingen og tilføje DNA-skabeloner. Figur 1 er et LAMP-diagram.
Figur 1: Et skematisk diagram over Salmonella LAMP-arbejdsprocessen. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Klargør og kør installation
- Ren bænk med isopropanol og en DNA- og DNase-nedbrydende opløsning (Tabel over materialer). Rene pipetter og rørstribeholdere (Tabel over materialer) med DNA- og DNase-nedbrydende opløsning.
- Tø den isotermiske master mix, primer mix (10x), molekylær kvalitet vand, positiv kontrol DNA, og DNA skabeloner ved stuetemperatur.
- Tænd lampeinstrumentet (Table of Materials ),og tryk på åbningsskærmen for at få adgang til startskærmen. Følg disse trin for at oprette en kørsel.
BEMÆRK: En model af LAMP-instrumentet har 2 blokke (A og B) med 8 prøver i hver blok, og en anden model har en enkelt blok, der kan rumme 8 prøver(Tabel over materialer).- Tryk på LAMP+Anneal, og vælg Rediger for at angive eksempeloplysninger.
BEMÆRK: Lampekørselsprofilen består af forstærkning ved 65 °C i 30 min. og en annealfase fra 98 °C til 80 °C med en 0,05 °C decrement pr. sek. - Tryk på hver eksempelrække for at aktivere markøren, og angiv relevante eksempeloplysninger ved hjælp af AB-blokikonet for at skifte mellem de to LAMP-instrumentblokke.
- Tryk på ikonet Kontroller, når alle eksempeloplysninger er angivet.
BEMÆRK: Du kan også gemme kørselsopsætningen (navnet "Profil", som indeholder eksempeloplysninger sammen med standard-LAMP-kørselsprofilen, til senere brug. Tryk på ikonet Gem, og giv profilen et entydigt navn. Når du tester det samme sæt eksempler næste gang, kan en ny kørsel startes ved hjælp af den gemte profil. Tryk på ikonet Mappe nederst til venstre på startskærmen, og vælg Profil for at indlæse gemte profiler.
- Tryk på LAMP+Anneal, og vælg Rediger for at angive eksempeloplysninger.
- LAMP reaktionsmontering
BEMÆRK: Når du bruger begge LAMP-instrumentblokke (A og B, i alt 16 prøver), skal lampens masterblanding forberedes til 18 prøver. Hvis du kun bruger én LAMP-instrumentblok (8 prøver i alt), skal lampemasterblandingen forberedes til 10 prøver. For andre prøvenumre skal du justere lydstyrken i overensstemmelse hermed for at tage højde for pipetteringstab. Medtag altid en positiv kontrol og en NTC i hvert LAMP-løb. Det anbefales at teste hver enkelt prøve i uafhængige LAMP-kørsler.- Forbered LAMP master mix i henhold til et regneark (Tabel 3). Tilsæt passende mængder af isotermisk master mix, primer mix, og molekylær kvalitet vand i en mikrocentrifuge rør og vortex forsigtigt for 3 s. Centrifuge kort.
- Rørstrimlen anbringes i stripholderen, og 23 μL af LAMP-masterblandingen fordeles på hver brønd.
- Vortex alle DNA-skabeloner og centrifuge kort. Der tilsættes 2 μL DNA-skabelon til den passende brønd og hætten tæt.
- Fjern rørstrimlen fra holderen, og svirp håndleddet for at sikre, at alle reagenser er samlet i bunden af røret.
- Lad rørstrimlen ind i LAMP-instrumentblokkene, og sørg for, at hætterne er sikre, inden låget lukkes.
| Komponent | Arbejder conc. | Sidste reaktion conc. | Volumen pr. prøve (μL) | Volumen for 18 prøver (μL) | Volumen for 10 prøver (μL) |
| ISO-001 isotermisk master mix | 1.67x | 1x | 15 | 270 | 150 |
| Primer mix | 10x | 1x | 2.5 | 45 | 25 |
| Molekylært vand | Nielsen | Nielsen | 5.5 | 99 | 55 |
| Subtotal for mastermiks | Nielsen | Nielsen | 23 | 414 | 230 |
| DNA-skabelon | Nielsen | Nielsen | 2 | Nielsen | Nielsen |
Tabel 3: Regneark til forberedelse af LAMP-reaktionsblandingen. Primerblandingen (10x) fremstilles i henhold til tabel 2 ved hjælp af stamopløsninger af primere, der er anført i tabel 1.
4. LAMPE Kør
BEMÆRK: Under en LAMP-kørsel erhverves fluorescensaflæsninger ved hjælp af FAM-kanalen. Time-to-peak-værdierne(Tmax; min) bestemmes automatisk af instrumentet for det tidspunkt, hvor fluorescensforholdet når den maksimale værdi af forstærkningshastighedskurven. Tm (°C) er smelte-/udglødningstemperaturen for det endelige forstærkede produkt.
- Klik på ikonet Kør øverst til højre på skærmen, og vælg den eller de blokke, der indeholder rørstrimler, for at starte LAMP-kørslen.
- Du kan også trykke på fanen Temperatur, Forstærkningog Anneal , mens reaktionen er i gang, for at se dynamiske ændringer af forskellige parametre under LAMP-kørslen.
- Når kørslen er fuldført, skal du trykke på fanerne Forstærkning og Anneal for at se komplette forstærknings- og annealkurver og trykke på fanen Resultater for at se resultaterne.
- Du kan også registrere kørselsnummeret øverst til venstre på skærmen ved hjælp af formatet "instrumentserie number_run nummer", f.eks.
5. Fortolkning af LAMP Resultater
BEMÆRK: LAMP-resultaterne kan ses direkte på LAMP-instrumentpanelet og/eller ved hjælp af en LAMP-software (Tabel over materialer).
- Følg disse trin for at fortolke LAMP-resultaterne på instrumentpanelet.
- Tryk på ikonet Mappe nederst til venstre på startskærmen, og vælg Log for at navigere til filplaceringen for at indlæse det lampeløb, der er af interesse.
BEMÆRK: LAMP KØRER er organiseret efter dato, begyndende med året. - Overhold de fem faner, der er knyttet til hver kørsel: Profil, Temperatur, Forstærkning, Annealog Resultater.
BEMÆRK: Profil- og temperaturfanerne viser henholdsvis programmerede og faktiske temperaturer i prøvebrøndene, efterhånden som LAMP-reaktionen skrider frem. Forstærknings- og annealfanerne viser fluorescensaflæsninger og ændringer i henholdsvis fluorescens i forstærknings- og annealfaserne. Under fanen Resultater vises en tabelvisning af LAMP-resultaterne. - Tryk på fanen Resultater for at observere LAMP-resultaterne for hver brønd.
BEMÆRK: Der er tre kolonner (Nå, Forstærkning, og Anneal). Kolonnen "Forstærkning" viser værdierne for time-to-peak(Tmax; min:sec) for hver prøve ("Nå"), og kolonnen "Anneal" viser smelte-/udglødningstemperaturerne(Tm; °C) for ethvert forstærket produkt i brønden. - Fortolk LAMP-resultaterne, og rapporter de endelige LAMP-resultater på følgende måde.
- Undersøg kontrolbrøndene først. NTC-brønden skal have tom Tmax, mens Tm kan være enten tom (begge LAMP-instrumentmodeller) eller < 83 °C (kun for LAMP-instrumentmodellen med to blokke). Den positive kontrolbrønd skal have Tmax mellem 5 og 10 min. og Tm omkring 90 °C.
- Undersøg prøvebrøndene. Alle prøver med den korrekte Tm (ca. 90 °C) og Tmax (mellem 5−30 min. ) betragtes som positive for Salmonella.
