Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

En Drosophila Model til undersøgelse Sår-induceret Polyploidization

Published: June 9, 2020 doi: 10.3791/61252
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 1
1Biology Department, Boston College, 2Graduate School of Biomedical Sciences and Engineering and Kathryn W. Davis Center for Regenerative Biology and Medicine, MDI Biological Laboratory, University of Maine
* These authors contributed equally

Summary

Sår-induceret polyploidisering er en bevaret væv reparation strategi, hvor cellerne vokser i størrelse i stedet for at dividere for at kompensere for celletab. Her er en detaljeret protokol om, hvordan man bruger frugtfluen som model til at måle ploidy og dens genetiske regulering i epitelsår reparation.

Abstract

Polyploidi er et hyppigt fænomen, hvis indvirkning på organisme sundhed og sygdom er stadig dårligt forstået. En celle defineres som polyploid, hvis den indeholder mere end den diploidkopi af dens kromosomer, hvilket er et resultat af endoreplet eller cellefusion. I væv reparation, sår-induceret polyploidization (WIP) har vist sig at være en bevaret helbredende strategi fra bananfluer til hvirveldyr. IGVA har flere fordele i forhold til celleprolifererende, herunder resistens over for onkogen vækst og genotoksisk stress. Udfordringen har været at identificere, hvorfor polyploide celler opstår, og hvordan disse unikke celler fungerer. Forudsat er en detaljeret protokol til undersøgelse af IGVA i voksent frugtfluepitel, hvor polyploide celler genereres inden for 2 dage efter et punkteringssår. Drage fordel af D. melanogaster omfattende genetiske værktøjskasse, de gener, der kræves for at indlede og regulere WIP, herunder Myc, er begyndt at blive identificeret. Fortsatte undersøgelser ved hjælp af denne metode kan afsløre, hvordan andre genetiske og fysiologiske variabler, herunder køn, kost, og alder regulere og påvirke WIP's funktion.

Introduction

Drosophila melanogaster er et attraktivt modelsystem til at studere de cellulære og molekylære mekanismer epitelsår reparation. Som hos pattedyr afhænger de anvendte vævsreparationsmekanismer af både vævet og dets udviklingsfase. Arløs sårheling sker i frugtflue embryo, hvor en actomyosin "pung streng" former på epitel forkant gør det muligt for såret atproblemfrit lukke 1,2. Post-embryonal sårheling i larver, pupper og voksne bananfluer resulterer i ekstracellulær matrix remodeling, melanin ardannelse og epitelcellevækst3,4,,5,6. Epitelcellerne stiger i størrelse efter cellefusion og endocytet, en ufuldstændig cellecyklus, der omgår mitose3,4,7,8. Som følge heraf kompenseres celletab af polyploid cellevækst i stedet for celledeling. Den voksne flyve hindgut, midgut, og follikulære epitel også stole på polyploid cellevækst for at kompensere for celletab eftervævsskader 9,10,11.

Polyploidi er et velkendt aspekt af organismeudvikling i planter og insekter, men i de sidste par år er det blevet mere tydeligt, at polyploidi er en bevaret væv reparation strategi i hvirveldyr12. Zebrafisk, som har kapacitet til at regenerere sit hjerte, er afhængig af polyploid cellevækst til at helbrede beskadiget epicardium13. Polyploidi bidrager også til leverregenerering af pattedyr og nyre tubulepitelepitel efter akut skade14,15. I disse eksempler genereres polyploide celler ved endorelikering via enten endocy- eller endomitose, hvilket resulterer i en binukleeret celle på grund af en blok i cytokinese12. Gåden er grunden til polyploide celler opstår under sårreparation, og hvordan polyploidi påvirker vævsfunktionen. Nylige undersøgelser har givet ny indsigt i spørgsmålet om, hvorvidt polyploidi giver en helbredende fordel eller ulempe. I zebrafisk epicardium, polyploidy forbedret hastigheden af sårheling13. I D. melanogaster hindgut og pattedyr lever, polyploidy blev anset for at være beskyttende mod onkogen vækst11,14. Hos voksne flyve epitel, Blev det for nylig konstateret, at polyploidi muliggør sår reparation i overværelse af genotoksisk stress16. Endorplication er resistent over for DNA-skader, så sårheling, når celleproliferation ellers ville blivekompromitteret 17. For kardiomyocytter i mus og zebrafisk hjerter, dog, polyploidy bremser healing, resulterer i øget ardannelse 18,19. Derfor, afhængigt af organ og / eller celletype, polyploidy kan være en gavnlig eller skadelig væv reparation strategi. Tilgængeligheden af D. melanogaster genetik kombineret med analyse af sår-induceret polyploidization (WIP) svar gør det til en ideel model system til at belyse de molekylære og cellulære mekanismer, der styrer denne sårheling strategi.

Her præsenterer vi en protokol til analyse af WIP i den voksne D. melanogaster epitel. Inkluderet er instruktioner til frugt flue skade, dissektion, immunstaining, montering, billeddannelse, og analyse af re-epitelisering, celle fusion, og endoreplication (ploidy). Billeddannelses- og ploidyanalysen kan også tilpasses andre modeller for at teste, om IGVA finder sted. Det skal bemærkes, at der med en stigning i det nukleare DNA-indhold ofte er en tilsvarende stigning i den nukleare størrelse. Der er imidlertid mange eksempler inden for biologi, hvor den nukleare størrelse ikke afspejler en tilsvarende ændring i ploidy20. Endnu mere forsigtighed bør tages, når man fortolker nukleare størrelse i forbindelse med et sår miljø, hvor cellerne ofte vil sprede sig eller strække til at dække sårstedet. Derfor er det eneste endelige bevis for ændring i ploidy at måle DNA-indhold ved denne metode (eller andre, såsom hele genom sekventering)21. Denne metode øger egnetheden af den voksne D. melanogaster abdominal epitel som en model til at studere den rolle og regulering af polyploidi i sårreparation.

