Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Fremstilling av mesh-formet konstruert hjertevev avledet fra menneskelige iPS-celler for In Vivo myokardreparasjon

doi: 10.3791/61246 Published: June 9, 2020

Summary

Den nåværende protokollen genererer mesh-formet konstruert hjertevev som inneholder kardiovaskulære celler avledet fra menneskelige induserte pluripotente stamceller for å tillate undersøkelse av celleimplantasjonsterapi for hjertesykdommer.

Abstract

Den nåværende protokollen beskriver metoder for å generere skalerbare, mesh-formede konstruerte hjertevev (ECTs) bestående av kardiovaskulære celler avledet fra humane induserte pluripotente stamceller (hiPSCer), som er utviklet mot målet om klinisk bruk. HiPSC-avledede kardiomyocytter, endotelceller og vaskulære veggmalericeller blandes med gelmatrise og helles deretter i en polydimetylsiloxane (PDMS) vevsform med rektangulære interne forskjøvede innlegg. Etter kulturdagen modnes 14 ECTs til en 1,5 cm x 1,5 cm nettingstruktur med 0,5 mm diameter myofiberbunter. Kardiomyocytter justeres etter den lange aksen til hver bunt og slår spontant synkront. Denne tilnærmingen kan skaleres opp til en større (3,0 cm x 3,0 cm) mesh ECT samtidig som konstruere modning og funksjon bevares. Dermed kan mesh-formede ECTs generert fra hiPSC-avledede hjerteceller være mulig for hjerteregenerering paradigmer.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tallrike prekliniske studier og kliniske studier har bekreftet effektiviteten av cellebaserte hjerteregenerative terapier for sviktendehjerter 1,,2,,3. Blant ulike celletyper, menneskelig indusert pluripotente stamceller (hiPSCs) er lovende cellekilder i kraft av deres proliferative evne, potensial til å generere ulike kardiovaskulæreavstamninger 4,,5,og allogenitet. I tillegg har vevsteknologi gjort det mulig å overføre millioner av celler til et skadet hjerte5,6,7,8.

Tidligere rapporterte vi generering av tredimensjonale (3D) lineære konstruerte hjertevev (ECTs) fra hiPSC-avledede kardiovaskulære avstamninger ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig kultursystem for 3D bioartificial vev5,,7. Vi fant at sameksistensen av vaskulære endotelceller og veggmalericeller med kardiomyocytter i ECT tilrettelagte strukturell og elektrofysiologiske vevmodning. Videre validerte vi det terapeutiske potensialet til implanterte hiPSC-ECTs i en immuntolerant rotte hjerteinfarktmodell for å forbedre hjertefunksjonen, regenerere myokardi og forbedre angiogenese5. De lineære ECT-ene som ble konstruert ved denne metoden var imidlertid 1 mm med 10 mm sylindere og var derfor ikke egnet for implantasjon i prekliniske studier med større dyr eller klinisk bruk.

Basert på vellykket bruk av vevsformer for å generere porøs konstruert vevsdannelse ved hjelp av rotte skjelettmyoblaster og kardiomyocytter9,menneskelig ESC-avledet kardiomyocytter10 og mus iPSCs11,utviklet vi en protokoll for å generere skalerbare hiPSC-avledede større implanterbare vev ved hjelp av polydimetylsiloxane (PDMS) former. Vi evaluerte en rekke mugggeometrier for å bestemme de mest effektive muggegenskapene. Mesh-formede ECTs med flere bunter og veikryss viste gode egenskaper i celle levedyktighet, vevfunksjon og skalerbarhet sammenlignet med vanlig ark eller lineære formater som manglet porer eller veikryss. Vi implanterte den mesh-formede ECT i en rotte hjerteinfarkt modell og bekreftet dens terapeutiske effekter som ligner på implantert sylindriske ECTs12. Her beskriver vi protokollen for å generere en hiPSC-avledet mesh-formet ECT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Vedlikehold av hiPSCer og kardiovaskulær differensiering

  1. Utvid og vedlikehold hiPSCer på tynn-coat kjeller membran matrise (vekstfaktor redusert, 1:60 fortynning) i betinget medium ekstrahert fra mus embryonale fibroblaster (MEF-CM) med human grunnleggende fibroblast vekstfaktor (hbFGF)4.
    MERK: Vi brukte en hiPSCs (4-faktor (Oct3/4, Sox2, Klf4 og c-Myc) linje: 201B6). Legg hbFGF ved riktig konsentrasjon for hver cellelinje. Laminin-511 fragment kan også brukes til belegg av kulturrett i stedet for kjeller membran matrise. Kommersielt tilgjengelig medium designet for materfri kultur av hiPSCer kan brukes som en erstatning for MEF-CM.
  2. Bruk Versene (0,48 mM etylendiaminetetraacetic acid (EDTA) oppløsning) for å løsne og dissosiere celler når cellesammenløpet når 90 \\ u2012100%.
    MERK: Andre kommersielt tilgjengelige produkter for celledissosiasjon kan også brukes.
  3. Plateceller med en tetthet på 10 000 celler/mm2 på matrisebelagte cellekulturplater i MEF-CM med hbFGF og kultur i to til tre dager.
  4. Når kulturen blir helt samløpet, dekk cellene med matrise (1:60 fortynning med MEF-CM) i en dag.
  5. Erstatt MEF-CM med RPMI 1640 + B27 medium. Tilsett 100 ng/ml Activin A og 100 ng/ml Wnt3A i mediet i én dag.
    MERK: Dette er dag 0 av differensiering. For å oppregulere kanonisk Wnt-signalering kan GSK3β-hemmere også brukes i stedet for Wnt3A.
  6. På dag 1 av differensiering, endre mediet til nye RPMI 1640 + B27 med 10 ng /ml BMP4 og 10 ng/ml hbFGF. Kulturceller for to (MC-protokoll) eller fire (CM+EC-protokoll) dager uten middels endring5.
    MERK: CM+EC-protokollen er optimalisert for samtidig å indusere kardiomyocytter (CMs) og vaskulære endotelceller (ECer). MC-protokollen er optimalisert for å fortrinnsvis indusere vaskulære veggmalericeller (MCer).
  7. CM+EC-protokollen for induksjon av CMs og ECer (figur 1A).
    1. Erstatt mediet på dag 5 differensiering med RPMI 1640 + B27 supplert med 50 ng/ml VEGF165.
    2. Endre kulturmediet hver 48.
  8. MC-protokollen for induksjon av vaskulære veggmalericeller (figur 1B)
    1. Erstatt mediet med RPMI1640 + 10 % føtal storfeserum (FBS) på dag 3 av differensiering.
    2. Endre kulturmediet hver 48.

2. Celleinnhøsting og avstamning analyse på differensiering dag 13 \\ u201215

  1. Vask cellene med Ca2+ og Mg2 + fri fosfatbufret saltvann (PBS).
  2. Tilsett celledissosiasjonsløsning (som inneholder proteaser, collagenaser og DnAser) i cellekulturfatet for å dekke platen. Inkuber platen i 5 min ved 37 °C.
  3. Samle og dissosiere cellene med kultur medium ved hjelp av en pipette etter inkubasjon.
  4. Tildel 1 x 106 celler for avstamning analyse med flyt cytometri. For å eliminere døde celler, flekk cellene med fikserbar levedyktighet fargestoff.
  5. Flekk cellene med membranoverflatemarkører i PBS med 5% FBS. Bruk følgende fortynninger av antistoff i fluorescensaktivert cellesortering (FACS) fargingsbuffer: anti-PDGFRβ (1:100), anti-VE-kadherin (1:100), anti-TRA-1-60 (1:20).
  6. For intracellulære proteiner, resuspend og fikse cellene med 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS.
  7. Flekk cellene med anti-hjerte isoform av Troponin T (cTnT) i PBS med 5% FBS og 0,75% Saponin, deretter merke cTnT antistoff med 488 mus IgG1 (fortynning 1:50).
  8. Resuspend de beisede cellene i PBS med 5% FBS og legg dem i FACS-rør med cellesil.
  9. Analyser cellesammensetningen av de beisede cellene fra hver differensieringsprotokoll med strømningscytometri for å lette genereringen av cellesuspensjoner med definerte avstamningsfordelinger.
    MERK: Under denne prosedyren bevares den gjenværende cellefjæringen for ECTs i et kjøleskap på 4 °C.