- Anmeld de endelige LAMP-resultater baseret på resultater fra dublerede kørsler. Hvis dubletkørslerne har ensartede resultater, kan de endelige LAMP-resultater rapporteres. Hvis dublerede kørsler er inkonsekvente, gentages begge kørsler uafhængigt. Hvis resultaterne stadig er inkonsekvente, bør prøven betragtes som formodet positiv for Salmonella og skal gennemgå kulturbekræftelse.
- Tryk på ikonet Mappe nederst til venstre på startskærmen, og vælg Log for at navigere til filplaceringen for at indlæse det lampeløb, der er af interesse.
- Følg disse trin for at fortolke LAMP-resultaterne ved hjælp af softwaren.
- Klik på computerikonet i venstre panel, og naviger til filplaceringen for at indlæse LAMP-kørslen af interesse.
BEMÆRK: Computeren med softwaren installeret behøver ikke at være tilsluttet LAMP-instrumentet for at analysere LAMP-resultater, dvs. fjernadgang er tilgængelig. LAMP kører er organiseret efter dato. - Overhold de syv faner, der er knyttet til hvert løb: Profil, Temperatur, Forstærkning, Forstærkningshastighed, Anneal, Anneal-derivatog Resultat.
BEMÆRK: I lighed med instrumentpanelets visning viser profil- og temperaturfanerne henholdsvis programmerede og faktiske temperaturer i prøvebrøndene, efterhånden som LAMP-reaktionen skrider frem. Forstærknings-/forstærkningshastigheden og Anneal/Anneal-derivatfanerne viser henholdsvis fluorescensaflæsninger eller ændringer i fluorescens i henholdsvis forstærknings- og annealfaserne. Fanen Resultater viser en tabelvisning af LAMP-resultaterne, som afviger en smule fra instrumentpanelets visning. - Tryk på fanen Forstærkningshastighed for at få vist en grafisk visning af fluorescensforholdet efter tid. Klik på ikonet Indstilling øverst til højre på skærmen, og juster tærskelforholdet for registrering af spidsbelastning fra 0,020 til 0,010.
BEMÆRK: Justeringen er nødvendig for at sikre, at alle gyldige toppe identificeres, og de resultater, der opnås ved hjælp af softwaren, stemmer overens med dem, der vises på instrumentpanelet. - Tryk på fanen Resultat for at observere LAMP-resultaterne for hver brønd.
BEMÆRK: Der er fire kolonner (Grafnavn, Brøndnummer, Navn og Topværdi). Den øverste del af kolonnen "Peak Value" viser "Amp Time"(Tmax; min:sec) for hver prøve ("Brøndnavn"), mens den nederste del viser "Anneal Derivative" (Tm; °C) for ethvert forstærket produkt i brønden. - LAMP-resultaterne fortolkes, og de endelige LAMP-resultater rapporteres efter lignende trin, som når instrumentpanelet bruges med én undtagelse, at NTC-brønden og andre negative prøver skal have tomme Tm, da LAMP-softwareindstillingerne eliminerer disse Tm < 83 °C-resultater. På samme måde betragtes alle prøver med den korrekte Tm (ca. 90 °C) og Tmax (mellem 5−30 min) som positive for Salmonella.
- Klik på computerikonet i venstre panel, og naviger til filplaceringen for at indlæse LAMP-kørslen af interesse.
Representative Results
Figur 2 og figur 3 viser repræsentative LAMP-grafer/tabeller, der vises på begge platforme. I denne LAMP-kørsel er prøverne S1 til S6 10 gange serielle fortyndinger af S. enterica serovar Infantis ATCC 51741 fra 1,1 x 106 CFU til 11 CFU pr. reaktion. Positiv kontrol er S. enterica serovar Typhimurium ATCC 19585 (LT2) ved 1,7 x 104 CFU pr. reaktion, og NTC er vand af molekylær kvalitet.
Som vist i figur 2E og figur 3Ger både NTC- og PC-brønde gyldige kontrolelementer. NTC-brønden har tom Tmax, mens Tm er < 83 °C på LAMP instrumentpanelet og blank i LAMP-softwaren, hvilket tyder på et negativt resultat. Pc-brønden har enT-max på 7 min. 45 sek. og Tm på ~ 90 °C på begge platforme, hvilket tyder på et positivt resultat. Prøver S1 til S6 har Tmax mellem 6 min 30 sek og 12 min 15 sek, alle salmonella-positive.
