Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

En Drosophila modell för att studera sårinducerad polyploidisering

Published: June 9, 2020 doi: 10.3791/61252
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 1
1Biology Department, Boston College, 2Graduate School of Biomedical Sciences and Engineering and Kathryn W. Davis Center for Regenerative Biology and Medicine, MDI Biological Laboratory, University of Maine
* These authors contributed equally

Summary

Sårinducerad polyploidisering är en bevarad vävnadsreparationsstrategi där cellerna växer i storlek istället för att dela sig för att kompensera för cellförlust. Här är ett detaljerat protokoll om hur man använder fruktflugan som modell för att mäta ploidy och dess genetiska reglering i epitelial sår reparation.

Abstract

Polyploidy är ett vanligt fenomen vars inverkan på organismen hälsa och sjukdom är fortfarande dåligt förstådd. En cell definieras som polyploid om den innehåller mer än den diploida kopian av dess kromosomer, vilket är ett resultat av endoreplication eller cellfusion. I vävnad reparation, sår-inducerad polyploidization (WIP) har visat sig vara en bevarad helande strategi från bananflugor till ryggradsdjur. PIA har flera fördelar jämfört med cellproliferation, inklusive resistens mot onkogen tillväxt och genotoxisk stress. Utmaningen har varit att identifiera varför polyploida celler uppstår och hur dessa unika celler fungerar. Förutsatt är ett detaljerat protokoll för att studera WIP i den vuxna fruktflugan epitel där polyploid celler genereras inom 2 dagar efter en punktering sår. Med fördel av D. melanogasters omfattande genetiska verktygssats har de gener som krävs för att initiera och reglera PIA, inklusive Myc, börjat identifieras. Fortsatta studier med denna metod kan avslöja hur andra genetiska och fysiologiska variabler inklusive kön, kost, och ålder reglera och påverka WIP funktion.

Introduction

Drosophila melanogaster är ett attraktivt modellsystem för att studera de cellulära och molekylära mekanismerna för epitel sår reparation. Liksom hos däggdjur beror de vävnadsreparationer mekanismer som används på både vävnaden och dess utvecklingsstadium. Scarless sårläkning sker i fruktflugembryot där en actomyosin "handväska sträng" former vid epitelial framkant gör det möjligt för såret att sömlöststänga 1,2. Post-embryonal sårläkning i larver, puppor, och vuxna bananflugor resulterar i extracellulär matris remodeling, melanin ärr bildning, och epitelial cell tillväxt3,4,5,6. Epitelcellerna ökar i storlek genom cellfusion och endocykeln, en ofullständig cellcykel som kringgår mitos3,4,7,8. Som resultat kompenseras cellförlusten genom polyploid celltillväxt istället för celldelning. Den vuxna flug hindgut, midgut, och follikulära epitel också förlita sig på polyploida celltillväxt för att kompensera för cellförlustefter vävnadsskada 9,10,11.

Polyploidy är en välkänd aspekt av organismutveckling i växter och insekter, men under de senaste åren har det blivit mer uppenbart att polyploidy är en bevarad vävnad reparation strategi i ryggradsdjur12. Den zebrafisk, som har kapacitet att regenerera sitt hjärta, förlitar sig på polyploid celltillväxt för att läka skadade epicardium13. Polyploidy bidrar också till däggdjur leverregenerering och njurubuli epitel reparation efter akut skada14,15. I dessa exempel genereras polyploida celler genom endoreplication via antingen endocycle eller endomitosis, vilket resulterar i en binucleerad cell på grund av ett block i cytokines12. Gåtan är anledningen till att polyploida celler uppstår vid sårreparation och hur polyploidy påverkar vävnadsfunktionen. Nyligen genomförda studier har gett ny insikt i frågan om polyploidy erbjuder en helande fördel eller nackdel. I zebrafisk epicardium, polyploidy ökat hastigheten på sårläkning13. I D. melanogaster hindgut och däggdjur lever, polyploidy befanns vara skyddande mot onkogen tillväxt11,14. I vuxen fluge epitel, det konstaterades nyligen att polyploidy möjliggör sår reparation i närvaro av genotoxiska stress16. Endoreplication är resistent mot DNA-skador, vilket gör att sårläkning när cellproliferation annars skulle äventyras17. För kardiomyocyter i mus och zebrafisk hjärtan, dock polyploidy saktar läkning, vilket resulterar i förbättrad ärrbildning18,19. Därför, beroende på organ och / eller celltyp, kan polyploidy vara en fördelaktig eller skadlig vävnad reparation strategi. Tillgängligheten av D. melanogaster genetik i kombination med analys av sår-inducerad polyploidization (WIP) svar gör det till en idealisk modell system för att belysa de molekylära och cellulära mekanismer som styr denna sårläkning strategi.

Här presenterar vi ett protokoll för att analysera WIP i den vuxna D. melanogaster epitel. Inkluderat är instruktioner för fruktfluga skada, dissektion, immunfärgning, montering, avbildning, och analys av re-epithelialization, cell fusion, och endoreplication (ploidy). Bild- och ploidanalysen kan även anpassas till andra modeller för att testa om PIA förekommer. Det bör noteras att med en ökning av kärn-DNA-innehåll finns det ofta en motsvarande ökning av kärnstorlek. Det finns dock många exempel inom biologi där kärnstorleken inte återspeglar en motsvarande förändring i ploidy20. Ännu mer försiktighet bör iakttas vid tolkning av kärnstorlek i samband med en sårmiljö där celler ofta kommer att spridas eller sträcka sig för att täcka sårplatsen. Därför är det enda definitiva beviset på förändring i ploidy att mäta DNA-innehåll med denna metod (eller andra, såsom hela genomsekvensering)21. Denna metod ökar lämpligheten hos den vuxna D. melanogaster buken epitel som en modell för att studera roll och reglering av polyploidy i sår reparation.