3. Fabrikasjon av PDMS vev mold

  1. Legg en 0,5 mm tykk og over 30 mm x 30 mm lag med polydimetylsiloxane (PDMS) ved å blande prepolymer- og krysskoblingsløsningen i forholdet 10:1 og herd deretter ved 80 °C i 3 timer.
  2. Klipp PDMS-arket og bind det med silikonlim for å fremstille en 21 mm x 20,5 mm rektangulær skuff med 7 mm lang, 0,5 mm bred og 2,5 mm høye rektangulære stolper i forskjøvet stilling. Vannrett stolpeavstand mellom to linjer med stolper er 2,5 mm (figur 2B).
  3. Autoklav brettet ved 120 °C i 20 min.
  4. Coat skuffen med 1% poloxamer 407 i PBS i 1 time. Skyll poloksameren 407 og skyll formen med PBS tilstrekkelig før bruk.

4. ECT konstruksjon

  1. Etter cellelinjeanalysen kombinerer du cellene fra CM+EC- og MC-protokoller slik at den endelige konsentrasjonen av MCer er 10 til 20 % i et totalt cellenummer på seks millioner celler perkonstruksjon 5.
  2. Suspender blandede seks millioner celler i ECT kultur medium (alfa minimum essensiell medium supplert med 10% FBS, 50 μM 2-mercaptoethanol og 100 U / ml Penicillin-Streptomycin).
  3. Utarbeidelse av matriseløsning
    1. Bland 133 μL syreløselig rottehale kollagen type I oppløsning (2 mg/ml, pH 3) med 17 μL på 10x minimum viktig medium (MEM). Bland deretter oppløsningen med 17 μL alkalibuffer (0,2 M NaHCO3,0,2 M HEPES og 0,1 M NaOH).
      MERK: Kollagen må oppbevares på is (4 °C). Kontroller bufferfargen, og hvis mediet ikke blir rosa når alle løsningene blandes, legger du til ekstra alkalibuffer til mediet. Blandetrinnene må blandes kollagen I + 10x MEM, og deretter legge til alkalibuffer. IKKE endre denne ordren. IKKE generer bobler i blandingen.
    2. Tilsett 67 μL kjellermembranmatrise til den nøytraliserte kollagenløsningen.
      MERK: Den blandede oppløsningen må oppbevares på is (4 °C).
  4. Sentrifuger den tilberedte cellesuspensjonen som inneholder seks millioner celler ved 1100 o/min (240 x g)i 5 min og gjenoppuss cellene med 167 μL høyglukose DMEM + 20% FBS + 1% penicillin-streptomycin (100x).
  5. Bland cellefjæringen og matriseløsningen. Det totale volumet av celle/matriseblanding for en konstruksjon er 400 μL.
    MERK: Celle-/matriseblandingen skal være ikke-viskøs og en rosa farge på dette trinnet. Hold den på isen, da gelen vil stivne ved romtemperatur. Den endelige konsentrasjonen av kollagen type I er 0,67 mg / ml.
  6. Hell celle/matriseblandingen jevnt over poloxamer 407 belagt PDMS vevsform, som er plassert i en seks-brønns kulturplate12.
    MERK: Hell blandingen nøye for å unngå å generere bobler for å unngå å fylle defekter i den hellede gelen.
  7. Inkuber celle-/matriseblandingen i en standard CO2 inkubator (37C, 5 % CO2) i 60 min.
  8. Etter at vevet er dannet, suge vevsformen med 4 ml ECT kulturmedium.
    MERK: Selv om cellen / matrisen er krysskoblet i 60 min, er konstruksjonen fortsatt svært skjør. Tilsett middels forsiktig for å unngå å skade den.
  9. Kultur vevet i 14 dager med middels forandring hver dag.
  10. Før ECT implantasjon, fjerne ECT fra lastestolpene forsiktig ved hjelp av steriliserte fine tang.
    MERK: De endelige ECT-dimensjonene etter fjerning fra formen er mindre enn den opprinnelige formen. En 2,1 cm x 2,05 cm mugg genererer en frigjort ECT på ca. 1,5 cm x 1,5 cm. En større 3,9 cm x 4,05 cm mugg genererer en ECT på ca. 3 cm x 3 cm. Losset ECT viser egen spontan juling i varmt kulturmedium. Selv om den i utgangspunktet opprettholder en nettstruktur, krymper og kondenserer en losset ECT over tid. Det er mulig å holde vevet mykt med fine tang og deretter bruke 7-0 silkesutur for å feste ECT til epicardium.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Figur 1A,B viser skjemaene til CM+EC- og MC-protokollen. Etter å ha indusert CMs og ECer fra CM + EC-protokollen og MC-protokollen, blandes cellene med å justere endelige MC-konsentrasjoner for å representere 10 til 20% av totale celler. Den 2 cm brede vevsformen er fabrikkert i henhold til designtegningen fra 0,5 mm tykt PDMS-ark (figur 2A, B). Seks millioner CM + EC + MC celler er kombinert med kollagen I, og matrise og helles på vev mold precoated med poloxamer 407 (Figur 2C). Under foreløpige eksperimenter fabrikkerte vi vevsformer med ulike mønstre preget av ulike stolpelengder og avstand og bekreftede endelige geometrier av ECTs (figur 3). Vi valgte formen med 7 mm lange innlegg med 2,5 mm brede intervaller for denne studien.

Poloxamer 407 forhindrer celle vedheft til formen og aktiverte dannelsen av karakteristisk mesh struktur etter rask gelkomprimering i 14 dager (Figur 4). Denne strukturen opprettholdes selv etter at ECT frigjøres fra sin form. Hele vevet er ca. 1,5 cm bredt og 0, 5 mm tykt, og bredden på hver bunt i nettet er ca. 0, 5 mm i gjennomsnitt.

Det er mulig å generere en 3 cm siste bredde mesh ECT som inneholder tjuefire millioner celler fra en fire ganger større mold med samme forskjøvet stolpe design (Figur 5A, B). Denne større mesh ECT kan fjernes fra formen enkelt og genererer lokal aktiv kraft tilsvarende mindre mesh ECT (Figur 5C).

Figure 1
Figur 1: Protokoller for å skille kardiovaskulære celler fra humane induserte pluripotente stamceller. Skjematiske diagrammer av protokoller som brukes til å indusere kardiomyocytter og vaskulære endotelceller (A, CM + EC-protokoll) og for å indusere vaskulære veggmalericeller (B, MC-protokoll). CM = kardiomyocyte; EC = endotelcelle; MC = vaskulær veggmaleri celle; iPSC = indusert pluripotente stamcelle; MG = kjeller membran matrise; ActA = Activin A; Wnt3a, BMP4, Bone morfogenetisk protein 4; bFGF = grunnleggende fibroblast vekstfaktor; VEGF = vaskulær endotelcellevekstfaktor; FBS = føtal storfe serum. Dette tallet er tilpasset fra referanse Masumoto et al.5. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Fabrikasjon av PDMS vevsform og ECT-konstruksjon. (A)Representativt bilde av en ECT-form som er fabrikkert fra 0,5 mm tykke PDMS-ark. (B) Utformingen av PDMS vev mold med 7 mm lange interne innlegg arrangert i forskjøvet stilling; frontvisning (øvre panel) og sidevisning (nedre panel). (C)Den skjematiske protokollen for ECT konstruksjon fra hiPSC-avledede kardiovaskulære celler og matrise gel. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Virkningen av vevsformdesign på endelige ECT-geometrier. (A) Definisjoner av stolpelengde (PL) og horisontal etterstand (HPS). (B)En vevsform uten rektangulære innlegg (PL0) og dannet et ark ECT. (C\u2012E) Vevsformer med forskjellige PL/HPS- og nettinge-ECT-er. (F)En vevsform med lange parallelle stolper og dannet en flere lineære ECT. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Dannelse av mesh ECT etter gelkomprimering. Representativ serie bilder av en mesh ECT modning fra dag 0 til 14 vises. Celle/matrise helles i PDMS vevsform (Dag 0_0 h), deretter legges kulturmediet til en time senere (dag 0_1 h). På dag 1 observeres elliptiske porer rundt lastestolper. Konstruksjonen viste rask gelkomprimering og modnet til et mesh vev deretter. På dag 14 frigjøres vevet fra formen. Den lossede ECT opprettholder nettinggeometrien. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Representative bilder av en større mesh ECT beregnet for store dyre prekliniske studier og kliniske studier. (A) Design av 4 cm x 4 cm PDMS vev mold med 7 mm lange innlegg og (B) et bilde av formen. (C) Representativt bilde av en 3 cm x 3 cm større mesh ECT. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggs figur 1: Patologisk og elektrofysiologisk evaluering av mesh ECTs. (A) Representativt bilde for en bunt i en mesh ECT farget med Hoechst 33342 (blå) for levende celler og Ethidium Homodimer III (rød) for døde celler. Vektstangen: 250 μm. (B) Representativt bilde av et tredimensjonalt konfokalbilde av en bunt i en mesh ECT farget med hjertetroponin T (grønn). Lokale kardiomyocytterretninger i bunten visualiseres som små linjer, der linjefarge indikerer størrelsen i de omkrets (grønne), radiale (røde) og aksiale (blå) retningene. (C)Det sfæriske histogrammet viser lokale kardiomyocyttretninger. Volumet på hver stråle representerer det relative antallet for hver retning, og den tykke røde linjen viser gjennomsnittlig CM-retning. (B) og (C) er tilpasset fra referanse13 med revisjon. (D)Representativt bilde av kontraktil kraftmåling. Et segment ble avskåret på den røde stiplede linjen i en 1,5 cm x 1,5 cm mesh ECT og festet til muskeltestsystemet ved hjelp av 10-0 nylon sutur. Det hvite pilhodet indikerer krafttransduser, og det gule pilhodet indikerer høyhastighets lengderegulator. (E) Representative bølgeformer av aktivt stress ved forskjellige tempofrekvenser fra 1,5 Hz til 4 Hz. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.

Tilleggsvideo 1: Iboende juling av et veikryss i en mesh ECT på dag 14. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Tilleggsvideo 2: Egenslag av en bunt i en mesh ECT på dag 14. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Supplerende Video 3: Iboende juling av en mesh ECT på dag 14 etter utgitt fra vevsformen. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Etter ferdigstillelse av vår undersøkelse av et lineært format, hiPSC avledet ECT5,tilpasset vi protokollen for å blande hiPSC-avledede CMs, ECer og parlamentsmedlemmer for å lette in vitro-utvidelsen av vaskulære celler i ECTs og påfølgende in vivo vaskulær kobling mellom ECTs og mottaker myokardi.

For å lette genereringen av større, implanterbare mesh ECT geometrier brukte vi tynne PDMS-ark for å designe 3D-formene med lastestolper som er plassert i forskjøvede posisjoner. Under foreløpige eksperimenter bemerket vi at ECTs fulgte PDMS-innleggene under gelkomprimering, og derfor endret vi vår metode for å belegge hver mugg med overflateaktiv poloksamer for å forhindre celleadhesjon som er et kritisk trinn i dagensprotokoll 9. ECTs forblir løsrevet fra de interne lastestolpene og muggbunnen under in vitro modning, noe som letter gelkomprimering og ECT fjerning fra formen. Et annet kritisk trinn i protokollen er å jevnt helle celle-gel matriseblandingen i PDMS-formen før matrisen stivner. Det er viktig å utføre prosedyren innen kort tid. Bobler i celle-gel matrise blandingen bør også unngås fordi det kan føre til strukturell vacuolation og funksjonell forstyrrelse av ECTs.