Efter dobbeltkørsler af det samme sæt prøver rapporteres de endelige LAMP-resultater for disse prøver. Denne repræsentative LAMP-kørsel viser, at LAMP med succes registrerer Salmonella med en bred vifte af koncentrationer i prøverne.
Figur 2: Repræsentative LAMP-resultater, der vises på LAMP-instrumentpanelet. (a)Fanen Profil viser den programmerede temperaturprofil. (B) Temperaturfanen viser de faktiske temperaturer i prøvebrøndene, efterhånden som LAMP-reaktionen fortsætter. (C) Forstærkningsfanen viser lysstofmålinger under LAMP-forstærkning. (D) Fanen Anneal viser ændringer i fluorescens (afledt) i annealfasen. (E) Fanen Resultater viser en tabelvisning af LAMP-resultaterne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Repræsentative LAMP-resultater set i LAMP-softwaren. (a)Fanen Profil viser den programmerede temperaturprofil. (B) Temperaturfanen viser de faktiske temperaturer i prøvebrøndene, efterhånden som LAMP-reaktionen fortsætter. (C) Forstærkningsfanen viser lysstofmålinger under LAMP-forstærkning. (D) Fanen Forstærkningshastighed viser ændringer i lysstof (fluorescensforhold) under LAMP-forstærkning. (E) Fanen Anneal viser fluorescensaflæsninger i annealfasen. (F) Fanen Anneal-derivat viser ændringer i fluorescens (afledt) i annealfasen. (G) Fanen Resultat viser en tabelvisning af LAMP-resultaterne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Vi har her fremlagt en enkel, hurtig, specifik og følsom LAMP-metode til screening og bekræftelse af salmonella i henholdsvis dyrefoder og ren kultur. Med bekvemmeligheden af en isotermisk master mix, der indeholder fire centrale reagenser, og en klar til brug, in-house forberedt primer mix, samle en LAMP reaktion kræver kun et par pipetter trin (Figur 1). Den samlede køretid inklusive forstærknings- og annealfaser er mindre end 38 min. Positive resultater overvåges via fluorescens i realtid(figur 2C og figur 3C,D) og kan påvises allerede kl. Annealfasen tjener som en ekstra bekræftelse af LAMP's specificitet, da kun prøver med korrekt Tm (ca. 90 °C) rapporteres som positive(figur 2D, E og figur 3E−G). Følsomheden af 1 Salmonellacelle i ren kultur og < 1 CFU/25 g i dyrefoder er tidligere blevet rapporteret26.
Da LAMP er ret effektiv og genererer en stor mængde DNA1, er det afgørende, at bedste laboratoriepraksis bruges til at forhindre krydskontaminering, hvilket kan omfatte fysisk adskillelse af områderne til forberedelse af LAMP-masterblandingen og tilføjelse af DNA-skabeloner, undgå at generere aerosoler, bruge filterpipettespidser, skifte handsker ofte og afstå fra at åbne LAMP-reaktionsrør efter forstærkning.
Specificiteten af denne Salmonella LAMP-metode blev tidligere testet ved hjælp af 300 bakteriestammer (247 Salmonella på 185 serovars og 53ikke-Salmonella) og påvist at være 100% specifikke26. Især blev der observeret betydelige forskelle i Tmax mellem de to Salmonella arter, S. enterica og Salmonella bongori, og blandt S. enterica underarter, især subsp. arizonae (IIIa)26. Ikke desto mindre var disse stadig gyldige positive resultater i henhold til reglerne for fortolkning af LAMP-resultater. I vores multi-laboratorium kollaborativ undersøgelse i tør hundemad, som involverede 14 analytikere19, prøver, der har inkonsekvente resultater i dobbelt LAMP kører blev lejlighedsvis observeret. Disse involverede normalt prøver med forsinkede positive resultater(Tmax > 15 min). Hvis du gentager begge kørsler uafhængigt, blev problemet normalt løst. Mere sjældent observerede vi prøver med korrekte Tm, men ingen eller uregelmæssige Tmax-værdier (< 5 min). Dette var normalt forårsaget af luftbobler i reaktionsrøret.
Gennem hele livscyklus LAMP metode udvikling, evaluering, prækoborativ undersøgelse, og multi-laboratorium validering, har vi observeret høj tolerance over for LAMP til hæmmere i forskellige animalske fødevarer eller fødevarer matricer og kultur medier4,19,22,23,24, fremhæver robusthed af metoden og samarbejder med en lang række andre undersøgelser på globalt plan8. Dette er bedre sammenlignet med PCR eller REAL-TIME PCR, som normalt kræver en intern forstærkningskontrol for at sikre, at negative resultater ikke skyldes matrixhæmning28. Desuden viste LAMP lignende (eller overlegen) specificitet og følsomhed sammenlignet med PCR eller REAL-TIME PCR i langt de fleste undersøgelser8. Omkostningerne ved LAMP reagenser er på omkring $ 1 per reaktion. De LAMP-instrumenter, der bruges i denne protokol, er små, vedligeholdelsesfrie og bærbare. De kan håndtere enhver isotermisk forstærkningsmetode, der anvender måldetektering ved fluorescensmåling, medfølger LAMP. Ved hjælp af LAMP-softwaren kan omfattende rapporter genereres i flere formater (pdf, tekst og billede).
Metodevalidering er et kritisk trin, før der kan anvendes en ny metode til rutinemæssig brug. Det er bemærkelsesværdigt, at lampeprotokollen, der er rapporteret her, har gennemført validering af flere laboratorier19. Med den nylige inkorporering af denne LAMP-protokol i den amerikanske FDA's BAM Kapitel 5 Salmonella27, forventes det, at metoden vil få meget bredere anvendelse, både som en hurtig screeningsmetode i dyrefoder og som en pålidelig bekræftelsesmetode for formodede Salmonella-isolater fra alle fødevarekategorier.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser. De synspunkter, der kommer til udtryk i dette manuskript, er forfatternes og afspejler ikke nødvendigvis den officielle politik fra Department of Health and Human Services, U.S. Food and Drug Administration eller den amerikanske regering. Henvisning til kommercielle materialer, udstyr eller processer udgør på ingen måde godkendelse, godkendelse eller anbefaling fra Food and Drug Administration.
Acknowledgments
Forfatterne takker medlemmer af FDA's Microbiology Methods Validation Underudvalget (MMVS) og Bacteriological Analytical Manual (BAM) Rådet for kritisk gennemgang Salmonella LAMP metode validering undersøgelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain heart infusion (BHI) broth | BD Diagnostic Systems, Sparks, MD | 299070 | Liquid growth medium used in the cultivation of Salmonella. |
| Buffered peptone water (BPW) | BD Diagnostic Systems, Sparks, MD | 218105 | Preenrichment medium for the recovery of Salmonella from animal food samples. |
| DNA AWAY | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 7010 | Eliminates unwanted DNA and DNase from laboratory bench, glassware, and plasticware without affecting subsequent DNA samples. |
| Genie Explorer software | OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom | Version 2.0.6.3 | Supports remote operation of Genie instruments including LAMP runs and data analysis. |
| Genie II or Genie III (LAMP instrument) | OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom | GEN2-02 or GEN3-02 | A small instrument capable of temperature control up to 100 °C with ± 0.1 °C accuracy and simultaneous fluorescence detection via the FAM channel. Genie II has 2 blocks (A and B) with 8 samples in each block. Genie III has a single block that accommodates 8 samples. |
| Genie strip | OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom | OP-0008 | 8-well microtube strips with integral locking caps and a working volume of 10 to 150 µl. |
| Genie strip holder | OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom | GBLOCK | Used to hold Genie strips when setting up a LAMP reaction, the aluminum holder can also be used as a cool block. |
| Hydrochloric acid (HCl) solution, 1 N | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | SA48-500 | Adjusts pH of animal food samples after adding BPW and prior to overnight enrichment. |