Protocol

1. Mellanlagring och sårning av vuxna fruktflugor

  1. Välj D. melanogaster stam val (dvs. epi-Gal4/ UAS stam, se Tabell över material).
    OBS: Här används Gal4/UAS-systemet för att möjliggöra epitelspecifikt genuttryck (epi-Gal4) av en gen eller RNAi som kodas nedströms av UAS. Denna studie använder fluorescerande membranprotein (UAS-Cd8.mRFP), mitotiska inducerare (UAS-fzrRNAi, UAS-stg), och WIP-hämmare (UAS-E2F1RNAi; UAS-RacDN).
  2. Samla två injektionsflaska med 10–15 nyinslutna kvinnliga fruktflugor och ålder på färska matalar vid 25 °C till 3-5 dagar gamla. En injektionsflaska kommer att fungera som den oskadade kontrollen och den andra injektionsflaskan kommer att såras enligt nedan. De kvinnliga flugorna ska underhållas med hanar (~5/injektionsflaska).
  3. För att linda flugorna, montera flera stifthållare vardera med en enda 0,10 mm rostfritt stål stift. Se till att den skarpa änden av tappen är vänd ut. Stift kan lätt böja eller chip efter punktering av flugan och hooked eller skadade stift bör kasseras.
  4. Söva åldern kvinnliga bananflugor på en CO2-flypad under ett stereomikroskop och anpassa dem till en rad med hjälp av en pensel. Bära skyddsglasögon, hålla stifthållaren i ena handen och pinps i den andra, använd pinps för att placera en fluga med sin ventrala buken uppåt.
  5. Punktera de vuxna honflugorna inom epitelial pleuritregionen i tergite A4 på vardera sidan av den ventrala mittlinjen sterniter (Figur 1A). Punktering denna ventrala regionen ger optimalt utrymme bort från dissekering platser där vävnad kanter kommer att slitas av mekanisk bearbetning.
  6. Retur sårade flugor till matflaskan och ålder till önskad dag efter skada (dpi). Epitelial sårläkning börjar vid 1 dpi och slutar med 3 dpi. Endoreplication toppar vid 2 dpi, som är idealisk för EdU-analysen (avsnitt 4, figur 2).

2. Fly buken dissektion

OBS: Under detta steg är det viktigt att undvika att vidröra den ventrala bukvävnaden med dissektionsverktygen eftersom det kommer att äventyra epitelens integritet.

  1. Erhåll alla erforderliga material för dissektion: Graces lösning, pincett, Vannas Spring Scissors, 0,10 mm stift, dissekerande plattor, 9 brunns-glass dissektionsfat, fixativ lösning (4% paraformaldehyd i 1x PBS), 1x PBS, våtservetter, pipetter och tips för 30 μm, och handskar (se Tabell över material).
  2. Bekräfta att flugor var framgångsrikt skadats av sövande sårade flugor på en CO2-fly pad under en stereomikroskop och kontroll av förekomsten av såret ärr (dvs, en melanin plats på buken, se figur 1B). Kasta alla flugor från den experimentella gruppen som inte var framgångsrikt sårade.
  3. För att starta dissekering, fyll en brunn av en 9 brunnsglas dissektionsrätt med Grace lösning. Använd ett par tänjningar för att gripa en sårad honfluga vid bröstkorgens ryggsida och dränka flugan i brunnen som innehåller Graces lösning.
  4. Använda tlyck i motsatt hand utan att släppa bröstkorgen, punktera rygg nagelband nedan tergite A6 och dra nagelbanden bort den bakre änden av fruktflugan. De inre organen (äggstock och tarm) kommer vanligtvis att komma ut vid detta steg. Om inte, tryck försiktigt på ryggsidan av buken med tänjarna för att pressa ut de återstående organen och kasta i en tom brunn.
  5. Snap off hela buken vid bröstkorgen korsningen ovanför tergite A2 med hjälp av tutstötarna och överföra buken till en tom brunn som innehåller ~ 100 μL av Grace lösning.
  6. Upprepa steg 2.3-2.5 tills alla flyga bukar dissekeras.
  7. Minska volymen av Graces lösning till 30 μL i brunnen som innehåller poolade, dissekerade bukar.
  8. Filé buken öppna genom att placera buken på ryggsidan med tärnorna i ena handen och sedan sätta in bottenbladet av Vannas vårsaxar i bukhålan med den andra handen. Skär längs rygg mittlinjen tills buken är helt öppnad, vilket kan kräva upp till tre skärningar (Bild 1C, 1D).
  9. Ställ upp en torr dissekeringsplatta med fyra 0,10 mm stift per buken monteringsområde. Varje 35 mm dissekeringsplatta kan passa upp till sju monteringsområden. Pipett 30 μL av Graces lösning på varje monteringsområde och överför en filead buk till varje droppe.
  10. Nåla fast de fileade bukarna på skålen på de fyra rygghörn (Bild 1E). Se till att vävnaden ligger platt utan att riva eller översträcka bukvävnaden.
  11. För att fixera vävnaden, pipettera av Graces lösning och tillsätt 30 μL av fixlösningen till den fästa buken.
    VAR FÖRSIKTIG: Använd handskar medan du hanterar fixlösningen, eftersom paraformaldehyd är giftig.
  12. Upprepa steg 2.10-2.11 tills alla fileade bukar är fästa på dissekeringsplattan.
  13. Placera en bandetikett på undersidan av varje maträtt för att markera varje kontroll och experimentell grupp. Fix prover för 30-60 min vid rumstemperatur (RT).
  14. Tvätta bort fixlösning genom pipettering på 1,5 mL av 1x PBS till varje platta. Kassera fixlösning och plast i lämpliga behållare för flytande eller torrt kemiskt avfall enligt institutionella riktlinjer.
  15. Tvätta plattor 2x med 1,5 mL av 1x PBS och förvara fast vävnad täckt i 1,5 mL av 1x PBS i en plastbehållare med lock. Tillsätt ett lager av fuktig pappershandduk i botten av behållaren och förvara prover vid 4 °C tills det är klart att immunstainera inom 1 vecka efter dissektion.

3. Immunofluorescens

  1. Nybereda reagenser (seTabell över material ): diskbuffertlösning (0,3% Triton X 100, 0,3% BSA i 1x PBS). Överbliven tvättbuffert kan sparas vid 4 °C och användas under hela 2 dagars infärgningsprotokollet. Bered tillräckligt med primär antikroppslösning per analys (figur 2) med hjälp av Anti-FasIII (1:50 mus anti-Fasciclin-III) i tvättbuffert med antingen anti-Grh (1:300 affinitet renad kanin anti-Grainyhead8) eller anti-RFP (1:1,000 kanin anti-RFP). Primära antikroppslösningar kan sparas vid 4 °C och återanvändas flera gånger tills signalen reduceras avsevärt.
  2. Permeabilisera vävnad genom pipettering av 1x PBS, lägga till 1,5 mL tvättbuffert, och inkubering i minst 30 min på en orbital shaker (80 rpm) vid RT.
  3. Avlägsna tvättbuffert och fläckvävnad över natten med 1,5 mL primär antikroppslösning, inkubera på en orbitalskak (80 rpm) vid 4 °C. Samla den primära antikroppslösningen och spara i ett rör vid 4 °C för framtida experiment.
  4. Skölj först provet snabbt med 1x PBS och tvätta sedan 3x med 1,5 mL tvättbuffert. För varje tvätt inkubera prover vid RT på en orbitalskak i minst 30 min.
  5. Under den slutliga tvätten, preparera den sekundära antikroppslösningen: 1:1 000 åsna anti-kanin Alexa 488 eller 568 och 1:1,000 get anti-mus Alexa 488 eller 568 (eller fluoroforer val) i tvättbuffert.
  6. Avlägsna tvättbuffert och fläcka vävnader med 1,5 mL sekundär antikroppslösning. Täck prover med aluminiumfolie och inkubera på en orbitalskak på RT i 3 h. Alternativt kan prover inkuberas över natten vid 4 °C på en orbitalskak.
  7. Tvätta prover genom att först kassera sekundär antikroppslösning och skölj sedan prov snabbt med 1x PBS följt av tre tvättar med 1,5 mL tvättbuffert. För varje tvätt inkubera prover vid RT på en orbitalskak i minst 30 min.
  8. Bered DAPI-lösning genom att späda ut DAPI till 10 μg/mL i tvättbuffert. Efter den slutliga tvätten, betsprover med 1,5 mL DAPI-lösning som inkuberas vid RT i 30 min.
  9. Kassera DAPI-lösning och sköljprover 2x i 1,5 mL av 1x PBS. Förvara fläckad vävnad i 1,5 mL av 1x PBS i mörker, täckt med aluminiumfolie, vid 4 °C tills den är klar att montera på en glasrutschbana med täckskydd. Monteringssteget ska utföras inom 1 vecka.

4. Aktiviteten i cellcykeln (EdU-analys)

  1. Gör upp en 10 mM EdU stamlösning från Click-iT kit (se Table of Materials) genom att lösa upp EdU pulver i dH20 och blanda i ~ 15 min tills den är helt upplöst. Stamlösningen kan alikvotas (250 μL per rör) och lagras vid -80 °C.
  2. Feed flyger EdU genom att först späda EdU lager till 5 mM i dH2O. Tillsätt torrjäst tills lösningen är grumlig och kort virvel att blanda. Skär av en 0,5 mL rörlock och placera den längst ner på flugmatflaskan. Tryck in locket i maten, så det är stabilt.
  3. Bedöva flugorna och överför 3-5 dagars gamla flugor in i injektionsflaskan. Knacka på flugor till ena kanten så att ingen har fastnat i locket.
  4. Pipett 75 μL av jäst-EdU lösning i locket. Flugor bör matas färsk jäst-EdU lösning varje dag och överföras till en färsk mat injektionsflaska med ett lock varannan dag för att säkerställa att flugorna inte fastnar i botten av injektionsflaskan.
  5. För att överföra flugor, vänd till en ny injektionsflaska med en keps, sätt flugor i viloläge, peka flugor åt ena sidan och tillsätt färsk jäst-EdU-lösning.
  6. På den tredje dagen, skada flugorna och fortsätta att mata jäst-EdU tills dissekering vid 2 dpi (Figur 4A). Se protokollavsnitt 2 för dissektion och fixeringsmetoder.
  7. Förbered EdU-infärgningsreagenser: tvättbuffert (0,3 % Triton X 100, 0,3 % BSA i 1x PBS), permeabiliseringsbuffert (0,5 % Triton X 100 i 1x PBS), blockerande buffert (3% BSA i 1x PBS), och förbereda reagenser från EdU-analyssatsen (se Table of Materials), inklusive 1x reaktionsbuffert och 1x reaktionsbufferttillsats enligt tillverkarens anvisningar.
  8. Tvätta prover för 1 h, blandning vid RT i 1,5 mL tvättbuffert.
  9. Tillsätt 1,5 mL permeabiliseringsbuffert och inkubera prover i 20 min.
    OBS: Tina och förbered reaktionscocktaillösning med hjälp av en volym på 500 μL/platta.
  10. Tvätta prover 1x snabbt med 1x PBS och sedan 3x snabbt med 1 mL blockerande buffert.
  11. Pipettera av all kvarvarande blockerande buffert och tillsätt 500 μL reaktionscocktaillösning per platta. Virvelplattor för att säkerställa att vävnaderna är helt täckta. Inkubera i en låda i mörker i 1 h vid RT.
  12. Tvätta prover 1x snabbt med 1,5 mL blockerande buffert.
  13. Fläck med 1,5 mL DAPI-lösning vid 1:5,000 i tvättbuffert i 30 min.
  14. Tvätta 2x med 1x PBS snabbt, linda in i folie, och förvara i mörker vid 4 °C tills redo att montera prover inom 3 dagar.

5. Montera fläckad vävnad

  1. Skaffa alla nödvändiga material för montering: glas diabilder, glas täcken, klar nagellack, montering media, ett par tämpningar, och våtservetter.
  2. För att montera färgade flyga vävnad, unpin buken från dissekering plattan med hjälp av tlyckor under stereomikroskop. Överför vävnad till ~30 μL av monteringsmedia på ett glasskyddsslip genom att försiktigt ta tag i vävnaden med tång vid dess ryggflanker, var försiktig för att undvika att vidröra det ventrala området med tång.
  3. Under stereomikroskopet orientera bukvävnaden så att insidan är vänd nedåt mot täckplattan (dvs. den yttre nagelbanden/borsten är vänd uppåt). Dra de orienterade bukarna till kanten av mediadroppar med hjälp av tärnorna. Ytspänning kommer att hjälpa till att hålla vävnaden platt( Bild 1F).
    OBS: Det är till hjälp för bildbehandling att organisera buken i en kolumn eller rad i detta skede.
  4. Märk en glasglasbild (dvs. kontroll eller experimentell) och plocka upp täcket genom att sakta föra bilden närmare täcket. Vänd glida över och försiktigt blot med en torka för att ta bort överflödig montering media.
  5. Täta täckslipens kanter med klart nagellack och upprepa för alla återstående experimentella grupper. Förvara bilder i en ruta i 4 °C tills de är färdiga att avbildas.