Protocol

1. Iscenesættelse og lokering af voksne bananfluer

  1. Vælg D. melanogaster-stamme (dvs. epi-Gal4/ UAS-stamme, se Materialetabel).
    BEMÆRK: Her anvendes Gal4/UAS-systemet til at muliggøre epitelspecifikt genekspression (epi-Gal4) af et gen eller RNAi, der er kodet nedstrøms for UAS. Denne undersøgelse anvender fluorescerende membranprotein (UAS-Cd8.mRFP), mitotisk inducer (UAS-fzrRNAi, UAS-stg) og WIP-hæmmer (UAS-E2F1RNAi; UAS-RacDN).
  2. Der opsaml to hætteglas med 10-15 nyligt lukkede hunfrugtfluer hver og alder på hætteglas med friske fødevarer ved 25 °C indtil 3-5 dage gamle. Det ene hætteglas vil fungere som den uskadte kontrol, og det andet hætteglas vil blive såret som beskrevet nedenfor. Hunfluerne skal holdes med hanner (~5/hætteglas).
  3. For at vikle fluerne samles flere pinholdere hver med en enkelt 0,10 mm stift i rustfrit stål. Sørg for, at den skarpe ende af stiften vender ud. Stifter kan nemt bøje eller spåner efter punktering af fluen og hooked eller beskadigede stifter skal kasseres.
  4. Bedøve alderen kvindelige bananfluer på en CO2-flyvepad under et stereomikroskop og tilpasse dem i en række ved hjælp af en pensel. Iført sikkerhedsbriller, holde pinholderen i den ene hånd og pincet i den anden, bruge pincet til at placere en flue med sin ventrale mave vender opad.
  5. Punkter den voksne hun flyver inden for epitel pleuriteregionen tergite A4 på hver side af ventrale midterline sternites (Figur 1A). Punktering denne ventrale region giver optimal plads væk fra dissektion steder, hvor væv kanter vil blive revet af mekanisk behandling.
  6. Vend tilbage sårede fluer til mad hætteglasset og alder til den ønskede dag efter skade (dpi). Epitelsårheling starter ved 1 dpi og slutter med 3 dpi. Endorplication toppe ved 2 dpi, hvilket er ideelt til EdU-analysen (afsnit 4, Figur 2).

2. Flyve abdominal dissektion

BEMÆRK: Under dette trin er det vigtigt at undgå at røre det ventrale bugvæv med dissektionsværktøjerne, da det vil kompromittere epitelets integritet.

  1. Få alle nødvendige materialer til dissektion: Grace's opløsning, pincet, Vanna's Spring Saks, 0,10 mm stifter, dissekereplader, 9 godt glas dissektion fad, fiksativ opløsning (4% paraformaldehyd i 1x PBS), 1x PBS, klude, pipette og tips til 30 μm, og handsker (se Tabel over materialer).
  2. Bekræft, at fluer med held blev såret af bedøvende sårede fluer på en CO2-flyvepad under et stereomikroskop og kontrol for tilstedeværelsen af såret ar (dvs. en melanin plet på maven, se figur 1B). Kassér fluer fra forsøgsgruppen, som ikke blev såret med succes.
  3. For at starte dissektion, fylde en brønd af en 9 godt glas dissektion fad med Grace's opløsning. Brug et par kraftafcessiver til at gribe en såret kvindelig flue ved brystkassens brystkasse og nedsænke fluen i brønden indeholdende Graces opløsning.
  4. Brug af spån i den modsatte hånd uden at slippe brystkassen, punktere dorsale neglebånd under tergite A6 og trække neglebånd fra bagenden af frugtfluen. De indre organer (æggestokkene og tarmen) vil normalt komme ud på dette trin. Hvis ikke, forsigtigt skubbe på den dorsale side af maven med stænden til at presse de resterende organer og kassere i en tom brønd.
  5. Snap off den fulde mave ved brystkassen krydset over tergite A2 ved hjælp af snævler og overføre maven til en tom brønd, der indeholder ~ 100 μL af Grace's opløsning.
  6. Gentag trin 2.3-2.5, indtil alle flyve maven er dissekeret.
  7. Reducer mængden af Graces opløsning til 30 μL i brønden, der indeholder poolede, dissekerede maver.
  8. Filet maven åbne ved at placere maven på rygsiden med snævler i den ene hånd og derefter indsætte den nederste klinge af Vanna's foråret saks i bughulen med den anden hånd. Skær langs dorsale midterlinjen, indtil maven er helt åbnet, hvilket kan kræve op til tre snit(Figur 1C, 1D).
  9. Opsæt en tør dissekering plade med fire 0,10 mm ben pr abdominal montering område. Hver 35 mm dissekereplade kan rumme op til syv monteringsområder. Pipette 30 μL graces opløsning på hvert monteringsområde og overføre en fileteret mave til hver dråbe.
  10. Fastgør de fileterede maver til skålen på de fire dorsale hjørner (Figur 1E). Sørg for, at vævet ligger fladt uden at rive eller overbelaste mavevævet.
  11. For at fikse vævet pipetterer Graces opløsning af og tilsættes 30 μL af fixopløsningen til den fastgjorte mave.
    FORSIGTIG: Brug handsker, mens du håndterer opløsningen, da paraformaldehyd er giftigt.
  12. Gentag trin 2.10-2.11, indtil alle fileterede maver er fastgjort på dissekeringpladen.
  13. Placer en tape etiket på bunden af hver skål for at markere hver kontrol og eksperimentel gruppe. Fix prøver i 30-60 min ved stuetemperatur (RT).
  14. Fastgør opløsningen vaskes ved at pipettere på 1,5 ml 1x PBS til hver plade. Løsn opløsning og plast i passende beholdere til flydende eller tørt kemisk affald i henhold til institutionelle retningslinjer.
  15. Pladerne vaskes 2x med 1,5 ml 1x PBS, og fast væv, der er dækket af 1,5 ml 1x PBS, opbevares i en plastbeholder med låg. Der tilsættes et lag fugtigt køkkenrulle til bunden af beholderen, og prøverne opbevares ved 4 °C, indtil de er klar til immunstain inden for 1 uge efter dissektion.

3. Immunfluorescens

  1. Reagenser til friskberedning (se Materialetabel):vaskebufferopløsning (0,3 % Triton X 100, 0,3 % BSA i 1x PBS). Sidesten vask buffer kan gemmes ved 4 °C og anvendes i hele 2 dages farvning protokol. Der klargør tilstrækkelig primær antistofopløsning pr. analyse (figur 2) ved hjælp af Anti-FasIII (1:50 mus anti-Fasciclin-III) i vaskebuffer med enten anti-Grh (1:300 affinitetsrens renset kanin anti-Grainyhead8) eller anti-RFP (1:1.000 kaninanti-RFP). Primære antistofopløsninger kan gemmes ved 4 °C og genbruges flere gange, indtil signalet reduceres betydeligt.
  2. Permeabilize væv ved pipettering off 1x PBS, tilføje 1,5 ml vask buffer, og inkubering i mindst 30 min på en orbital shaker (80 rpm) på RT.
  3. Vaskbuffer og pletvæv natten over fjernes med 1,5 ml primær antistofopløsning, der inkuberes på en orbitalshasker (80 omdr./min.) ved 4 °C. Den primære antistofopløsning opsamls, og gem i et rør ved 4 °C til fremtidige eksperimenter.
  4. Skyl først prøven hurtigt med 1x PBS, og vask derefter 3x med 1,5 ml vaskebuffer. For hver vask inkuberes prøverne ved RT på en orbitalshaker i mindst 30 min.
  5. Under den endelige vask, forberede den sekundære antistof opløsning: 1:1,000 æsel anti-kanin Alexa 488 eller 568 og 1:1,000 ged anti-mus Alexa 488 eller 568 (eller fluorophores valg) i vask buffer.
  6. Fjern vaskebuffer og pletvæv med 1,5 ml sekundær antistofopløsning. Dæk prøver med aluminiumsfolie og inkubere på en orbital shaker på RT i 3 timer. Alternativt kan prøver inkuberes natten over ved 4 °C på en orbital shaker.
  7. Prøverne vaskes først ved at kassere sekundærantistofopløsning, og prøven skylles hurtigt med 1x PBS efterfulgt af tre vaske med 1,5 ml vaskebuffer. For hver vask inkuberes prøverne ved RT på en orbitalshaker i mindst 30 min.
  8. Dapi-opløsningen klargøres ved at fortynde DAPI til 10 μg/ml i vaskebuffer. Efter den endelige vask skal der indstænnes pletter med 1,5 ml DAPI-opløsning ved RT i 30 min.
  9. Dapi-opløsning kasseres, og prøverne 2x i 1,5 ml 1x PBS kasseres. Opbevar blyindfattet væv i 1,5 ml 1x PBS i mørke, dækket med aluminiumsfolie, ved 4 °C, indtil det er klar til montering på et glasdias med dækslæb. Monteringstrinnet skal udføres inden for 1 uge.

4. Cellecyklusaktivitet (EdU-analyse)

  1. Der foretages en 10 mM EdU-lageropløsning fra Click-iT-kit (se Materialetabel)ved at opløse EdU-pulveret i dH2 0og blandes i ~ 15 min, indtil det er helt opløst. Lageropløsningen kan aliquoted (250 μL pr. rør) og opbevares ved -80 °C.
  2. Foder flyver EdU ved først at fortynde EdU lager til 5 mM i dH2O. Tilsæt tør gær, indtil opløsningen er uklar og kort vortex at blande. Skær en 0,5 ml rørhætte af og læg den i bunden af fluemadhætteglasset. Skub hætten ind i maden, så den er stabil.
  3. Bedøve fluerne og overføre 3-5 dage gamle flyver ind i hætteglasset. Tryk på fluerne til den ene kant, så ingen sidder fast i hætten.
  4. Pipette 75 μL gær-EdU opløsning i hætten. Fluer skal fodres frisk gær-EdU løsning hver dag og overføres til en frisk mad hætteglas med en hætte hver anden dag for at sikre, at fluerne ikke går i stå i bunden af hætteglasset.
  5. Hvis du vil overføre fluer, flip til et nyt hætteglas med en hætte, sætte fluer i søvn, tryk fluer til den ene side, og tilsæt frisk gær-EdU løsning.
  6. På den tredje dag, skade fluerne og fortsætte med at fodre gær-EdU indtil dissektion på 2 dpi (Figur 4A). Se protokol afsnit 2 for dissektion og fiksering metoder.
  7. EdU-farvningsgengøringsgengøring: vaskebuffer (0,3 % Triton X 100, 0,3% BSA i 1x PBS), permeabiliseringsbuffer (0,5% Triton X 100 i 1x PBS), blokerende buffer (3% BSA i 1x PBS) og forberede reagenser fra EdU-analysesættet (se Materialetabel),herunder 1x reaktionsbuffer og 1x reaktionsdem buffertilsætningsstof som anvist af producenten.
  8. Prøverne vaskes i 1 time, og der blandes ved RT i 1,5 ml vaskebuffer.
  9. Der tilsættes 1,5 ml permeabiliseringsbuffer, og der inkuberes prøver i 20 min.
    BEMÆRK: Optø og forbered reaktionscocktailopløsningen med et volumen på 500 μL/plade.
  10. Vask prøver 1x hurtigt med 1x PBS og derefter 3x hurtigt med 1 ml blokerende buffer.
  11. Pipette af alle resterende blokerende buffer og tilsæt 500 μL reaktion cocktail opløsning pr plade. Swirl plader for at sikre væv er helt dækket. Inkuberes i en skuffe i mørke i 1 time på RT.
  12. Vask prøver 1x hurtigt med 1,5 ml blokerende buffer.
  13. Plet med 1,5 ml DAPI-opløsning ved 1:5.000 i vaskebuffer i 30 min.
  14. Vask 2x med 1x PBS hurtigt, wrap i folie, og opbevares i mørke ved 4 °C, indtil klar til at montere prøver inden for 3 dage.

5. Mount plettet væv

  1. Få alle nødvendige materialer til montering: glas dias, glas coverslips, klar neglelak, montering medier, et par kraftvipper, og klude.
  2. At montere farvede flyvevæv, frigøre maver fra dissekerepladen ved hjælp af snævler under stereomikroskopet. Overfør væv til ~ 30 μL monteringsmedier på et glasdækslet ved forsigtigt at tage væv med sniver ved dens dorsale flanker, idet man skal passe på at undgå at røre ventrale område med snævler.
  3. Under stereomikroskopet orientere abdominalvævet, så indersiden vender nedad mod coverslip (dvs. de eksterne neglebånd / børster vender opad). Træk de orienterede maver til kanten af mediedråberne ved hjælp af snægtene. Overfladespænding vil hjælpe med at holde vævet fladt (Figur 1F).
    BEMÆRK: Det er nyttigt for billedbehandling at organisere maven i en kolonne eller række på dette tidspunkt.
  4. Mærk et glasdias (dvs. kontrol eller eksperimentel), og tag dækslen op ved langsomt at bringe glidet tættere på dækslæbet. Flip over og forsigtigt skamplet med en tørre for at fjerne overskydende monteringsmedier.
  5. Seal kanterne af coverslip med klar neglelak og gentag for alle resterende eksperimentelle grupper. Opbevar dias i en slideboks ved 4 °C, indtil de er klar til billedet.

6. Billedbehandling og behandling

  1. Billede flue abdominal sår område ved først at lokalisere melanin ar med en konfokal mikroskop (Figur 1B), enten et punkt scanner eller en struktureret belysning (ApoTome) med en 40x olie eller tør mål.
  2. Kontroller eksponeringen på hver kanal, og sikre, at signalet er under mætning. Billedindstillingerne skal være baseret på den klareste eksempelgruppe. Dette er især vigtigt for ploidy analyse som DAPI kanal skal forblive i det lineære område for præcist at måle DNA-indhold.
  3. Tag et komplet z-stack billede i alle tre kanaler med en optimal afstand på mindst 0,50 μm mellem skiver. Gem optagne billeder og åbn filen i billedanalyseprogrammet Fiji (også kendt som ImageJ).
  4. For hvert billede skal du oprette en z-stack-projektion ved hjælp af indstillingen sum af udsnit for alle kanaler.
  5. Drej billederne efter behov for at sikre, at kernerne er linet op vandret på tværs af billeder(Figur 3A og Figur 4E).
  6. Beskære alle billederne til et rektangulært udvalg på 300 μm x 300 μm centreret omkring sårstedet eller midten af uskadt kontrol. Identificer området ved at tegne et rektangel og vælge Rediger | Udvælgelse | Angiv. Kontroller, at skalerede enheder er i mikron for at sikre, at boksen af samme størrelse bruges til alle billeder, der skal analyseres.

7. Endoreplering (ploidy) analyse

  1. Ved hjælp af Fiji skal du vælge Grh-kanalvinduet og duplikere billedet. Brug derefter tærskelværktøjet til at oprette en maske. Juster tærsklen manuelt ved at skubbe den øverste bjælke for at minimere baggrunden uden at få kernerne til at skrumpe drastisk(Figur 4D).
  2. Hvis nogen kerner i Grh-kanalen rører ved tærskelbilledet, skal du bruge penselværktøjet (2 pixelbredde) i samme farve som baggrunden for at tegne en streg mellem kernerne. Klik for at anvende 1x, når du er færdig for at generere den endelige maske.
  3. Opret et kort over interesseområde (ROI) ved hjælp af funktionen Analyser partikler: Angiv størrelsen til 5 μm-60 μm for at fange det meste af kernerne uden at medtage baggrunden.
  4. Juster investeringsafkastet efter behov manuelt i roi-chefen. Slet alle valg, der ikke er kerner, og føj eventuelle kerner til listen, som ikke blev identificeret ved at skitsere kernen med værktøjet til frihåndsvalg og føje den til roi-lederen (Figur 4D).
  5. Vælg DAPI-kanalen, og klik derefter på Vis alt i roi-lederen for at anvende det genererede investeringsafkast-kort i Grh-kanalen på DAPI-kanalen.
  6. Slet valg, hvor epitelkerner-konturen overlapper med ikke-muskelklekerner (f.eks. kerner fra muskel eller fedt) fra kortet over investeringsafkastet. Kornyhoved kun pletter epitelkerner, mens DAPI pletter alle kerner. Kontroller, at hvert dispositionsvalg kun indeholder én kerne, og slet eller rediger markeringer med mere end én kerne. Gem redigeret roi-liste.
  7. Mål området og den integrerede tæthed af hver epitelkerner i investeringsafkastet kortet ved hjælp af analyseværktøjerne i Fiji. Eksporter værdierne til et regnearksprogram.
  8. Mål den gennemsnitlige billedbaggrund ved hjælp af det cirkulære markeringsværktøj. Tegn tre cirkler, der ikke overlapper med nogen kerner i forskellige områder af DAPI-billedet. Føj området og den integrerede tæthed af hver af cirklerne til et regnearksprogram for at fastslå baggrundsbilledets lysstyrke.
  9. Start med at beregne den gennemsnitlige baggrund pr. enhedsområde for hvert billede ved at dividere hver baggrundsintegreret tæthedsværdi med det tilsvarende område. Derefter gennemsnit de tre integrerede tæthed pr område målinger for billedet for at opnå den gennemsnitlige baggrund pr enhed område.
  10. Derefter beregnes den samlede baggrund for hver DAPI-kerne ved at gange kernens areal med den gennemsnitlige baggrund pr. enhedsområde. Den normaliserede DAPI-intensitet for hver målt kerne kan derefter beregnes ved at trække den samlede baggrund for hver kerne fra den målte integrerede tæthed.
  11. Gennemsnit alle de normaliserede DAPI intensitet værdier fra den uskadte epitel kontrol. De skadesløs epitelkerner blev tidligere beregnet til at have en ploidyværdi på 2C og kan tjene som reference for beregning af ploidy i epitelkernerne fra forsøgsbetingelserne8.
  12. Beregn ploidy for hver kerne ved at dividere den normaliserede DAPI-intensitet for hver kerne med den normaliserede værdi fra referenceskadelig epitelkontrol (2C), hvordylværdien med 2 til den normaliserede ploidy (C-værdi):
    (Nuklear integreret tæthed - Baggrund Nuklear integreret tæthed)/Gennemsnitlig nuklear integreret tæthed (uskadt epitelkerner = 2C) x 2 = epitelatisk nukleart ploidy (C)
  13. Grafkerner med ploidyværdier som et punktdiagram, histogram eller grupperet i en søjlediagram i overensstemmelse hermed (dvs. 2C [0.6-2.9C], 4C [3.0-5.9C], 8C [6.0-12.9C], 16C [13.0-24.9C] og >32C [>25.0C] (Figur 3F).