| Heat block | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 88-860-022 | Heats samples at 100 ± 1 oC for DNA extraction. |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 3960 | Standard laboratory incubator. |
| ISO-001 isothermal master mix | OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom | ISO-001 | An optimized master mix to simplify the assembly of a LAMP reaction, containing a strand-displacing GspSSD DNA polymerase large fragment from Geobacillus spp., thermostable inorganic pyrophosphatase, reaction buffer, MgSO4, dNTPs, and a double-stranded DNA binding dye (FAM detection channel). |
| Isopropanol | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | A416 | Disinfects work surfaces. |
| LAMP primers | Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, IA | Custom | LAMP primers with detailed information in Table 1. |
| Microcentrifuge | Eppendorf North America, Hauppauge, NY | 22620207 | MiniSpin plus personal microcentrifuge. |
| Microcentrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 05-408-129 | Standard microcentrifuge tubes. |
| Molecular grade water | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | AM9938 | Used in making primer stocks, primer mix, and LAMP reaction mix. |
| Sodium hydroxide (NaOH) solution, 1 N | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | SS266-1 | Adjusts pH of animal food samples after adding BPW and prior to overnight enrichment. |
| Nonselective agar (e.g., blood agar, nutrient agar, and trypticase soy agar) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | R01202 | Solid growth medium used in the cultivation of Salmonella. |
| Peptone water | BD Diagnostic Systems, Sparks, MD | 218071 | Dilutes overnight Salmonella cultures to make positive control DNA. |
| Pipettes and tips | Mettler-Toledo Rainin LLC, Oakland CA | Pipet Lite LTS series | Standard laboratory pipettes and tips. |
| PrepMan Ultra sample preparation reagent | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 4318930 | A simple kit used for the rapid preparation of DNA templates for use in a LAMP reaction. |
| Salmonella reference strain LT2 | ATCC, Manassas, VA | 700720 | Salmonella reference strain used as positive control. |
| Trypticase soy broth (TSB) | BD Diagnostic Systems, Sparks, MD | 211768 | Liquid growth medium used in the cultivation of Salmonella. |
| Vortex mixer | Scientific Industries, Inc., Bohemia, NY | SI-0236 | Standard laboratory vortex mixer. |
| Whirl-pak filter bag | Nasco Sampling Brand, Fort Atkinson, WI | B01318 | Filter bags to hold animal food samples for preenrichment. |
References
- Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research. 28 (12), 63 (2000).
- Kaneko, H., Kawana, T., Fukushima, E., Suzutani, T. Tolerance of loop-mediated isothermal amplification to a culture medium and biological substances. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 70 (3), 499-501 (2007).
- Francois, P., et al. Robustness of a loop-mediated isothermal amplification reaction for diagnostic applications. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 62 (1), 41-48 (2011).
- Yang, Q., Wang, F., Prinyawiwatkul, W., Ge, B. Robustness of Salmonella loop-mediated isothermal amplification assays for food applications. Journal of Applied Microbiology. 116 (1), 81-88 (2014).
- Nagamine, K., Watanabe, K., Ohtsuka, K., Hase, T., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification reaction using a nondenatured template. Clinical Chemistry. 47 (9), 1742-1743 (2001).
- Zhang, X., Lowe, S. B., Gooding, J. J. Brief review of monitoring methods for loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Biosensors & Bioelectronics. 61, 491-499 (2014).
- Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Molecular and Cellular Probes. 16 (3), 223-229 (2002).
- Yang, Q., Domesle, K. J., Ge, B. Loop-mediated isothermal amplification for Salmonella detection in food and feed: Current applications and future directions. Foodborne Pathogens and Disease. 15 (6), 309-331 (2018).