6. Bildbehandling och bearbetning

  1. Avbilda flugbuksårområdet genom att först lokalisera melaninärret med ett konfokalmikroskop (Figur 1B), antingen en punktskanner eller en strukturerad belysning (ApoTome) med en 40x olja eller torr objective.
  2. Kontrollera exponeringen på varje kanal, se till att signalen är under mättnad. Bildframställningsinställningarna ska baseras på den ljusaste provgruppen. Detta är särskilt viktigt för ploidy analys som DAPI kanalen måste stanna i det linjära intervallet för att noggrant mäta DNA-innehåll.
  3. Ta en full z-stack bild i alla tre kanaler med ett optimalt avstånd på minst 0,50 μm mellan skivor. Spara tagna bilder och öppna filen i bildanalysprogrammet Fiji (även kallat ImageJ).
  4. För varje bild skapar du en z-stack-projektion med hjälp av alternativet summa av segment för alla kanaler.
  5. Rotera bilderna efter behov för att säkerställa att kärnorna är uppradade horisontellt över bilder (Bild 3A och bild 4E).
  6. Beskär alla bilder till ett rektangulärt urval av 300 μm x 300 μm centrerad kring sårplatsen eller mitten av oskadad kontroll. Identifiera området genom att rita en rektangel och välja Redigera | Urval | Ange. Kontrollera att skalade enheter är i mikrometer för att säkerställa att samma storlek rutan används för alla bilder som ska analyseras.

7. Endoreplication (ploidy) analys

  1. Med Fiji markerar du grh-kanalfönstret och duplicerar bilden. Använd sedan tröskelverktyget för att skapa en mask. Justera tröskelvärdet manuellt genom att skjuta den övre listen för att minimera bakgrund utan att orsaka att kärnorna krymper drastiskt (Bild 4D).
  2. Om några kärnor i Grh-kanalen berör i tröskelbilden använder du verktyget för målarpensel (2 bildpunktsbredd) i samma färg som bakgrunden, för att rita en linje mellan kärnorna. Klicka för att tillämpa 1x när den är klar för att generera den slutliga masken.
  3. Generera en region av intresse (ROI) karta genom att använda funktionen Analysera partiklar: inställd storlek till 5 μm-60 μm för att fånga upp de flesta av atomkärnor utan att inkludera bakgrunden.
  4. Justera ROI-kartan manuellt efter behov i ROI-chefen. Ta bort alla val som inte är kärnor och lägg till några kärnor i listan som inte identifierades genom att beskriva kärnan med markeringsverktyget för frihand och lägga till det i ROI-chefen (Bild 4D).
  5. Välj DAPI-kanalen klicka sedan på Visa alla i ROI-hanteraren för att tillämpa den genererade ROI-kartan i Grh-kanalen på DAPI-kanalen.
  6. Stryk alla val där epitelialkärnor konturen överlappar med nonepithelial atomkärnor (t.ex. kärnor från muskler eller fett) från ROI kartan. Kornigahuvud bara fläckar epitelial kärnor, medan DAPI fläckar alla kärnor. Kontrollera att varje skisserat urval endast innehåller en kärna och ta bort eller redigera eventuella val med mer än en kärna. Spara redigerad ROI-lista.
  7. Mät området och den integrerade tätheten av varje epitelkärnor i ROI-kartan med hjälp av analysverktygen i Fiji. Exportera värdena till ett kalkylprogram.
  8. Mät den genomsnittliga bildbakgrunden med hjälp av verktyget för cirkelmarkering. Rita tre cirklar som inte överlappar med några kärnor i olika områden i DAPI-bilden. Lägg till området och integrerad täthet för var och en av cirklarna till ett kalkylprogram för att upprätta bakgrundsbildens ljusstyrka.
  9. Börja med att beräkna den genomsnittliga bakgrunden per enhet område för varje bild genom att dividera varje bakgrund integrerad densitet värde med dess motsvarande område. Sedan medelvärde de tre integrerade densitet per område mätningar för bilden för att få den genomsnittliga bakgrunden per enhet område.
  10. Därefter beräkna den totala bakgrunden för varje DAPI-kärna genom att multiplicera arean av kärnan med den genomsnittliga bakgrunden per enhet område. Den normaliserade DAPI-intensiteten för varje nucleus som mäts kan sedan beräknas genom att subtrahera den totala bakgrunden för varje kärna från dess uppmätta integrerade densitet.
  11. Medelvärde för alla normaliserade DAPI-intensitetsvärden från den oskadade epitelstyrningen. De oskadade epitelkärnorna beräknades tidigare för att ha ett ploidyvärde på 2C och kan fungera som referens för att beräkna ploidy i epitelkärnorna från de experimentella förhållandena8.
  12. Beräkna ploidy av varje kärna genom att dividera normaliserade DAPI intensiteten i varje kärna med det normaliserade värdet från referens oskadade epitelstyrning (2C), sedan multiplicera värdet med 2 till lika den normaliserade ploidy (C-värde):
    (Kärnintegrerad täthet - Bakgrund Kärnintegrerad täthet)/Genomsnittlig kärnintegrerad täthet (oskadad epitelkärnor = 2C) x 2 = epitelial kärn- ploidy (C)
  13. Grafkärnor med ploidyvärden som punktrit, histogram eller grupperat i en stapelgraf i enlighet med detta (dvs., 2C [0.6-2.9C], 4C [3.0-5.9C], 8C [6.0-12.9C], 16C [13.0-24.9C], och >32C [>25.0C] (Bild 3F).