Ifølge levedyktighetsanalyser var ca. 97 % av cellene i live i løpet av dagen 14 konstruksjoner (tilleggsfigur 1A). Tilleggsfigur 1B viser hele brakettens konfokalbilde farget med cTnT som representerer myofiberjustering parallelt med den lokale buntlange aksen (Tilleggsfigur 1C)13. Alle konstruksjoner starter iboende spontan juling in vitro innen 72 timer og fortsatte å slå gjennom hele kulturvarmingen (Supplerende videoer 1 \\ u20123). Vi analyserte elektromekaniske egenskaper på 1,5 cm x 1,5 cm ECTs ved hjelp av et tilpasset isolert muskeltestsystem (Supplerende figur 1D). ECTs viste maksimal pacing fangsthastigheter på 4 Hz og genererte en gjennomsnittlig aktiv stress på 0,55 mN / mm2 ved 2 Hz, 5 V pacing protokoll (n = 11, standard feil på midler = 0,063; Tilleggstall 1E).

Selv om vi valgte 7 mm lange interne lastestolper med 5 mm intervaller, er det mulig å variere den endelige ECT-geometrien ved å ordne lengden på lastestolper og intervallet mellom tilstøtende stolper (figur 3). Videre er det mulig å utvide skalaen på 1,5 cm x 1,5 cm ECTs til større formater som 3 cm x 3 cm stor mesh ECT. Ifølge kraftmåling viste 3 cm x 3 cm ECTs elektromekaniske egenskaper som ligner på 1,5 cm x 1,5 cm ECTs12. Fleksibiliteten til vevsformer og skalerbarhet med bevart vevsfunksjon er betydning av den nåværende protokollen med hensyn til allerede eksisterende metoder.

En begrensning av den nåværende protokollen er at PDMS-formene er håndmontert fra PDMS-ark. Selv om byggingen av millimeter-enhet former ville være mulig ved håndmontering, former fra fotolitografi eller støping fra master former ville være mer egnet for utvidet og stabil ECT generasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen økonomiske eller vitenskapelige konflikter å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble økonomisk støttet av Kosair Charities Pediatric Heart Research Program ved University of Louisville og Organoid Project ved RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research. HiPSCs brukes i våre publiserte protokoller ble levert av Center for iPS Cell Research and Application, Kyoto University, Kyoto, Japan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Cell Culture Dishes 100x20 mm style Falcon/ Thomas scientific 9380C51
Multiwell Plates For Cell Culture 6well 50/CS Falcon / Thomas scientific 6902A01
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning 761036
Reagents
Accumax Innovative Cell Technologies AM-105
BMP4, recombinant (10µg) R&D RSD-314-BP-010
Collagen, Type I solution from rat tail Sigma C3867
Growth factor-reduced Matrigel Corning 356231
Human VEGF (165) IS, premium grade Miltenyi 130-109-385
Pluronic F-127, 0.2 µm filtered (10% Solution in Water) Molecular Probes P-6866
Recombinant human bFGF WAKO 060-04543
Recombinant Human/Mouse/Rat ActivinA (50µg) R&D 338-AC-050
rh Wnt-3a (10µg) R&D 5036-WN
Versene solution Gibco 15040066
Culture medium and supplements
10x MEM Invitrogen 11430
2 Mercaptro Ethanol SIGMA M6250
B27 supplement minus insulin Gibco A1895601
DMEM, high glucose Gibco 11965084
Fetal Bovine Serum (500ml) Any
Fetal Bovine Serum (500ml) Any
L-Glutamine Gibco 25030081
NaHCO3 Any
PBS 1x Gibco 10010-031
Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL) Gibco 15070-063
RPMI1640 medium Gibco 21870092
αMEM Invitrogen 11900024
Flowcytometry
anti-TRA-1-60, FITC, Clone: TRA-1-60, BD Biosciences BD / Fisher 560380
anti-Troponin T, Cardiac Isoform Ab-1, Clone: 13-11, Thermo Scientific Lab Vision Fisher MS-295-P0
BD FACS Clean Solution BD 340345
BD FACSFlow Sheath Fluid BD 342003
BD FACSRinse Solution BD 340346
EDTA Any
Falcon Tube with Cell Strainer Cap (Case of 500) Corning 352235
Fetal Bovine Serum (500ml) Any
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation Molecular Probes L34957
PDGFRb; anti-CD140b, R-PE, Clone: 28D4, BD Biosciences BD / Fisher 558821
Saponin Sigma-Aldrich 47306-50G-F
VEcad-FITC; anti-CD144, FITC, Clone: 55-7H1, BD Biosciences BD / Fisher 560411
Zenon Alexa Fluor 488 Mouse IgG1 Labeling Kit Molecular Probes Z25002

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sanganalmath, S. K., Bolli, R. Cell therapy for heart failure: A comprehensive overview of experimental and clinical studies, current challenges, and future directions. Circulation Research. 113, 810-834 (2013).
  2. Fisher, S. A., Doree, C., Mathur, A., Martin-Rendon, E. Meta-Analysis of Cell Therapy Trials for Patients With Heart Failure. Circulation Research. 116, 1361-1377 (2015).
  3. Menasché, P., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors for severe heart failure treatment: first clinical case report: Figure 1. European Heart Journal. 36, 2011-2017 (2015).
  4. Masumoto, H., et al. Human iPS cell-engineered cardiac tissue sheets with cardiomyocytes and vascular cells for cardiac regeneration. Scientific Reports. 4, 6716 (2014).
  5. Masumoto, H., et al. The myocardial regenerative potential of three-dimensional engineered cardiac tissues composed of multiple human iPS cell-derived cardiovascular cell lineages. Scientific Reports. 6, 29933 (2016).
  6. Zimmermann, W. H., et al. Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts. Nature Medicine. 12, 452-458 (2006).
  7. Fujimoto, K. L., et al. Engineered fetal cardiac graft preserves its cardiomyocyte proliferation within postinfarcted myocardium and sustains cardiac function. Tissue engineering. Part A. 17, 585-596 (2011).
  8. Lancaster, J. J., et al. Surgical treatment for heart failure: cell-based therapy with engineered tissue. Vessel Plus. 2019, (2019).
  9. Bian, W., Liau, B., Badie, N., Bursac, N. Mesoscopic hydrogel molding to control the 3D geometry of bioartificial muscle tissues. Nature protocols. 4, 1522-1534 (2009).
  10. Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34, 5813-5820 (2013).
  11. Christoforou, N., et al. Induced pluripotent stem cell-derived cardiac progenitors differentiate to cardiomyocytes and form biosynthetic tissues. PloS one. 8, 65963 (2013).
  12. Nakane, T., et al. Impact of Cell Composition and Geometry on Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Engineered Cardiac Tissue. Scientific Reports. 7, 45641 (2017).
  13. Kowalski, W. J., et al. Quantification of Cardiomyocyte Alignment from Three-Dimensional (3D) Confocal Microscopy of Engineered Tissue. Microscopy and Microanalysis. 1, (2017).
Fremstilling av mesh-formet konstruert hjertevev avledet fra menneskelige iPS-celler for In Vivo myokardreparasjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nakane, T., Abulaiti, M., Sasaki, Y., Kowalski, W. J., Keller, B. B., Masumoto, H. Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair. J. Vis. Exp. (160), e61246, doi:10.3791/61246 (2020).More

Nakane, T., Abulaiti, M., Sasaki, Y., Kowalski, W. J., Keller, B. B., Masumoto, H. Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair. J. Vis. Exp. (160), e61246, doi:10.3791/61246 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter