Summary
Het huidige protocol genereert mesh-vormige ontworpen cardiale weefsels met cardiovasculaire cellen afkomstig van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen om het onderzoek van celimplantatietherapie voor hartziekten mogelijk te maken.
Abstract
Het huidige protocol beschrijft methoden voor het genereren van schaalbare, mesh-vormige ontworpen cardiale weefsels (ECT's) samengesteld uit cardiovasculaire cellen afkomstig van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's), die zijn ontwikkeld naar het doel van klinisch gebruik. HiPSC-afgeleide cardiomyocyten, endotheelcellen en vasculaire muurschilderingcellen worden gemengd met gelmatrix en vervolgens gegoten in een polydimethylsiloxane (PDMS) weefselmal met rechthoekige interne gespreide palen. Op cultuurdag 14 ECT's vervallen in een 1,5 cm x 1,5 cm mesh structuur met 0,5 mm diameter myofiber bundels. Cardiomyocyten stemmen op de lange as van elke bundel en slaan spontaan synchroon. Deze aanpak kan worden opgeschaald naar een grotere (3,0 cm x 3,0 cm) mesh ECT met behoud van de bouw rijping en functie. Zo kunnen mesh-vormige ECT's gegenereerd uit hiPSC-afgeleide hartcellen haalbaar zijn voor cardiale regeneratieparadigma's.
Introduction
Talrijke preklinische studies en klinische studies hebben de efficiëntie van op cellen gebaseerde hartregeneratieve therapieën voor falende harten1,2,3bevestigd . Onder verschillende celtypen, menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) zijn veelbelovende celbronnen op grond van hun proliferative vermogen, potentieel om verschillende cardiovasculaire afstammingen4,,5, en allogene te genereren. Bovendien hebben weefseltechnische technologieën het mogelijk gemaakt om miljoenen cellen over te brengen op een beschadigd hart5,6,7,8.
Eerder rapporteerden we de generatie van driedimensionale (3D) lineair ontworpen hartweefsels (ECT's) uit hiPSC-afgeleide cardiovasculaire afstammingen met behulp van een commercieel beschikbaar kweeksysteem voor 3D biokunstweefsels5,7. We ontdekten dat de coëxistentie van vasculaire endotheelcellen en muurschilderingcellen met cardiomyocyten binnen de ECT structurele en elektrofysiologische weefselrijping vergemakkelijkte. Bovendien hebben we het therapeutisch potentieel van geïmplanteerde hiPSC-ECT's gevalideerd in een immuuntolerante rat hartinfarct model om de hartfunctie te verbeteren, myocardium te regenereren en angiogenese5te verbeteren. De lineaire ECT's die met deze methode werden geconstrueerd, waren echter 1 bij 10 mm cilinders en dus niet geschikt voor implantatie in preklinische studies met grotere dieren of klinisch gebruik.
Op basis van het succesvolle gebruik van weefselmallen om poreuze weefselvorming te genereren met behulp van rat skeletmyoblasten en cardiomyocyten9, menselijke ESC-afgeleide cardiomyocyten10 en muis iPSCs11, ontwikkelden we een protocol voor het genereren van schaalbare hiPSC-afgeleide grotere implanteerbare weefsel met behulp van polydimethylsiloxane (PDMS) mallen. We evalueerden een reeks schimmelgeometrieën om de meest effectieve schimmelkenmerken te bepalen. Mesh-vormige ECT's met meerdere bundels en knooppunten vertoonden uitstekende kenmerken in celconsistenties, weefselfunctie en schaalbaarheid in vergelijking met gewone of lineaire formaten die poriën of knooppunten misten. We implanteerden de mesh-vormige ECT in een rat hartinfarct model en bevestigde de therapeutische effecten vergelijkbaar met geïmplanteerde cilindrische ECTs12. Hier beschrijven we het protocol om een hiPSC-afgeleide mesh-vormige ECT te genereren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Onderhoud van hiPSC's en cardiovasculaire differentiatie
- Uitbreiden en onderhouden van hiPSC's op dunne-coat kelder membraan matrix (groeifactor verminderd, 1:60 verdunning) in geconditioneerd medium gewonnen uit muis embryonale fibroblasten (MEF-CM) met menselijke basis fibroblast groeifactor (hbFGF)4.
OPMERKING: We gebruikten een hiPSC's (4-factor (Oct3/4, Sox2, Klf4 en c-Myc) lijn: 201B6). Voeg hbFGF toe bij de juiste concentratie voor elke cellijn. Laminin-511 fragment kan ook worden gebruikt voor de coating van cultuur schotel in plaats van kelder membraan matrix. Commercieel verkrijgbaar medium ontworpen voor feeder-vrije cultuur van hiPSC's kan worden gebruikt als een substituut voor MEF-CM. - Gebruik Versene (0,48 mM ethylenediaminetetraaceticum (EDTA) om cellen los te maken en te scheiden wanneer celvloeiing 90\u2012100% bereikt.
LET OP: Andere commercieel verkrijgde producten voor celdissociatie kunnen ook worden gebruikt. - Plaatcellen met een dichtheid van 10.000 cellen/mm2 op met matrix gecoate celkweekplaten in MEF-CM met hbFGF en cultuur gedurende twee tot drie dagen.
- Wanneer de cultuur volledig samenvloeiend wordt, bedek de cellen met matrix (1:60 verdunning met MEF-CM) voor één dag.
- Vervang de MEF-CM door RPMI 1640 + B27 medium. Voeg 100 ng/mL Activin A en 100 ng/mL Wnt3A voor één dag toe aan het medium.
LET OP: Dit is dag 0 van differentiatie. Om canonieke Wnt-signalering te upreguleren, kunnen GSK3β-remmers ook worden gebruikt in plaats van Wnt3A. - Verander op dag 1 van differentiatie het medium naar nieuwe RPMI 1640 + B27 met 10 ng/mL BMP4 en 10 ng/mL hbFGF. Kweekcellen voor twee (MC-protocol) of vier (CM+EG-protocol) dagen zonder medium verandering5.
OPMERKING: HET CM+EC-protocol is geoptimaliseerd om tegelijkertijd cardiomyocyten (CMs) en vasculaire endotheelcellen (EC's) op te wekken. MC-protocol is geoptimaliseerd om bij voorkeur vasculaire muurschilderingcellen (MC's) te induceren. - CM+EG-protocol voor de inductie van CMs en EU's (figuur 1A).
- Vervang het medium op dag 5 van differentiatie door RPMI 1640 + B27 aangevuld met 50 ng/mL vegf165.
- Verander het cultuurmedium om de 48 uur tot dag 13\u201215 van differentiatie.
- MC-protocol voor de inductie van vasculaire muurschilderingcellen(figuur 1B)
- Vervang het medium door RPMI1640 + 10% foetale runderserum (FBS) op dag 3 van differentiatie.
- Verander het cultuurmedium om de 48 uur tot dag 13\u201215 van differentiatie.
2. Celoogst- en afstammingsanalyse op differentiatiedag 13\u201215
- Was de cellen met Ca2+ en Mg2+ vrij fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Voeg celdissociatieoplossing (met proteasen, collagenases en DNAses) toe in de celkweekschotel om de plaat te bedekken. Broed de plaat 5 min bij 37 °C.
- Verzamel en dissociale de cellen met cultuurmedium met behulp van een pipet na incubatie.
- Wijs 1 x 106 cellen toe voor lijnanalyse met stroomcytometrie. Om dode cellen te elimineren, bevlek de cellen met fixable levensvatbaarheid kleurstof.
- Bevlek de cellen met membraanoppervlakmarkeringen in PBS met 5% FBS. Gebruik de volgende verdunningen van antilichamen bij fluorescentie geactiveerde celsorteren (FACS) kleuringsbuffer: anti-PDGFRβ (1:100), anti-VE cadherine (1:100), anti-TRA-1-60 (1:20).
- Voor intracellulaire eiwitten, resuspend en fix de cellen met 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS.
- Vlek de cellen met anti-cardiale isoform van Troponin T (cTnT) in PBS met 5% FBS en 0,75% Saponin en label het cTnT-antilichaam vervolgens met 488 muis IgG1 (verdunning 1:50).
- Resuspend de gekleurde cellen in PBS met 5% FBS en zet ze in FACS buizen met celzeef.
- Analyseer de celsamenstelling van de gekleurde cellen van elk differentiatieprotocol met stroomcytometrie om het genereren van celsuspensies met gedefinieerde afstammingsverdelingen te vergemakkelijken.
OPMERKING: Tijdens het uitvoeren van deze procedure wordt de resterende celsuspensie voor EC's bewaard in een koelkast van 4 °C.
3. Fabricage van PDMS-weefselmal
- Giet een laag van 0,5 mm dik en meer dan 30 mm x 30 mm polydimethylsiloxaan (PDMS) door de voorpolymeer- en kruiskoppelingsoplossing te mengen met een verhouding van 10:1 en vervolgens te genezen bij 80 °C gedurende 3 uur.
- Snijd de PDMS-plaat en bind het met siliconenlijm om een rechthoekige lade van 21 mm x 20,5 mm te fabriceren met een lengte van 7 mm, 0,5 mm breed en 2,5 mm hoge rechthoekige palen in een gespreide positie. De horizontale afstand tussen twee lijnen van palen bedraagt 2,5 mm (figuur 2B).
- Autoclave de lade op 120 °C gedurende 20 minuten.
- Bekleed de lade met 1% poloxamer 407 in PBS voor 1 uur. Spoel de poloxamer 407 en spoel de mal voldoende voor gebruik af met PBS.
4. ECT-constructie
- Na de analyse van de cellijn, combineer de cellen van CM+EG- en MC-protocollen zodat de uiteindelijke concentratie van MC's 10 tot 20% is in een totaal celaantal van zes miljoen cellen per constructie5.
- Schort gemengde zes miljoen cellen op in ECT-kweekmedium (alfa minimaal essentieel medium aangevuld met 10% FBS, 50 μM 2-mercaptoethanol en 100 U/mL Penicilline-Streptomycin).
- Voorbereiding van matrixoplossing
- Meng 133 μL van zuur oplosbare rat staart collageen type I oplossing (2 mg/mL, pH 3) met 17 μL van 10x minimaal essentieel medium (MEM). Meng vervolgens de oplossing met 17 μL alkalibuffer (0,2 M NaHCO3,0,2 M HEPES en 0,1 M NaOH).
LET OP: Collageen moet op ijs worden gehouden (4 °C). Controleer buffer kleur en als het medium niet rozeachtig wanneer alle oplossingen worden gemengd, voeg extra alkali buffer aan het medium. De mengstappen moeten collageen I + 10x MEM mengen en vervolgens alkalibuffer toevoegen. Wijzig deze volgorde NIET. Genereer GEEN bubbels in de mix. - Voeg 67 μL keldermembraanmatrix toe aan de geneutraliseerde collageenoplossing.
LET OP: De gemengde oplossing moet op ijs worden gehouden (4 °C).
- Meng 133 μL van zuur oplosbare rat staart collageen type I oplossing (2 mg/mL, pH 3) met 17 μL van 10x minimaal essentieel medium (MEM). Meng vervolgens de oplossing met 17 μL alkalibuffer (0,2 M NaHCO3,0,2 M HEPES en 0,1 M NaOH).
- Centrifuge de voorbereide celsuspensie met zes miljoen cellen bij 1.100 tpm (240 x g)gedurende 5 min en resuspend de cellen met 167 μL high-glucose DMEM + 20% FBS + 1% penicilline-streptomycine (100x).
- Meng de celopening en de matrixoplossing. Het totale volume van cel/matrixmengsel voor één constructie is 400 μL.
OPMERKING: Het cel/matrixmengsel moet bij deze stap niet-stroperig en rozeachtig zijn. Houd het op ijs als de gel zal stollen bij kamertemperatuur. De uiteindelijke concentratie van collageen type I is 0,67 mg/mL. - Giet de cel / matrix mengsel gelijkmatig over de poloxamer 407 gecoate PDMS weefsel mal, die is geplaatst in een zes-put cultuur plaat12.
OPMERKING: Giet het mengsel voorzichtig om te voorkomen dat het genereren van bellen om te voorkomen dat vulling gebreken in de gegoten gel. - Het cel/matrixmengsel incuren in een standaard CO2-incubator (37C, 5 % CO2) gedurende 60 minuten.
- Nadat het weefsel is gevormd, weken de weefselmal met 4 mL van ECT cultuurmedium.
OPMERKING: Hoewel de cel/matrix in 60 minuten is gekruist, is de constructie nog steeds erg kwetsbaar. Voeg medium voorzichtig toe om beschadiging te voorkomen. - Kweek het weefsel gedurende 14 dagen met medium verandering elke dag.
- Verwijder de ECT voorzichtig van de laadpalen met gesteriliseerde fijne tangen voordat de ECT-implantatie wordt gesteriliseerd.
OPMERKING: De uiteindelijke ECT-afmetingen na verwijdering uit de mal zijn minder dan de oorspronkelijke mal. Een mal van 2,1 cm x 2,05 cm genereert een vrijgekomen ECT van ongeveer 1,5 cm x 1,5 cm. Een grotere mal van 3,9 cm x 4,05 cm genereert een ECT van ongeveer 3 cm x 3 cm. Losted ECT toont intrinsieke spontane afstraffing in warme cultuurmedium. Hoewel het in eerste instantie een mesh-structuur behoudt, krimpt en condenseert een ongeladen ECT in de loop van de tijd. Het is mogelijk om het weefsel zachtjes te houden met fijne tangen en vervolgens 7-0 zijden hechting te gebruiken om de ECT aan het epicardium te bevestigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1A,B toont de schema's van het CM+EC- en MC-protocol. Na het induceren van CMs en ECs uit het CM+EC-protocol en MC-protocol, worden de cellen gemengd om de uiteindelijke MC-concentraties aan te passen om 10 tot 20% van de totale cellen te vertegenwoordigen. De 2 cm brede weefselmal is vervaardigd volgens de ontwerptekening van 0,5 mm dik PDMS-vel(figuur 2A,B). Zes miljoen CM+EC+MC cellen worden gecombineerd met collageen I, en matrix en gegoten op het weefsel schimmel voorgecoat met poloxamer 407 (Figuur 2C). Tijdens voorlopige experimenten fabriceerden we weefselvormen met verschillende patronen die worden gekenmerkt door verschillende postlengtes en afstand en bevestigde we de uiteindelijke geometrieën van ECT's (figuur 3). Voor deze studie hebben we de mal met 7 mm lange palen met 2,5 mm brede intervallen geselecteerd.
Poloxamer 407 voorkomt celhechting aan de mal en maakte de vorming van karakteristieke mesh structuur na snelle gel verdichting in 14 dagen (figuur 4). Deze structuur wordt gehandhaafd, zelfs nadat de ECT is vrijgegeven van zijn mal. Het hele weefsel is ongeveer 1,5 cm breed en 0,5 mm dik, en de breedte van elke bundel in het gaas is gemiddeld ongeveer 0,5 mm.
Het is mogelijk om een 3 cm uiteindelijke breedte mesh ECT met vierentwintig miljoen cellen te genereren uit een vier keer grotere mal met dezelfde gespreide post ontwerp (Figuur 5A,B). Deze grotere mesh ECT kan gemakkelijk uit de mal worden verwijderd en genereert lokale actieve kracht die gelijkwaardig is aan de kleinere mesh ECT(figuur 5C).
Figuur 1: Protocollen om cardiovasculaire cellen te onderscheiden van door de mens veroorzaakte pluripotente stamcellen. Schematische diagrammen van protocollen die worden gebruikt om cardiomyocyten en vasculaire endotheelcellen (A, CM+EC-protocol) te induceren en vasculaire muurschilderingcellen (B, MC-protocol) te induceren. CM = cardiomyocyte; EC = endotheelcel; MC = vasculaire muurschilderingcel; iPSC = geïnduceerde pluripotente stamcel; MG = keldermembraanmatrix; ActA = Activin A; Wnt3a, BMP4, Bot morfogenetisch eiwit 4; bFGF = basisfiblastgroeifactor; VEGF = vasculaire endotheelcelgroeifactor; FBS = foetaal runderserum. Dit cijfer is aangepast van referentie Masumoto et al.5. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Fabricage van PDMS weefselmal en ECT-constructie. (A) Representatieve afbeelding van een ECT-mal vervaardigd uit 0,5 mm dikke PDMS-platen. (B) Ontwerp van de PDMS-weefselmal met 7 mm lange interne palen in gespreide positie; vooraanzicht (bovenste paneel) en zijaanzicht (onderste paneel). (C) Het schematische protocol van ECT constructie van hiPSC-afgeleide cardiovasculaire cellen en matrix gel. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Impact van weefselmalontwerpen op de uiteindelijke ECT-geometrieën. (A) Definities van postlengte (PL) en horizontale postafstand (HPS). (B) Een weefselmal zonder rechthoekige palen (PL0) en vormde een blad ECT. (C\u2012E) Weefselmallen met verschillende PL/HPS en mesh ECT's. (F) Een weefselmal met lange parallelle palen en vormde een meervoudige lineaire ECT. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Vorming van mesh ECT na gelverdichting. Representatieve reeks afbeeldingen van een mesh ECT-rijping van dag 0 tot en met 14 worden getoond. Cel/matrix wordt gegoten in de PDMS weefselmal (Dag 0_0 h), waarna het kweekmedium een uur later wordt toegevoegd (dag 0_1 uur). Op dag 1 worden elliptische poriën waargenomen rond laadpalen. De constructie toonde snelle gelverdichting en rijpte daarna in een meshweefsel. Op dag 14 komt het weefsel vrij uit de mal. De ongeladen ECT behoudt de mesh geometrie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Representatieve beelden van een grotere mesh ECT bestemd voor grote dierlijke preklinische proeven en klinische proeven. (A) Ontwerp van de 4 cm x 4 cm PDMS weefselmal met 7 mm lange palen en (B) een afbeelding van de mal. (C) Representatieve afbeelding van een 3 cm x 3 cm groter gaas ECT. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Pathologische en elektrofysiologische evaluatie van mesh ECT's. (A) Representatieve afbeelding voor een bundel in een mesh ECT gekleurd met Hoechst 33342 (blauw) voor levende cellen en Ethidium Homodimer III (rood) voor dode cellen. Schaalbalk: 250 μm. (B) Representatief beeld van een driedimensionaal confocal beeld van een bundel in een mesh ECT besmeurd met cardiale troponine T (groen). Lokale cardiomyocyte oriëntaties binnen de bundel worden gevisualiseerd als kleine lijnen, waarbij lijnkleur magnitude in de omtrek (groen), radiaal (rood) en axiale (blauwe) richtingen aangeeft. (C) Het sferische histogram toont lokale cardiomyocyteoriënten. Het volume van elke straal vertegenwoordigt het relatieve aantal voor elke richting en de dikke rode lijn toont de gemiddelde CM-oriëntatie. B) en C worden aangepast aan de hand van referentie13 met herziening. (D) Representatief beeld van contractielkrachtmeting. Een segment werd afgesneden op de rode stippellijn in een 1,5 cm x 1,5 cm mesh ECT en bevestigd aan de spier testen systeem met behulp van 10-0 nylon hechting. De witte pijlpunt geeft krachttransducer aan en de gele pijlpunt geeft een snelheidsregelaar aan. (E) Representatieve golfvormen van actieve stress op verschillende pacing frequenties van 1,5 Hz tot 4 Hz. Klik hier om dit cijfer te downloaden.
Aanvullende video 1: Intrinsieke afstraffing van een kruising in een mesh ECT op dag 14. Klik hier om deze video te downloaden.
Aanvullende video 2: Intrinsieke afstraffing van een bundel in een mesh ECT op dag 14. Klik hier om deze video te downloaden.
Aanvullende video 3: Intrinsieke afstraffing van een mesh ECT op dag 14 na het vrijkomen van de weefselmal. Klik hier om deze video te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Na de voltooiing van ons onderzoek naar een lineair formaat, hiPSC afgeleid ECT5, hebben we het protocol aangepast om hiPSC-afgeleide CMs, MC's en MC's te mengen om de in vitro expansie van vasculaire cellen binnen ECT's en de daaropvolgende in vivo vasculaire koppeling tussen ECT's en ontvanger myocardium te vergemakkelijken.
Om het genereren van grotere, implanteerbare mesh ECT-geometrieën te vergemakkelijken, hebben we dunne PDMS-platen gebruikt om de 3D-mallen te ontwerpen met laadpalen die op gespreide posities zijn opgesteld. Tijdens voorlopige experimenten merkten we op dat ECT's zich aan de PDMS-palen hielden tijdens gelverdichting en dus hebben we onze methode aangepast om elke mal te coaten met de oppervlakteactieve poloxamer om celhechting te voorkomen, wat een kritieke stap is van het huidige protocol9. ECT's blijven los van de interne laadpalen en de matrijsbodem tijdens in vitro rijping, wat gelverdichting en ECT-verwijdering uit de mal vergemakkelijkt. Een andere kritieke stap van het protocol is om de cel-gel matrix mengsel gelijkmatig giet in de PDMS mal voordat de matrix stolt. Het is van cruciaal belang om de procedure binnen een korte tijd te volbrengen. Bubbels in het cel-gel matrixmengsel moeten ook worden vermeden omdat het structurele vacuolatie en functionele verstoring van de ECT's kan veroorzaken.
Volgens de levensvatbaarheid tests, ongeveer 97% van de cellen in leven waren binnen de dag 14 constructies (Supplemental Figuur 1A). Aanvullende figuur 1B toont de hele mount confocale afbeelding gekleurd met cTnT die myofiber uitlijning parallel aan de lokale bundel lange as (Supplemental Figuur 1C)13. Alle constructies beginnen intrinsieke spontane kloppen in vitro binnen 72 uur en bleef slaan gedurende de duur van de cultuur (Aanvullende video's 1 \u20123). We analyseerden elektromechanische eigenschappen van 1,5 cm x 1,5 cm ECT's met behulp van een op maat geïsoleerd spiertestsysteem(supplementisch figuur 1D). ECT's vertoonden maximale pacing capture rates van 4 Hz en genereerden een gemiddelde actieve stress van 0,55 mN/mm2 bij 2 Hz, 5 V pacing protocol (n = 11, standaard fout van middelen = 0,063; Aanvullend cijfer 1E).
Hoewel we 7 mm lange interne laadpalen met intervallen van 5 mm hebben geselecteerd, is het mogelijk om de uiteindelijke ECT-geometrie te variëren door de lengte van laadpalen en het interval tussen aangrenzende palen te rangschikken (figuur 3). Bovendien is het mogelijk om de schaal van 1,5 cm x 1,5 cm ECT's uit te breiden naar grotere formaten zoals 3 cm x 3 cm groot gaas ECT. Volgens krachtmeting vertoonden 3 cm x 3 cm ECT's elektromechanische eigenschappen die vergelijkbaar zijn met 1,5 cm x 1,5 cm ECT's12. De flexibiliteit van de weefselvormen en de schaalbaarheid met de bewaarde weefselfunctie is van belang van het huidige protocol met betrekking tot reeds bestaande methoden.
Een beperking van het huidige protocol is dat de PDMS-mallen met de hand worden samengesteld uit PDMS-platen. Hoewel de bouw van millimeter-eenheid mallen haalbaar zou zijn door de hand-assemblage, mallen uit fotolithografie of gieten van master mallen zou meer geschikt zijn voor uitgebreide en stabiele ECT generatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen financiële of wetenschappelijke conflicten te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd financieel ondersteund door het Kosair Charities Pediatric Heart Research Program van de Universiteit van Louisville en het Organoid Project van het RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research. HiPSC's die in onze gepubliceerde protocollen werden gebruikt, werden geleverd door het Center for iPS Cell Research and Application, Kyoto University, Kyoto, Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Cell Culture Dishes 100x20 mm style | Falcon/ Thomas scientific | 9380C51 | |
| Multiwell Plates For Cell Culture 6well 50/CS | Falcon / Thomas scientific | 6902A01 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 761036 | |
| Reagents | |||
| Accumax | Innovative Cell Technologies | AM-105 | |
| BMP4, recombinant (10µg) | R&D | RSD-314-BP-010 | |
| Collagen, Type I solution from rat tail | Sigma | C3867 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | Corning | 356231 | |
| Human VEGF (165) IS, premium grade | Miltenyi | 130-109-385 | |
| Pluronic F-127, 0.2 µm filtered (10% Solution in Water) | Molecular Probes | P-6866 | |
| Recombinant human bFGF | WAKO | 060-04543 | |
| Recombinant Human/Mouse/Rat ActivinA (50µg) | R&D | 338-AC-050 | |
| rh Wnt-3a (10µg) | R&D | 5036-WN | |
| Versene solution | Gibco | 15040066 | |
| Culture medium and supplements | |||
| 10x MEM | Invitrogen | 11430 | |
| 2 Mercaptro Ethanol | SIGMA | M6250 | |
| B27 supplement minus insulin | Gibco | A1895601 | |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11965084 | |
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| NaHCO3 | Any | ||
| PBS 1x | Gibco | 10010-031 | |
| Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL) | Gibco | 15070-063 | |
| RPMI1640 medium | Gibco | 21870092 | |
| αMEM | Invitrogen | 11900024 | |
| Flowcytometry | |||
| anti-TRA-1-60, FITC, Clone: TRA-1-60, BD Biosciences | BD / Fisher | 560380 | |
| anti-Troponin T, Cardiac Isoform Ab-1, Clone: 13-11, Thermo Scientific Lab Vision | Fisher | MS-295-P0 | |
| BD FACS Clean Solution | BD | 340345 | |
| BD FACSFlow Sheath Fluid | BD | 342003 | |
| BD FACSRinse Solution | BD | 340346 | |
| EDTA | Any | ||
| Falcon Tube with Cell Strainer Cap (Case of 500) | Corning | 352235 | |
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Molecular Probes | L34957 | |
| PDGFRb; anti-CD140b, R-PE, Clone: 28D4, BD Biosciences | BD / Fisher | 558821 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47306-50G-F | |
| VEcad-FITC; anti-CD144, FITC, Clone: 55-7H1, BD Biosciences | BD / Fisher | 560411 | |
| Zenon Alexa Fluor 488 Mouse IgG1 Labeling Kit | Molecular Probes | Z25002 |
References
- Sanganalmath, S. K., Bolli, R. Cell therapy for heart failure: A comprehensive overview of experimental and clinical studies, current challenges, and future directions. Circulation Research. 113, 810-834 (2013).
- Fisher, S. A., Doree, C., Mathur, A., Martin-Rendon, E. Meta-Analysis of Cell Therapy Trials for Patients With Heart Failure. Circulation Research. 116, 1361-1377 (2015).
- Menasché, P., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors for severe heart failure treatment: first clinical case report: Figure 1. European Heart Journal. 36, 2011-2017 (2015).
- Masumoto, H., et al. Human iPS cell-engineered cardiac tissue sheets with cardiomyocytes and vascular cells for cardiac regeneration. Scientific Reports. 4, 6716 (2014).
- Masumoto, H., et al. The myocardial regenerative potential of three-dimensional engineered cardiac tissues composed of multiple human iPS cell-derived cardiovascular cell lineages. Scientific Reports. 6, 29933 (2016).
- Zimmermann, W. H., et al. Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts. Nature Medicine. 12, 452-458 (2006).
- Fujimoto, K. L., et al. Engineered fetal cardiac graft preserves its cardiomyocyte proliferation within postinfarcted myocardium and sustains cardiac function. Tissue engineering. Part A. 17, 585-596 (2011).
- Lancaster, J. J., et al. Surgical treatment for heart failure: cell-based therapy with engineered tissue. Vessel Plus. 2019, (2019).
- Bian, W., Liau, B., Badie, N., Bursac, N. Mesoscopic hydrogel molding to control the 3D geometry of bioartificial muscle tissues. Nature protocols. 4, 1522-1534 (2009).
- Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34, 5813-5820 (2013).
- Christoforou, N., et al. Induced pluripotent stem cell-derived cardiac progenitors differentiate to cardiomyocytes and form biosynthetic tissues. PloS one. 8, 65963 (2013).
- Nakane, T., et al. Impact of Cell Composition and Geometry on Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Engineered Cardiac Tissue. Scientific Reports. 7, 45641 (2017).
- Kowalski, W. J., et al. Quantification of Cardiomyocyte Alignment from Three-Dimensional (3D) Confocal Microscopy of Engineered Tissue. Microscopy and Microanalysis. 1, (2017).