- Mori, Y., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): Expansion of its practical application as a tool to achieve universal health coverage. Journal of Infection and Chemotherapy. 26 (1), 13-17 (2020).
- Mansour, S. M., Ali, H., Chase, C. C., Cepica, A. Loop-mediated isothermal amplification for diagnosis of 18 World Organization for Animal Health (OIE) notifiable viral diseases of ruminants, swine and poultry. Animal Health Research Reviews. 16 (2), 89-106 (2015).
- Kumar, Y., Bansal, S., Jaiswal, P. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A rapid and sensitive tool for quality assessment of meat products. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 16 (6), 1359-1378 (2017).
- WHO. The use of loop-mediated isothermal amplification (TB-LAMP) for the diagnosis of pulmonary tuberculosis: policy guidance. , Available from: http://www.who.int/tb/publications/lamp-diagnosis-molecular/en (2016).
- Kundapur, R. R., Nema, V. Loop-mediated isothermal amplification: Beyond microbial identification. Cogent Biology. 2, 1137110 (2016).
- WHO. Salmonella (non-typhoidal) fact sheet. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs139/en (2018).
- FAO/WHO. Executive summary report of the joint FAO/WHO expert meeting on hazards associated with animal feed. , Available from: http://www.fao.org/3/a-az851e.pdf (2015).
- FDA. Compliance Policy Guide Sec. 690.800 Salmonella in Food for Animals. , Available from: https://www.fda.gov/downloads/iceci/compliancemanuals/compliancepolicyguidancemanual/ucm361105.pdf (2013).
- Bird, P., et al. Evaluation of the 3M molecular detection assay (MDA) 2 - Salmonella for the detection of Salmonella spp. in select foods and environmental surfaces: collaborative study, first action 2016.01. Journal of AOAC International. 99 (4), 980-997 (2016).
- D'Agostino, M., et al. Validation of a loop-mediated amplification/ISO 6579-based method for analysing soya meal for the presence of Salmonella enterica. Food Analytical Methods. 9 (11), 2979-2985 (2016).
- Ge, B., et al. Multi-laboratory validation of a loop-mediated isothermal amplification method for screening Salmonella in animal food. Frontiers in Microbiology. 10, 562 (2019).
- D'Agostino, M., Diez-Valcarce, M., Robles, S., Losilla-Garcia, B., Cook, N. A loop-mediated isothermal amplification-based method for analysing animal feed for the presence of Salmonella. Food Analytical Methods. 8 (10), 2409-2416 (2015).
- Galan, J. E., Ginocchio, C., Costeas, P. Molecular and functional characterization of the Salmonella invasion gene invA: homology of InvA to members of a new protein family. Journal of Bacteriology. 174 (13), 4338-4349 (1992).
- Chen, S., Wang, F., Beaulieu, J. C., Stein, R. E., Ge, B. Rapid detection of viable salmonellae in produce by coupling propidium monoazide with loop-mediated isothermal amplification. Applied and Environmental Microbiology. 77 (12), 4008-4016 (2011).
- Yang, Q., Chen, S., Ge, B. Detecting Salmonella serovars in shell eggs by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Food Protection. 76 (10), 1790-1796 (2013).
- Yang, Q., et al. Evaluation of loop-mediated isothermal amplification for the rapid, reliable, and robust detection of Salmonella in produce. Food Microbiology. 46, 485-493 (2015).
- Yang, Q., Domesle, K. J., Wang, F., Ge, B. Rapid detection of Salmonella in food and feed by coupling loop-mediated isothermal amplification with bioluminescent assay in real-time. BMC Microbiology. 16 (1), 112 (2016).
- Domesle, K. J., Yang, Q., Hammack, T. S., Ge, B. Validation of a Salmonella loop-mediated isothermal amplification assay in animal food. International Journal of Food Microbiology. 264, 63-76 (2018).
- Andrews, W. H., Jacobson, A., Hammack, T. S. Bacteriological Analytical Manual. Chapter 5: Salmonella. , Available from: http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070149.htm (2020).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
