Summary
Das vorliegende Protokoll erzeugt netzförmige stämmige Herzgewebe, das kardiovaskuläre Zellen enthält, die aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen gewonnen wurden, um die Untersuchung der Zellimplantationstherapie für Herzkrankheiten zu ermöglichen.
Abstract
Das aktuelle Protokoll beschreibt Methoden zur Erzeugung skalierbarer, netzförmiger Herzgewebe (ECTs), die aus kardiovaskulären Zellen bestehen, die aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSCs) gewonnen werden und auf das Ziel der klinischen Anwendung hin entwickelt werden. HiPSC-abgeleitete Kardiomyozyten, Endothelzellen und vaskuläre Wandzellen werden mit Gelmatrix vermischt und dann in eine Polydimethylsiloxan (PDMS) Gewebeform mit rechteckigen inneren versetzten Pfosten gegossen. Am Kulturtag reifen 14 ECTs zu einer 1,5 cm x 1,5 cm Maschenöffnung mit Myofiberbündeln mit 0,5 mm Durchmesser. Cardiomyozyten richten sich an der Langachse jedes Bündels aus und schlagen spontan synchron. Dieser Ansatz kann auf einen größeren (3,0 cm x 3,0 cm) Mesh-ECT skaliert werden, wobei die Konstruktreifung und -funktion erhalten bleibt. So können netzförmige ECTs, die aus hiPSC-abgeleiteten Herzzellen erzeugt werden, für Kardialregenerationsparadigmen möglich sein.
Introduction
Zahlreiche präklinische Studien und klinische Studien haben die Effizienz zellbasierter herzregenerativer Therapien bei versagenden Herzen1,2,3bestätigt. Unter verschiedenen Zelltypen sind humaninduzierte pluripotente Stammzellen (HiPSCs) vielversprechende Zellquellen aufgrund ihrer proliferativen Fähigkeit, des Potenzials, verschiedene kardiovaskuläre Linien4,,5, und Allogenität zu erzeugen. Darüber hinaus haben Gewebe-Engineering-Technologien es möglich gemacht, Millionen von Zellen auf ein geschädigtes Herz zu übertragen5,6,7,8.
Zuvor berichteten wir über die Erzeugung dreidimensionaler (3D) linearer Herzgewebe (ECTs) aus hiPSC-abgeleiteten kardiovaskulären Linien mit einem kommerziell erhältlichen Kultursystem für biokünstliche 3D-Gewebe5,7. Wir fanden heraus, dass die Koexistenz von vaskulären Endothelzellen und Wandzellen mit Kardiomyozyten innerhalb des ECT die strukturelle und elektrophysiologische Gewebereifung erleichterte. Darüber hinaus haben wir das therapeutische Potenzial implantierter HiPSC-ECTs in einem immuntoleranten Myokardinfarktmodell der Ratte validiert, um die Herzfunktion zu verbessern, Myokard zu regenerieren und die Angiogenese zu verbessern5. Die nach diesem Verfahren konstruierten linearen ECTs waren jedoch 1 mm x 10 mm Zylinder und daher nicht für die Implantation in präklinischen Studien mit größeren Tieren oder der klinischen Anwendung geeignet.
Basierend auf der erfolgreichen Verwendung von Gewebeformen zur Erzeugung poröser, konstruierter Gewebebildung mit Ratenskelettmyoblasten und Kardiomyozyten9, humanen ESC-abgeleiteten Kardiomyozyten10 und Maus-iPSCs11, haben wir ein Protokoll entwickelt, um skalierbares, von HiPSC abgeleitetes größeres implantierbares Gewebe mit Polydimethylsiloxan (PDMS)-Formen zu erzeugen. Wir haben eine Reihe von Formgeometrien ausgewertet, um die effektivsten Werkzeugeigenschaften zu bestimmen. Mesh-förmige ECTs mit mehreren Bündeln und Knoten wiesen hervorragende Eigenschaften in Zelllebensfähigkeit, Gewebefunktion und Skalierbarkeit im Vergleich zu einfachen Oder linearen Formaten auf, denen Poren oder Knoten fehlten. Wir implantierten die netzförmige ECT in ein Myokardinfarktmodell der Ratte und bestätigten ihre therapeutische Wirkung ähnlich den implantierten zylindrischen ECTs12. Hier beschreiben wir das Protokoll zur Erzeugung eines hiPSC-abgeleiteten netzförmigen ECT.
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Protocol
1. Pflege von HiPSCs und kardiovaskuläre Differenzierung
- Erweitern und pflegen Sie hiPSCs auf dünnschichtigen Kellermembranmatrix (Wachstumsfaktor reduziert, 1:60 Verdünnung) in konditionierten Medium aus Maus embryonalen Fibroblasten (MEF-CM) mit humanen Basis-Fibroblasten-Wachstumsfaktor (hbFGF)4extrahiert.
HINWEIS: Wir haben eine hiPSCs (4-Faktor (Okt3/4, Sox2, Klf4 und c-Myc) Linie verwendet: 201B6). Fügen Sie hbFGF bei der entsprechenden Konzentration für jede Zelllinie hinzu. Laminin-511 Fragment kann auch für die Beschichtung von Kulturschale anstelle von Kellermembran Matrix verwendet werden. Kommerziell erhältliches Medium, das für die feederfreie Kultur von hiPSCs entwickelt wurde, kann als Ersatz für MEF-CM verwendet werden. - Verwenden Sie Versene (0,48 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Lösung), um Zellen zu lösen und zu dissoziieren, wenn die Zellkonfluenz 90-u2012100% erreicht.
HINWEIS: Es können auch andere handelsübliche Produkte zur Zelldissoziation verwendet werden. - Plattenzellen mit einer Dichte von 10.000 Zellen/mm2 auf matrixbeschichteten Zellkulturplatten in MEF-CM mit hbFGF und Kultur für zwei bis drei Tage.
- Wenn die Kultur vollständig konfluent wird, decken Sie die Zellen für einen Tag mit Matrix (1:60 Verdünnung mit MEF-CM) ab.
- Ersetzen Sie den MEF-CM durch RPMI 1640 + B27 medium. 100 ng/ml Activin A und 100 ng/ml Wnt3A für einen Tag in das Medium geben.
HINWEIS: Dies ist Tag 0 der Differenzierung. Um die kanonische Wnt-Signalisierung zu regulieren, können anstelle von Wnt3A auch GSK3-Inhibitoren verwendet werden. - Ändern Sie am ersten Tag der Differenzierung das Medium auf das neue RPMI 1640 + B27 mit 10 ng/ml BMP4 und 10 ng/ml hbFGF. Kulturzellen für zwei (MC-Protokoll) oder vier (CM+EC-Protokoll) Tage ohne mittlere Veränderung5.
HINWEIS: Das CM+EC-Protokoll ist so optimiert, dass gleichzeitig Kardiomyozyten (CMs) und vaskuläre Endothelzellen (ECs) induzieren. Das MC-Protokoll ist optimiert, um bevorzugt gefäßbildende Zellen (MCs) zu induzieren. - CM+EC-Protokoll zur Induktion von CMs und ECs (Abbildung 1A).
- Ersetzen Sie das Medium am 5. Tag der Differenzierung durch RPMI 1640 + B27, ergänzt durch 50 ng/ml VEGF165.
- Ändern Sie das Kulturmedium alle 48 h bis zum Tag 13-201215 der Differenzierung.
- MC-Protokoll zur Induktion von gefäßbildenden Wandzellen (Abbildung 1B)
- Ersetzen Sie das Medium an Tag 3 der Differenzierung durch RPMI1640 + 10% fetales Rinderserum (FBS).
- Ändern Sie das Kulturmedium alle 48 h bis zum Tag 13-201215 der Differenzierung.
2. Zellernte- und Abstammungsanalyse am Differenzierungstag 13-u201215
- Waschen Sie die Zellen mit Ca2+ und Mg2+ freier Phosphat-gepufferter Saline (PBS).
- Fügen Sie eine Zelldissoziationslösung (mit Proteasen, Kollagenen und DNAsen) in die Zellkulturschale ein, um die Platte zu bedecken. Inkubieren Sie die Platte für 5 min bei 37 °C.
- Sammeln und dissoziieren Sie die Zellen mit Kulturmedium mit einer Pipette nach der Inkubation.
- Weisen Sie 1 x 106 Zellen für die Linienanalyse mit Durchflusszytometrie zu. Um abgestorbene Zellen zu beseitigen, färben Sie die Zellen mit fixierbarem Lebensfähigkeitsfarbstoff.