Representative Results

Ett detaljerat protokoll tillhandahålls för att använda D. melanogaster som modell för att studera sårinducerad polyploidisering (PIA). Denna sårläkningsmodell ger många fördelar jämfört med däggdjur och andra flugmodeller av PIA. Polyploidy var lätt framkallas genom en mekanisk punktering med en insekt stift och polyploida celler genererades inom en kort tidsperiod (2-3 dpi) (Figur 1A, 1B)4. Den stora utmaningen är dissektionen av intakt bukvävnad utan några perturbations till epitelet. D. melanogasterepitelet stöts lätt av misstag eller repas med de vassa dissektionsverktygen. Därför bör stegen i detta protokoll övas före användning och analys.

Först var skadan begränsad till ventrala kvinnliga buken, som ger en stor, platt ogenomskinlig vävnad område idealisk för bildbehandling. Sticksåren tillfogades i pleuritepitelet, som ligger på vardera sidan av den ventrala mittlinjen sterniter och riktade mellan tergite (T) segment T4-T5 (Figur 1A-C). Denna sårplacering ger ett stort synligt område som inte störs av dissektionen. Utmanande steg inkluderar buken våren sax klippa och nålning steg (Figur 1D, 1E). Fjäderskärsteget fungerade bäst när bukarna skars i en reducerad volym av Graces lösning (~30 μL) för att minska vävnadsrörelsen. En välcentrerad skärning längs ryggsminne mittlinjen var nödvändigt för att ge tillräckligt med område på buken ryggklaffar att stift öppna på dissekeringsplattan (Figur 1C). Buken måste försiktigt fästas på de fyra hörnen utan överdriven kraft (Bild 1E). En pin push som är för hårt kommer att snedvrida buken vävnaden och kan även driva vävnaden i dissekering plattan. Om detta händer måste vävnaden kasseras. När bukvävnaden var fast, det kvar på dissekering plattan tills immunofluorescens färgning var fullständig och buken var monterade på ett glas coverslip för bildframställning (Figur 1F).

Sårläkning kräver en kontinuerlig epitelisk ark för att bilda, som är beroende av endoreplication och cell fusion4,16. Septate junction proteinet FasIII, som etiketter cell-cell korsningar, gav en indikator för om någon bearbetning perturbations inträffade under beredningen (Figur 1G, 1H). Buk med stora repor (ej påse område) som perturb sårområdet måste kasseras och användes inte för vidare analys (Bild 1H).

Nästa steg var att analysera intakta prover för eventuella defekter i PIA. Detta protokoll innehåller distinkta analyser för att upptäcka olika aspekter av PIA-svaret (bild 2). Sårreparationen var fullständig när en central, stor, flerkärnig cell täckte sårskorpan (Bild 3A). Här cell fusion upptäcktes genom färgning för FasIII / Grh och kvantifiera antalet Grh+ epitelial kärnor som omfattas av FasIII skisserade området4. Defekter i sår stängning eller re-epithelialization upptäcktes när luckor i >10 μm i epitelplåten observerades (Figur 3B, röd pil). Detta var fallet, till exempel när WIP hämmades genom aktivering av mitotiska cykel via uttryck av stg, fzrRNAi, som nyligenrapporterade 16. I detta genetiska tillstånd kunde 52% av såren inte bilda ett kontinuerligt epitelblad över sårskorven (Figur 3B, 3C).

En annan metod för att mäta sårreparation i denna modell var genom att visualisera epitelmembranet med epi-Gal4-uttryck av UAS-mCD8-ChRFP4 (Figur 2, Figur 3D). I kontrollen, 91% av epitel sår stängt helt av 3 dpi, men hämmar WIP genom att blockera endoreplication (E2f1RNAi) och cell fusion (RacDN) samtidigt, som tidigare rapporterats, orsakade 92% av epitelial sår att förbli helt öppen (Figur 3D, 3E)8,16. Aktiveringen av mitotiska cellen cykel genom uttryck av stg, fzrRNAi resulterade också i en epitelial sår stängning defekt. Genom att visualisera epitelial cellmembranet kunde dock omfattningen av åter epithelialization defekt fastställas. Den WIP mutant (E2f1RNAi, RacDN) flyga sår var mer öppna än stg, fzrRNAi sår (Figur 3D, streckad röd kontur)16. Detta membran sårläkning assay lämnat mer information om omfattningen av såret reparation defekt. Som ett resultat av detta kunde återepitelfel grupperas som antingen helt öppna, delvis slutna (dvs., >10 μm mellanrum), eller helt slutna (Figur 3D, 3E).

Förutom cellfusion växer epitelceller i storlek genom endoreplication, en ofullständig cellcykel som fördubblar kärn-DNA-innehållet. Endoreplicationen var assayed av både cellcykelaktivitet och direkta kärn-DNA ploidymätningar (Figur 2 och figur 4). Här upptäcktes cellcykelaktivitet genom inkorporering av den tymidinanalogin, EdU (Figur 4A, 4B). D. melanogaster epitelceller konstaterades komma in i endocykeln, en ofullständig cellcykel som pendlar mellan S- och G-faserna utan en mellanliggande M fas4,12. Den vuxna D. melanogaster diet kompletterades med EdU+ mat före skada och flugorna bibehölls på en EdU+ diet tills dissekering vid 2 dpi (Figur 4A). EdU upptäcktes sedan med hjälp av tillverkarens Click-iT-protokoll. Denna EdU-analys användes för att avgöra var, när, och hur många atomkärnor utlöstes för att gå in S fas som svar på ett sår. Med hjälp av Gal4 / UAS-systemet, konstaterades nyligen att epitelial specifikt uttryck för myc kan antingen blockera (mycRNAi) eller förvärra (Myc överuttryck) kompetens epitelceller att gå in S fas. Som resultat har det visat sig att Myc är tillräckligt för att framkalla endoreplication i postmitotiska celler, även utan skada16,22.

Därefter fastställdes epitelial ploidy genom att direkt mäta kärn-DNA-innehåll. Epitelial kärnor identifierades genom immunofluorescens färgning för epitel specifika markör, Grh (Figur 4D). I Fiji imaging programvara, epitelial kärnor identifierades systemiskt och sedan tröskelbest med Grh nukleära fläcken. Kärnor var sedan separerade och ROIs överlagras på summan av stackar DAPI bild (Figur 4D, grön pil). Eventuella överlappande kärnor raderades manuellt innan den valda kärnornas integrerade densitet mättes (Figur 4D, röda pilar). Denna halvautomaterade metod gör det möjligt för en att kvantifiera fördelningen och ploidy av de flesta kärnor i hela oskadade och reparerade flyga buken epitel8. Som nyligen rapporterats, epitelial kärnor som omger såret var sammansatt av 44% polyploida kärnor med DNA-innehåll mer än 3C vid 3 dpi (Figur 4E, 4F)16. Som förväntat från EdU-resultaten ledde knockdown av MYC till ett betydande block i endoreplication, eftersom endast 9% av epitelkärnor var polyploida, medan överuttryck av Myc resulterade i 100% polyploida epitelkärnor runt sårplatsen (Figur 4F)16. Epitelial kärnämne storlek var också synligt påverkas av myc uttryck med antingen reducerade eller utvidgade atomkärnor närvarande. Kärnområdet är dock inte ett korrekt mått på ploidy och fysiologiska effekter, eftersom faktorer som cell stretching kan också påverka kärnstorlek utan att påverka kärn-DNA-innehåll20.

Figure 1
Figur 1: Adulta sårskador i fruktfluga buken, dissekering och vävnadsmontering. (A) Diagram över den vuxna buken såranalys. Flugor ska skadas på vardera sidan av buken vid tergite 4 (T4). (B) Vuxen honfruktfluga 3 dpi med melanin scab bildad av sårläkning (vit låda). Skala bar = 50 μm. (C) Dissekerad vuxen buk, ryggvy, med tergites märkt. Buken var filead ner mittlinjen av ryggsidan (vit streckad linje). Skala bar = 50 μm. (D) Dissekeras och filead vuxen buk före fastklämning. Skala bar = 50 μm. (E) Nålas vuxen buk på en dissekering platta. En tapp placerades i var och en av de fyra hörnen av buken på ryggsidan. Vävnaden öppnades försiktigt men sträcktes inte, för att undvika att riva. (F) Vuxna bukar monterades och placerades på ett glasöverdrag med insidan av buken vänd nedåt mot täcket och nagelband orienterade mot glasglaset. (G) FasIII färgning av intakt sår område med ingen bearbetning perturbation och en central syncytium (streckad gul linje). Skalstång = 50 μm. (H) Bild av ett repigt sårområde (*) med en obefläckad FasIII-region som stör syncytiumet. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 2
Bild 2: Pågående arbete analys arbetsflöde. Flödesschemat skildrar de tre analyser som beskrivs i denna studie och överlappande och distinkta steg för att upptäcka och mäta PIA-svaret. EdU-analysen mäter cellcykelaktivitet (blåa lådor), ploidy och re-epithelialization detekteras av Grh/FasIII immunfärgning (gröna lådor), och uttryck av membran RFP möjliggör mätning av omfattningen av epitelial sår stängning (rosa lådor). Vanliga steg är i grå lådor och D. melanogaster stam genotyper är listade ovan. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 3
Bild 3: Metoder för att upptäcka återepitelisering under PIA. Re-epithelialization var störd när WIP var genetiskt hämmas. Immunfluorescerande bilder av kontroll (A) och stg, fzrRNAi (B) vid 3 dpi. Epitelial kärnor och septate korsningar var färgas med Grh (grön) och FasIII (magenta), respektive. (A' och B") FasIII färgning enbart visade att re-epithelialization var nedsatt (röd pil) i stg, fzrRNAi epitel. Skala bar = 50 μm. (C) Kvantifiering av återepitelialiseringsdefekter (%) vid 3 dpi (grå): kontroll (n = 8), stg, fzrRNAi (n = 6). Felstaplar indikerar standardfel; statistisk signifikans mättes via Students T-test, **P < 0,01. Re-epithelialization under sår reparation kunde också detekteras genom uttryck av ett membran länkade RFP med hjälp av epi-Gal4, UAS-mCD8-RFP. (D) Immunofluorescerande bilder av kontroll, E2F1RNAi, RacDN, och stg, fzrRNAi på 3 dpi. Skalstång = 20 μm. Sårskorv (gul kontur) och öppet epitelial sårområde (röd kontur). (E) Kvantifiering av sårstängning i ctrl (n = 11), E2F1RNAi, RacDN (n = 13), och stg, fzrRNAi (n = 13). Anpassad från Grendler et al.16. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 4
Bild 4: Metoder för att upptäcka endoreplication under PÅGÅENDE ARBETE. (A) Tidslinje för EdU-analys: vuxna Drosophila matades 75 μL av 5 mM jäst-EdU varje dag 2 dagar före skada och fortsatte till 2 dpi. (B) Immunfluorescerande bilder av EdU-etikett i flugstammar uttryckta med epi- Gal4/ UAS-system vid 2 dpi. Sårskorpa (W). Skala bar = 50 μm. (C) Genomsnittligt antal EdU + epitelial kärnor per fluga vid 2 dpi: ctrl (n = 37), mycRNAi# 1 (n = 10), och Myc (n = 8). Felstaplar indikerar standardfel; statistisk signifikans mättes via Students T-test, *P < 0,05, **P < 0,01. (D) Schematisk för detektion och mätning av epitel kärnknepidy. Epitelial kärnor identifierades och tröskelats av den anti-Grh fläcken i Fiji. Överlappande epitelial kärnor separerades (gröna pilspetsar) eller tas bort (röda pilspetsar) om överlagrad av nonepithelial kärnor. Den integrerade densitet och kärnområdet motsvarande DAPI färgas kärnor bilden mättes. (E) Epitelial kärn- storleksanpassar (Grh) ändrades av myc uttryck på 3 dpi. (F) Epitelial kärn- ploidy (%) vid 3 dpi: ctrl (n = 4), mycRNAi#1 (n = 6), och Myc (n = 3). Anpassad från Grendler et al.16. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Discussion

Presenteras är ett detaljerat protokoll om hur man dissekerar och använder den vuxna D. melanogaster bukepitel för att studera hur gener reglerar WIP genom att ändra re-epithelialization och endoreplication under sårreparation16. Med den här metoden identifierades nyligen proto-onkogene Myc som en nyckelregulator för PIA. Myc krävs för epitelceller till endoreplicate post skada och är tillräcklig för quiescent epitelceller att endocycle både i vuxen fluge epitel och tillbehörkörtlar 16,22. Det konstaterades också att byta epitelceller till en mitotiska cellcykel genom uttryck av stg, fzrRNAi är skadligt för sår reparation. Fortsatta studier med denna metod kommer att identifiera andra gener som krävs för att reglera re-epithelialization och endoreplication under PIA, avslöjar både likheter och skillnader till hur polyploidy regleras och fungerar i en mängd olika vävnader.

Denna modell och metod erbjuder unika fördelar, inklusive den enkla induktionen av polyploidy med en mekanisk punktering och det faktum att polyploida celler genereras inom dagar4. Vävnadsdisektionen och beredningsprotokollen baseras på larv dissektionsteknik23, men vuxenflugan buken är styvare och därför lätt störd. Som ett resultat kräver detta protokoll praxis och precision för att isolera en intakt vävnad för att studera PIA. När dissekeras, men epitelet är tydligt synlig och lätt avbildad, vilket ger en ögonblicksbild av sårläkningsprocessen. Denna metod ger en mängd information om den vuxna flugans epitelorganisation, cell- och synkytiumstorlek, och cellernas och enskilda kärnors ploidy. Medan live imaging ännu inte är möjligt inom intakt fruktfluga på grund av dess ogenomskinliga nagelband, detta protokoll skulle kunna anpassas till att omfatta för närvarande tillgängliga ex vivo kultur villkor som används i D. melanogaster att utföra kortsiktiga live imaging studier24.

I framtiden kommer denna modell att vara idealisk för att studera cell-till-cell överhörning och bidraget från andra celltyper till PIA genom att reglera genuttryck med Gal4/UAS-systemet i andra celltyper av intresse. Liknande frågor kan också besvaras med hjälp av en mängd olika genetiska och mutanta bakgrunder. Den dissekerade vuxna flyga buken innehåller en mängd olika celltyper som lätt kan visualiseras med hjälp av denna metod, inklusive fett kropp och oenocytes, laterala muskelfibrer, sensoriska nervceller, luftstrupe, och makrofag-liknande hemocyter. Dessutom, denna modell kommer att tillåta forskare att undersöka hur fysiologiska variabler påverkar PIA, inklusive kön, kost, infektion, ålder, och miljö stressfaktorer. Medan protokollet använder den vuxna honflugan på grund av sin större storlek förekommer WIP även i den manliga fruktflugan (Gjelsvik och Losick, opublicerade). Polyploida celler har visat sig uppstå under åldrande och åldersrelaterade sjukdom i däggdjur lever, hjärna, öga, och hjärta12. Fruktflugan modellen kommer att göra det möjligt för forskare att studera polyploidisering i fysiologiska och sjukdomssammanhang eftersom mänskliga sjukdomsrelaterade gener är mycket bevarade.

Disclosures

Ingen.

Acknowledgments

På Boston College, vill vi tacka Dr Eric Folker för användning av hans lab kamera och stereoscope mikroskop setup för imaging och Bret Judson vid Boston College Imaging Core för infrastruktur och stöd. Vi vill också tacka fluggemenskapens resurser: Bloomington Drosophila Stock Center (NIH P40OD018537), Vienna Drosophila Resource Center och TRiP Center vid Harvard Medical School (NIH/NIGMS R01-GM084947) för att tillhandahålla transgena lager som används i denna studie. Musen FasIII antikropp erhölls från Developmental Studies Hybridoma Bank stöds av NICHD av NIH och underhålls vid University of Iowa, Institutionen för biologi, Iowa City, IA. Forskning som redovisas i denna publikation stöddes av National Institute of General Medical Sciences av National Institutes of Health under Award Number R35GM124691. Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikterna från National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm Petri dishes Fisher Scientific FB0875713 For creating plates to dissect in
50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-432-22 For preparing staining reagents in
AxioImager M2 with Apotome Zeiss NA For imaging samples
Blowgun mini Genesee Scientific 54-104M For anethesizing D. melanogaster strains
Bovine Serum Albumin, 30% Sigma A7284-500ML For immuostaining
Carbon dioxide tank various distributors N/A For anethesizing D. melanogaster strains
Click-iT EdU 594 Kit Thermofisher C10339 For EdU assay
Coverslips Thermofisher 3406 For mounting
DAPI Sigma D9542-10MG For immuostaining
Dissecting Plates (use Sylgard 184 Sil Elastic Kit) Ellsworth Adhesives 184SIL For creating plates to dissect in. Mix epoxy as directed, let dry overnight
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Thermofisher A21206 For secondary immuostaining
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 conjugate Thermofisher A10042 For secondary immuostaining
Drosophila tubing and fittings Genesee Scientific 59-124C, 59-123, 59-140 For anethesizing D. melanogaster strains
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20 For dissecting
epi-Gal4 Bloomington Drosophila Stock Center (b) b38793 Losick et al. Current Biology, 2013
epi-Gal4, UAS-mCD8.RFP Bloomington Drosophila Stock Center (b) b38793, b27392 Losick et al. Current Biology, 2013
Excel Microsoft For performing ploidy calculations
Fiji/ImageJ (image analysis software) NIH https://imagej.nih.gov/ij For image analysis
Fly food Archon Scientific N/A Corn Syrup/Soy food
Flystuff Flypad Genesee Scientific 59-114 For anethesizing D. melanogaster strains
Glass dissecting dish Fisher Scientific 13-748B For performing dissections in
Glass slides Fisher Scientific 12-518-104C For mounting
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Thermofisher A11001 For secondary immuostaining
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 conjugate Thermofisher A11031 For secondary immuostaining
Grace's Insect Medium, unsupplemented Thermofisher 11595030 For dissecting in
Insect pins Fine Science Tools 26002-10 For wounding and pinning fly abdomens flat
Mouse anti-Fasciclin III (Drosophila) Primary Antibody Developmental Studies Hybridoma Bank 7G10 For immunostaining epithelial cell-cell junctions
Mouting media Vector Laboratories H-1000 Anti-fade mounting media to prevent photo bleaching during imaging
Nail polish Electron Microscopy Sciences 72180 For sealing slides
Ortibal shaker Fisher Scientific 02-217-988 For immuostaining
Phosphate Buffered Saline, PH 7.4 Sigma P3813-10PAK For staining
Pin holders Fine Science Tools 91606-07 For wounding
Rabbit anti-Grainyhead Primary Antibody N/A N/A For immunostaining epithelial nuclei. Protocol to make antibody can be found (Ref. #4 and 8)
Rabbit anti-RFP Primary Antibody MBL PM005 For immunostaining mCD8-RFP fly epithelium
Stereomicroscope Olympus SZ51 For dissecting and mounting fly tissue
Triton X-100 Sigma 10789704001 For immuostaining
UAS-E2F RNAi, UAS-RacDN VDRC (v) and Bloomington Drosophila Stock Center (b) v108837, b6292 Losick et al. Current Biology, 2013
UAS-fzr RNAi, UAS-Stg VDRC (v) and Bloomington Drosophila Stock Center (b) v25550, b56562 Grendler et al. Development, 2019
UAS-Myc Bloomington Drosophila Stock Center (b) b9674 Grendler et al. Development, 2019
UAS-myc RNAi Bloomington Drosophila Stock Center (b) b36123 Grendler et al. Development, 2019
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-00 For dissecting

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abreu-Blanco, M. T., Verboon, J. M., Liu, R., Watts, J. J., Parkhurst, S. M. Drosophila embryos close epithelial wounds using a combination of cellular protrusions and an actomyosin purse string. Journal of Cell Science. 125 (Pt 24), 5984-5997 (2012).
  2. Wood, W., et al. Wound healing recapitulates morphogenesis in Drosophila embryos. Nature Cell Biology. 4 (11), 907-912 (2002).
  3. Galko, M. J., Krasnow, M. A. Cellular and genetic analysis of wound healing in Drosophila larvae. PLoS Biology. 2 (8), E239 (2004).
  4. Losick, V. P., Fox, D. T., Spradling, A. C. Polyploidization and cell fusion contribute to wound healing in the adult Drosophila epithelium. Current Biology. 23 (22), 2224-2232 (2013).
  5. Wang, Y., et al. Integrin Adhesions Suppress Syncytium Formation in the Drosophila Larval Epidermis. Current Biology. 25 (17), 2215-2227 (2015).
  6. Ramos-Lewis, W., LaFever, K. S., Page-McCaw, A. A scar-like lesion is apparent in basement membrane after wound repair in vivo. Matrix Biology. 74, 101-120 (2018).
  7. Lee, C. W., Kwon, Y. C., Lee, Y., Park, M. Y., Choe, K. M. cdc37 is essential for JNK pathway activation and wound closure in Drosophila. Molecular Biology of the Cell. 30 (21), 2651-2658 (2019).
  8. Losick, V. P., Jun, A. S., Spradling, A. C. Wound-Induced Polyploidization: Regulation by Hippo and JNK Signaling and Conservation in Mammals. PLoS One. 11 (3), e0151251 (2016).
  9. Tamori, Y., Deng, W. M. Tissue repair through cell competition and compensatory cellular hypertrophy in postmitotic epithelia. Developmental Cell. 25 (4), 350-363 (2013).
  10. Xiang, J., et al. EGFR-dependent TOR-independent endocycles support Drosophila gut epithelial regeneration. Nature Communications. 8, 15125 (2017).
  11. Cohen, E., Allen, S. R., Sawyer, J. K., Fox, D. T. Fizzy-Related dictates A cell cycle switch during organ repair and tissue growth responses in the Drosophila hindgut. Elife. 7, e38327 (2018).
  12. Gjelsvik, K. J., Besen-McNally, R., Losick, V. P. Solving the Polyploid Mystery in Health and Disease. Trends in genetics: TIG. 35 (1), 6-14 (2019).
  13. Cao, J., et al. Tension Creates an Endoreplication Wavefront that Leads Regeneration of Epicardial Tissue. Developmental Cell. 42 (6), 600-615 (2017).
  14. Zhang, S., et al. The Polyploid State Plays a Tumor-Suppressive Role in the Liver. Developmental Cell. 44 (4), 447-459 (2018).
  15. Lazzeri, E., et al. Endocycle-related tubular cell hypertrophy and progenitor proliferation recover renal function after acute kidney injury. Nature Communications. 9 (1), 1344 (2018).
  16. Grendler, J., Lowgren, S., Mills, M., Losick, V. P. Wound-induced polyploidization is driven by Myc and supports tissue repair in the presence of DNA damage. Development. 146 (15), 173005 (2019).
  17. Mehrotra, S., Maqbool, S. B., Kolpakas, A., Murnen, K., Calvi, B. R. Endocycling cells do not apoptose in response to DNA rereplication genotoxic stress. Genes & Development. 22 (22), 3158-3171 (2008).
  18. Patterson, M., et al. Frequency of mononuclear diploid cardiomyocytes underlies natural variation in heart regeneration. Nature Genetics. 49 (9), 1346-1353 (2017).
  19. Gonzalez-Rosa, J. M., et al. Myocardial Polyploidization Creates a Barrier to Heart Regeneration in Zebrafish. Developmental Cell. 44 (4), 433-446 (2018).
  20. Webster, M., Witkin, K. L., Cohen-Fix, O. Sizing up the nucleus: nuclear shape, size and nuclear-envelope assembly. Journal of Cell Science. 122 (Pt 10), 1477-1486 (2009).
  21. Knouse, K. A., Lopez, K. E., Bachofner, M., Amon, A. Chromosome Segregation Fidelity in Epithelia Requires Tissue Architecture. Cell. 175 (1), 200-211 (2018).
  22. Box, A. M., et al. Endocycles support tissue growth and regeneration of the adult Drosophila accessory gland. bioRxiv. , 719013 (2019).
  23. Karim, M. R., Moore, A. W. Morphological analysis of Drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics. Journal of Visualized Experiments. (57), e3111 (2011).
  24. Dai, W., Montell, D. J. Live Imaging of Border Cell Migration in Drosophila. Methods in Molecular Biology. 1407, 153-168 (2016).

Tags

Utvecklingsbiologi Utgåva 160 sårläkning vävnadsreparation endoreplication polyploidy Myc Drosophila
En <em>Drosophila</em> modell för att studera sårinducerad polyploidisering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bailey, E. C., Dehn, A. S.,… More

Bailey, E. C., Dehn, A. S., Gjelsvik, K. J., Besen-McNally, R., Losick, V. P. A Drosophila Model to Study Wound-induced Polyploidization. J. Vis. Exp. (160), e61252, doi:10.3791/61252 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter