Summary
הפרוטוקול הנוכחי מייצר רקמות לב מהונדסות בצורת רשת המכילות תאי לב וכלי דם המופקים מתאי גזע פלורופוטנטיים אנושיים כדי לאפשר חקירה של טיפול השתלת תאים למחלות לב.
Abstract
הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטות ליצירת רקמות לב מהונדסות (ECTs) מדרגיות בצורת רשת המורכבות מתאי לב וכלי דם המופקים מתאי גזע פלורופוטנטיים (hiPSCs) הנגרמים על ידי בני אדם, אשר מפותחים לקראת המטרה של שימוש קליני. קרדיומיוקיטים נגזר HiPSC, תאים אנדותל, ותאי ציור קיר כלי דם מעורבבים עם מטריצת ג'ל ולאחר מכן נשפכים לתוך עובש רקמה polydimethylsiloxane (PDMS) עם הודעות מלבניות פנימיות מטלטלות. ביום תרבות 14 ECTs להבשיל לתוך 1.5 ס"מ x 1.5 ס"מ רשת מבנה עם חבילות myofiber קוטר 0.5 מ"מ. קרדיומיוציטים ליישר את הציר הארוך של כל צרור ולנצח באופן ספונטני באופן סינכרוני. ניתן לשנות את קנה המידה של גישה זו עד ECT רשת גדולה יותר (3.0 ס"מ x 3.0 ס"מ) תוך שמירה על התבגרות ופונקציה של מבנה. לכן, ECTs בצורת רשת המופקת מתאי לב הנגזרים על-ידי hiPSC עשויים להיות אפשריים עבור פרדיגמות התחדשות הלב.
Introduction
מחקרים פרה-קליניים רבים וניסויים קליניים אישרו את היעילות של טיפולים התחדשות לב מבוססי תאים עבורלבבות כושלים 1,,2,,3. בין סוגי תאים שונים, תאי גזע פלורופוטנטיים המושרה על ידי בני אדם (hiPSCs) מבטיחים מקורות תאים מכוח יכולת ההתפשטות שלהם, פוטנציאל לייצר תוחינות לב וכלידם שונים 4,,5, ו allogenicity. בנוסף, טכנולוגיות הנדסת רקמות אפשרו להעביר מיליוני תאים ללבפגום 5,6,,,7,,8.
בעבר, דיווחנו על הדור של רקמות לב ליניאריות (3D) ליניאריים מהונדסים (ECTs) מ-hiPSC נגזר תחבולות לב וכלי דם באמצעות מערכת תרבות מסחרית זמינה עבור רקמות ביו-ארטיפיאליות 3D5,7. מצאנו כי הדו-קיום של תאי אנדותל כלי דם ותאי ציור קיר עם קרדיומיוציטים בתוך ECT הקלה על התבגרות רקמות מבניות ואלקטרופיזיולוגיות. יתר על כן, אימתנו את הפוטנציאל הטיפולי של hiPSC-ECTs מושתל במודל אוטם שריר הלב חולדה סובלני חיסונית כדי לשפר את תפקוד הלב, לחדש את שריר הלב, ולשפר אנגיוגנזה5. עם זאת, ECTs ליניארי שנבנה על ידי שיטה זו היו 1 מ"מ על 10 מ"מ צילינדרים ולכן לא מתאים להשתלה במחקרים פרה-קליניים עם בעלי חיים גדולים יותר או שימוש קליני.