Representative Results

En detaljeret protokol er fastsat til at bruge D. melanogaster som model til at studere sår-induceret polyploidisering (WIP). Denne sårheling model giver mange fordele i forhold til pattedyr og andre flyve modeller af WIP. Polyploidi blev let induceret af en mekanisk punktering med en insektstift, og polyploide celler blev genereret inden for en kort periode (2-3 dpi) (Figur 1A, 1B)4. Den største udfordring er dissektion af intakt abdominalvæv uden problemer til epitel. D. melanogaster epitel er let ved et uheld stødte eller ridset med den skarpe dissektion værktøjer. Derfor bør trinene i denne protokol praktiseres før brug og analyse.

For det første var skaden begrænset til den ventrale kvindelige mave, som giver et stort, fladt uigennemsigtigt vævsområde ideel til billeddannelse. De punktering sår blev påført i pleurite epitel, som ligger på begge sider af ventrale midterlinjen sternites og målrettet mellem tergite (T) segmenter T4-T5 (Figur 1A-C). Denne sårplacering giver et stort synligt område, der ikke forstyrres af dissektionen. Udfordrende trin omfatter abdominal foråret saks skåret og pinning trin( Figur 1D, 1E). Fjederskæringstrinnet fungerede bedst, når maven blev skåret i en reduceret mængde Graces opløsning (~30 μL) for at reducere vævsbevægelsen. Et godt centreret snit langs rygmens midterlinje var nødvendigt for at give tilstrækkelig plads på mavernes flaps til at fastgøre åbne på dissektionspladen (Figur 1C). Maven skal fastgøres forsigtigt på de fire hjørner uden overdreven kraft (Figur 1E). En pin push, der er for hårdt vil fordreje abdominalvæv og kunne endda skubbe vævet ind i dissektion plade. Hvis dette sker, skal vævet kasseres. Når mavevævet var rettet, forblev det på dissektionspladen, indtil immunfluorescensfarvning var fuldstændig, og maven blev monteret på en glasdækslet til billeddannelse (Figur 1F).

Sårheling kræver en kontinuerlig epitelark til at danne, som er afhængig af endoreplication og celle fusion4,16. Septate junction protein FasIII, som etiketter celle-celle kryds, forudsat en indikator for, om eventuelle forarbejdning urolige opstod underpræparatet( Figur 1G, 1H). Maver med store ridser (ubeboet område), der forstyrrer sårområdet, skal kasseres og ikke anvendes til yderligere analyse (Figur 1H).

Det næste skridt var at analysere intakte prøver for eventuelle fejl i WIP. Denne protokol indeholder særskilte analyser til påvisning af forskellige aspekter af IGVA-responsen (figur 2). Sårreparationen var fuldført, da en central, stor, flerkernet celle dækkede sårskurven (Figur 3A). Her celle fusion blev opdaget ved farvning for FasIII / Grh og kvantificere antallet af Grh+ epitelkerner omfattet i FasIII skitseret område4. Der blev konstateret fejl ved sårlukning eller re-epitelisering, når der blev observeret huller på >10 μm i epitelarket (figur 3B, rød pil). Dette var for eksempel tilfældet, da IG blev hæmmet af aktivering af mitotisk cyklus via udtryk for stg, fzrRNAi, som for nylig rapporteret16. I denne genetiske tilstand, 52% af sårene var ikke i stand til at danne en kontinuerlig epitel ark over såret skorpe (Figur 3B, 3C).

En anden metode til at måle sårreparation i denne model var ved at visualisere epitelmembranen med epi-Gal4 udtryk for UAS-mCD8-ChRFP4 (Figur 2, Figur 3D). I kontrol, 91% af epitelsår lukket helt af 3 dpi, men hæmme WIP ved at blokere endoreplication (E2f1RNAi) og celle fusion (RacDN) samtidig, som tidligere rapporteret, forårsaget 92% af epitelsår til at forblive helt åben (Figur 3D, 3E)8,16. Aktivering af mitotisk celle cyklus ved udtryk for stg, fzrRNAi resulterede også i en epitelsår lukning defekt. Men ved at visualisere epitelcellemembranen kan omfanget af re-epiteliseringsdefekt bestemmes. IG-mutanten (E2f1RNAi, RacDN) var mere åbne end stg-, fzrRNAi-sårene (Figur 3D, stiplet rødt omrids)16. Denne membran sårheling analyse givet flere oplysninger om omfanget af såret reparation defekt. Som følge heraf kan re-epiteliseringsfejl grupperes som enten helt åbne, delvist lukkede (dvs. >10 μm huller) eller helt lukket (Figur 3D, 3E).

Ud over cellefusion vokser epitelceller i størrelse ved endorelikering, en ufuldstændig cellecyklus, der fordobler det nukleare DNA-indhold. Endorpletningen blev analyseret af både cellecyklusaktivitet og direkte nukleare DNA-ploidymålinger (figur 2 og figur 4). Her, celle cyklus aktivitet blev opdaget ved inkorporering af thymidin analog, EdU (Figur 4A, 4B). D. melanogaster epitelceller blev fundet at komme ind i endoskopi, en ufuldstændig celle cyklus, der svinger mellem S og G faser uden en mellemliggende M fase4,12. Den voksne D. melanogaster diæt blev suppleret med EdU+ mad før skade og fluerne blev opretholdt på en EdU+ kost indtil dissektion på 2 dpi (Figur 4A). EdU blev derefter fundet ved hjælp af producentens Click-iT-protokol. Denne EdU-analyse blev brugt til at bestemme, hvor, hvornår og hvor mange kerner der blev udløst for at komme ind i S-fasen som reaktion på et sår. Ved hjælp af Gal4 / UAS-systemet blev det for nylig konstateret, at epitelspecifikt udtryk for myc enten kan blokere (mycRNAi) eller forværre (Myc overekspression) kompetence epitelceller til at komme ind S fase. Som følge heraf har det vist sig, at Myc er tilstrækkelig til at fremkalde endoreplet i postmitotiske celler, selv uden skade16,22.

Dernæst blev epitel ploidy bestemt ved direkte at måle nukleart DNA-indhold. Epitelkerner blev identificeret ved immunfluorescensfarvning for den epitelspecifikke markør, Grh (Figur 4D). I Fiji imaging software, epitelkerner blev systemisk identificeret og derefter tærskles ved hjælp af Grh nukleare plet. Kerner blev derefter adskilt og ROI'erne overlejret på SUM af stakke DAPI billede (Figur 4D, grøn pil). Alle overlappende kerner blev slettet manuelt, før den integrerede tæthed for de valgte kerner blev målt (Figur 4D, røde pile). Denne halvautomatiske metode gør det muligt at kvantificere fordelingen og ploidy af de fleste kerner i hele uskadt og repareret flyve abdominal epitel8. Som for nylig rapporteret, epitelkerner omkring såret var sammensat af 44% polyploid kerner med DNA-indhold mere end 3C ved 3 dpi (Figur 4E, 4F)16. Som forventet fra EdU resultater, knockdown af myc førte til en betydelig blok i endoreplication, som kun 9% af epitelkerner var polyploid, mens overekspression af Myc resulterede i 100% polyploid epitelkerner omkring sårstedet (Figur 4F)16. Epitel nukleare størrelse blev også synligt påvirket af myc udtryk med enten reduceret eller udvidet kerner til stede. Det nukleare område er imidlertid ikke et nøjagtigt mål for de ploidy og fysiologiske virkninger, fordi faktorer som cellestræk også kan påvirke den nukleare størrelse uden at påvirke det nukleareDNA-indhold 20.

Figure 1
Figur 1: Voksen frugt flyve abdominal sårede, dissekere, og væv montering. aA) Diagram over den voksne abdominale såranalyse. Fluer skal komme til skade på begge sider af maven ved tergite 4 (T4). (B) Voksen hunfrugt flue 3 dpi med melanin skurv dannet af sårheling (hvid boks). Skalabar = 50 μm. (C) Dissekeret voksen mave, dorsal visning, med tergites mærket. Maver blev fileteret ned midterlinjen af dorsale side (hvid stiplede linje). Skalabar = 50 μm.(D) Dissekeret og fileteret voksentrenes maver før fastgørelse. Skalabar = 50 μm.(E) Fastgjort voksent abdomen på en dissekerende plade. En pin blev placeret i hver af de fire hjørner af maven på den dorsale side. Vævet blev forsigtigt åbnet, men ikke strakt, for at undgå at rive. (F)Voksne maver blev monteret og placeret på et glas coverslip med indersiden af maven vender nedad mod dækslet og neglebånd orienteret mod glasset dias. gG) FasIII farvning af intakt sårområde uden behandlingsforvaltelse og et centralt synytium (stiplet gul linje). Skalalinje = 50 μm. (H) Billede af et ridset sårområde (*) med et uhæmmet FasIII-område, der forstyrrer synkroniseringsbilledet. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Arbejdsgang for IGVA-analyse. Rutediagrammet viser de tre analyser, der er beskrevet i denne undersøgelse, og overlappende og forskellige trin til at detektere og måle VIA-responsen. EdU-analysen måler cellecyklusaktivitet (blå bokse), ploidy og re-epitelisering påvises ved Grh/FasIII immunostaining (grønne bokse), og ekspression af membran RFP tillader måling af omfanget af epitelsårlukning (lyserøde kasser). Almindelige trin er i grå kasser og D. melanogaster stamme genotyper er anført ovenfor. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Metoder til registrering af re-epitelisering under IGVA. Re-epitelisering blev forstyrret, da WIP var genetisk hæmmet. Immunofluorescerende billeder af kontrol (A) og stg, fzrRNAi (B) ved 3 dpi. Epitelkerner og septate kryds blev plettet med Grh (grøn) og FasIII (magenta), henholdsvis. (A' og B') FasIII farvning alene viste, at re-epitelisering var nedsat (rød pil) i stg, fzrRNAi epitel. Skalabar = 50 μm. (C) Kvantificering af re-epiteliseringsdefekter (%) ved 3 dpi (grå): kontrol (n = 8), stg, fzrRNAi (n = 6). Fejllinjer angiver standardfejl. statistisk signifikans blev målt via Student's T-test, **P < 0,01. Re-epitelisering under sårreparation kunne også påvises ved udtryk for en membran forbundet RFP ved hjælp af epi-Gal4, UAS-mCD8-RFP. dD) Immunofluorescerende billeder af kontrol, E2F1RNAi, RacDN, og stg, fzrRNAi på 3 dpi. Skalabar = 20 μm. Sårskurv (gul kontur) og åbent epitelsårområde (rødt kontur). (E) Kvantificering af sårlukning i ctrl (n = 11), E2F1RNAi, RacDN (n = 13) og stg, fzrRNAi (n = 13). Tilpasset fra Grendler et al.16. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Metoder til registrering af endoreplet under IGVA. a) Tidslinje for EdU-analyse: voksen Drosophila blev fodret med 75 μL på 5 mM gær-EdU hver dag 2 dage før skaden og fortsatte indtil 2 dpi. (B) Immunofluorescerende billeder af EdU-mærket i fluestammer udtrykt med epi-Gal4/ UAS-system ved 2 dpi. Sårskurv (W). Skalalinje = 50 μm. (C) Gennemsnitligt antal EdU+ epitelkerner pr. flue ved 2 dpi: ctrl (n = 37), mycRNAi#1 (n = 10) og Myc (n = 8). Fejllinjer angiver standardfejl. statistisk signifikans blev målt via Student's T-test, *P < 0,05, **P < 0,01. d) Skematisk over påvisning og måling af epitelsetisk nukleart ploidy. Epitelkerner blev identificeret og tærskelaf anti-Grh pletten i Fiji. Overlappende epitelkerner blev adskilt (grønne pilespidser) eller fjernet (røde pilespidser), hvis overlejret af ikke-overlappende kerner. Det integrerede tætheds- og nukleart område med tilsvarende DAPI-billede af farvede kerner blev målt. (E) Epithelial nukleare størrelse (Grh) blev ændret ved myc udtryk på 3 dpi. (F) Epitelselige nukleare ploidy (%) ved 3 dpi: ctrl (n = 4), mycRNAi#1 (n = 6) og Myc (n = 3). Tilpasset fra Grendler et al.16. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Præsenteret er en detaljeret protokol om, hvordan man dissekere og bruge den voksne D. melanogaster abdominal epitel til at undersøge, hvordan gener regulere WIP ved at ændre re-epitelisering og endoreplication under sårreparation16. Ved hjælp af denne metode blev proto-oncogene Myc for nylig identificeret som en vigtig regulator af IGVA. Myc er nødvendig for epitelceller at endoreplicere post skade og er tilstrækkelig til quiescent epitelceller til endocycle både i voksne flyve epitel og tilbehør kirtler16,22. Det blev også konstateret, at skifte epitelceller til en mitotisk celle cyklus ved udtryk for stg, fzrRNAi er skadeligt for sår reparation. Fortsatte undersøgelser ved hjælp af denne metode vil identificere andre gener, der kræves for at regulere re-epitelisering og endoreplication under WIP, afslører både ligheder og forskelle til, hvordan polyploidy er reguleret og fungerer i en række forskellige væv.

Denne model og metode giver unikke fordele, herunder nem induktion af polyploidi med en mekanisk punktering og det faktum, at polyploide celler genereres inden fordag 4. Vævsdissektions- og præparatprotokollerne er baseret på larvedissektionsteknikker23, men den voksne flue maven er mere stiv og derfor let forstyrret. Som et resultat, denne protokol kræver praksis og præcision til at isolere en intakt væv til at studere WIP. Når dissekeret, men epitel er klart synlig og let afbildet, giver et øjebliksbillede af sårhelingsprocessen. Denne metode giver et væld af oplysninger om den voksne flyve epitel organisation, celle og syncytium størrelse, og ploidy af celler og individuelle kerner. Mens levende billeddannelse endnu ikke er muligt inden for den intakte frugtflue på grund af dens uigennemsigtige neglebånd, kan denne protokol tilpasses til at omfatte de nuværende tilgængelige ex vivo-dyringsbetingelser, der anvendes i D. melanogaster til at udføre kortvarige levende billeddannelsesundersøgelser24.

I fremtiden vil denne model være ideel til at studere celle-til-celle krydstale og andre celletypers bidrag til IGVA ved at regulere genekspression med Gal4/UAS-systemet i andre celletyper af interesse. Lignende spørgsmål kan også besvares ved hjælp af en række genetiske og mutant baggrunde. Den dissekerede voksne flyve maven indeholder en række celletyper, der let kan visualiseres ved hjælp af denne metode, herunder fedt krop og oenocytes, laterale muskelfibre, sensoriske neuroner, luftrør, og makrofag-lignende hæmocytter. Desuden vil denne model give forskerne mulighed for at undersøge, hvordan fysiologiske variabler påvirker WIP, herunder sex, kost, infektion, alder og miljømæssige stressfaktorer. Mens protokollen bruger den voksne kvindelige flyve på grund af sin større størrelse, WIP forekommer også i den mandlige frugtflue (Gjelsvik og Losick, ikke offentliggjort). Polyploide celler har vist sig at opstå under aldring og aldersrelaterede sygdom i pattedyrlever, hjerne, øje, og hjerte12. Frugtfluemodellen vil gøre det muligt for forskere at studere polyploidisering i fysiologiske og sygdomsmæssige sammenhænge, fordi menneskelige sygdomsrelaterede gener er stærkt bevaret.

Disclosures

Ingen.

Acknowledgments

På Boston College, vil vi gerne takke Dr. Eric Folker for brug af hans lab kamera og stereoscope mikroskop setup til billedbehandling og Bret Judson på Boston College Imaging Core for infrastruktur og støtte. Vi vil også gerne takke flue samfund ressourcer: Bloomington Drosophila Stock Center (NIH P40OD018537), Wien Drosophila Resource Center, og TRiP Center på Harvard Medical School (NIH / NIGMS R01-GM084947) for at give transgene bestande, der anvendes i denne undersøgelse. Musen FasIII antistof blev opnået fra Developmental Studies Hybridoma Bank støttet af NICHD af NIH og vedligeholdes på The University of Iowa, Institut for Biologi, Iowa City, IA. Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af National Institute of General Medical Sciences af National Institutes of Health under Award Nummer R35GM124691. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra de nationale sundhedsinstitutter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm Petri dishes Fisher Scientific FB0875713 For creating plates to dissect in
50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-432-22 For preparing staining reagents in
AxioImager M2 with Apotome Zeiss NA For imaging samples
Blowgun mini Genesee Scientific 54-104M For anethesizing D. melanogaster strains
Bovine Serum Albumin, 30% Sigma A7284-500ML For immuostaining
Carbon dioxide tank various distributors N/A For anethesizing D. melanogaster strains
Click-iT EdU 594 Kit Thermofisher C10339 For EdU assay
Coverslips Thermofisher 3406 For mounting
DAPI Sigma D9542-10MG For immuostaining
Dissecting Plates (use Sylgard 184 Sil Elastic Kit) Ellsworth Adhesives 184SIL For creating plates to dissect in. Mix epoxy as directed, let dry overnight
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Thermofisher A21206 For secondary immuostaining
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 conjugate Thermofisher A10042 For secondary immuostaining
Drosophila tubing and fittings Genesee Scientific 59-124C, 59-123, 59-140 For anethesizing D. melanogaster strains
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20 For dissecting
epi-Gal4 Bloomington Drosophila Stock Center (b) b38793 Losick et al. Current Biology, 2013
epi-Gal4, UAS-mCD8.RFP Bloomington Drosophila Stock Center (b) b38793, b27392 Losick et al. Current Biology, 2013
Excel Microsoft For performing ploidy calculations
Fiji/ImageJ (image analysis software) NIH https://imagej.nih.gov/ij For image analysis
Fly food Archon Scientific N/A Corn Syrup/Soy food
Flystuff Flypad Genesee Scientific 59-114 For anethesizing D. melanogaster strains
Glass dissecting dish Fisher Scientific 13-748B For performing dissections in
Glass slides Fisher Scientific 12-518-104C For mounting
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Thermofisher A11001 For secondary immuostaining
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 conjugate Thermofisher A11031 For secondary immuostaining
Grace's Insect Medium, unsupplemented Thermofisher 11595030 For dissecting in
Insect pins Fine Science Tools 26002-10 For wounding and pinning fly abdomens flat
Mouse anti-Fasciclin III (Drosophila) Primary Antibody Developmental Studies Hybridoma Bank 7G10 For immunostaining epithelial cell-cell junctions
Mouting media Vector Laboratories H-1000 Anti-fade mounting media to prevent photo bleaching during imaging
Nail polish Electron Microscopy Sciences 72180 For sealing slides
Ortibal shaker Fisher Scientific 02-217-988 For immuostaining
Phosphate Buffered Saline, PH 7.4 Sigma P3813-10PAK For staining
Pin holders Fine Science Tools 91606-07 For wounding
Rabbit anti-Grainyhead Primary Antibody N/A N/A For immunostaining epithelial nuclei. Protocol to make antibody can be found (Ref. #4 and 8)
Rabbit anti-RFP Primary Antibody MBL PM005 For immunostaining mCD8-RFP fly epithelium
Stereomicroscope Olympus SZ51 For dissecting and mounting fly tissue
Triton X-100 Sigma 10789704001 For immuostaining
UAS-E2F RNAi, UAS-RacDN VDRC (v) and Bloomington Drosophila Stock Center (b) v108837, b6292 Losick et al. Current Biology, 2013
UAS-fzr RNAi, UAS-Stg VDRC (v) and Bloomington Drosophila Stock Center (b) v25550, b56562 Grendler et al. Development, 2019
UAS-Myc Bloomington Drosophila Stock Center (b) b9674 Grendler et al. Development, 2019
UAS-myc RNAi Bloomington Drosophila Stock Center (b) b36123 Grendler et al. Development, 2019
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-00 For dissecting

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abreu-Blanco, M. T., Verboon, J. M., Liu, R., Watts, J. J., Parkhurst, S. M. Drosophila embryos close epithelial wounds using a combination of cellular protrusions and an actomyosin purse string. Journal of Cell Science. 125 (Pt 24), 5984-5997 (2012).
  2. Wood, W., et al. Wound healing recapitulates morphogenesis in Drosophila embryos. Nature Cell Biology. 4 (11), 907-912 (2002).
  3. Galko, M. J., Krasnow, M. A. Cellular and genetic analysis of wound healing in Drosophila larvae. PLoS Biology. 2 (8), E239 (2004).
  4. Losick, V. P., Fox, D. T., Spradling, A. C. Polyploidization and cell fusion contribute to wound healing in the adult Drosophila epithelium. Current Biology. 23 (22), 2224-2232 (2013).
  5. Wang, Y., et al. Integrin Adhesions Suppress Syncytium Formation in the Drosophila Larval Epidermis. Current Biology. 25 (17), 2215-2227 (2015).
  6. Ramos-Lewis, W., LaFever, K. S., Page-McCaw, A. A scar-like lesion is apparent in basement membrane after wound repair in vivo. Matrix Biology. 74, 101-120 (2018).
  7. Lee, C. W., Kwon, Y. C., Lee, Y., Park, M. Y., Choe, K. M. cdc37 is essential for JNK pathway activation and wound closure in Drosophila. Molecular Biology of the Cell. 30 (21), 2651-2658 (2019).
  8. Losick, V. P., Jun, A. S., Spradling, A. C. Wound-Induced Polyploidization: Regulation by Hippo and JNK Signaling and Conservation in Mammals. PLoS One. 11 (3), e0151251 (2016).
  9. Tamori, Y., Deng, W. M. Tissue repair through cell competition and compensatory cellular hypertrophy in postmitotic epithelia. Developmental Cell. 25 (4), 350-363 (2013).
  10. Xiang, J., et al. EGFR-dependent TOR-independent endocycles support Drosophila gut epithelial regeneration. Nature Communications. 8, 15125 (2017).
  11. Cohen, E., Allen, S. R., Sawyer, J. K., Fox, D. T. Fizzy-Related dictates A cell cycle switch during organ repair and tissue growth responses in the Drosophila hindgut. Elife. 7, e38327 (2018).
  12. Gjelsvik, K. J., Besen-McNally, R., Losick, V. P. Solving the Polyploid Mystery in Health and Disease. Trends in genetics: TIG. 35 (1), 6-14 (2019).
  13. Cao, J., et al. Tension Creates an Endoreplication Wavefront that Leads Regeneration of Epicardial Tissue. Developmental Cell. 42 (6), 600-615 (2017).
  14. Zhang, S., et al. The Polyploid State Plays a Tumor-Suppressive Role in the Liver. Developmental Cell. 44 (4), 447-459 (2018).
  15. Lazzeri, E., et al. Endocycle-related tubular cell hypertrophy and progenitor proliferation recover renal function after acute kidney injury. Nature Communications. 9 (1), 1344 (2018).
  16. Grendler, J., Lowgren, S., Mills, M., Losick, V. P. Wound-induced polyploidization is driven by Myc and supports tissue repair in the presence of DNA damage. Development. 146 (15), 173005 (2019).
  17. Mehrotra, S., Maqbool, S. B., Kolpakas, A., Murnen, K., Calvi, B. R. Endocycling cells do not apoptose in response to DNA rereplication genotoxic stress. Genes & Development. 22 (22), 3158-3171 (2008).
  18. Patterson, M., et al. Frequency of mononuclear diploid cardiomyocytes underlies natural variation in heart regeneration. Nature Genetics. 49 (9), 1346-1353 (2017).
  19. Gonzalez-Rosa, J. M., et al. Myocardial Polyploidization Creates a Barrier to Heart Regeneration in Zebrafish. Developmental Cell. 44 (4), 433-446 (2018).
  20. Webster, M., Witkin, K. L., Cohen-Fix, O. Sizing up the nucleus: nuclear shape, size and nuclear-envelope assembly. Journal of Cell Science. 122 (Pt 10), 1477-1486 (2009).
  21. Knouse, K. A., Lopez, K. E., Bachofner, M., Amon, A. Chromosome Segregation Fidelity in Epithelia Requires Tissue Architecture. Cell. 175 (1), 200-211 (2018).
  22. Box, A. M., et al. Endocycles support tissue growth and regeneration of the adult Drosophila accessory gland. bioRxiv. , 719013 (2019).
  23. Karim, M. R., Moore, A. W. Morphological analysis of Drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics. Journal of Visualized Experiments. (57), e3111 (2011).
  24. Dai, W., Montell, D. J. Live Imaging of Border Cell Migration in Drosophila. Methods in Molecular Biology. 1407, 153-168 (2016).

Tags

Udviklingsmæssige Biologi sårheling væv reparation endoreplering polyploidy Myc Drosophila
En <em>Drosophila</em> Model til undersøgelse Sår-induceret Polyploidization
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bailey, E. C., Dehn, A. S.,… More

Bailey, E. C., Dehn, A. S., Gjelsvik, K. J., Besen-McNally, R., Losick, V. P. A Drosophila Model to Study Wound-induced Polyploidization. J. Vis. Exp. (160), e61252, doi:10.3791/61252 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter