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Bioengineering

Preparazione di tessuti cardiaci ingegnerizzati a forma di mesh derivati da cellule iPS umane per la riparazione miocardia in Vivo

doi: 10.3791/61246 Published: June 9, 2020

Summary

L'attuale protocollo genera tessuti cardiaci ingegnerizzati a forma di maglia contenenti cellule cardiovascolari derivate da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo per consentire lo studio della terapia dell'impianto cellulare per le malattie cardiache.

Abstract

L'attuale protocollo descrive i metodi per generare tessuti cardiaci ingegnerizzati scalabili a forma di mesh (ET) composti da cellule cardiovascolari derivate da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC), che vengono sviluppate verso l'obiettivo dell'uso clinico. I cardiomiociti derivati dall'HiPSC, le cellule endoteliali e le cellule murali vascolari vengono mescolati con la matrice gel e poi versati in uno stampo di tessuto polidimetlsiloxane (PDMS) con post interni rettangolari sfalsati. Entro il giorno della coltura 14 ET maturano in una struttura a maglia di 1,5 cm x 1,5 cm con fasci di miofibera di 0,5 mm di diametro. I cardiomiociti si allineano all'asse lungo di ogni fascio e battono spontaneamente in modo sincrono. Questo approccio può essere scalato fino a una mesh più grande (3,0 cm x 3,0 cm) ECT, preservando la maturazione e la funzione del costrutto. Pertanto, le ECT a forma di mesh generate da cellule cardiache derivate da hiPSC possono essere fattibili per i paradigmi di rigenerazione cardiaca.

Introduction

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Numerosi studi preclinici e studi clinici hanno confermato l'efficienza delle terapie cardiogenerative a base cellulare per i cuoriche hanno mancato di cuore 1,2,3. Tra i vari tipi di cellule, le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC) sono promettenti fonti cellulari in virtù della loro capacità prolifertiva, potenziale per generare varie linee cardiovascolari4,5e allogenicità. Inoltre, le tecnologie di ingegneria tissu/tessuto hanno reso possibile il trasferimento di milioni di cellule su un cuoredanneggiato 5,6,7,8.

In precedenza, abbiamo segnalato la generazione di tessuti cardiaci lineari (ECT) tridimensionali (3D) da linee cardiovascolari derivate da hiPSC utilizzando un sistema di coltura disponibile in modo commerciale per i tessuti bioartifici3D 5,7. Abbiamo scoperto che la coesistenza di cellule endoteliali vascolari e cellule murali con cardiomiociti all'interno dell'ECT ha facilitato la maturazione strutturale ed elettrofisiologica dei tessuti. Inoltre, abbiamo convalidato il potenziale terapeutico dell'hiPSC-ECT impiantato in un modello di infarto miocardico tollerante all'immunita' per migliorare la funzione cardiaca, rigenerare il miocardio e migliorare l'angiogenesi5. Tuttavia, le ECT lineari costruite con questo metodo erano cilindri da 1 mm per 10 mm e quindi non adatti per l'impianto in studi preclinici con animali più grandi o uso clinico.

Sulla base dell'uso riuscito di stampi tisssidali per generare formazione di tessuto ingegnerizzato poroso utilizzando myoblast scheletrici e cardiomiocitischeletrici 9, cardiomiociti umani derivati da ESC10 e iPSC del topo11, abbiamo sviluppato un protocollo per generare tessuti impiantabili più grandi derivati da hiPSC scalabili utilizzando stampi polidimetillsiloxane (PDMS). Abbiamo valutato una gamma di geometrie di stampo per determinare le caratteristiche di stampo più efficaci. Le ET a forma di mesh con più fasci e giunzioni hanno mostrato eccellenti caratteristiche nella vitalità cellulare, nella funzione dei tessuti e nella scalabilità rispetto ai formati semplici o lineari privi di pori o giunzioni. Abbiamo impiantato l'ECT a forma di maglia in un modello di infarto miocardico e abbiamo confermato i suoi effetti terapeutici simili agli ECT cilindriciimpiantati 12. Qui descriviamo il protocollo per generare un ECT a forma di mesh derivato da hiPSC.

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Protocol

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1. Manutenzione di hiPSC e differenziazione cardiovascolare

  1. Espandere e mantenere iPSC sulla matrice di membrana seminterrato thin-coat (fattore di crescita ridotto, diluizione 1:60) in mezzo condizionato estratto da fibroblasti embrionali di topo (MEF-CM) con fattore di crescita fibroblasta di base umano (hbFGF)4.
    NOTA: Abbiamo usato una linea hiPSCs (4 fattori (oct3/4, Sox2, Klf4 e c-Myc): 201B6). Aggiungere hbFGF alla concentrazione appropriata per ogni linea cellulare. Il frammento laminin-511 può essere utilizzato anche per il rivestimento del piatto di coltura al posto della matrice della membrana seminterrato. Il mezzo disponibile in mercato progettato per la coltura senza alimentatori di hiPSC può essere utilizzato come sostituto di MEF-CM.
  2. Utilizzare la soluzione Versene (0,48 mM di acido etilenediaminetetraacetico (EDTA) per staccare e dissociare le cellule quando la confluenza cellulare raggiunge il 90-u2012100%.
    NOTA: Possono essere utilizzati anche altri prodotti disponibili in mercato per la dissociazione cellulare.
  3. Celle di piastra ad una densità di 10.000 cellule/mm2 su piastre di coltura cellulari rivestite a matrice in MEF-CM con hbFGF e coltura per due o tre giorni.
  4. Quando la coltura diventa completamente confluente, coprire le cellule con matrice (1:60 diluizione con MEF-CM) per un giorno.
  5. Sostituire il MEF-CM con il supporto RPMI 1640 - B27. Aggiungere 100 ng/mL di Activin A e 100 ng/mL di Wnt3A al mezzo per un giorno.
    NOTA: questo è il giorno 0 di differenziazione. Per upregolare la segnalazione canonica Wnt, GSK3β inibitori possono essere utilizzati anche al posto di Wnt3A.
  6. Il giorno 1 di differenziazione, cambiare il mezzo al nuovo RPMI 1640 - B27 con 10 ng/mL di BMP4 e 10 ng/mL di hbFGF. Celle di coltura per due (protocollo MC) o quattro giorni (protocollo CM-EC) senza variazione media5.
    NOTA: il protocollo CM-EC è ottimizzato per indurre simultaneamente cardiomiociti (CM) e cellule endoteliali vascolari (EC). Il protocollo MC è ottimizzato per indurre preferibilmente celle murali vascolari (MC).
  7. Protocollo CM-EC per l'induzione di CMs e ECs (Figura 1A).
    1. Sostituire il mezzo il giorno 5 di differenziazione con RPMI 1640 - B27 integrato con 50 ng/mL di VEGF165.
    2. Cambiare il mezzo di coltura ogni 48 h fino al giorno 13-u201215 di differenziazione.
  8. Protocollo MC per l'induzione di celle murali vascolari (Figura 1B)
    1. Sostituire il mezzo con RPMI1640 - 10% siero bovino fetale (FBS) al giorno 3 di differenziazione.
    2. Cambiare il mezzo di coltura ogni 48 h fino al giorno 13-u201215 di differenziazione.

2. Analisi del raccolto cellulare e del lignaggio nel giorno di differenziazione 13-u201215

  1. Lavare le cellule con ca2 e Mg2 snodie a cuscinetto di fosfati liberi (PBS).
  2. Aggiungere la soluzione di dissociazione cellulare (contenente proteasi, collagene e DNAses) nel piatto di coltura cellulare per coprire la piastra. Incubare la piastra per 5 minuti a 37 gradi centigradi.
  3. Raccogliere e dissociare le cellule con mezzo di coltura utilizzando una pipetta dopo l'incubazione.
  4. Allocare 1 x 106 celle per l'analisi della derivazione con citometria di flusso. Per eliminare le cellule morte, macchiare le cellule con colorante di vitalità fissabile.
  5. Macchiare le cellule con marcatori di superficie della membrana in PBS con 5% FBS. Utilizzare le seguenti diluizioni di anticorpi nel buffer di colorazione a fluorescenza attivata (FACS): anti-PDGFRβ (1:100), cadherin anti-VE (1:100), anti-TRA-1-60 (1:20).
  6. Per le proteine intracellulari, riesospette e fissa le cellule con 4% di paraformaldeide (PFA) in PBS.
  7. Macchiare le cellule con isoforme anti-cardiaci di Troponin T (cTnT) in PBS con 5% FBS e 0,75% Saponin, quindi etichettare l'anticorpo cTnT con 488 topO IgG1 (diluizione 1:50).
  8. Rispendere le cellule macchiate in PBS con il 5% di FBS e metterle in tubi FACS con deformatore cellulare.
  9. Analizzare la composizione cellulare delle cellule macchiate da ogni protocollo di differenziazione con citometria di flusso per facilitare la generazione di sospensioni cellulari con distribuzioni di lignaggio definite.
    NOTA: Durante l'esecuzione di questa procedura, la sospensione delle celle rimanenti per le ET viene conservata in un frigorifero a 4 gradi centigradi.

3. Fabbricazione di stampo tissu tessuto PDMS

  1. Lanciare uno strato di polidimetiloxane (PDMS) di 0,5 mm e di oltre 30 mm x 30 mm mescolando la soluzione prepolimera e cross-linking a un rapporto di 10:1 e quindi curare a 80 gradi centigradi per 3 h.
  2. Tagliare il foglio PDMS e legarlo con adesivo in silicone per fabbricare un vassoio rettangolare da 21 mm x 20,5 mm con 7 mm di lunghezza, 0,5 mm di larghezza e 2,5 mm di altezza di pali rettangolari in posizione sfalsata. La spaziatura orizzontale tra due file di pali è di 2,5 mm (Figura 2B).
  3. Autoclave il vassoio a 120 gradi centigradi per 20 min.
  4. Rivestire il vassoio con 1% poloxamer 407 in PBS per 1 h. Sciacquare la poloxamer 407 e sciacquare lo stampo con PBS sufficientemente prima dell'uso.

4. Costruzione di ECT

  1. Dopo l'analisi del lignaggio cellulare, combinare le cellule dei protocolli CM-EC e MC in modo che la concentrazione finale di MC sia dal 10 al 20% in un numero totale di cellule di sei milioni di celle percostrutto 5.
  2. Sospendere sei milioni di cellule miste nel mezzo di coltura ECT (mezzo essenziale minimo alfa integrato con il 10% di FBS, 50 M 2-mercaptoethanol e 100 U/mL Penicillina-Streptomycin).
  3. Preparazione della soluzione a matrice
    1. Mescolare 133 L della soluzione di collagene di tipo I della coda di ratto solubile acida (2 mg/mL, pH 3) con 17 L di 10x mezzo essenziale minimo (MEM). Quindi mescolare la soluzione con 17 L di buffer alcali (0,2 M NaHCO3, 0,2 M HEPES e 0,1 M NaOH).
      NOTA: Il collagene deve essere conservato sul ghiaccio (4 gradi centigradi). Controllare il colore del buffer e se il mezzo non diventa rosato quando tutte le soluzioni sono miste, aggiungere ulteriore buffer alcali al supporto. I passaggi di miscelazione devono essere mescolare collagene I - 10x MEM, e quindi aggiungere buffer alcali. NON modificare questo ordine. NON generare bolle nel mix.
    2. Aggiungere 67 L di matrice di membrana del seminterrato alla soluzione di collagene neutralizzato.
      NOTA: La soluzione mista deve essere tenuta su ghiaccio (4 gradi centigradi).
  4. Centrifugare la sospensione cellulare preparata contenente sei milioni di cellule a 1.100 rpm(240 x g ) per 5 min e rispendere le cellule con 167 L di DMEM ad alto glucosio - 20% FBS - 1% penicillina-streptomicina (100x).
  5. Mescolare la sospensione delle celle e la soluzione a matrice. Il volume totale della miscela di cellule/matrici per un costrutto è di 400 L.
    NOTA: La miscela cellulare/matrice deve essere non viscosa e un colore rosato in questo passaggio. Tenerlo sul ghiaccio come il gel si solidifica a temperatura ambiente. La concentrazione finale di collagene di tipo I è 0,67 mg/mL.
  6. Versare la miscela cellulare/matrice uniformemente sopra lo stampo di tessuto PDMS rivestito poloxamer 407, che viene posto in una piastra di coltura asei possiedi 12.
    NOTA: Versare la miscela con attenzione per evitare di generare bolle al fine di evitare difetti di riempimento nel gel versato.
  7. Incubare la miscela cellulare/matrice in un incubatore standard di CO2 (37C, 5 % CO2) per 60 min.
  8. Dopo che il tessuto si è formato, immergere lo stampo del tessuto con 4 mL di mezzo di coltura ECT.
    NOTA: Anche se la cella/matrice è interconnessa in 60 min, il costrutto è ancora molto fragile. Aggiungere il mezzo delicatamente per evitare di danneggiarlo.
  9. Coltura il tessuto per 14 giorni con cambiamento medio ogni giorno.
  10. Prima dell'impianto ECT, rimuovere delicatamente l'ECT dai pali di carico utilizzando le forcelli sottili sterilizzati.
    NOTA: le quote ECT finali dopo la rimozione dallo stampo sono inferiori allo stampo originale. Uno stampo di 2,1 cm x 2,05 cm genera un ECT rilasciato di circa 1,5 cm x 1,5 cm. Uno stampo più grande di 3,9 cm x 4,05 cm genera un ECT di circa 3 cm x 3 cm. L'ECT scaricato mostra un battito spontaneo intrinseco nel mezzo di coltura calda. Anche se inizialmente mantiene una struttura mesh, un ECT scaricato si riduce e si condensa nel tempo. È possibile tenere il tessuto con le forcelle fini e quindi utilizzare la sutura di seta 7-0 per attaccare l'ECT all'epicardio.

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Representative Results

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Figura 1A,B mostra gli schemi del protocollo CM-EC e MC. Dopo aver indotto cMs e ECs dal protocollo CM-EC e MCs dal protocollo MC, le cellule sono mescolate regolando le concentrazioni mc finali per rappresentare il 10-20% delle cellule totali. Lo stampo vessu su tessuto largo 2 cm viene fabbricato secondo il disegno di progettazione da un foglio PDMS di 0,5 mm di spessore(Figura 2A,B). Sei milioni di cellule CM-EC-MC sono combinate con il collagene I e la matrice e versate sullo stampo vessu su tessuto prebitede con poloxamer 407 (Figura 2C). Durante gli esperimenti preliminari, abbiamo fabbricato stampi tisssing con vari modelli caratterizzati da varie lunghezze di palo e spaziatura e geometrie finali confermate di ETS (Figura 3). Abbiamo selezionato lo stampo con pali lunghi 7 mm con intervalli di 2,5 mm di larghezza per questo studio.

Poloxamer 407 previene l'adesione cellulare allo stampo e ha permesso la formazione di una struttura a maglie caratteristica dopo una rapida compattazione del gel in 14 giorni (Figura 4). Questa struttura viene mantenuta anche dopo che l'ECT è stato rilasciato dal suo stampo. L'intero tessuto è largo circa 1,5 cm e spesso 0,5 mm, e la larghezza di ogni fascio nella rete è di circa 0,5 mm in media.

È possibile generare una mesh di larghezza finale di 3 cm ECT contenente ventiquattro milioni di celle da uno stampo quattro volte più grande con lo stesso post design sfalsato (Figura 5A,B). Questa mesh più grande ECT può essere rimosso facilmente dallo stampo e genera forza attiva locale equivalente alla mesh più piccola ECT (Figura 5C).

Figure 1
Figura 1: Protocolli per differenziare le cellule cardiovascolari dalle cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo. Diagrammi schematici dei protocolli utilizzati per indurre cardiomiociti e cellule endoteliali vascolari (protocollo A, CM-EC) e per indurre cellule murali vascolari (B, protocollo MC). CM - cardiomiocato; EC - cellula endoteliale; MC - cella murale vascolare; iPSC - cellule staminali pluripotenti indotte; MG - matrice di membrana interrato; ActA - Attivazione A; Wnt3a, BMP4, proteina morfogenetica ossea 4; bFGF - fattore di crescita fibroblasta di base; VEGF - fattore di crescita delle cellule endoteliali vascolari; FBS - siero bovino fetale. Questa figura è adattata dal riferimento Masumoto et al.5. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Fabbricazione dello stampo vessurico PDMS e costruzione ECT. (A) Immagine rappresentativa di uno stampo ECT fabbricato da fogli PDMS spessi 0,5 mm. (B) Progettazione dello stampo vessu su tessuto PDMS con pali interni lunghi 7 mm disposti in posizione sfalsata; vista anteriore (pannello superiore) e vista laterale (pannello inferiore). (C) Il protocollo schematico della costruzione ECT da cellule cardiovascolari derivate da hiPSC e gel di matrice. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Impatto dei progetti di stampi tisssing sulle geometrie ECT finali. (A) Definizioni di post length (PL) e spaziatura tra post orizzontali (HPS). (B) Uno stampo di tessuto senza pali rettangolari (PL0) e ha formato un foglio ECT. (C- U2012E) Stampi a tessuto con diversi P/HPS e ET mesh. (F) Uno stampo di tessuto con lunghi pali paralleli e formato un multiplo lineare ECT. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Formazione di ECT a maglie dopo la compattazione del gel. Vengono mostrate serie rappresentative di immagini di una maturazione ECT a maglie dal giorno 0 al 14. La cella/matrice viene versata nello stampo del tessuto PDMS (Giorno 0_0 h), quindi il mezzo di coltura viene aggiunto un'ora dopo (Giorno 0_1 h). Il primo giorno, i pori ellittici sono osservati intorno ai pali di carico. Il costrutto ha mostrato una rapida compattazione del gel e successivamente è maturato in un tessuto a rete. Il giorno 14, il tessuto viene rilasciato dallo stampo. L'ECT scaricato mantiene la geometria della mesh. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Immagini rappresentative di un ECT a maglia più grande destinato a grandi sperimentazioni preclinici e cliniche sugli animali. (A) Disegno dello stampo di tessuto PDMS 4 cm x 4 cm con pali lunghi 7 mm e (B) un'immagine dello stampo. (C) Immagine rappresentativa di una mesh di 3 cm x 3 cm più grande. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 1: valutazione patologica ed elettrofisiologica delle ET mesh. (A) Immagine rappresentativa per un fascio in una mesh ECT macchiato con Hoechst 33342 (blu) per le cellule vive e Ethidium Homodimer III (rosso) per le cellule morte. Barra della scala: 250 m. (B) Immagine rappresentativa di un'immagine confocale tridimensionale di un fascio in una mesh ECT macchiata con troponina cardiaca T (verde). Gli orientamenti cardiomiocisti locali all'interno del fascio vengono visualizzate come linee piccole, dove il colore della linea indica la grandezza nelle direzioni circonferenziali (verde), radiale (rosso) e assiale (blu). (C) L'istogramma sferico visualizza gli orientamenti cardiomiocito locali. Il volume di ogni raggio rappresenta il conteggio relativo per ogni direzione e la linea rossa spessa mostra l'orientamento CM medio. (B) e (C) sono adattati a partire dal puntodi riferimento 13 con revisione. (D) Immagine rappresentativa della misurazione della forza contrazione. Un segmento è stato tagliato sulla linea tratteggiata rossa in una maglia di 1,5 cm x 1,5 cm ECT e attaccato al sistema di test muscolare utilizzando una sutura di nylon 10-0. La punta della freccia bianca indica il trasduttore di forza e la punta della freccia gialla indica il controller di lunghezza ad alta velocità. (E) Forme d'onda rappresentative di sollecitazione attiva a frequenze di stimolazione diverse da 1,5 Hz a 4 Hz. Fare clic qui per scaricare questa cifra.

Video supplementare 1: battito intrinseco di una giunzione in una mesh ECT il giorno 14. Clicca qui per scaricare questo video.

Video supplementare 2: battito intrinseco di un fascio in un ECT a rete il giorno 14. Clicca qui per scaricare questo video.

Video supplementare 3: battito intrinseco di una maglia ECT il giorno 14 dopo il rilascio dallo stampo vessurico. Clicca qui per scaricare questo video.

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Discussion

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Dopo il completamento della nostra indagine su un formato lineare, derivato da hiPSC ECT5, abbiamo adattato il protocollo per mescolare CIC, EC e MC derivati da hiPSC per facilitare l'espansione in vitro delle cellule vascolari all'interno delle ECT e il successivo accoppiamento vascolare in vivo tra ECT e miocardio ricevente.

Per facilitare la generazione di geometrie ECT mesh più grandi e impiantabili abbiamo usato sottili fogli PDMS per progettare gli stampi 3D con pali di carico insaccati in posizioni sfalsate. Durante gli esperimenti preliminari, abbiamo notato che le ET hanno aderito ai posti PDMS durante la compattazione del gel e quindi abbiamo modificato il nostro metodo per rivestire ogni stampo con il poloxamer surfactant per prevenire l'adesione delle cellule che è un passo critico dell'attualeprotocollo 9. Le ECT rimangono staccate dai pali di carico interni e dal fondo dello stampo durante la maturazione in vitro, il che facilita la compattazione del gel e la rimozione dell'ECT dallo stampo. Un altro passo critico del protocollo è quello di versare uniformemente la miscela di matrice cell-gel nello stampo PDMS prima che la matrice si solidifica. È fondamentale eseguire la procedura in breve tempo. Anche le bolle nella miscela di matrice cell-gel dovrebbero essere evitate perché possono causare vacuolazione strutturale e interruzione funzionale delle ET.

Secondo i saggi di fattibilità, circa il 97% delle cellule erano vive entro il giorno 14 costrutti (Supplemental Figure 1A). La figura supplementare 1B mostra l'intera immagine confocale di montaggio macchiata con cTnT che rappresenta l'allineamento miofibria parallela all'asse lungo del fascio locale (Figura supplementare 1C)13. Tutti i costrutti iniziano il battito spontaneo intrinseco in vitro entro 72 h e continuano a battere per tutta la durata della cultura (Supplemental Videos 1 -u20123). Abbiamo analizzato le proprietà elettromeccali di 1,5 cm x 1,5 cm ET utilizzando un sistema di test muscolare isolato personalizzato (Figura supplementare 1D). Gli ECT mostravano velocità di acquisizione del ritmo massimo di 4 Hz e generavano una sollecitazione attiva media di 0,55 mN/mm2 a 2 Hz, 5 V protocollo di stimolazione (n x 11, errore standard dei mezzi - 0,063; (Figura supplementare 1E).

Anche se abbiamo selezionato pali di carico interni lunghi 7 mm con intervalli di 5 mm, è possibile variare la geometria finale dell'ECT disponendo la lunghezza dei pali di carico e l'intervallo tra i pali adiacenti (Figura 3). Inoltre, è possibile espandere la scala di 1,5 cm x 1,5 cm ECT a formati più grandi come 3 cm x 3 cm di grande mesh ECT. Secondo la misurazione della forza, 3 cm x 3 cm ETS hanno mostrato proprietà elettromeccali simili a 1,5 cm x 1,5 cm ETS12. La flessibilità delle forme dei tessuti e la scalabilità con la funzione dei tessuti conservati sono i significati dell'attuale protocollo rispetto ai metodi già esistenti.

Una limitazione dell'attuale protocollo è che gli stampi PDMS sono assemblati a mano da fogli PDMS. Anche se la costruzione di stampi millimetri-unità sarebbe fattibile per assemblaggio a mano, stampi da fotolitraografia o colata da stampi master sarebbe più adatto per la generazione ECT espansa e stabile.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti finanziari o scientifici da divulgare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dal Kosair Charities Pediatric Heart Research Program presso l'Università di Louisville e dal Progetto Organoid presso il RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research. Gli HiPSC utilizzati nei nostri protocolli pubblicati sono stati forniti dal Center for iPS Cell Research and Application, Kyoto University, Kyoto, Giappone.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Cell Culture Dishes 100x20 mm style Falcon/ Thomas scientific 9380C51
Multiwell Plates For Cell Culture 6well 50/CS Falcon / Thomas scientific 6902A01
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 761036
Reagents
Accumax Innovative Cell Technologies AM-105
BMP4, recombinant (10µg) R&D RSD-314-BP-010
Collagen, Type I solution from rat tail Sigma C3867
Growth factor-reduced Matrigel Corning 356231
Human VEGF (165) IS, premium grade Miltenyi 130-109-385
Pluronic F-127, 0.2 µm filtered (10% Solution in Water) Molecular Probes P-6866
Recombinant human bFGF WAKO 060-04543
Recombinant Human/Mouse/Rat ActivinA (50µg) R&D 338-AC-050
rh Wnt-3a (10µg) R&D 5036-WN
Versene solution Gibco 15040066
Culture medium and supplements
10x MEM Invitrogen 11430
2 Mercaptro Ethanol SIGMA M6250
B27 supplement minus insulin Gibco A1895601
DMEM, high glucose Gibco 11965084
Fetal Bovine Serum (500ml) Any
Fetal Bovine Serum (500ml) Any
L-Glutamine Gibco 25030081
NaHCO3 Any
PBS 1x Gibco 10010-031
Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL) Gibco 15070-063
RPMI1640 medium Gibco 21870092
αMEM Invitrogen 11900024
Flowcytometry
anti-TRA-1-60, FITC, Clone: TRA-1-60, BD Biosciences BD / Fisher 560380
anti-Troponin T, Cardiac Isoform Ab-1, Clone: 13-11, Thermo Scientific Lab Vision Fisher MS-295-P0
BD FACS Clean Solution BD 340345
BD FACSFlow Sheath Fluid BD 342003
BD FACSRinse Solution BD 340346
EDTA Any
Falcon Tube with Cell Strainer Cap (Case of 500) Corning 352235
Fetal Bovine Serum (500ml) Any
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation Molecular Probes L34957
PDGFRb; anti-CD140b, R-PE, Clone: 28D4, BD Biosciences BD / Fisher 558821
Saponin Sigma-Aldrich 47306-50G-F
VEcad-FITC; anti-CD144, FITC, Clone: 55-7H1, BD Biosciences BD / Fisher 560411
Zenon Alexa Fluor 488 Mouse IgG1 Labeling Kit Molecular Probes Z25002

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References

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Preparazione di tessuti cardiaci ingegnerizzati a forma di mesh derivati da cellule iPS umane per la riparazione miocardia in Vivo
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Nakane, T., Abulaiti, M., Sasaki, Y., Kowalski, W. J., Keller, B. B., Masumoto, H. Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair. J. Vis. Exp. (160), e61246, doi:10.3791/61246 (2020).More

Nakane, T., Abulaiti, M., Sasaki, Y., Kowalski, W. J., Keller, B. B., Masumoto, H. Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair. J. Vis. Exp. (160), e61246, doi:10.3791/61246 (2020).

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