Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल हृदय रोगों के लिए कोशिका प्रत्यारोपण चिकित्सा की जांच की अनुमति देने के लिए मानव प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त हृदय कोशिकाओं से युक्त जाल के आकार के इंजीनियर हृदय ऊतक उत्पन्न करता है ।
Abstract
वर्तमान प्रोटोकॉल मानव प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं (hiPSCs) से प्राप्त हृदय कोशिकाओं से बना स्केलेबल, जाल के आकार के इंजीनियर हृदय ऊतकों (ईसीटी) उत्पन्न करने के तरीकों का वर्णन करता है, जो नैदानिक उपयोग के लक्ष्य की दिशा में विकसित किए जाते हैं। हिप्ससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स, एंडोथेलियल कोशिकाओं, और संवहनी भित्ति कोशिकाओं को जेल मैट्रिक्स के साथ मिलाया जाता है और फिर आयताकार आंतरिक कंपित पदों के साथ पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) ऊतक मोल्ड में डाला जाता है। संस्कृति दिवस तक 14 ईसीटी 0.5 मिमी व्यास मायोफाइबर बंडलों के साथ 1.5 सेमी x 1.5 सेमी जाल संरचना में परिपक्व होता है। कार्डियोमायोसाइट्स प्रत्येक बंडल की लंबी धुरी के अनुरूप होते हैं और अनायास ही समकालिक रूप से हरा देते हैं। इस दृष्टिकोण को निर्माण परिपक्वता और कार्य को संरक्षित करते हुए एक बड़े (3.0 सेमी x 3.0 सेमी) जाल ईसीटी तक बढ़ाया जा सकता है। इस प्रकार, एचआईपीसी-व्युत्पन्न हृदय कोशिकाओं से उत्पन्न जाल के आकार का ईसीटी हृदय उत्थान प्रतिमान के लिए संभव हो सकता है।
Introduction
कई प्रीक्लिनिकल अध्ययनों और नैदानिक परीक्षणों ने असफल दिलों के लिए सेल आधारित कार्डियक पुनर्योजी उपचारों की दक्षता की पुष्टि की है1,2,,3. विभिन्न सेल प्रकारों में, मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs) उनकी प्रसार क्षमता, विभिन्न हृदय वंश4,,5,और एलोजेनिकिटी उत्पन्न करने की क्षमता के आधार पर सेल स्रोतों का वादा कर रहे हैं। इसके अलावा, टिश्यू इंजीनियरिंग प्रौद्योगिकियों ने लाखों कोशिकाओं को क्षतिग्रस्त हृदय5,6,,,7,,8पर स्थानांतरित करना संभव बना दिया है।
इससे पहले, हमने 3 डी बायोआर्टिफिशियल ऊतकों5,,7के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध संस्कृति प्रणाली का उपयोग करके हिप्ससी-व्युत्पन्न हृदय वंश से त्रि-आयामी (3 डी) रैखिक इंजीनियर कार्डियक ऊतकों (ईसीटी) की पीढ़ी की सूचना दी। हमने पाया कि ईसीटी के भीतर कार्डियोमायोसाइट्स के साथ वैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं और भित्ति कोशिकाओं के सह-अस्तित्व ने संरचनात्मक और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल ऊतक परिपक्वता की सुविधा प्रदान की। इसके अलावा, हमने कार्डियक फ़ंक्शन में सुधार करने, मायोकार्डियम को पुनर्जीवित करने और एंजियोजेनेसिस5को बढ़ाने के लिए एक प्रतिरक्षा सहिष्णु चूहा मायोकार्डियल इंफार्क्शन मॉडल में प्रत्यारोपित एचआईपीएससी-ईसीटी की चिकित्सीय क्षमता को मान्य किया। हालांकि, इस विधि द्वारा निर्मित रैखिक ईसीटी 10 मिमी सिलेंडरों द्वारा 1 मिमी थे और इसलिए बड़े जानवरों या नैदानिक उपयोग के साथ प्रीक्लिनिकल अध्ययनों में प्रत्यारोपण के लिए उपयुक्त नहीं थे।
चूहे कंकाल मायोब्लास्ट और कार्डियोमायोसाइट्स9,मानव ईएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स 10 और माउस आईपीएससी11 का उपयोग करके असुरक्षित इंजीनियर ऊतकगठनउत्पन्न करने के लिए ऊतक मोल्डों के सफल उपयोग के आधार पर, हमने पॉलीडिमेथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) मोल्डों का उपयोग करके स्केलेबल हिप्ससी-व्युत्पन्न बड़े प्रत्यारोपण ऊतक उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया। हमने सबसे प्रभावी मोल्ड विशेषताओं को निर्धारित करने के लिए मोल्ड ज्यामिति की एक श्रृंखला का मूल्यांकन किया। कई बंडलों और जंक्शनों के साथ मेष के आकार का ईसीटी सादे चादर या रैखिक प्रारूपों की तुलना में सेल व्यवहार्यता, ऊतक समारोह और स्केलेबिलिटी में उत्कृष्ट विशेषताओं का प्रदर्शन किया गया जिसमें छिद्रों या जंक्शनों की कमी थी। हमने एक चूहे मायोकार्डियल इंफार्क्शन मॉडल में जाल के आकार का ईसीई प्रत्यारोपित किया और प्रत्यारोपित बेलनाकार ईसीटी12के समान इसके चिकित्सीय प्रभावों की पुष्टि की। यहां हम एक hiPSC-व्युत्पन्न जाल के आकार का ECT उत्पन्न करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।
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Protocol
1. हिप्ससी और हृदय भेदभाव का रखरखाव
- मानव बुनियादी फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर (एचबीएफजीएफ) 4 के साथ माउस भ्रूणीय फाइब्रोब्लास्ट (एमईएफ-सीएम) से निकाले गए वातानुकूलित माध्यम में पतले कोट तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (विकास कारक कम,1:60कमजोर पड़ने) पर हिप्ससी का विस्तार और रखरखाव करें।
नोट: हमने एक हिप्ससी (4-फैक्टर (ऑक्ट3/4, Sox2, Klf4 और सी-Myc) लाइन: 201B6 का उपयोग किया। प्रत्येक सेल लाइन के लिए उपयुक्त एकाग्रता पर एचबीएफजीएफ जोड़ें। लैमिनिन-511 टुकड़े का उपयोग बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स के बजाय संस्कृति पकवान की कोटिंग के लिए भी किया जा सकता है। एचआईपीएससी की फीडर-फ्री संस्कृति के लिए डिजाइन किए गए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माध्यम का उपयोग एमईएफ-सीएम के विकल्प के रूप में किया जा सकता है। - कोशिका की पूर्णता 90\u2012100% तक पहुंचने पर कोशिकाओं को अलग करने और अलग करने के लिए Versene (0.48 m ethylenediamineteacetic acid (EDTA) समाधान का उपयोग करें।
नोट: सेल वियोजन के लिए अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उत्पादों का भी उपयोग किया जा सकता है। - दो से तीन दिनों के लिए एचबीएफजीएफ और संस्कृति के साथ एमईएफ-सीएम में मैट्रिक्स-कोटेड सेल कल्चर प्लेटों पर१०,००० कोशिकाओं/एमएम 2 के घनत्व पर प्लेट सेल ।
- जब संस्कृति पूरी तरह से संकुचित हो जाती है, तो कोशिकाओं को मैट्रिक्स (एमईएफ-सीएम के साथ 1:60 कमजोर पड़ने) के साथ एक दिन के लिए कवर करें।
- एमईएफ-सीएम को आरपीएमआई 1640+ बी27 माध्यम से बदलें। एक दिन के लिए माध्यम में एक्टिविन ए के १०० एनजी/एमएल और Wnt3A के १०० एनजी/एमएल जोड़ें ।
नोट: यह भेदभाव का दिन 0 है । विकनिक वांट सिग्नलिंग को बढ़ाने के लिए, WNT3A के बजाय GSK3ο अवरोधकों का भी उपयोग किया जा सकता है। - विभेदन के दिन, मध्यम को नए आरपीएमआई 1640 + बी27 में बीएमपी 4 के 10 एनजी/एमएल और एचबीएफजीएफ के 10 एनजी/एमएल के साथ बदलें । दो (एमसी प्रोटोकॉल) या चार (सीएम + ईसी प्रोटोकॉल) दिनों के लिए संस्कृति कोशिकाओं मध्यम परिवर्तन5के बिना ।
नोट: सीएम + ईसी प्रोटोकॉल को एक साथ कार्डियोमायोसाइट्स (सीएम) और वैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं (ईसी) को प्रेरित करने के लिए अनुकूलित किया गया है। एमसी प्रोटोकॉल को अधिमानतः संवहनी भित्ति कोशिकाओं (एमसी) को प्रेरित करने के लिए अनुकूलित किया जाता है। - सीएम + ईसी प्रोटोकॉल सीएम और ईसी(चित्रा 1A) कोशामिल करने के लिए ।
- भेदभाव के दिन 5 पर माध्यम को आरपीएमआई 1640 + बी27 के साथ बदलें जो वीजीएफ165के 50 एनजी/एमएल के साथ पूरक है ।
- भेदभाव के दिन 13 \ u201215 तक हर ४८ घंटे संस्कृति माध्यम बदलें ।
- वैस्कुलर भित्ति कोशिकाओं को शामिल करने के लिए एमसी प्रोटोकॉल(चित्रा 1B)
- अंतर के दिन 3 पर RPMI1640 + 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ माध्यम की जगह ।
- भेदभाव के दिन 13 \ u201215 तक हर ४८ घंटे संस्कृति माध्यम बदलें ।
2. विभेदन दिवस पर सेल हार्वेस्ट और वंश विश्लेषण 13 \ u201215
- सीए2 + और एमजी 2+ मुफ्त फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के साथ कोशिकाओं को धोएं।
- प्लेट को कवर करने के लिए सेल कल्चर डिश में सेल डिसोसिएशन सॉल्यूशन (प्रोटीज, कोलेजनेस और डीएनसेस युक्त) जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
- इनक्यूबेशन के बाद एक पिपेट का उपयोग करके संस्कृति माध्यम के साथ कोशिकाओं को इकट्ठा करें और अलग करें।
- प्रवाह साइटोमेट्री के साथ वंश विश्लेषण के लिए 1 x10 6 कोशिकाओं का आवंटन करें। मृत कोशिकाओं को खत्म करने के लिए, फिक्सेबल व्यवहार्यता डाई के साथ कोशिकाओं को दाग।
- 5% एफबीएस के साथ पीबीएस में झिल्ली सतह मार्कर के साथ कोशिकाओं को दाग। फ्लोरेसेंस एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (FACS) धुंधला बफर में एंटीबॉडी के निम्नलिखित कमजोर पड़ने का उपयोग करें: एंटी-पीडीजीएफआर (1:100), एंटी-वीई कैडेरिन (1:100), एंटी-टीआरए-1-60 (1:20)।
- इंट्रासेलुलर प्रोटीन के लिए, पीबीएस में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के साथ कोशिकाओं को फिर से ढर्रेदार और ठीक करें।
- 5% एफबीएस और 0.75% सैपोनिन के साथ पीबीएस में ट्रोपोनिन टी (सीटीएनटी) के एंटी-कार्डियक आइसोफॉर्म के साथ कोशिकाओं को दाग दें, फिर सीटीएनटी एंटीबॉडी को 488 माउस इग्जी1 (कमजोर 1:50) के साथ लेबल करें।
- पीबीएस में दाग कोशिकाओं को 5% एफबीएस के साथ फिर से रीसुस्पेंड करें और उन्हें सेल छन्नी के साथ एफएएफएस ट्यूब में डाल दें।
- परिभाषित वंश वितरण के साथ सेल निलंबन की पीढ़ी को सुविधाजनक बनाने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री के साथ प्रत्येक भेदभाव प्रोटोकॉल से दाग कोशिकाओं की कोशिका संरचना का विश्लेषण करें।
नोट: इस प्रक्रिया को निष्पादित करते समय, ईसीटी के लिए शेष सेल निलंबन 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में संरक्षित है।
3. पीडीएमएस ऊतक मोल्ड का निर्माण
- 10:1 के अनुपात में प्रीपॉलिमर और क्रॉस-लिंकिंग समाधान को मिलाकर पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) की 0.5 मिमी मोटी और 30 मिमी x 30 मिमी परत डालें और फिर 3 घंटे के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर इलाज करें।
- पीडीएमएस शीट को काटें और इसे 7 मिमी लंबी, 0.5 मिमी चौड़ी और 2.5 मिमी उच्च आयताकार पदों के साथ 21 मिमी x 20.5 मिमी आयताकार ट्रे बनाने के लिए सिलिकॉन चिपकने के साथ बांड करें। पदों की दो लाइनों के बीच क्षैतिज पोस्ट अंतर 2.5 मिमी(चित्रा 2B)है।
- ऑटोक्लेव ट्रे को 20 मिनट के लिए 120 डिग्री सेल्सियस पर।
- 1 घंटे के लिए पीबीएस में 1% पोलोक्सामर 407 के साथ ट्रे कोट करें। पोलोक्सामर 407 कुल्ला और उपयोग करने से पहले पर्याप्त रूप से पीबीएस के साथ मोल्ड कुल्ला।
4. ईसीटी निर्माण
- सेल वंश विश्लेषण के बाद, सीएम + ईसी और एमसी प्रोटोकॉल से कोशिकाओं को मिलाएं ताकि एमसी की अंतिम एकाग्रता5निर्माण प्रति छह मिलियन कोशिकाओं की कुल सेल संख्या में 10 से 20% हो।
- ECT संस्कृति माध्यम में मिश्रित छह मिलियन कोशिकाओं को निलंबित करें (अल्फा न्यूनतम आवश्यक माध्यम 10% एफबीएस, 50 माइक्रोन 2-मर्केप्टोथेनॉल और 100 यू/एमएल पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक)।
- मैट्रिक्स समाधान की तैयारी
- 10x न्यूनतम आवश्यक माध्यम (एमईएम) के 17 माइक्रोन के साथ एसिड-घुलनशील चूहा पूंछ कोलेजन प्रकार I समाधान (2 मिलीग्राम/एमएल, पीएच 3) के 133 माइक्रोन मिलाएं। फिर क्षार बफर (0.2 एम नाएचसीओ3, 0.2एम एचईपी, और 0.1 एम नाओएच) के 17 माइक्रोन के साथ समाधान मिलाएं।
नोट: कोलेजन को बर्फ (4 डिग्री सेल्सियस) पर रखा जाना चाहिए। बफर कलर की जांच करें और अगर सभी समाधान मिश्रित होने पर माध्यम गुलाबी नहीं हो जाता है, तो माध्यम में अतिरिक्त क्षार बफर जोड़ें। मिश्रण चरण मिश्रण कोलेजन I + 10x MEM होना चाहिए, और फिर क्षार बफर जोड़ें। इस आदेश को न बदलें। मिश्रण में बुलबुले उत्पन्न न करें। - बेअसर कोलेजन समाधान के लिए तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के 67 माइक्रोन जोड़ें।
नोट: मिश्रित समाधान बर्फ (4 डिग्री सेल्सियस) पर रखा जाना चाहिए।
- 10x न्यूनतम आवश्यक माध्यम (एमईएम) के 17 माइक्रोन के साथ एसिड-घुलनशील चूहा पूंछ कोलेजन प्रकार I समाधान (2 मिलीग्राम/एमएल, पीएच 3) के 133 माइक्रोन मिलाएं। फिर क्षार बफर (0.2 एम नाएचसीओ3, 0.2एम एचईपी, और 0.1 एम नाओएच) के 17 माइक्रोन के साथ समाधान मिलाएं।
- सेंट्रलाइज तैयार सेल सस्पेंशन जिसमें 1,100 आरपीएम (240 x ग्राम)पर 5 मिनट के लिए छह मिलियन कोशिकाएं होती हैं और 167 माइक्रोन उच्च ग्लूकोज डीएमईएम + 20% एफबीएस + 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (100x) के साथ कोशिकाओं को फिर से खर्च करते हैं।
- सेल सस्पेंशन और मैट्रिक्स सॉल्यूशन मिलाएं। एक निर्माण के लिए सेल/मैट्रिक्स मिश्रण की कुल मात्रा 400 माइक्रोन है।
नोट: सेल/मैट्रिक्स मिश्रण इस कदम पर गैर चिपचिपा और एक गुलाबी रंग होना चाहिए । इसे बर्फ पर रखें क्योंकि जेल कमरे के तापमान पर जमना होगा। कोलेजन प्रकार की अंतिम एकाग्रता मैं 0.67 मिलीग्राम/ - पोलोक्सामर ४०७ लेपित पीडीएमएस ऊतक मोल्ड पर समान रूप से सेल/मैट्रिक्स मिश्रण डालो, जो एक छह अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट12में रखा गया है ।
नोट: डाला जेल में दोष भरने को रोकने के लिए बुलबुले पैदा करने से बचने के लिए मिश्रण को ध्यान से डालें। - सेल/मैट्रिक्स मिश्रण को एक मानक सह2 इनक्यूबेटर (37C, 5% सीओ2)में 60 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
- टिश्यू बनने के बाद टिश्यू मोल्ड को ईसीटी कल्चर मीडियम के 4 एमएल से सोख लें।
नोट: हालांकि सेल/मैट्रिक्स ६० मिनट में क्रॉसलिंक किया जाता है, निर्माण अभी भी बहुत नाजुक है । इसे नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए धीरे-धीरे मध्यम जोड़ें। - हर दिन मध्यम परिवर्तन के साथ 14 दिनों के लिए ऊतक संस्कृति।
- ECT प्रत्यारोपण से पहले, निष्फल ठीक संदंश का उपयोग कर धीरे लोडिंग पदों से ECT हटा दें ।
नोट: मोल्ड से हटाने के बाद अंतिम ECT आयाम मूल मोल्ड से कम हैं। 2.1 सेमी x 2.05 सेमी मोल्ड लगभग 1.5 सेमी x 1.5 सेमी का जारी ईसी उत्पन्न करता है। एक बड़ा 3.9 सेमी x 4.05 सेमी मोल्ड लगभग 3 सेमी x 3 सेमी का ईसीटी उत्पन्न करता है। अनलोड ECT गर्म संस्कृति माध्यम में आंतरिक सहज पिटाई से पता चलता है । हालांकि यह शुरू में एक जाल संरचना रखता है, एक अनलोड ECT सिकुड़ती है और समय के साथ संघनित । ठीक संदंश के साथ ऊतक को धीरे से पकड़ना संभव है और फिर एपिकार्डियम को ईसीई संलग्न करने के लिए 7-0 रेशम सीवन का उपयोग करें।
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Representative Results
चित्रा 1ए, बी सीएम + ईसी और एमसी प्रोटोकॉल की योजनाबद्धता दिखाता है । एमसी प्रोटोकॉल से सीएम + ईसी प्रोटोकॉल और एमसी से सीएम + ईसी प्रोटोकॉल से सीएम और ईसी को प्रेरित करने के बाद, कोशिकाओं को कुल कोशिकाओं के 10 से 20% का प्रतिनिधित्व करने के लिए अंतिम एमसी सांद्रता को समायोजित करने के लिए मिश्रित किया जाता है। 0.5 मिमी मोटी पीडीएमएस शीट(चित्रा 2ए, बी)से डिजाइन ड्राइंग के अनुसार 2 सेमी चौड़ा ऊतक मोल्ड तैयार किया गया है। सीएम + ईसी + एमसी कोशिकाओं के ६,०००,००० कोलेजन मैं, और मैट्रिक्स के साथ संयुक्त कर रहे है और पोलोक्सामर ४०७(चित्रा 2C)के साथ पूर्व कोट ऊतक मोल्ड पर डाला । प्रारंभिक प्रयोगों के दौरान, हमने विभिन्न पैटर्न के साथ ऊतक मोल्ड गढ़े, जिनमें विभिन्न पोस्ट लंबाई और रिक्ति की विशेषता है और ईसीटी(चित्र 3)की अंतिम ज्यामिति की पुष्टि की गई है। हमने इस अध्ययन के लिए 2.5 मिमी चौड़े अंतराल के साथ 7 मिमी लंबे पदों के साथ मोल्ड का चयन किया।
पोलोक्सामर 407 मोल्ड के लिए सेल आसंजन को रोकता है और 14 दिनों(चित्र 4)में तेजी से जेल कॉम्पैक्टेशन के बाद विशेषता जाल संरचना के गठन को सक्षम करता है। ईसीटी के मोल्ड से रिलीज होने के बाद भी इस स्ट्रक्चर को बरकरार रखा जाता है। पूरे ऊतक लगभग 1.5 सेमी चौड़ा और 0.5 मिमी मोटी है, और जाल में प्रत्येक बंडल की चौड़ाई औसत में लगभग 0.5 मिमी है।
एक ही कंपित पोस्ट डिजाइन(चित्रा 5ए, बी)के साथ चार गुना बड़े मोल्ड से चौबीस मिलियन कोशिकाओं वाले चौबीस मिलियन कोशिकाओं वाले 3 सेमी अंतिम चौड़ाई जाल ECT उत्पन्न करना संभव है। इस बड़े जाल ECT को मोल्ड से आसानी से हटाया जा सकता है और छोटे जाल ईसीटी(चित्रा 5C)के बराबर स्थानीय सक्रिय बल उत्पन्न करता है।
चित्रा 1: मानव प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं से हृदय कोशिकाओं में अंतर करने के लिए प्रोटोकॉल। कार्डियोमायोसाइट्स और वैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं (ए, सीएम + ईसी प्रोटोकॉल) को प्रेरित करने और संवहनी भित्ति कोशिकाओं (बी, एमसी प्रोटोकॉल) को प्रेरित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध आरेख। मुख्यमंत्री = कार्डियोमायोसाइट; चुनाव आयोग = एंडोथेलियल सेल; एमसी = संवहनी भित्ति सेल; आईपीएससी = प्रेरित pluripotent स्टेम सेल; एमजी = तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स; ActA = एक्टिविन ए; Wnt3a, BMP4, बोन मॉर्फोजेनेटिक प्रोटीन 4; टीएफजीएफ = बुनियादी फाइब्रोब्लास्ट विकास कारक; VEGF = संवहनी एंडोथेलियल सेल विकास कारक; एफबीएस = भ्रूण गोजातीय सीरम। यह आंकड़ा संदर्भ मासुमोटो एट अल5से अनुकूलित है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: पीडीएमएस ऊतक मोल्ड और ईसीटी निर्माण का निर्माण। (A)0.5 मिमी मोटी पीडीएमएस शीट से निर्मित ईसीटी मोल्ड की प्रतिनिधि छवि। (ख)7 मिमी लंबी आंतरिक पदों के साथ पीडीएमएस ऊतक मोल्ड का डिजाइन कंपित स्थिति में व्यवस्थित; फ्रंट व्यू (अपर पैनल) और साइड व्यू (लोअर पैनल)। (ग)एचआईपीएससी-व्युत्पन्न हृदय कोशिकाओं और मैट्रिक्स जेल से ईसीटी निर्माण का योजनाबद्ध प्रोटोकॉल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: अंतिम ईसीटी ज्यामिति पर ऊतक मोल्ड डिजाइन का प्रभाव। (A)पोस्ट लेंथ (पीएल) और क्षैतिज पोस्ट स्पेसिंग (एचपीएस) की परिभाषाएं । (ख)आयताकार पदों (PL0) के बिना एक ऊतक मोल्ड और एक शीट ECT का गठन किया । (C\u2012ई) विभिन्न पीएल/एचपीएस और जाल ईसीटी के साथ ऊतक मोल्ड। (च)लंबे समानांतर पदों के साथ एक ऊतक मोल्ड और एक बहु रैखिक ECT का गठन किया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4: जेल कॉम्पैक्टेशन के बाद जाल ECT का गठन। 0 से 14 दिन तक जाल ईसीटी परिपक्वता की छवियों की प्रतिनिधि श्रृंखला दिखाई जाती है। सेल/मैट्रिक्स पीडीएमएस ऊतक मोल्ड (दिन 0_0 एच) में डाला जाता है, फिर संस्कृति माध्यम को एक घंटे बाद (दिन 0_1 घंटे) जोड़ा जाता है। 1 दिन, लोडिंग पोस्ट के आसपास अंडाकार छिद्रों मनाया जाता है। निर्माण तेजी से जेल कॉम्पैक्टेशन दिखाया और उसके बाद एक जाल ऊतक में परिपक्व । 14 दिन, ऊतक मोल्ड से जारी किया जाता है। अनलोड ईसीटी जाल ज्यामिति रखता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 5: बड़े पशु पूर्व नैदानिक परीक्षणों और नैदानिक परीक्षणों के लिए इरादा एक बड़ा जाल ECT के प्रतिनिधि छवियां। (A)7 एमएम लंबी पोस्ट के साथ 4 सेमी x 4 सेमी पीडीएमएस टिश्यू मोल्ड और(बी)मोल्ड की एक छवि का डिजाइन। (ग)3 सेमी x 3 सेमी बड़ा जाल ECT की प्रतिनिधि छवि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
पूरक चित्रा 1: जाल ईसीटी के पैथोलॉजिकल और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल मूल्यांकन। (A)जीवित कोशिकाओं के लिए होचस्ट 33342 (नीला) और मृत कोशिकाओं के लिए एथिडियम होमेमर III (लाल) के साथ दाग वाले जाल ईसीटी में बंडल के लिए प्रतिनिधि छवि। स्केल बार: 250 माइक्रोन। (ख)कार्डियक ट्रोपोनिन टी (ग्रीन) से सना जाल ईसीटी में एक बंडल की त्रि-आयामी कॉन्फोकल छवि की प्रतिनिधि छवि। बंडल के भीतर स्थानीय कार्डियोमायोसाइट झुकाव को छोटी रेखाओं के रूप में कल्पना की जाती है, जहां रेखा का रंग परिधि (हरा), रेडियल (लाल), और अक्षीय (नीला) दिशाओं में परिमाण को इंगित करता है। (ग)गोलाकार हिस्टोग्राम स्थानीय कार्डियोमायोसाइट झुकाव प्रदर्शित करता है । प्रत्येक किरण की मात्रा प्रत्येक दिशा के लिए सापेक्ष गिनती का प्रतिनिधित्व करता है और मोटी लाल रेखा मतलब सीएम अभिविन्यास दिखाती है। (ख) और (ग) संशोधन के साथ संदर्भ13 से अनुकूलित हैं । (घ)संकुचन बल माप की प्रतिनिधि छवि। एक खंड को 1.5 सेमी x 1.5 सेमी जाल ईसीटी में लाल बिंदीदार रेखा पर काट दिया गया था और 10-0 नायलॉन सीवन का उपयोग करके मांसपेशियों के परीक्षण प्रणाली से जुड़ा हुआ था। सफेद एरोहेड बल ट्रांसड्यूसर को इंगित करता है और पीला तीर सिर उच्च गति लंबाई नियंत्रक को इंगित करता है। (ई)1.5 हर्ट्ज से 4 हर्ट्ज तक विभिन्न पेसिंग आवृत्तियों पर सक्रिय तनाव के प्रतिनिधि तरंग। कृपया इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
पूरक वीडियो 1: 14 दिन में एक जाल ECT में एक जंक्शन की आंतरिक पिटाई । कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
पूरक वीडियो 2: 14 दिन में एक जाल ECT में एक बंडल की आंतरिक पिटाई । कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
पूरक वीडियो 3: ऊतक मोल्ड से जारी होने के बाद 14 दिन पर एक जाल ECT की आंतरिक पिटाई। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
एक रैखिक प्रारूप की हमारी जांच के पूरा होने के बाद, hiPSC व्युत्पन्नECT 5,हमने ईसीटी और प्राप्तकर्ता मायोकार्डियम के बीच वीवो वैस्कुलर कपलिंग में ईसीटी के भीतर संवहनी कोशिकाओं के इन विट्रो विस्तार को सुविधाजनक बनाने के लिए हिप्ससी-व्युत्पन्न सी, ईसी और एमसी को मिलाने के लिए प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया।
बड़े, प्रत्यारोपण जाल ECT ज्यामिति की पीढ़ी को सुविधाजनक बनाने के लिए हमने कंपित पदों पर सरणी लोडिंग पोस्ट के साथ 3 डी मोल्ड डिजाइन करने के लिए पतली पीडीएमएस शीट का उपयोग किया। प्रारंभिक प्रयोगों के दौरान, हमने नोट किया कि ईसीटी ने जेल कॉम्पैक्टेशन के दौरान पीडीएमएस पदों का पालन किया और इसलिए हमने सेल आसंजन को रोकने के लिए प्रत्येक मोल्ड को सर्फेक्टेंट पोलोक्सामर के साथ कोट करने के लिए अपनी विधि को संशोधित किया जो वर्तमान प्रोटोकॉल9का एक महत्वपूर्ण कदम है। ईसीटी इन विट्रो परिपक्वता के दौरान आंतरिक लोडिंग पोस्ट और मोल्ड बॉटम से अलग रहते हैं, जो मोल्ड से जेल कॉम्पैक्टेशन और ईसीटी हटाने की सुविधा प्रदान करता है। प्रोटोकॉल का एक और महत्वपूर्ण कदम मैट्रिक्स जमने से पहले पीडीएमएस मोल्ड में सेल-जेल मैट्रिक्स मिश्रण को समान रूप से डालना है। कम समय में प्रक्रिया को पूरा करना महत्वपूर्ण है। सेल-जेल मैट्रिक्स मिश्रण में बुलबुले से भी बचा जाना चाहिए क्योंकि इससे ईसीटी के संरचनात्मक वैक्यूलेशन और कार्यात्मक व्यवधान हो सकते हैं।
व्यवहार्यता परख के अनुसार, लगभग 97% कोशिकाएं दिन के भीतर जीवित थीं 14 निर्माण(पूरक चित्रा 1A)। पूरक चित्रा 1B सीटीएनटी के साथ दाग वाली पूरी माउंट कॉन्फोकल छवि को दिखाता है जो स्थानीय बंडल लंबी धुरी(पूरक चित्र 1 सी) 13के समानांतर माईफिबर संरेखण का प्रतिनिधित्व करता है।13 सभी निर्माण 72 घंटे के भीतर विट्रो में आंतरिक सहज पिटाई शुरू करते हैं और संस्कृति की अवधि में पिटाई जारीरखते हैं (पूरक वीडियो 1\u20123)। हमने कस्टम पृथक मांसपेशी परीक्षण प्रणाली (पूरक चित्रा 1D) का उपयोग करके 1.5 सेमी x1.5सेमी ईसीटी के विद्युत गुणों का विश्लेषण किया। ईसीटी ने 4 हर्ट्ज की अधिकतम पेसिंग कैप्चर दरों को प्रदर्शित किया और2 हर्ट्ज, 5 वी पेसिंग प्रोटोकॉल (एन = 11, मानक त्रुटि का मतलब = 0.063 पर 0.55 मिलियन/मिमी 2 का औसत सक्रिय तनाव उत्पन्न किया; पूरक चित्रा 1E)।
यद्यपि हमने 5 मिमी अंतराल के साथ 7 मिमी लंबी आंतरिक लोडिंग पोस्ट का चयन किया है, लेकिन लोडिंग पोस्ट की लंबाई और आसन्न पदों(चित्र 3)के बीच अंतराल की व्यवस्था करके अंतिम ईसीटी ज्यामिति को अलग करना संभव है। इसके अलावा, 3 सेमी x 3 सेमी बड़े जाल ईसीटी जैसे बड़े प्रारूपों में 1.5 सेमी x 1.5 सेमी ईसीटी के पैमाने का विस्तार करना संभव है। बल माप के अनुसार, 3 सेमी x 3 सेमी ईसीटी ने 1.5 सेमी x 1.5 सेमी ईसीटी 12 के समान विद्युत गुणदिखाए। ऊतक आकार का लचीलापन और संरक्षित ऊतक समारोह के साथ स्केलेबिलिटी पहले से मौजूद तरीकों के संबंध में वर्तमान प्रोटोकॉल के महत्व है।
वर्तमान प्रोटोकॉल की एक सीमा यह है कि पीडीएमएस मोल्ड पीडीएमएस शीट से हाथ से इकट्ठे होते हैं। यद्यपि मिलीमीटर-इकाई मोल्डों का निर्माण हाथ-असेंबली द्वारा संभव होगा, फोटोलिथोग्राफी से मोल्ड या मास्टर मोल्ड से कास्टिंग विस्तारित और स्थिर ईसीटी पीढ़ी के लिए अधिक उपयुक्त होगा।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कोई वित्तीय या वैज्ञानिक संघर्ष नहीं है ।
Acknowledgments
इस काम को लुइसविले विश्वविद्यालय में कोसैयर चैरिटी पीडियाट्रिक हार्ट रिसर्च प्रोग्राम और रिकोन सेंटर फॉर बायोसिस्टम्स डायनेमिक्स रिसर्च में ऑर्गेनॉइड प्रोजेक्ट द्वारा आर्थिक रूप से समर्थित किया गया था। हमारे प्रकाशित प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले HiPSCs को सेंटर फॉर आईपीएस सेल रिसर्च एंड एप्लीकेशन, क्योटो विश्वविद्यालय, क्योटो, जापान द्वारा प्रदान किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Cell Culture Dishes 100x20 mm style | Falcon/ Thomas scientific | 9380C51 | |
| Multiwell Plates For Cell Culture 6well 50/CS | Falcon / Thomas scientific | 6902A01 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 761036 | |
| Reagents | |||
| Accumax | Innovative Cell Technologies | AM-105 | |
| BMP4, recombinant (10µg) | R&D | RSD-314-BP-010 | |
| Collagen, Type I solution from rat tail | Sigma | C3867 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | Corning | 356231 | |
| Human VEGF (165) IS, premium grade | Miltenyi | 130-109-385 | |
| Pluronic F-127, 0.2 µm filtered (10% Solution in Water) | Molecular Probes | P-6866 | |
| Recombinant human bFGF | WAKO | 060-04543 | |
| Recombinant Human/Mouse/Rat ActivinA (50µg) | R&D | 338-AC-050 | |
| rh Wnt-3a (10µg) | R&D | 5036-WN | |
| Versene solution | Gibco | 15040066 | |
| Culture medium and supplements | |||
| 10x MEM | Invitrogen | 11430 | |
| 2 Mercaptro Ethanol | SIGMA | M6250 | |
| B27 supplement minus insulin | Gibco | A1895601 | |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11965084 | |
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| NaHCO3 | Any | ||
| PBS 1x | Gibco | 10010-031 | |
| Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL) | Gibco | 15070-063 | |
| RPMI1640 medium | Gibco | 21870092 | |
| αMEM | Invitrogen | 11900024 | |
| Flowcytometry | |||
| anti-TRA-1-60, FITC, Clone: TRA-1-60, BD Biosciences | BD / Fisher | 560380 | |
| anti-Troponin T, Cardiac Isoform Ab-1, Clone: 13-11, Thermo Scientific Lab Vision | Fisher | MS-295-P0 | |
| BD FACS Clean Solution | BD | 340345 | |
| BD FACSFlow Sheath Fluid | BD | 342003 | |
| BD FACSRinse Solution | BD | 340346 | |
| EDTA | Any | ||
| Falcon Tube with Cell Strainer Cap (Case of 500) | Corning | 352235 | |
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Molecular Probes | L34957 | |
| PDGFRb; anti-CD140b, R-PE, Clone: 28D4, BD Biosciences | BD / Fisher | 558821 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47306-50G-F | |
| VEcad-FITC; anti-CD144, FITC, Clone: 55-7H1, BD Biosciences | BD / Fisher | 560411 | |
| Zenon Alexa Fluor 488 Mouse IgG1 Labeling Kit | Molecular Probes | Z25002 |
References
- Sanganalmath, S. K., Bolli, R. Cell therapy for heart failure: A comprehensive overview of experimental and clinical studies, current challenges, and future directions. Circulation Research. 113, 810-834 (2013).
- Fisher, S. A., Doree, C., Mathur, A., Martin-Rendon, E. Meta-Analysis of Cell Therapy Trials for Patients With Heart Failure. Circulation Research. 116, 1361-1377 (2015).
- Menasché, P., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors for severe heart failure treatment: first clinical case report: Figure 1. European Heart Journal. 36, 2011-2017 (2015).
- Masumoto, H., et al. Human iPS cell-engineered cardiac tissue sheets with cardiomyocytes and vascular cells for cardiac regeneration. Scientific Reports. 4, 6716 (2014).
- Masumoto, H., et al. The myocardial regenerative potential of three-dimensional engineered cardiac tissues composed of multiple human iPS cell-derived cardiovascular cell lineages. Scientific Reports. 6, 29933 (2016).
- Zimmermann, W. H., et al. Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts. Nature Medicine. 12, 452-458 (2006).
- Fujimoto, K. L., et al. Engineered fetal cardiac graft preserves its cardiomyocyte proliferation within postinfarcted myocardium and sustains cardiac function. Tissue engineering. Part A. 17, 585-596 (2011).
- Lancaster, J. J., et al. Surgical treatment for heart failure: cell-based therapy with engineered tissue. Vessel Plus. 2019, (2019).
- Bian, W., Liau, B., Badie, N., Bursac, N. Mesoscopic hydrogel molding to control the 3D geometry of bioartificial muscle tissues. Nature protocols. 4, 1522-1534 (2009).
- Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34, 5813-5820 (2013).
- Christoforou, N., et al. Induced pluripotent stem cell-derived cardiac progenitors differentiate to cardiomyocytes and form biosynthetic tissues. PloS one. 8, 65963 (2013).
- Nakane, T., et al. Impact of Cell Composition and Geometry on Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Engineered Cardiac Tissue. Scientific Reports. 7, 45641 (2017).
- Kowalski, W. J., et al. Quantification of Cardiomyocyte Alignment from Three-Dimensional (3D) Confocal Microscopy of Engineered Tissue. Microscopy and Microanalysis. 1, (2017).