- Färben Sie die Zellen mit Membranoberflächenmarkern in PBS mit 5% FBS. Verwenden Sie die folgenden Verdünnungen von Antikörpern in fluoreszenzaktivierten Zellsortierungspuffer (FACS): Anti-PDGFR (1:100), Anti-VE-Cadherin (1:100), Anti-TRA-1-60 (1:20).
- Für intrazelluläre Proteine die Zellen mit 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS resuspendieren und fixieren.
- Färben Sie die Zellen mit antikardialer Isoform von Troponin T (cTnT) in PBS mit 5% FBS und 0,75% Saponin, dann beschriften Sie den cTnT Antikörper mit 488 Maus IgG1 (Verdünnung 1:50).
- Setzen Sie die gebeizten Zellen in PBS mit 5% FBS wieder auf und legen Sie sie in FACS-Röhren mit Zellsieb.
- Analysieren Sie die Zellzusammensetzung der gefärbten Zellen aus jedem Differenzierungsprotokoll mit Durchflusszytometrie, um die Erzeugung von Zellsuspensionen mit definierten Linienverteilungen zu erleichtern.
HINWEIS: Bei dieser Durchführung dieses Verfahrens wird die verbleibende Zellsuspension für ECTs in einem 4 °C-Kühlschrank aufbewahrt.
3. Herstellung von PDMS Gewebeform
- Gießen Sie eine 0,5 mm dicke und über 30 mm x 30 mm Schicht Aus Polydimethylsiloxan (PDMS) durch Mischen des Prepolymers und der Vernetzungslösung im Verhältnis 10:1 und härten Sie dann bei 80 °C für 3 h aus.
- Schneiden Sie das PDMS-Blatt und verkleben Sie es mit Silikonkleber, um ein rechteckiges Tablett mit einer Höhe von 7 mm, einer Länge von 0,5 mm und 2,5 mm hohen rechteckigen Pfosten in gestaffelter Position herzustellen. Der horizontale Pfostenabstand zwischen zwei Pfostenlinien beträgt 2,5 mm (Abbildung 2B).
- Autoklavieren Sie das Fach bei 120 °C für 20 min.
- Beschichten Sie das Fach mit 1% Poloxamer 407 in PBS für 1 h. Spülen Sie den Poloxamer 407 und spülen Sie die Form mit PBS ausreichend vor Gebrauch.
4. ECT-Bau
- Kombinieren Sie nach der Zelllinienanalyse die Zellen aus CM+EC- und MC-Protokollen so, dass die endletzte Konzentration von MCs bei einer Gesamtzellenzahl von sechs Millionen Zellen pro Konstrukt510 bis 20 % beträgt.
- Suspend gemischte sechs Millionen Zellen in ECT-Kulturmedium (alpha Minimum essentielle Medium ergänzt mit 10% FBS, 50 M 2-Mercaptoethanol und 100 U/ml Penicillin-Streptomycin).
- Vorbereitung der Matrixlösung
- Mischen Sie 133 l säurelösliche Rattenschwanzkollagen Typ I Lösung (2 mg/ml, pH 3) mit 17 l von 10x Minimum Essential Medium (MEM). Mischen Sie dann die Lösung mit 17 l Alkalipuffer (0,2 M NaHCO3, 0,2 m HEPES und 0,1 M NaOH).
HINWEIS: Kollagen muss auf Eis (4 °C) gehalten werden. Überprüfen Sie die Pufferfarbe, und wenn das Medium nicht rosawird, wenn alle Lösungen gemischt werden, fügen Sie dem Medium zusätzlichen Alkalipuffer hinzu. Die Mischschritte müssen Kollagen I + 10x MEM mischen und dann Alkalipuffer hinzufügen. Ändern Sie diese Reihenfolge NICHT. Erzeugen Sie KEINE Blasen in der Mischung. - Fügen Sie der neutralisierten Kollagenlösung 67 L Kellermembranmatrix hinzu.
HINWEIS: Die Mischlösung muss auf Eis (4 °C) gehalten werden.
- Mischen Sie 133 l säurelösliche Rattenschwanzkollagen Typ I Lösung (2 mg/ml, pH 3) mit 17 l von 10x Minimum Essential Medium (MEM). Mischen Sie dann die Lösung mit 17 l Alkalipuffer (0,2 M NaHCO3, 0,2 m HEPES und 0,1 M NaOH).
- Zentrifugieren Sie die vorbereitete Zellsuspension mit sechs Millionen Zellen bei 1.100 U/min (240 x g) für 5 min und setzen Sie die Zellen mit 167 l hochglukosedmEM + 20% FBS + 1% Penicillin-Streptomycin (100x) wieder aus.
- Mischen Sie die Zellsuspension und die Matrixlösung. Das Gesamtvolumen der Zell-Matrix-Mischung für ein Konstrukt beträgt 400 l.
HINWEIS: Die Zell-Matrix-Mischung sollte in diesem Schritt nicht-viskos und rosafarben sein. Halten Sie es auf Eis, da das Gel bei Raumtemperatur erstarrt. Die Endkonzentration von Kollagen Typ I beträgt 0,67 mg/ml. - Gießen Sie die Zell-Matrix-Mischung gleichmäßig über die poloxamer 407 beschichtete PDMS-Gewebeform, die in eine Sechs-Well-Kulturplatte12gelegt wird.
HINWEIS: Gießen Sie die Mischung sorgfältig, um Blasen zu vermeiden, um Füllfehler im gegossenen Gel zu vermeiden. - Inkubieren Sie das Zell-Matrix-Gemisch in einem Standard-CO2-Inkubator (37C, 5 %CO2) für 60 min.2
- Nachdem das Gewebe gebildet wurde, tränken Sie die Gewebeform mit 4 ml ECT-Kulturmedium.
HINWEIS: Obwohl die Zelle/Matrix in 60 min vernetzt ist, ist das Konstrukt immer noch sehr zerbrechlich. Fügen Sie Das Medium vorsichtig hinzu, um eine Beschädigung zu vermeiden. - Kultur das Gewebe für 14 Tage mit mittlerer Veränderung jeden Tag.
- Entfernen Sie vor der ECT-Implantation den ECT vorsichtig mit sterilisierten Feinzangen von den Ladepfosten.
HINWEIS: Die endgültigen ECT-Abmessungen nach dem Entfernen aus der Form sind kleiner als die ursprüngliche Form. Eine 2,1 cm x 2,05 cm große Form erzeugt einen freigesetzten ECT von ca. 1,5 cm x 1,5 cm. Eine größere Form von 3,9 cm x 4,05 cm erzeugt einen ECT von ca. 3 cm x 3 cm. Unloaded ECT zeigt intrinsische spontane Schläge im warmen Kulturmedium. Obwohl zunächst eine Netzstruktur beibehalten wird, schrumpft und kondensiert ein entladener ECT im Laufe der Zeit. Es ist möglich, das Gewebe mit feinen Zangen weich zu halten und dann 7-0 Seidennaht zu verwenden, um den ECT am Epikardie zu befestigen.
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Representative Results
Abbildung 1A,B zeigt die Schaltpläne des CM+EC- und MC-Protokolls. Nach der Induktion von CMs und ECs aus cm+EC-Protokoll und MCs aus dem MC-Protokoll werden die Zellen gemischt und passen die endgültigen MC-Konzentrationen an 10 bis 20 % der Gesamtzellen an. Die 2 cm breite Gewebeform wird nach der Konstruktionszeichnung aus 0,5 mm dickem PDMS-Blatt gefertigt(Abbildung 2A,B). Sechs Millionen CM+EC+MC-Zellen werden mit Kollagen I und Matrix kombiniert und auf die mit Poloxamer 407 vorbeschichtete Gewebeform gegossen (Abbildung 2C). In Vorversuchen fertigten wir Gewebeformen mit verschiedenen Mustern, die sich durch unterschiedliche Pfostenlängen und -abstände auszeichneten und bestätigten Endgeometrien von ECTs (Abbildung 3). Wir haben die Form mit 7 mm langen Pfosten mit 2,5 mm breiten Intervallen für diese Studie ausgewählt.
Poloxamer 407 verhindert die Zellhaftung an der Form und ermöglicht die Bildung einer charakteristischen Netzstruktur nach schneller Gelverdichtung in 14 Tagen(Abbildung 4). Diese Struktur wird auch dann beibehalten, wenn der ECT aus seiner Form gelöst wird. Das gesamte Gewebe ist ca. 1,5 cm breit und 0,5 mm dick, und die Breite jedes Bündels im Netz beträgt im Durchschnitt ca. 0,5 mm.
Es ist möglich, ein 3 cm großes Netz ECT mit 24 Millionen Zellen aus einer viermal größeren Form mit dem gleichen gestaffelten Post-Design zu erzeugen (Abbildung 5A,B). Diese größere Netz-ECT kann einfach aus der Form entfernt werden und erzeugt lokale aktive Kraft, die dem kleineren Netz ECT entspricht (Abbildung 5C).
Abbildung 1: Protokolle zur Unterscheidung von kardiovaskulären Zellen von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen. Schematische Diagramme von Protokollen, die verwendet werden, um Kardiomyozyten und vaskuläre Endothelzellen (A, CM+EC-Protokoll) zu induzieren und gefäßbildende Zellen zu induzieren (B, MC-Protokoll). CM = Kardiomyozyten; EC = Endothelzelle; MC = vaskuläre Wandzelle; iPSC = induzierte pluripotente Stammzelle; MG = Kellermembranmatrix; ActA = Aktivin A; Wnt3a, BMP4, Knochen morphogenetisches Protein 4; bFGF = grundlegender Fibroblasten-Wachstumsfaktor; VEGF = vaskulärer endotheliale Zellwachstumsfaktor; FBS = fetales Rinderserum. Diese Figur ist von der Referenz Masumoto et al.5adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Herstellung von PDMS-Gewebeform und ECT-Konstruktion. (A) Repräsentatives Bild einer ECT-Form aus 0,5 mm dicken PDMS-Platten. (B) Konstruktion der PDMS-Gewebeform mit 7 mm langen Innenpfosten in gestaffelter Position angeordnet; Vorderansicht (obere Und Seitenansicht) und Seitenansicht (untere Ansicht). (C) Das schematische Protokoll der ECT-Konstruktion aus hiPSC-abgeleiteten kardiovaskulären Zellen und Matrixgel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Auswirkungen von Gewebeformkonstruktionen auf endgültige ECT-Geometrien. (A) Definitionen der Postlänge (PL) und des horizontalen Postabstands (HPS). (B) Eine Gewebeform ohne rechteckige Pfosten (PL0) und bildete ein Blatt ECT. (C-u2012E) Gewebeformen mit verschiedenen PL/HPS und Mesh-ECTs. (F) Eine Gewebeform mit langen parallelen Pfosten und bildete eine multiple lineare ECT. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Bildung von Mesh ECT nach Gelverdichtung. Repräsentative Bilderreihen einer Netz-ECT-Reifung vom Tag 0 bis 14 werden gezeigt. Zelle/Matrix wird in die PDMS-Gewebeform gegossen (Tag 0_0 h), dann wird kulturmedium eine Stunde später hinzugefügt (Tag 0_1 h). Am ersten Tag werden elliptische Poren um Ladepfosten beobachtet. Das Konstrukt zeigte eine schnelle Gelverdichtung und reifte danach zu einem Netzgewebe. Am 14. Tag wird das Gewebe aus der Form freigesetzt. Der entladene ECT behält die Netzgeometrie bei. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Repräsentative Bilder eines größeren Netzes ECT für vorklinische Großtierversuche und klinische Versuche. (A) Design der 4 cm x 4 cm PDMS Gewebeform mit 7 mm langen Pfosten und (B) einem Bild der Form. (C) Repräsentatives Bild eines 3 cm x 3 cm größeren Netzes ECT. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 1: Pathologische und elektrophysiologische Bewertung von Netz-ECTs. (A) Repräsentatives Bild für ein Bündel in einem Netz ECT mit Hoechst 33342 (blau) für lebende Zellen und Ethidium Homodimer III (rot) für abgestorbene Zellen gebeizt. Maßstabsleiste: 250 m. (B) Repräsentatives Bild eines dreidimensionalen konfokalen Bildes eines Bündels in einem Netz ECT mit Herztroponin T (grün) gefärbt. Lokale Kardiomyozytenausrichtungen innerhalb des Bündels werden als kleine Linien visualisiert, wobei die Linienfarbe die Größe in den umlaufenden (grünen), radialen (roten) und axialen (blauen) Richtungen angibt. (C) Das sphärische Histogramm zeigt lokale Kardiomyozytenausrichtungen an. Das Volumen jedes Strahls stellt die relative Anzahl für jede Richtung dar, und die dicke rote Linie zeigt die mittlere CM-Ausrichtung an. (B) und (C) werden von Bezug13 mit Überarbeitung angepasst. (D) Repräsentatives Bild der Kontraktilenkraftmessung. Ein Segment wurde an der roten gepunkteten Linie in einem 1,5 cm x 1,5 cm Mesh ECT abgeschnitten und mit 10-0 Nylon-Nähten am Muskeltestsystem befestigt. Die weiße Pfeilspitze zeigt den Kraftwandler und die gelbe Pfeilspitze den Hochgeschwindigkeits-Längenregler an. (E) Repräsentative Wellenformen aktiver Spannung bei unterschiedlichen Taktfrequenzen von 1,5 Hz bis 4 Hz. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung herunterzuladen.
Ergänzendes Video 1: Intrinsisches Schlagen einer Kreuzung in einem Netz ECT am 14. Tag. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Ergänzendes Video 2: Intrinsisches Schlagen eines Bündels in einem Netz ECT am 14. Tag. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Ergänzendes Video 3: Intrinsisches Schlagen eines Netzes ECT am 14. Tag nach der Freigabe aus der Gewebeform. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
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Discussion
Nach Abschluss unserer Untersuchung eines linearen Formats, hiPSC abgeleitet ECT5, passten wir das Protokoll an, um hiPSC-abgeleitete CMs, ECs und MCs zu mischen, um die In-vitro-Expansion von Gefäßzellen innerhalb von ECTs und die anschließende in vivo-Gefäßkopplung zwischen ECTs und Empfängermyokard zu erleichtern.
Um die Erzeugung größerer, implantierbarer Netz-ECT-Geometrien zu erleichtern, verwendeten wir dünne PDMS-Platten, um die 3D-Formen mit Ladepfosten zu entwerfen, die an gestaffelten Positionen angeordnet sind. Bei Vorversuchen stellten wir fest, dass ECTs während der Gelverdichtung an den PDMS-Pfosten hafteten, und so modifizierten wir unsere Methode, jede Form mit dem Tensid Poloxamer zu beschichten, um eine Zellhaftung zu verhindern, die ein kritischer Schritt des vorliegenden Protokolls9ist. ECTs bleiben während der In-vitro-Reifung von den inneren Ladepfosten und dem Formboden getrennt, was die Gelverdichtung und ECT-Entfernung aus der Form erleichtert. Ein weiterer kritischer Schritt des Protokolls besteht darin, die Zell-Gel-Matrix-Mischung gleichmäßig in die PDMS-Form zu gießen, bevor die Matrix erstarrt. Es ist wichtig, das Verfahren innerhalb kurzer Zeit durchzuführen. Blasen in der Zell-Gel-Matrix-Mischung sollten ebenfalls vermieden werden, da sie strukturelle Vakuolation und funktionelle Störungen der ECTs verursachen können.
Nach Lebensfähigkeits-Assays waren etwa 97% der Zellen innerhalb des Tages 14 Konstrukte am Leben (Supplemental Figure 1A). Ergänzende Abbildung 1B zeigt das gesamte konfokale Bild der Halterung, das mit cTnT befleckt ist und die Myofiberausrichtung parallel zur lokalen Bündel-Langachse darstellt (Ergänzende Abbildung 1C)13. Alle Konstrukte beginnen intrinsische spontane Schlagen in vitro innerhalb von 72 h und weiterhin schlagen während der gesamten Dauer der Kultur (Ergänzende Videos 1-u20123). Wir analysierten elektromechanische Eigenschaften von 1,5 cm x 1,5 cm ECTs mit einem kundenspezifischisolierten Muskeltestsystem (Supplemental Abbildung 1D). ECTs zeigten maximale Tempoaufnahmeraten von 4 Hz und erzeugten eine durchschnittliche aktive Spannung von 0,55 mN/mm2 bei 2 Hz, 5 V Schrittprotokoll (n = 11, Standardfehler der Mittelwerte = 0,063; Ergänzende Abbildung 1E).
Obwohl wir 7 mm lange interne Ladepfosten mit 5 mm Intervallen ausgewählt haben, ist es möglich, die endgültige ECT-Geometrie zu variieren, indem die Länge der Ladepfosten und das Intervall zwischen benachbarten Pfosten(Abbildung 3) anzuordnen sind. Darüber hinaus ist es möglich, die Skala von 1,5 cm x 1,5 cm ECTs auf größere Formate wie 3 cm x 3 cm großes Mesh ECT zu erweitern. Nach Kraftmessung zeigten 3 cm x 3 cm ECTs elektromechanische Eigenschaften ähnlich 1,5 cm x 1,5 cm ECTs12. Die Flexibilität der Gewebeformen und die Skalierbarkeit mit konservierter Gewebefunktion sind Bedeutungen des vorliegenden Protokolls in Bezug auf bereits bestehende Methoden.
Eine Einschränkung des vorliegenden Protokolls besteht darin, dass die PDMS-Formen von Hand aus PDMS-Platten zusammengesetzt werden. Obwohl der Bau von Millimeter-Einheiten-Formen durch Handmontage machbar wäre, wären Formen aus der Photolithographie oder gussaus Meisterformen besser für eine erweiterte und stabile ECT-Erzeugung geeignet.
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Disclosures
Die Autoren haben keine finanziellen oder wissenschaftlichen Konflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch das Kosair Charities Pediatric Heart Research Program an der University of Louisville und das Organoid Project am RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research finanziell unterstützt. HiPSCs, die in unseren veröffentlichten Protokollen verwendet werden, wurden vom Center for iPS Cell Research and Application, Kyoto University, Kyoto, Japan bereitgestellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Cell Culture Dishes 100x20 mm style | Falcon/ Thomas scientific | 9380C51 | |
| Multiwell Plates For Cell Culture 6well 50/CS | Falcon / Thomas scientific | 6902A01 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 761036 | |
| Reagents | |||
| Accumax | Innovative Cell Technologies | AM-105 | |
| BMP4, recombinant (10µg) | R&D | RSD-314-BP-010 | |
| Collagen, Type I solution from rat tail | Sigma | C3867 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | Corning | 356231 | |
| Human VEGF (165) IS, premium grade | Miltenyi | 130-109-385 | |
| Pluronic F-127, 0.2 µm filtered (10% Solution in Water) | Molecular Probes | P-6866 | |
| Recombinant human bFGF | WAKO | 060-04543 | |
| Recombinant Human/Mouse/Rat ActivinA (50µg) | R&D | 338-AC-050 | |
| rh Wnt-3a (10µg) | R&D | 5036-WN | |
| Versene solution | Gibco | 15040066 | |
| Culture medium and supplements | |||
| 10x MEM | Invitrogen | 11430 | |
| 2 Mercaptro Ethanol | SIGMA | M6250 | |
| B27 supplement minus insulin | Gibco | A1895601 | |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11965084 | |
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| NaHCO3 | Any | ||
| PBS 1x | Gibco | 10010-031 | |
| Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL) | Gibco | 15070-063 | |
| RPMI1640 medium | Gibco | 21870092 | |
| αMEM | Invitrogen | 11900024 | |
| Flowcytometry | |||
| anti-TRA-1-60, FITC, Clone: TRA-1-60, BD Biosciences | BD / Fisher | 560380 | |
| anti-Troponin T, Cardiac Isoform Ab-1, Clone: 13-11, Thermo Scientific Lab Vision | Fisher | MS-295-P0 | |
| BD FACS Clean Solution | BD | 340345 | |
| BD FACSFlow Sheath Fluid | BD | 342003 | |
| BD FACSRinse Solution | BD | 340346 | |
| EDTA | Any | ||
| Falcon Tube with Cell Strainer Cap (Case of 500) | Corning | 352235 | |
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Molecular Probes | L34957 | |
| PDGFRb; anti-CD140b, R-PE, Clone: 28D4, BD Biosciences | BD / Fisher | 558821 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47306-50G-F | |
| VEcad-FITC; anti-CD144, FITC, Clone: 55-7H1, BD Biosciences | BD / Fisher | 560411 | |
| Zenon Alexa Fluor 488 Mouse IgG1 Labeling Kit | Molecular Probes | Z25002 |
References
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