בהתבסס על השימוש המוצלח של תבניות רקמות כדי ליצור היווצרות רקמות מהונדסות נקבוביות באמצעות myoblasts שלד חולדה ו cardiomyocytes9, אדם ESC נגזר cardiomyocytes10 ועכבר iPSCs11,פיתחנו פרוטוקול כדי ליצור מדרגי hiPSC נגזר רקמות מושתלות גדולות יותר באמצעות תבניות polydimethylsiloxane (PDMS). הערכנו מגוון של גיאומטריות עובש כדי לקבוע את מאפייני עובש היעילים ביותר. ECTs בצורת רשת עם חבילות וצמתים מרובים הציגו מאפיינים מצוינים בכדאיות התא, פונקציית רקמות ומדרגיות בהשוואה לפורמטים פשוטים או ליניאריים שחסרים נקבוביות או צמתים. השתלנו את ECT בצורת רשת במודל אוטם שריר הלב חולדה ואימת את השפעותיו הטיפוליות דומה ECTs גלילימושתל 12. כאן אנו מתארים את הפרוטוקול כדי ליצור ECT בצורת רשת שינוי נגזר hiPSC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תחזוקה של hiPSCs ובידול לב וכלי דם
- להרחיב ולתחזק hiPSCs על מטריצת קרום מרתף מעיל דק (גורם גדילה מופחת, 1:60 דילול) בינוני מותנה מופק פיברובלסטים עוברי העכבר (MEF-CM) עם גורם גדילה פיברובלסט בסיסי אנושי (hbFGF)4.
הערה: השתמשנו בקו hiPSCs (4 גורם (אוק3/4, Sox2, Klf4 ו- c-Myc) שורה: 201B6). הוסף hbFGF בריכוז המתאים עבור כל קו תא. שבר Laminin-511 יכול לשמש גם לציפוי של צלחת תרבות במקום מטריצת קרום מרתף. אמצעי זמין מסחרית המיועד לתרבות ללא הזנה של hiPSCs יכול לשמש כתחליף ל- MEF-CM. - השתמש Versene (0.48 mM אתילנדיאמין טטראצטי חומצה (EDTA) פתרון) כדי לנתק ולנתק תאים כאשר קונפלוננס התא מגיע 90\u2012100%.
הערה: ניתן להשתמש גם במוצרים אחרים הזמינים מסחרית עבור דיסוציאציה של תאים. - תאי לוח בצפיפות של 10,000 תאים /מ"מ 2 על לוחות תרבות תא מצופה מטריצה ב MEF-CM עם hbFGF ותרבות במשך יומיים עדשלושה ימים.
- כאשר התרבות הופכת לתלת-תפלה מלאה, כסה את התאים במטריצה (דילול של 1:60 עם MEF-CM) ליום אחד.
- החלף את MEF-CM ב- RPMI 1640 + B27 בינוני. להוסיף 100 ng/mL של Activin A ו 100 ng/mL של Wnt3A למדיום ליום אחד.
הערה: זהו היום 0 של בידול. כדי לתזמן איתות WNT canonical, מעכבי GSK3β יכול לשמש גם במקום Wnt3A. - ביום הראשון של בידול, לשנות את המדיום RPMI חדש 1640 + B27 עם 10 ng/mL של BMP4 ו 10 ng/mL של hbFGF. תאי תרבות עבור שני ימים (פרוטוקול MC) או ארבעה (פרוטוקול CM+EC) ללא שינוי בינוני5.
הערה: פרוטוקול CM+EC ממוטב כדי לגרום בו-זמנית לתאי קרדיומיוציטים (CMs) ותאי אנדותל כלי דם (ECs). פרוטוקול MC ממוטב לתאי ציור קיר של כלי דם (MCs). - פרוטוקול CM+EC עבור אינדוקציה של CMs ו- ECs (איור 1A).
- החלף את המדיום ביום 5 של בידול עם RPMI 1640 + B27 בתוספת 50 ng/mL של VEGF165.
- שנה את מדיום התרבות כל 48 שעות עד היום 13\u201215 של בידול.
- פרוטוקול MC עבור אינדוקציה של תאי קיר כלי דם (איור 1B)
- החלף את המדיום בסרום RPMI1640 + 10% סרום נקבי עוברי (FBS) ביום 3 של בידול.
- שנה את מדיום התרבות כל 48 שעות עד היום 13\u201215 של בידול.
2. ניתוח קציר תאים ו קוצר יוחות ביום בידול 13\u201215
- לשטוף את התאים עם Ca2+ ו Mg2+ תמיסת מלח פוספט חינם אגירה (PBS).
- הוסף פתרון דיסוציאציה של תאים (המכיל פרוטאזים, קולאזנס ו-DNAses) בצלחת תרבות התא כדי לכסות את הצלחת. דגירה את הצלחת במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
- לאסוף ולנתק את התאים עם מדיום תרבות באמצעות pipette לאחר הדגירה.
- הקצה 1 x 106 תאים לניתוח שושלת עם ציתום זרימה. כדי לחסל תאים מתים, להכתים את התאים עם צבע קיימא לתקן.
- להכתים את התאים עם סמני משטח קרום PBS עם 5% FBS. השתמש דילולים הבאים של נוגדנים פלואורסצנטית מופעל תא מיון (FACS) כתמים מאגר: אנטי PDGFRβ (1:100), קאדרין נגד VE (1:100), anti-TRA-1-60 (1:20).
- עבור חלבונים תאיים, לתקן את התאים עם 4% paraformaldehyde (PFA) ב PBS.
- להכתים את התאים עם isoform אנטי לב של טרופונין T (cTnT) ב PBS עם 5% FBS ו 0.75% סאפונין, ואז לתייג את הנוגדן cTnT עם 488 עכבר IgG1 (דילול 1:50).
- לתוסף מחדש את התאים המוכתמים ב PBS עם 5% FBS ולשים אותם בצינורות FACS עם מסננת תא.
- נתח את הרכב התא של התאים המוכתמים מכל פרוטוקול בידול עם ציתום זרימה כדי להקל על יצירת מתלי תאים עם הפצות שושלת מוגדרות.
הערה: בעת ביצוע הליך זה, מתלי התא הנותרים עבור ECTs נשמרים במקרר של 4°C.
3. ייצור של תבנית רקמת PDMS
- הטלת שכבה בעובי 0.5 מ"מ ושכבה של מעל 30 מ"מ x 30 מ"מ של פולידימטילסילוקסן (PDMS) על-ידי ערבוב פתרון טרום-פולימר וחיבור צולב ביחס של 10:1 ולאחר מכן ריפוי ב-80°C למשך 3 שעות.
- חותכים את גיליון ה-PDMS ומקשרים אותו עם דבק סיליקון כדי לפברק מגש מלבני של 21 מ"מ x 20.5 מ"מ באורך 7 מ"מ, ברוחב 0.5 מ"מ ובצבים מלבניים בגובה 2.5 מ"מ בתנוחה מלבנית. מרווח אופקי בין שתי שורות של פוסטים הוא 2.5 מ"מ(איור 2B).
- אוטוקבל המגש ב-120 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
- ציפוי המגש עם 1% poloxamer 407 ב PBS עבור 1 שעה. יש לשטוף את הפולוקסאמר 407 ולשטוף את התבנית ב-PBS מספיק לפני השימוש.
4. בניית ECT
- לאחר ניתוח תוחם התא, שלב את התאים מפרוטוקולי CM+EC ו- MC כך שהריכוז הסופי של MCs הוא 10 עד 20% במספר תא כולל של שישה מיליון תאים לכלמבנה 5.
- להשעות מעורב שישה מיליון תאים במדיום תרבות ECT (אלפא מינימום חיוני בינוני בתוספת עם 10% FBS, 50 μM 2-mercaptoethanol ו 100 U /mL פניצילין-סטרפטומיצין).
- הכנת פתרון מטריקס
- לערבב 133 μL של חומצה מסיסה זנב חולדה זנב קולגן סוג אני פתרון (2 מ"ג / מ"ל, pH 3) עם 17 μL של 10x מינימום חיוני בינוני (MEM). לאחר מכן לערבב את הפתרון עם 17 μL של מאגר אלקלי (0.2 M NaHCO3, 0.2 M HEPES, ו 0.1 M NaOH).
הערה: יש לשמור על קולגן על קרח (4°C). בדוק את צבע המאגר ואם המדיום אינו הופך ורדש כאשר כל הפתרונות מעורבבים, הוסף מאגר אלקלי נוסף למדיום. שלבי ערבוב חייבים להיות שילוב קולגן I + MEM 10x ולאחר מכן להוסיף מאגר אלקלי. אל תשנה הזמנה זו. אל תיצור בועות בתמהיל. - הוסף 67 μL של מטריצת קרום מרתף לפתרון קולגן מנוטרל.
הערה: יש לשמור את הפתרון המעורב על קרח (4 °C).
- לערבב 133 μL של חומצה מסיסה זנב חולדה זנב קולגן סוג אני פתרון (2 מ"ג / מ"ל, pH 3) עם 17 μL של 10x מינימום חיוני בינוני (MEM). לאחר מכן לערבב את הפתרון עם 17 μL של מאגר אלקלי (0.2 M NaHCO3, 0.2 M HEPES, ו 0.1 M NaOH).
- צנטריפוגה מתלי התא המוכן המכיל שישה מיליון תאים ב 1,100 סל"ד (240 x g)במשך 5 דקות ולתחל מחדש את התאים עם 167 μL של DMEM גלוקוז גבוה + 20% FBS + 1% פניצילין סטרפטומיצין (100x).
- ערבב את מתלי התא ואת פתרון המטריצה. הנפח הכולל של תערובת תא / מטריצה עבור מבנה אחד הוא 400 μL.
הערה: תערובת התא/מטריקס צריכה להיות לא צמיגית וצבע ורדיד בשלב זה. שמור אותו על קרח כמו הג'ל יתגבש בטמפרטורת החדר. הריכוז הסופי של קולגן סוג אני הוא 0.67 מ"ג/מ"ל. - יוצקים את תערובת התא / מטריקס באופן שווה על פולוקסאמר 407 מצופה PDMS רקמת עובש, אשר ממוקם בצלחת תרבות שש באר12.
הערה: יוצקים את התערובת בזהירות כדי למנוע יצירת בועות כדי למנוע מילוי פגמים בג'ל שנשפך. - דגירה את תערובת התא / מטריקס באינקובטור CO2 סטנדרטי (37C, 5 % CO2) במשך60 דקות.
- לאחר הרקמה נוצרת, להשרות את עובש הרקמה עם 4 מ"ל של ECT תרבות בינונית.
הערה: למרות התא / מטריצה הוא crosslinked בתוך 60 דקות, המבנה הוא עדיין שביר מאוד. מוסיפים בעדינות מדיום כדי למנוע פגיעה בו. - תרבות הרקמה במשך 14 ימים עם שינוי בינוני בכל יום.
- לפני השתלת ECT, הסר את ECT מעמדות הטעינה בעדינות באמצעות מפלצות עדינות מעוטרות.
הערה: ממדי ECT הסופיים לאחר ההסרה מהתבנית הם פחות מהתבנית המקורית. תבנית 2.1 ס"מ על 2.05 ס"מ יוצרת ECT משוחרר של כ 1.5 ס"מ x 1.5 ס"מ. תבנית גדולה יותר באורך 3.9 ס"מ על 4.05 ס"מ יוצרת ECT של כ-3 ס"מ על 3 ס"מ. ECT לא פרוק מראה מכות ספונטניות פנימיות במדיום תרבות חמה. למרות שבתחילה הוא שומר על מבנה רשת שינוי, ECT לא פורק מתכווץ ומתעב לאורך זמן. ניתן להחזיק את הרקמה ברכות עם מלקות עדינות ולאחר מכן להשתמש בתפר משי 7-0 כדי לחבר את ECT לאפיקארדיום.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1A,B מציג את השרטוטים של פרוטוקול CM+EC ו- MC. לאחר גורם CMs ו- ECs מפרוטוקול CM + EC ו- MCs פרוטוקול MC, התאים מעורבים התאמת ריכוזי MC הסופי לייצג 10 עד 20% של תאים הכולל. תבנית רקמה ברוחב 2 ס"מ מפוברקת על פי ציור העיצוב מגליון PDMS בעובי 0.5 מ"מ(איור 2א', ב). שישה מיליון תאי CM+EC+MC משולבים עם קולגן I, מטריצה ומוזגים על עובש הרקמה precoed עם poloxamer 407(איור 2C). במהלך ניסויים ראשוניים, מפוברקים תבניות רקמות עם דפוסים שונים המאופיין אורכי פוסט שונים מרווח ואישר גיאומטריות סופיות של ECTs (איור 3). בחרנו את התבנית עם 7 מ"מ הודעות ארוכות עם מרווחי מרווח רוחב 2.5 מ"מ עבור מחקר זה.
Poloxamer 407 מונע הידבקות תאים לתבנית ואפשר היווצרות של מבנה רשת אופיינית לאחר דחיסת ג'ל מהירה בתוך 14 ימים(איור 4). מבנה זה נשמר גם לאחר ECT משתחרר מהתבנית שלה. רוחב הרקמה כולה הוא כ-1.5 ס"מ ועובי של 0.5 מ"מ, והרוחב של כל חבילה ברשת הוא כ-0.5 מ"מ בממוצע.
ניתן ליצור 3 ס"מ רוחב סופי רשת ECT המכילה 24 מיליון תאים מעובש גדול פי ארבעה עם אותו עיצוב פוסט נדהם (איור 5A,B). רשת שינוי גדולה יותר זו ECT ניתן להסיר מן התבנית בקלות ויוצר כוח פעיל מקומי שווה ערך ECT רשת קטנה יותר (איור 5C).
איור 1: פרוטוקולים להבדיל תאי לב וכלי דם מתאי גזע פלורופוטנטיים המושרה על ידי בני אדם. דיאגרמות סכמטיות של פרוטוקולים המשמשים להוערת קרדיומיוציטים ותאי אנדותל כלי דם (A, פרוטוקול CM+EC) ולגרמת תאי קיר של כלי דם (B, פרוטוקול MC). CM = קרדיומיוציט; EC = תא אנדותל; MC = תא ציור קיר כלי דם; iPSC = המושרה תא גזע פלורופוטנטי; MG = מטריצת קרום מרתף; ActA = אקטיבין A; Wnt3a, BMP4, חלבון מורפוגנטי עצם 4; bFGF = גורם גדילה פיברובלסט בסיסי; VEGF = גורם גדילה אנדותל כלי דם; FBS = סרום של נקמני עוברי. נתון זה מותאם מתוך התייחסות Masumoto ואח'5. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: ייצור של עובש רקמת PDMS ובניית ECT. (A) תמונה מייצגת של תבנית ECT מפוברקת מגיליונות PDMS בעובי 0.5 מ"מ. (ב)עיצוב של תבנית רקמת PDMS עם 7 מ"מ הודעות פנימיות ארוכות מסודרים בתנוחה מטלטלת; תצוגה קדמית (לוח עליון) ותצוגה צדדית (בלוח התחתון). (ג)הפרוטוקול השרטוטי של בניית ECT מתאי לב וכלי דם שמקורם ב-hiPSC וג'ל מטריקס. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: ההשפעה של עיצובי עובש רקמות על גיאומטריות ECT הסופיות. (א)הגדרות של אורך פוסט (PL) ומרווח אופקי לפוסטים (HPS). (ב)תבנית רקמה ללא פוסטים מלבניים (PL0) ויצרה גיליון ECT. (C\u2012E) תבניות רקמות עם PL/HPS שונים ו- ECTs רשת. (F)תבנית רקמה עם עמודים מקבילים ארוכים ויצרה ECT ליניארי מרובה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: היווצרות רשת ECT בעקבות דחיסת ג'ל. סדרה מייצגת של תמונות של התבגרות רשת ECT מהיום 0 עד 14 מוצגות. תא/מטריצה מוזגים בתבנית רקמת PDMS (יום 0_0 h), ולאחר מכן מדיום תרבות מתווסף שעה אחת מאוחר יותר (יום 0_1 h). ביום הראשון, נצפים נקבוביות אליפטיות סביב עמדות טעינה. המבנה הראה דחיסת ג'ל מהירה והבשיל לתוך רקמת רשת לאחר מכן. ביום ה-14, הרקמה משתחררת מהתבנית. ECT לפרוק שומר על גיאומטריית הרשת. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: תמונות מייצגות של רשת ECT גדולה יותר המיועדת לניסויים פרה-קליניים גדולים של בעלי חיים וניסויים קליניים. (A)עיצוב של תבנית רקמת PDMS 4 ס"מ על 4 ס"מ עם 7 מ"מ הודעות ארוכות ו -(B)תמונה של התבנית. (ג)תמונה מייצגת של ECT רשת גדולה יותר ב-3 ס"מ. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור משלים 1: הערכה פתולוגית ואלקטרופיזיולוגית של ECTs רשת. (A)תמונה מייצגת עבור צרור ברשת ECT מוכתם Hoechst 33342 (כחול) עבור תאים חיים ואתידיום הומודימר השלישי (אדום) עבור תאים מתים. סרגל קנה מידה: 250 μm. (ב)תמונה מייצגת של תמונה תלת מימדית של צרור ברשת ECT מוכתם טרופונין לב T (ירוק). כיווני קרדיומיוציט מקומיים בתוך החבילה מדמיינת קווים קטנים, כאשר צבע הקו מציין סדר גודל בהוראות ההיקף (ירוק), הרדיאלי (אדום) והצירי (כחול). (ג)היסטוגרמה כדורית מציגה כיווני קרדיומיוציט מקומיים. נפח האחסון של כל קרן מייצג את הספירה היחסית עבור כל כיוון והקו האדום העבה מציג את כיוון CM ממוצע. (ב) ו- (C) מותאמים מתוך הפניה13 עם מהדורה. (ד)תמונה מייצגת של מדידת כוח מתכווץ. קטע נחתך בקו האדום המקווקו ב-1.5 ס"מ x 1.5 ס"מ רשת ECT וצורף למערכת בדיקת השרירים באמצעות תפר ניילון 10-0. ראש החץ הלבן מציין מתמר כוח וחץ צהוב מציין בקר אורך במהירות גבוהה. (ה)צורות גל מייצגות של מתח פעיל בתדרי צעידה שונים מ- 1.5 הרץ עד 4 הרץ.
וידאו משלים 1: הכאה פנימית של צומת ברשת ECT ביום 14. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
וידאו משלים 2: מכות פנימיות של חבילה ברשת ECT ביום 14. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
וידאו משלים 3: מכות פנימיות של רשת ECT ביום 14 לאחר ששוחרר מעובש הרקמה. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
לאחר השלמת החקירה שלנו של פורמט ליניארי, hiPSC נגזר ECT5, התאמנו את הפרוטוקול כדי לערבב cMs נגזר hiPSC, ECs, ו- MCs כדי להקל על הרחבת מבחנה של תאי כלי דם בתוך ECTs ולאחר מכן צימוד כלי דם vivo בין ECTs ו שריר הלב הנמען.
כדי להקל על יצירת גיאומטריות ECT גדולות יותר, הניתנות להשתלה, השתמשנו בגיליונות PDMS דקים כדי לעצב את תבניות תלת-ממדיות עם עמדות טעינה מסודרות בעמדות מטלטלות. במהלך ניסויים ראשוניים, הערנו כי ECTs דבק הפוסטים PDMS במהלך דחיסת ג'ל ולכן שינינו את השיטה שלנו כדי לכסות כל עובש עם poloxamer פעילי שטח כדי למנוע הידבקות תא שהוא שלב קריטי של הפרוטוקול הנוכחי9. ECTs להישאר מנותקים מעמדות הטעינה הפנימית ואת תחתית עובש במהלך התבגרות מבחנה, אשר מקל על דחיסת ג'ל והסרת ECT מהתבנית. שלב קריטי נוסף של הפרוטוקול הוא לשפוך באופן שווה את תערובת מטריצת התא-ג'ל לתוך תבנית PDMS לפני המטריצה מתגבשת. זה קריטי כדי לבצע את ההליך בתוך זמן קצר. בועות בתערובת מטריצת תא-ג'ל יש להימנע גם כי זה עלול לגרום vacuolation מבני ושיבוש פונקציונלי של ECTs.
על פי נתוני הכדאיות, כ-97% מהתאים היו בחיים תוך היום 14 מבנים(איור משלים 1א). איור משלים 1B מציג את כל התמונה הר confocal מוכתם cTnT המייצג יישור myofiber במקביל לציר ארוך צרור מקומי(איור משלים 1C)13. כל המבנים מתחילים מכות ספונטניות פנימיות במבחנה בתוך 72 שעות והמשיכו להכות לאורך כל תקופת התרבות (סרטונים משלימים 1\u20123). ניתחנו תכונות אלקטרומכניות של 1.5 ס"מ x 1.5 ס"מ ECTs באמצעות מערכת בדיקת שרירים מבודדת מותאמת אישית(איור משלים 1D). ECTs הציג קצבי לכידת ריווח מדרגיים של 4 הרץ ויצר מתח פעיל ממוצע של 0.55 mN/mm2 ב- 2 הרץ, פרוטוקול 5 V ריווח (n = 11, שגיאת אמצעים סטנדרטית = 0.063; איור משלים 1E).
למרות שנבחרנו 7 מ"מ ארוך עמדות טעינה פנימית עם מרווחי 5 מ"מ, ניתן לשנות את הגיאומטריה הסופית ECT על ידי סידור אורך עמדות טעינה ואת מרווח בין הודעות סמוכות (איור 3). יתר על כן, ניתן להרחיב את קנה המידה של 1.5 ס"מ x 1.5 ס"מ ECTs לפורמטים גדולים יותר כגון 3 ס"מ x 3 ס"מ רשת שינוי ECT. על פי מדידת כוח, 3 ס"מ x 3 ס"מ ECTs הראו תכונות אלקטרומכניות דומות 1.5 ס"מ x 1.5 ס"מ ECTs12. הגמישות של צורות הרקמה והמדרגיות עם פונקציית רקמה משומרת היא משמעות של הפרוטוקול הנוכחי ביחס לשיטות קיימות כבר.
מגבלה אחת של הפרוטוקול הנוכחי היא שתבניות PDMS נאספות ביד מגיליונות PDMS. למרות שבניית תבניות יחידת מילימטר תהיה אפשרית על ידי הרכבה ביד, תבניות פוטוליתוגרפיה או יציקה מתבניות מאסטר יהיה מתאים יותר לדור ECT מורחב ויציב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין קונפליקטים כלכליים או מדעיים לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה כספית על ידי תוכנית מחקר הלב לילדים של Kosair Charities באוניברסיטת לואיוויל ופרויקט אורגנואיד במרכז RIKEN לחקר דינמיקת מערכות ביולוגיות. HiPSCs בשימוש בפרוטוקולים שפורסמו שלנו סופקו על ידי המרכז למחקר ויישום תא iPS, אוניברסיטת קיוטו, קיוטו, יפן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Cell Culture Dishes 100x20 mm style | Falcon/ Thomas scientific | 9380C51 | |
| Multiwell Plates For Cell Culture 6well 50/CS | Falcon / Thomas scientific | 6902A01 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 761036 | |
| Reagents | |||
| Accumax | Innovative Cell Technologies | AM-105 | |
| BMP4, recombinant (10µg) | R&D | RSD-314-BP-010 | |
| Collagen, Type I solution from rat tail | Sigma | C3867 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | Corning | 356231 | |
| Human VEGF (165) IS, premium grade | Miltenyi | 130-109-385 | |
| Pluronic F-127, 0.2 µm filtered (10% Solution in Water) | Molecular Probes | P-6866 | |
| Recombinant human bFGF | WAKO | 060-04543 | |
| Recombinant Human/Mouse/Rat ActivinA (50µg) | R&D | 338-AC-050 | |
| rh Wnt-3a (10µg) | R&D | 5036-WN | |
| Versene solution | Gibco | 15040066 | |
| Culture medium and supplements | |||
| 10x MEM | Invitrogen | 11430 | |
| 2 Mercaptro Ethanol | SIGMA | M6250 | |
| B27 supplement minus insulin | Gibco | A1895601 | |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11965084 | |
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| NaHCO3 | Any | ||
| PBS 1x | Gibco | 10010-031 | |
| Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL) | Gibco | 15070-063 | |
| RPMI1640 medium | Gibco | 21870092 | |
| αMEM | Invitrogen | 11900024 | |
| Flowcytometry | |||
| anti-TRA-1-60, FITC, Clone: TRA-1-60, BD Biosciences | BD / Fisher | 560380 | |
| anti-Troponin T, Cardiac Isoform Ab-1, Clone: 13-11, Thermo Scientific Lab Vision | Fisher | MS-295-P0 | |
| BD FACS Clean Solution | BD | 340345 | |
| BD FACSFlow Sheath Fluid | BD | 342003 | |
| BD FACSRinse Solution | BD | 340346 | |
| EDTA | Any | ||
| Falcon Tube with Cell Strainer Cap (Case of 500) | Corning | 352235 | |
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Molecular Probes | L34957 | |
| PDGFRb; anti-CD140b, R-PE, Clone: 28D4, BD Biosciences | BD / Fisher | 558821 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47306-50G-F | |
| VEcad-FITC; anti-CD144, FITC, Clone: 55-7H1, BD Biosciences | BD / Fisher | 560411 | |
| Zenon Alexa Fluor 488 Mouse IgG1 Labeling Kit | Molecular Probes | Z25002 |
References
- Sanganalmath, S. K., Bolli, R. Cell therapy for heart failure: A comprehensive overview of experimental and clinical studies, current challenges, and future directions. Circulation Research. 113, 810-834 (2013).
- Fisher, S. A., Doree, C., Mathur, A., Martin-Rendon, E. Meta-Analysis of Cell Therapy Trials for Patients With Heart Failure. Circulation Research. 116, 1361-1377 (2015).
- Menasché, P., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors for severe heart failure treatment: first clinical case report: Figure 1. European Heart Journal. 36, 2011-2017 (2015).
- Masumoto, H., et al. Human iPS cell-engineered cardiac tissue sheets with cardiomyocytes and vascular cells for cardiac regeneration. Scientific Reports. 4, 6716 (2014).
- Masumoto, H., et al. The myocardial regenerative potential of three-dimensional engineered cardiac tissues composed of multiple human iPS cell-derived cardiovascular cell lineages. Scientific Reports. 6, 29933 (2016).
- Zimmermann, W. H., et al. Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts. Nature Medicine. 12, 452-458 (2006).
- Fujimoto, K. L., et al. Engineered fetal cardiac graft preserves its cardiomyocyte proliferation within postinfarcted myocardium and sustains cardiac function. Tissue engineering. Part A. 17, 585-596 (2011).
- Lancaster, J. J., et al. Surgical treatment for heart failure: cell-based therapy with engineered tissue. Vessel Plus. 2019, (2019).
- Bian, W., Liau, B., Badie, N., Bursac, N. Mesoscopic hydrogel molding to control the 3D geometry of bioartificial muscle tissues. Nature protocols. 4, 1522-1534 (2009).
- Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34, 5813-5820 (2013).
- Christoforou, N., et al. Induced pluripotent stem cell-derived cardiac progenitors differentiate to cardiomyocytes and form biosynthetic tissues. PloS one. 8, 65963 (2013).
- Nakane, T., et al. Impact of Cell Composition and Geometry on Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Engineered Cardiac Tissue. Scientific Reports. 7, 45641 (2017).
- Kowalski, W. J., et al. Quantification of Cardiomyocyte Alignment from Three-Dimensional (3D) Confocal Microscopy of Engineered Tissue. Microscopy and Microanalysis. 1, (2017).
