Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Forberedelse af mesh-formet manipuleret hjertevæv stammer fra humane iPS-celler til In Vivo Myokardiereparation

doi: 10.3791/61246 Published: June 9, 2020

Summary

Denne protokol genererer mesh-formet manipuleret hjertevæv, der indeholder hjerte-kar-celler stammer fra humane inducerede pluripotente stamceller til at tillade undersøgelse af celle implantation terapi for hjertesygdomme.

Abstract

Den nuværende protokol beskriver metoder til at generere skalerbare, mesh-formede manipuleret hjertevæv (ECTs) bestående af hjerte-kar-celler fremstillet af humane inducerede pluripotente stamceller (hiPSC), som er udviklet mod målet om klinisk brug. HiPSC-afledte kardiomyocytter, endotelceller og vaskulære vægmalericeller blandes med gelmatrix og hældes derefter i en polydimethylsiloxan (PDMS) vævsform med rektangulære interne forskudte stolper. Ved kulturdag 14 ECT'er modnes til en 1,5 cm x 1,5 cm mesh struktur med 0,5 mm diameter myofiber bundter. Kardiomyocytter tilpasse sig den lange akse af hvert bundt og spontant slå synkront. Denne fremgangsmåde kan skaleres op til en større (3,0 cm x 3,0 cm) mesh ECT og samtidig bevare konstruktørning og funktion. Således kan mesh-formede ECTs genereret fra hiPSC-afledte hjerteceller være muligt for hjerteregenerering paradigmer.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Talrige prækliniske undersøgelser og kliniske forsøg har bekræftet effektiviteten af cellebaserede hjertegenerative behandlinger for svigtende hjerter1,,2,,3. Blandt forskellige celletyper, humane inducerede pluripotente stamceller (hiPSCs) er lovende cellekilder i kraft af deres proliferative evne, potentiale til at generere forskellige hjerte-kar-slægter4,5, og allogenicitet. Desuden har vævsteknik teknologier gjort det muligt at overføre millioner af celler på etbeskadigethjerte 5,6,,7,8.

Tidligere rapporterede vi generation af tre-dimensionelle (3D) lineær manipuleret hjertevæv (ECTs) fra hiPSC-afledte hjerte-kar-slægter ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt kultursystem til 3D bioartificialt væv5,7. Vi fandt, at sameksistensen af vaskulære endotelceller og vægmaleri celler med kardiomyocytter inden for ECT lettet strukturelle og elektrofysiologiske væv modning. Desuden validerede vi det terapeutiske potentiale af implanterede hiPSC-ECT'er i en immuntolerant rotte myokardieinfarkt model for at forbedre hjertefunktionen, regenerere myokardiet og forbedre angiogenese5. De lineære ECT'er, der blev fremstillet ved denne metode, var imidlertid 1 mm med 10 mm cylindre og var derfor ikke egnede til implantation i prækliniske undersøgelser med større dyr eller klinisk anvendelse.

Baseret på en vellykket brug af væv forme til at generere porøse manipuleret væv dannelse ved hjælp af rotte skelet myoblaster og cardiomyocytes9, humane ESC-afledte cardiomyocytes10 og mus iPSCs11, vi udviklet en protokol til at generere skalerbare hiPSC-afledte større implantable væv ved hjælp af polydimethylsiloxan (PDMS) forme. Vi evaluerede en række skimmelgeometrier for at bestemme de mest effektive mugegenskaber. Mesh-formede ECT'er med flere bundter og vejkryds udviste fremragende egenskaber i celle levedygtighed, vævsfunktion og skalerbarhed sammenlignet med plain-sheet eller lineære formater, der manglede porer eller vejkryds. Vi implanterede den mesh-formede ECT i en rotte myokardieinfarkt model og bekræftede dens terapeutiske virkninger svarende til implanterede cylindriske ECT'er12. Her beskriver vi protokollen til at generere en hiPSC-afledt mesh-formet ECT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Vedligeholdelse af hiPSC'er og kardiovaskulær differentiering

  1. Udvide og vedligeholde hiPSCs på tynd-coat kælder membran matrix (vækstfaktor reduceret, 1:60 fortynding) i konditioneret medium udvundet fra mus embryonale fibroblaster (MEF-CM) med menneskelige grundlæggende fibroblast vækstfaktor (hbFGF)4.
    BEMÆRK: Vi brugte en hiPSCs (4-faktor (Oct3/4, Sox2, Klf4 og c-Myc) linje: 201B6). Der tilsættes hbFGF ved den relevante koncentration for hver cellelinje. Laminin-511 fragment kan også bruges til belægning af kultur parabol i stedet for kælderen membran matrix. Kommercielt tilgængelige medium designet til feeder-fri kultur af hiPSCs kan bruges som en erstatning for MEF-CM.
  2. Brug Versene (0,48 mM ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) opløsning) til at frigøre og dissociere celler, når celle sammenløbet når 90 \u2012100%.
    BEMÆRK: Andre kommercielt tilgængelige produkter til celle dissociation kan også anvendes.
  3. Pladeceller med en massetæthed på 10.000 celler/mm2 på matrixbelagte cellekulturplader i MEF-CM med hbFGF og kultur i to til tre dage.
  4. Når kulturen bliver fuldt sammenløbet, dække cellerne med matrix (1:60 fortynding med MEF-CM) for en dag.
  5. Udskift MEF-CM med RPMI 1640 + B27-mediet. Der tilsættes 100 ng/ml Activin A og 100 ng/ml Wnt3A til mediet i en dag.
    BEMÆRK: Dette er dag 0 af differentiering. For at upregulate kanoniske Wnt-signalering kan GSK3β-hæmmere også bruges i stedet for Wnt3A.
  6. På dag 1 i differentiering skal mediet ændres til ny RPMI 1640 + B27 med 10 ng/ml BMP4 og 10 ng/ml hbFGF. Kulturceller for to (MC-protokol) eller fire (CM+EC-protokol) dage uden medium ændring5.
    BEMÆRK: CM+EF-protokollen er optimeret til samtidig at fremkalde kardiomyocytter (CMs) og vaskulære endotelceller (EC'er). MC-protokollen er optimeret til fortrinsret fremkalde vaskulære vægmaleri celler (MC'er).
  7. CM+EF-protokol for induktion af CC'er og EC'er (figur 1A).
    1. Mellemdybning på dag 5 med RPMI 1640 + B27 suppleret med 50 ng/ml VEGF165.
    2. Skift kulturmediet hver 48 timer indtil dag 13\u201215 af differentiering.
  8. MC-protokol for induktion af vaskulære vægmalericeller (Figur 1B)
    1. Mediet udskiftes med RPMI1640 + 10 % føtalt kvægserum (FBS) ved differentieringsdagen 3.
    2. Skift kulturmediet hver 48 timer indtil dag 13\u201215 af differentiering.

2. Celle høst og afstamning analyse på differentiering dag 13\u201215

  1. Cellerne vaskes medca. 2+ og mg2+ gratis fosfatbufferet saltvand (PBS).
  2. Tilføj celle dissociation løsning (indeholdende proteaser, kollagen og DNAses) i cellen kultur parabol til at dække pladen. Pladen inkuberes i 5 minutter ved 37 °C.
  3. Cellerne opsaml og dissocier cellerne med kulturmedium ved hjælp af en pipette efter inkubation.
  4. Fordel 1 x 106 celler til afstamningsanalyse med flowcytometri. For at eliminere døde celler, pletter cellerne med fixable levedygtighed farvestof.
  5. Pletcellerne med membranoverflademarkører i PBS med 5% FBS. Brug følgende fortyndinger af antistof i fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) farvningsbuffer: anti-PDGFRβ (1:100), anti-VE cadherin (1:100), anti-TRA-1-60 (1:20).
  6. For intracellulære proteiner skal cellerne resuspenderes og fikses med 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS.
  7. Plet cellerne med anti-hjerte isoform af Troponin T (cTnT) i PBS med 5% FBS og 0,75% Saponin, derefter mærke cTnT antistof med 488 mus IgG1 (fortynding 1:50).
  8. Opslæmmede de farvede celler i PBS med 5% FBS og læg dem i FACS-rør med celleststiller.
  9. Analysere cellesammensætningen af de farvede celler fra hver differentieringsprotokol med flowcytometri for at lette genereringen af cellesuspensioner med definerede afstamningsfordelinger.
    BEMÆRK: Under denne procedure bevares den resterende cellesuspension for ECT'er i et køleskab på 4 °C.

3. Fremstilling af PDMS vævsform

  1. Der kastes en 0,5 mm tyk og over 30 mm x 30 mm lag polydimethylsiloxan (PDMS) ved at blande formalyser- og krydsbindingsopløsningen i et forhold på 10:1 og derefter hærde ved 80 °C i 3 timer.
  2. Skær PDMS-arket og lim det med silikoneklæber for at fremstille en 21 mm x 20,5 mm rektangulær bakke med 7 mm lang, 0,5 mm bred og 2,5 mm høj rektangulær stolpe i en forskudt position. Vandret postafstand mellem to stolper er 2,5 mm (Figur 2B).
  3. Autoklave bakken ved 120 °C i 20 min.
  4. Belagt bakken med 1% poloxamer 407 i PBS i 1 time. Skyl poloxamer 407 og skyl formen med PBS tilstrækkeligt før brug.

4. ECT-byggeri

  1. Efter celle afstamning analyse, kombinere cellerne fra CM + EF og MC protokoller, således at den endelige koncentration af MC'er er 10 til 20% i et samlet celletal på seks millioner celler prkonstruere 5.
  2. Blandede seks millioner celler i ECT-kulturmedium (alfa minimum vigtigt medium suppleret med 10% FBS, 50 μM 2-mercaptoethanol og 100 U/ml Penicillin-Streptomycin).
  3. Forberedelse af matrixopløsning
    1. 133 μL syreopløselig rottehalekollagen type I-opløsning (2 mg/ml, pH 3) blandes med 17 μL af 10x essentielt minimumsmedium (MEM). Opløsningen blandes derefter med 17 μL alkalibuffer (0,2 M NaHCO3,0,2 M HEPES og 0,1 M NaOH).
      BEMÆRK: Kollagen skal opbevares på is (4 °C). Kontroller bufferfarven, og hvis mediet ikke bliver rosa, når alle opløsninger er blandet, skal du tilføje yderligere alkalibuffer til mediet. Blandingstrinnene skal blandes kollagen I + 10x MEM, og derefter tilføje alkali buffer. Du må IKKE ændre denne rækkefølge. Generer IKKE bobler i blandingen.
    2. Tilsæt 67 μL kældermembranmatrix til den neutraliserede kollagenopløsning.
      BEMÆRK: Den blandede opløsning skal opbevares på is (4 °C).
  4. Centrifuge den forberedte celle suspension indeholder seks millioner celler ved 1.100 rpm (240 x g)for 5 min og resuspenderede cellerne med 167 μL højglose DMEM + 20% FBS + 1% penicillin-streptomycin (100x).
  5. Bland cellesuspensionen og matrixopløsningen. Det samlede volumen af celle/matrixblanding for en konstruktion er 400 μL.
    BEMÆRK: Cellen / matrix blandingen skal være ikke-tyktflydende og en rosa farve på dette trin. Hold det på is, da gelen vil størkne ved stuetemperatur. Den endelige koncentration af kollagen type I er 0,67 mg/ml.
  6. Hæld celle / matrix blandingen jævnt over poloxamer 407 belagt PDMS væv skimmel, som er placeret i en seks-brønd kultur plade12.
    BEMÆRK: Hæld blandingen forsigtigt for at undgå at generere bobler for at undgå påfyldning af defekter i den hældte gel.
  7. Cell/matrixblandingen inkuberes i et standard CO2-inkubator (37C, 5 % CO2) i 60 min.
  8. Efter vævet er dannet, suge vævsform med 4 ml ECT kultur medium.
    BEMÆRK: Selvom cellen/matrixen er krydsforbundne på 60 min. er konstruktionen stadig meget skrøbelig. Tilsæt forsigtigt medium for at undgå at beskadige det.
  9. Kulturer vævet i 14 dage med medium forandring hver dag.
  10. Før ECT-implantationen fjernes ECT'en forsigtigt fra lastepælene ved hjælp af steriliserede fine sslag.
    BEMÆRK: Den endelige ECT dimensioner efter fjernelse fra formen er mindre end den oprindelige skimmel. En 2,1 cm x 2,05 cm skimmel genererer en frigivet ECT på ca 1,5 cm x 1,5 cm. En større 3,9 cm x 4,05 cm skimmel genererer en ECT på ca 3 cm x 3 cm. Losset ECT viser iboende spontan slå i varm kultur medium. Selv om det i første omgang opretholder en maskestruktur, en losset ECT krymper og kondenserer over tid. Det er muligt at holde vævet blødt med fine kraftbecen og derefter bruge 7-0 silkesutur til at fastgøre ECT til epicardium.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Figur 1A,B viser skemaerne i CM+EC- og MC-protokollen. Efter at have induceret CCs og ECs fra CM + EF-protokol og MC'er fra MC-protokollen, cellerne er blandet justering endelige MC koncentrationer til at repræsentere 10 til 20% af den samlede celler. Den 2 cm brede vævsform fremstilles i henhold til designtegningen fra 0,5 mm tykt PDMS-ark (Figur 2A,B). Seks millioner CM + EC + MC celler er kombineret med kollagen I, og matrix og hældes på vævsform precoated med poloxamer 407 (Figur 2C). Under indledende eksperimenter, vi fabrikeret væv forme med forskellige mønstre karakteriseret ved forskellige post længder og afstand og bekræftede endelige geometrier af ECTs (Figur 3). Vi valgte formen med 7 mm lange stolper med 2,5 mm brede intervaller til denne undersøgelse.

Poloxamer 407 forhindrer cellevedhæftning til formen og gjorde det muligt at danne karakteristisk maskestruktur efter hurtig gelkomprimering på 14 dage (Figur 4). Denne struktur opretholdes, selv efter ECT er frigivet fra sin skimmel. Hele vævet er ca. 1,5 cm bredt og 0,5 mm tykt, og bredden af hvert bundt i masken er ca. 0,5 mm i gennemsnit.

Det er muligt at generere en 3 cm endelig bredde mesh ECT indeholder 24 millioner celler fra en fire gange større mug med samme forskudt post design (Figur 5A, B). Denne større mesh ECT kan fjernes fra formen let og genererer lokale aktive kraft svarende til de mindre mesh ECT (Figur 5C).

Figure 1
Figur 1: Protokoller til differentiering af kardiovaskulære celler fra humane inducerede pluripotente stamceller. Skematiske diagrammer over protokoller, der anvendes til at fremkalde kardiomyocytter og vaskulære endotelceller (A, CM+EF-protokol) og til at fremkalde vaskulære vægmalericeller (B, MC-protokol). CM = cardiomyocyte; EF = endotelcelle MC = vaskulær vægmaleri celle; iPSC = induceret pluripotent stamceller; MG = kældermembranmatrix; ActA = Activin A; Wnt3a, BMP4, Knoglemorgentisk protein 4; bFGF = grundlæggende fibroblast vækstfaktor; VEGF = vaskulær endotelcellevækstfaktor; FBS = føtalt kvægserum. Dette tal er tilpasset fra reference Masumoto et al.5. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Fremstilling af PDMS vævsform og ECT-konstruktion. a) Repræsentativt billede af en ECT-form fremstillet af 0,5 mm tykke PDMS-plader. bB) Udformning af PDMS-vævsformen med 7 mm lange indvendige stolper anbragt i forskudt stilling frontvisning (øverste panel) og sidevisning (nederste panel). (C) Den skematiske protokol for ECT-konstruktion fra hiPSC-afledte kardiovaskulære celler og matrixgel. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Vævsformens indvirkning på endelige ECT-geometrier. (A) Definitioner af postlængde (PL) og vandret postafstand (HPS). (B) En vævsform uden rektangulære stolper (PL0) og dannede et ark ECT. (C\u2012E) Vævsforme med forskellige PL/HPS og mesh ECTs. (F)En vævsform med lange parallelle stolper og dannede en flere lineær ECT. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Dannelse af mesh ECT efter gelkomprimering. Repræsentativ serie af billeder af en mesh ECT modning fra dag 0 til 14 vises. Celle / matrix hældes i PDMS væv skimmel (Dag 0_0 h), derefter kultur medium tilsættes en time senere (Dag 0_1 h). På dag 1 observeres elliptiske porer omkring lastningspæle. Konstruktionen viste hurtig gelkomprimering og modnet til et meshvæv derefter. På dag 14 frigives vævet fra formen. Den aflæssede ECT opretholder maskegeometrien. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Repræsentative billeder af et større net ECT beregnet til store prækliniske dyreforsøg og kliniske forsøg. (A) Design af 4 cm x 4 cm PDMS vævsform med 7 mm lange stolper og(B)et billede af formen. CC) Repræsentativt billede af et 3 cm x 3 cm større net-ECT. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 1: Patologisk og elektrofysiologisk vurdering af net-ECT'er. aA) Repræsentativt billede for et bundt i en mesh ECT plettet med Hoechst 33342 (blå) for levende celler og Ethidium Homodimer III (rød) for døde celler. Skalabar: 250 μm. (B)Repræsentativt billede af et tredimensionelt konfokalt billede af et bundt i et mesh ECT plettet med hjertetroponin T (grøn). Lokale kardiomyocyteretninger i bundtet visualiseres som små linjer, hvor linjefarve angiver størrelse i omkredsen (grøn), radiale (røde) og aksiale (blå) retninger. (C) Det sfæriske histogram viser lokale kardiomyocyteretninger. Lydstyrken for hver stråle repræsenterer det relative antal for hver retning, og den tykke røde linje viser den gennemsnitlige CM-retning. (B) og (C) tilpasses fra reference13 til revision. d) Repræsentativt billede af kontraktile kraftmåling. Et segment blev afskåret på den røde stiplede linje i en 1,5 cm x 1,5 cm mesh ECT og fastgjort til muskel testsystemet ved hjælp af 10-0 nylon sutur. Den hvide pilespids angiver krafttransducer, og den gule pilespids angiver en hastighedslængdestyring. (E)Repræsentative bølgeformer af aktiv stress ved forskellige pacing frekvenser fra 1,5 Hz til 4 Hz. Klik her for at downloade dette tal.

Supplerende Video 1: Iboende slå af et kryds i en mesh ECT på dag 14. Klik her for at downloade denne video.

Supplerende Video 2: Iboende slå af et bundt i en mesh ECT på dag 14. Klik her for at downloade denne video.

Supplerende Video 3: Iboende slå af en mesh ECT på dag 14 efter frigivet fra vævsform. Klik her for at downloade denne video.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Efter afslutningen af vores undersøgelse af et lineært format, hiPSC afledt ECT5, tilpassede vi protokollen til at blande hiPSC-afledte CMs, ECs og MC'er for at lette in vitro-udvidelse af vaskulære celler i ECT'er og efterfølgende in vivo vaskulær kobling mellem ECT'er og recipient myocardium.

For at lette genereringen af større, implantable mesh ECT-geometrier brugte vi tynde PDMS-plader til at designe 3D-formene med lastningspæle, der var opstillet i forskudte positioner. Under indledende eksperimenter, bemærkede vi, at ECTs overholdt PDMS stillinger under gel komprimering og så vi ændret vores metode til pels hver støbeform med overfladeaktivt poloxamer at forhindre celle vedhæftning, som er et kritisk trin i den nuværende protokol9. ECTs forbliver løsrevet fra de interne lastestillinger og formen bunden under in vitro modning, hvilket letter gel komprimering og ECT fjernelse fra formen. Et andet kritisk skridt i protokollen er at jævnt hælde celle-gel matrix blandingen i PDMS skimmel før matrix størkner. Det er afgørende at gennemføre proceduren inden for kort tid. Bobler i celle-gel matrix blandingen bør også undgås, fordi det kan forårsage strukturelle vakuolation og funktionelle afbrydelse af ECTs.

Ifølge rentabilitetsanalyser var ca. 97 % af cellerne i live inden for dag 14 konstruktioner (supplerende figur 1A). Supplerende figur 1B viser hele mount konfokale billede farves med cTnT repræsenterer myofiber tilpasning parallelt med den lokale bundt langakse ( Supplerende Figur 1C)13. Alle konstruktioner starte iboende spontan slå in vitro inden for 72 timer og fortsatte med at slå hele varigheden af kulturen (Supplerende Videoer 1 \ u20123). Vi analyserede elektromekaniske egenskaber på 1,5 cm x 1,5 cm ECT'er ved hjælp af et brugerdefineret isoleret muskeltestsystem (supplerende figur 1D). ECT'er viste maksimale tempofangsthastigheder på 4 Hz og genererede en gennemsnitlig aktiv belastning på 0,55 mN/mm2 ved 2 Hz, 5 V pacing protokol (n = 11, standard fejl af midler = 0,063; Supplerende figur 1E).

Selv om vi valgte 7 mm lange indvendige lasterum med 5 mm intervaller, er det muligt at variere den endelige ECT-geometri ved at arrangere længden af lasterum og intervallet mellem tilstødende stolper (Figur 3). Desuden er det muligt at udvide skalaen på 1,5 cm x 1,5 cm ECTs til større formater som 3 cm x 3 cm stor mesh ECT. Ifølge kraftmåling viste 3 cm x 3 cm ECT'er elektromekaniske egenskaber svarende til 1,5 cm x 1,5 cm ECTs12. Vævsformernes fleksibilitet og skalerbarheden med bevaret vævsfunktion er betydningen af denne protokol i forhold til allerede eksisterende metoder.

En begrænsning af denne protokol er, at PDMS forme er hånd-samlet fra PDMS ark. Selv om opførelsen af millimeter-enhed forme ville være muligt ved hånd-samling, forme fra fotolitografi eller støbning fra master forme ville være mere egnet til udvidet og stabil ECT generation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen finansielle eller videnskabelige konflikter at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet økonomisk af Kosair Charities Pediatric Heart Research Program ved University of Louisville og Organoid Project på RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research. HiPSCs anvendes i vores offentliggjorte protokoller blev leveret af Center for iPS Cell Research and Application, Kyoto University, Kyoto, Japan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Cell Culture Dishes 100x20 mm style Falcon/ Thomas scientific 9380C51
Multiwell Plates For Cell Culture 6well 50/CS Falcon / Thomas scientific 6902A01
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 761036
Reagents
Accumax Innovative Cell Technologies AM-105
BMP4, recombinant (10µg) R&D RSD-314-BP-010
Collagen, Type I solution from rat tail Sigma C3867
Growth factor-reduced Matrigel Corning 356231
Human VEGF (165) IS, premium grade Miltenyi 130-109-385
Pluronic F-127, 0.2 µm filtered (10% Solution in Water) Molecular Probes P-6866
Recombinant human bFGF WAKO 060-04543
Recombinant Human/Mouse/Rat ActivinA (50µg) R&D 338-AC-050
rh Wnt-3a (10µg) R&D 5036-WN
Versene solution Gibco 15040066
Culture medium and supplements
10x MEM Invitrogen 11430
2 Mercaptro Ethanol SIGMA M6250
B27 supplement minus insulin Gibco A1895601
DMEM, high glucose Gibco 11965084
Fetal Bovine Serum (500ml) Any
Fetal Bovine Serum (500ml) Any
L-Glutamine Gibco 25030081
NaHCO3 Any
PBS 1x Gibco 10010-031
Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL) Gibco 15070-063
RPMI1640 medium Gibco 21870092
αMEM Invitrogen 11900024
Flowcytometry
anti-TRA-1-60, FITC, Clone: TRA-1-60, BD Biosciences BD / Fisher 560380
anti-Troponin T, Cardiac Isoform Ab-1, Clone: 13-11, Thermo Scientific Lab Vision Fisher MS-295-P0
BD FACS Clean Solution BD 340345
BD FACSFlow Sheath Fluid BD 342003
BD FACSRinse Solution BD 340346
EDTA Any
Falcon Tube with Cell Strainer Cap (Case of 500) Corning 352235
Fetal Bovine Serum (500ml) Any
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation Molecular Probes L34957
PDGFRb; anti-CD140b, R-PE, Clone: 28D4, BD Biosciences BD / Fisher 558821
Saponin Sigma-Aldrich 47306-50G-F
VEcad-FITC; anti-CD144, FITC, Clone: 55-7H1, BD Biosciences BD / Fisher 560411
Zenon Alexa Fluor 488 Mouse IgG1 Labeling Kit Molecular Probes Z25002

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sanganalmath, S. K., Bolli, R. Cell therapy for heart failure: A comprehensive overview of experimental and clinical studies, current challenges, and future directions. Circulation Research. 113, 810-834 (2013).
  2. Fisher, S. A., Doree, C., Mathur, A., Martin-Rendon, E. Meta-Analysis of Cell Therapy Trials for Patients With Heart Failure. Circulation Research. 116, 1361-1377 (2015).
  3. Menasché, P., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors for severe heart failure treatment: first clinical case report: Figure 1. European Heart Journal. 36, 2011-2017 (2015).
  4. Masumoto, H., et al. Human iPS cell-engineered cardiac tissue sheets with cardiomyocytes and vascular cells for cardiac regeneration. Scientific Reports. 4, 6716 (2014).
  5. Masumoto, H., et al. The myocardial regenerative potential of three-dimensional engineered cardiac tissues composed of multiple human iPS cell-derived cardiovascular cell lineages. Scientific Reports. 6, 29933 (2016).
  6. Zimmermann, W. H., et al. Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts. Nature Medicine. 12, 452-458 (2006).
  7. Fujimoto, K. L., et al. Engineered fetal cardiac graft preserves its cardiomyocyte proliferation within postinfarcted myocardium and sustains cardiac function. Tissue engineering. Part A. 17, 585-596 (2011).
  8. Lancaster, J. J., et al. Surgical treatment for heart failure: cell-based therapy with engineered tissue. Vessel Plus. 2019, (2019).
  9. Bian, W., Liau, B., Badie, N., Bursac, N. Mesoscopic hydrogel molding to control the 3D geometry of bioartificial muscle tissues. Nature protocols. 4, 1522-1534 (2009).
  10. Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34, 5813-5820 (2013).
  11. Christoforou, N., et al. Induced pluripotent stem cell-derived cardiac progenitors differentiate to cardiomyocytes and form biosynthetic tissues. PloS one. 8, 65963 (2013).
  12. Nakane, T., et al. Impact of Cell Composition and Geometry on Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Engineered Cardiac Tissue. Scientific Reports. 7, 45641 (2017).
  13. Kowalski, W. J., et al. Quantification of Cardiomyocyte Alignment from Three-Dimensional (3D) Confocal Microscopy of Engineered Tissue. Microscopy and Microanalysis. 1, (2017).
Forberedelse af mesh-formet manipuleret hjertevæv stammer fra humane iPS-celler til In Vivo Myokardiereparation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nakane, T., Abulaiti, M., Sasaki, Y., Kowalski, W. J., Keller, B. B., Masumoto, H. Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair. J. Vis. Exp. (160), e61246, doi:10.3791/61246 (2020).More

Nakane, T., Abulaiti, M., Sasaki, Y., Kowalski, W. J., Keller, B. B., Masumoto, H. Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair. J. Vis. Exp. (160), e61246, doi:10.3791/61246 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter