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Developmental Biology

घाव-प्रेरित पॉलीप्लाइडाइजेशन का अध्ययन करने के लिए एक ड्रोसोफिला मॉडल

Published: June 9, 2020 doi: 10.3791/61252
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 1
1Biology Department, Boston College, 2Graduate School of Biomedical Sciences and Engineering and Kathryn W. Davis Center for Regenerative Biology and Medicine, MDI Biological Laboratory, University of Maine
* These authors contributed equally

Summary

घाव-प्रेरित पॉलीप्लॉयडाइजेशन एक संरक्षित ऊतक मरम्मत रणनीति है जहां कोशिकाओं को कोशिका हानि की भरपाई के लिए विभाजित करने के बजाय आकार में वृद्धि होती है। यहां एक मॉडल के रूप में फल मक्खी का उपयोग करने के लिए एक मॉडल के रूप में कैसे प्लॉय और एपिथेलियल घाव की मरंमत में अपने आनुवंशिक विनियमन को मापने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल है ।

Abstract

पॉलीप्लाइडी एक बार घटना है जिसका प्रभाव संगठित स्वास्थ्य और बीमारी पर अभी भी खराब समझ में आता है । एक कोशिका को पॉलीप्लाइड के रूप में परिभाषित किया जाता है यदि इसमें इसके गुणसूत्रों की डिप्लॉयड कॉपी से अधिक होता है, जो एंडोरेसिकेशन या सेल फ्यूजन का परिणाम होता है। ऊतक की मरम्मत में, घाव-प्रेरित पॉलीप्लाइडाइजेशन (डब्ल्यूआईपी) फल मक्खियों से कशेरुकी तक एक संरक्षित चिकित्सा रणनीति पाई गई है। WIP सेल प्रसार पर कई फायदे हैं, जिसमें ऑन्कोजेनिक विकास और जेनोटॉक्सिक तनाव के प्रतिरोध शामिल हैं। चुनौती यह पहचानने की रही है कि पॉलीप्लॉयड कोशिकाएं क्यों उत्पन्न होती हैं और ये अनूठी कोशिकाएं कैसे कार्य करती हैं। बशर्ते वयस्क फल फ्लाई एपिथेलियम में WIP का अध्ययन करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल है जहां पंचर घाव के बाद 2 दिनों के भीतर पॉलीप्लाइड कोशिकाएं उत्पन्न होती हैं। डी मेलनोगास्टर के व्यापक आनुवंशिक उपकरण किट का लाभ उठाते हुए, Myc सहित WIP को शुरू करने और विनियमित करने के लिए आवश्यक जीन की पहचान शुरू हो गई है । इस विधि का उपयोग करके जारी अध्ययनों से पता चल सकता है कि सेक्स, आहार और उम्र सहित अन्य आनुवंशिक और शारीरिक चर WIP के कार्य को कैसे विनियमित और प्रभावित करते हैं।

Introduction

ड्रोसोफिला मेलानोगैस्टर एपिथेलियल घाव की मरम्मत के सेलुलर और आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक आकर्षक मॉडल प्रणाली है। स्तनधारियों के रूप में, ऊतक मरम्मत तंत्र ऊतक और उसके विकास के चरण दोनों पर निर्भर करता है। जख्मी घाव भरने का काम फल मक्खी भ्रूण में होता है जहां एपिथेलियल लीडिंग एज पर एक एक्टोमायोसिन "पर्स स्ट्रिंग" रूपों में घाव को मूल रूप से बंद करने में सक्षम बनाता है1,2. लार्वा, पिल्ला और वयस्क फल मक्खियों में भ्रूणीय घाव भरने के परिणामस्वरूप एक्सेरैलुलर मैट्रिक्स रीमॉडलिंग, मेलेनिन निशान गठन, और एपिथेलियल सेल विकास3,,4,,5, 6,होताहै। एपिथेलियल कोशिकाएं कोशिका संलयन और एंडोसाइकिल द्वारा आकार में वृद्धि करती हैं, एक अधूरा कोशिका चक्र जो माइटोसिस 3 ,,4,4,7,8को बाईपास करता है।, नतीजतन, सेल लॉस की भरपाई सेल डिवीजन के बजाय पॉलीप्लॉयड सेल ग्रोथ से की जाती है । वयस्क फ्लाई हिंडगट, मिडगट और कूप एपिथेलियम भी,ऊतक क्षति9,10, 11के बाद सेल नुकसान की भरपाई के लिए पॉलीप्लाइड सेल विकास पर भरोसाकरतेहैं।,

पॉलीप्लाइडी पौधों और कीड़ों में संगठनीय विकास का एक प्रसिद्ध पहलू है, लेकिन पिछले कुछ वर्षों में यह अधिक स्पष्ट हो गया है कि पॉलीप्लाइडी कशेरुकी12में एक संरक्षित ऊतक मरम्मत रणनीति है। जेब्राफिश, जिसमें अपने दिल को पुनर्जीवित करने की क्षमता है, क्षतिग्रस्त एपिकार्डियम13को ठीक करने के लिए पॉलीप्लाइड सेल विकास पर निर्भर करता है। 14,15एक्यूट इंजरी के बाद स्तनधारी लिवर के14उत्थान और किडनी ट्यूबुल एपिथेलियम रिपेयर में पॉलीप्लाइडी का भी योगदान है . इन उदाहरणों में, पॉलीप्लाइड कोशिकाएं एंडोरिसाइकल या एंडोमाइटोसिस के माध्यम से एंडोरिपिकेशन द्वारा उत्पन्न होती हैं, जिसके परिणामस्वरूप साइटोकिनेसिस12में ब्लॉक के कारण एक बाईन्यूक्लियेटेड सेल होता है। पहेली यह है कि घाव की मरम्मत के दौरान पॉलीप्लॉयड कोशिकाएं उत्पन्न होती हैं और पॉलीप्लॉयड ऊतक कार्य को कैसे प्रभावित करती हैं। हाल के अध्ययनों ने इस सवाल में नई अंतर्दृष्टि प्रदान की है कि क्या पॉलीप्लॉयी एक चिकित्सा लाभ या नुकसान प्रदान करता है। जेब्राफिश एपिकार्डियम में पॉलीप्लॉयडी ने घाव भरने की गतिको बढ़ाया 13। डी मेलनोगेस्टर हिंडगट और स्तनधारी जिगर में, पॉलीप्लाइडी को ऑन्कोजेनिक विकास11, 14,14के खिलाफ सुरक्षात्मक पाया गया । वयस्क फ्लाई एपिथेलियम में, हाल ही में पाया गया था कि पॉलीप्लॉयी जीनोटॉक्सिक तनाव16की उपस्थिति में घाव की मरम्मत में सक्षम बनाता है। एंडोरेप्लिकेशन डीएनए क्षति के लिए प्रतिरोधी है, जब कोशिका प्रसार अन्यथा17से समझौता किया जाएगा तो घाव भरने की अनुमति देता है। माउस और जेब्राफिश दिलों में कार्डियोमायोसाइट्स के लिए, हालांकि, पॉलीप्लाइडी उपचार को धीमा कर देता है, जिसके परिणामस्वरूप18, 19,19में बढ़ी हुई निशान गठन होता है। इसलिए, अंग और/या सेल प्रकार के आधार पर, पॉलीप्लॉयी एक फायदेमंद या हानिकारक ऊतक मरम्मत रणनीति हो सकती है । घाव-प्रेरित पॉलीप्लाइडाइजेशन (डब्ल्यूआईपी) प्रतिक्रिया के विश्लेषण के साथ-साथ डी मेलनोगेस्टर जेनेटिक्स की पहुंच इसे आणविक और सेलुलर तंत्र को स्पष्ट करने के लिए एक आदर्श मॉडल प्रणाली बनाती है जो इस घाव चिकित्सा रणनीति का मार्गदर्शन करती है।

यहां, हम वयस्क डी मेलनोगास्टर एपिथेलियम में WIP का विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। शामिल फल मक्खी की चोट, विच्छेदन, इम्यूनोदाता, बढ़ते, इमेजिंग, और फिर से epithelialization, सेल संलयन, और एंडोरिपेशन (प्लॉयडी) के विश्लेषण के लिए निर्देश हैं । इमेजिंग और प्लॉयडी विश्लेषण को अन्य मॉडलों के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है ताकि यह परीक्षण किया जा सके कि WIP होता है या नहीं। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि परमाणु डीएनए सामग्री में वृद्धि के साथ अक्सर परमाणु आकार में इसी वृद्धि होती है । हालांकि, जीव विज्ञान में ऐसे कई उदाहरण हैं जहां परमाणु आकार प्लॉयडी20में इसी परिवर्तन को प्रतिबिंबित नहीं करता है। घाव के वातावरण के संदर्भ में परमाणु आकार की व्याख्या करते समय और भी अधिक सावधानी बरती जानी चाहिए जहां कोशिकाएं अक्सर घाव स्थल को कवर करने के लिए फैलती हैं या खिंचाव करती हैं। इसलिए, प्लॉयडी में परिवर्तन का एकमात्र निश्चित प्रमाण इस विधि (या अन्य, जैसे पूरे जीनोम अनुक्रमण)21द्वारा डीएनए सामग्री को मापना है। इस विधि घाव की मरम्मत में पॉलीप्लाइडी की भूमिका और विनियमन का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल के रूप में वयस्क डी मेलनोगास्टर पेट एपिथेलियम की उपयुक्तता को बढ़ाता है।

Protocol

1. वयस्क फल मक्खियों का मंचन और घायल होना

  1. पसंद के डी मेलनोगेस्टर तनाव का चयन करें (यानी, epi-Gal4/UAS तनाव, सामग्री की तालिकादेखें) ।
    नोट: यहां, Gal4/UAS प्रणाली का उपयोग यूएएस के जीन या आरएनएआई इनकोडेड डाउनस्ट्रीम के एपिथेलियल विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति (एपीआई-Gal4) को सक्षम करने के लिए किया जाता है । इस अध्ययन में फ्लोरोसेंट झिल्ली प्रोटीन (यूएएस-सीडी 8.एमआरएफपी), माइटोटिक प्रेरक (यूएएस-एफजेडआरआरएनएआई,यूएएस-एसटीजी), और डब्ल्यूआईपी अवरोधक (यूएएस-ई2एफ1आरएनएआई;का उपयोग करता है; यूएएस-आरएसीडीएन)।
  2. 10-15 नए संलग्न मादा फल की दो शीशियों को 3-5 दिन की उम्र तक 25 डिग्री सेल्सियस पर ताजा भोजन की शीशियों पर उड़ता है और उम्र होती है। एक शीशी अघायल नियंत्रण के रूप में काम करेगी और दूसरी शीशी नीचे वर्णित के रूप में घायल हो जाएगी । मादा मक्खियों को पुरुषों (~ 5/शीशी) के साथ बनाए रखा जाना चाहिए।
  3. मक्खियों को घायल करने के लिए, एक 0.10 मिमी स्टेनलेस स्टील पिन के साथ कई पिन धारकों को इकट्ठा करें। सुनिश्चित करें कि पिन का तेज अंत बाहर का सामना करना पड़ रहा है। पिन आसानी से मोड़ या चिप मक्खी पंचर के बाद कर सकते हैं और कांटे की शकल या क्षतिग्रस्त पिन छोड़ दिया जाना चाहिए।
  4. एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत एक सीओ2-फ्लाईपैड पर उम्रदराज मादा फल उड़ता है और उन्हें पेंट ब्रश का उपयोग करके एक पंक्ति में संरेखित करता है। सुरक्षा चश्मा पहने हुए, एक हाथ में पिन धारक पकड़े और दूसरे में संदंश, अपने वेंट्रल पेट का सामना करना पड़ के साथ एक मक्खी की स्थिति के लिए संदंश का उपयोग करें ।
  5. पंचर वयस्क मादा वेंट्रल मिडलाइन स्टर्नाइट्स(चित्रा 1ए)के दोनों ओर टर्जिट ए 4 के एपिथेलियल प्लेयूराइट क्षेत्र के भीतर उड़ता है। इस वेंट्रल क्षेत्र को पंचर करना विच्छेदन साइटों से दूर इष्टतम स्थान प्रदान करता है जहां ऊतक किनारों को यांत्रिक प्रसंस्करण द्वारा फाड़ दिया जाएगा।
  6. भोजन की शीशी और वांछित दिन के बाद चोट (डीपीआई) के लिए उम्र के लिए घायल मक्खियों वापसी । एपिथेलियल घाव भरने 1 डीपीआई से शुरू होता है और 3 डीपीआई द्वारा समाप्त होता है। एंडोरेंटेशन 2 डीपीआई पर चोटियों, जो एडू परख (धारा 4, चित्रा 2) केलिए आदर्श है।

2. उड़ना पेट विच्छेदन

नोट: इस चरण के दौरान, विच्छेदन उपकरणों के साथ वेंट्रल पेट के ऊतकों को छूने से बचना महत्वपूर्ण है क्योंकि यह एपिथेलियम की अखंडता से समझौता करेगा।

  1. विच्छेदन के लिए सभी आवश्यक सामग्री प्राप्त करें: ग्रेस का समाधान, संदंश, वान्ना की स्प्रिंग कैंची, 0.10 मिमी पिन, विच्छेदन प्लेटें, 9 अच्छी तरह से ग्लास विच्छेदन पकवान, फिक्सेटिव समाधान (1x पीबीएस में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड), 1x पीबीएस, वाइप्स, पिपेट और 30 मीटर के लिए सुझाव, और दस्ताने (सामग्री की टेबलदेखें)।
  2. पुष्टि करें कि मक्खियों को एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के नीचे सीओ2-फ्लाईपैड पर घायल मक्खियों को एनेस्थेटाइज करके सफलतापूर्वक घायल किया गया था और घाव के निशान की उपस्थिति के लिए जांच (यानी, पेट पर एक मेलेनिन स्पॉट, चित्रा 1बीदेखें)। प्रयोगात्मक समूह से किसी भी मक्खियों को त्यागें जो सफलतापूर्वक घायल नहीं हुए थे।
  3. विच्छेदन शुरू करने के लिए, अनुग्रह के समाधान के साथ एक 9 अच्छी तरह से ग्लास विच्छेदन पकवान के एक अच्छी तरह से भरें। छाती के पृष्ठीय पक्ष द्वारा एक घायल मादा फ्लाई को समझने और अनुग्रह के समाधान वाले कुएं में फ्लाई को जलमग्न करने के लिए संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें।
  4. छाती को जारी किए बिना विपरीत हाथ में संदंश का उपयोग करना, टर्गिट ए 6 के नीचे पृष्ठीय क्यूटिकल को पंचर करें और फल फ्लाई के पीछे के छोर से क्यूटिकल खींचें। आंतरिक अंग (अंडाशय और आंत) आमतौर पर इस कदम पर बाहर आ जाएगा। यदि नहीं, तो शेष अंगों को निचोड़ने और एक खाली कुएं में त्यागने के लिए संदंश के साथ पेट के पृष्ठीय पक्ष पर धीरे-धीरे धक्का दें।
  5. संदंश का उपयोग करते हुए टर्गिट A2 के ऊपर थोरेक्स जंक्शन पर पूर्ण पेट को स्नैप करें और पेट को ग्रेस के समाधान के ~ 100 माइक्रोन युक्त एक खाली कुएं में स्थानांतरित करें।
  6. जब तक सभी फ्लाई पेट विच्छेदित न हो जाएं तब तक चरण 2.3-2.5 दोहराएं।
  7. अच्छी तरह से युक्त पूल्ड, विच्छेदित पेट में ग्रेस के समाधान की मात्रा को 30 माइक्रोन तक कम करें।
  8. पट्टिका पेट एक हाथ में संदंश के साथ पृष्ठीय पक्ष पर पेट की स्थिति से खुला है और फिर दूसरे हाथ के साथ पेट गुहा में Vanna वसंत कैंची के नीचे ब्लेड डालने । पेट पूरी तरह से खुलने तक पृष्ठीय मिडलाइन के साथ कटें, जिसके लिए तीन कटौती(चित्रा 1सी, 1D)तक की आवश्यकता हो सकती है।
  9. पेट बढ़ते क्षेत्र प्रति चार 0.10 मिमी पिन के साथ एक सूखी विच्छेदन प्लेट स्थापित करें। प्रत्येक 35 मिमी विच्छेदन प्लेट सात बढ़ते क्षेत्रों तक फिट हो सकती है। प्रत्येक बढ़ते क्षेत्र पर ग्रेस के समाधान के पिपेट 30 माइक्रोन और प्रत्येक बूंद के लिए एक भरा हुआ पेट स्थानांतरित करें।
  10. चार पृष्ठीय कोनों(चित्रा 1ई)पर डिश के लिए पट्टिका पेट पिन । सुनिश्चित करें कि ऊतक पेट के ऊतकों को फाड़ने या अधिक फैलाए बिना सपाट है।
  11. ऊतक को ठीक करने के लिए, ग्रेस के समाधान को बंद करें और पिन किए गए पेट में फिक्स समाधान के 30 माइक्रोन जोड़ें।
    सावधानी: फिक्स समाधान को संभालते समय दस्ताने पहनें, क्योंकि पैराफॉर्मेल्डिहाइड विषाक्त है।
  12. जब तक सभी भरे हुए पेट विच्छेदन प्लेट पर टिकी न हों तब तक चरण 2.10-2.11 दोहराएं।
  13. प्रत्येक नियंत्रण और प्रयोगात्मक समूह को चिह्नित करने के लिए प्रत्येक डिश के नीचे एक टेप लेबल रखें। कमरे के तापमान (आरटी) पर 30-60 मिनट के लिए नमूने ठीक करें।
  14. प्रत्येक प्लेट में 1x पीबीएस के 1.5 एमएल पर पाइपिंग करके फिक्स समाधान को धोएं। संस्थागत दिशा-निर्देशों के अनुसार उचित तरल या शुष्क रासायनिक अपशिष्ट कंटेनरों में फिक्स समाधान और प्लास्टिक का निपटान करें।
  15. 1x पीबीएस के 1.5 एमएल के साथ प्लेटें 2x धोएं और ढक्कन के साथ एक प्लास्टिक कंटेनर में 1x पीबीएस के 1.5 एमएल में कवर किए गए फिक्स्ड टिश्यू को स्टोर करें। कंटेनर के नीचे नम कागज तौलिया की एक परत जोड़ें और विच्छेदन के 1 सप्ताह के भीतर इम्यूनोदाता के लिए तैयार होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को स्टोर करें।

3. इम्यूनोफ्लोरेसेंस

  1. हौसले से तैयार रिएजेंट्स (सामग्री की तालिकादेखें): बफर समाधान धोएं (0.3% ट्राइटन एक्स 100, 1x पीबीएस में 0.3% बीएसए)। बचे हुए वॉश बफर को 4 डिग्री सेल्सियस पर बचाया जा सकता है और 2 दिन के धुंधला प्रोटोकॉल की अवधि के लिए उपयोग किया जा सकता है। एंटी-जीआरएच (1:300 एफ़िनिटी शुद्ध खरगोश एंटी-ग्रेनिर8)या एंटी-आरएफपी (1:1,000 खरगोश एंटी-आरएफपी) के साथ वॉश बफर में एंटी-फासीआईआई (1:50 माउस एंटी-फासिक्लिन-III) का उपयोग करके प्रति परख(चित्रा 2)के अनुसार पर्याप्त प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें। प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर बचाया जा सकता है और सिग्नल काफी कम होने तक कई बार पुन: इसया जाता है।
  2. 1x पीबीएस को बंद करके ऊतक को पार करें, 1.5 एमएल वॉश बफर जोड़ते हैं, और आरटी में एक कक्षीय शेखर (80 आरपीएम) पर कम से कम 30 मिनट के लिए इनक्यूबेटिंग करते हैं।
  3. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 1.5 एमएल के साथ रात भर धोने बफर और दाग ऊतक को हटा दें, 4 डिग्री सेल्सियस पर एक कक्षीय शेखर (80 आरपीएम) पर इनक्यूबेटिंग करें। प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान ले लीजिए और भविष्य के प्रयोगों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक ट्यूब में सहेजें।
  4. पहले 1x पीबीएस के साथ जल्दी से नमूना कुल्ला और फिर धोने बफर के 1.5 एमएल के साथ 3x धोने। प्रत्येक धोने के लिए, कम से 30 मिनट के लिए एक कक्षीय शेखर पर आरटी पर इनक्यूबेट नमूने ।
  5. अंतिम धोने के दौरान, माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें: वॉश बफर में 1:1,000 गधा विरोधी खरगोश एलेक्सा 488 या 568 और 1:1,000 बकरी विरोधी माउस एलेक्सा 488 या 568 (या पसंद के फ्लूरोफोरस)।
  6. सेकेंडरी एंटीबॉडी सॉल्यूशन के 1.5 एमएल के साथ वॉश बफर और दाग ऊतकों को हटा दें। 3 घंटे के लिए आरटी में एक कक्षीय शेखर पर एल्यूमीनियम पन्नी और इनक्यूबेट के साथ नमूनों को कवर करें । वैकल्पिक रूप से, नमूनों को कक्षीय शेखर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेटेड किया जा सकता है।
  7. पहले माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान को त्यागकर नमूने धोएं और फिर 1x पीबीएस के साथ नमूना जल्दी से कुल्ला करें और इसके बाद 1.5 एमएल वॉश बफर के साथ तीन वॉश करें। प्रत्येक धोने के लिए, कम से 30 मिनट के लिए एक कक्षीय शेखर पर आरटी पर इनक्यूबेट नमूने ।
  8. वॉश बफर में 10 माइक्रोग्राम/एमएल को डीएपीआई को कमजोर करके डीएपीआई समाधान तैयार करें। अंतिम धोने के बाद, 1.5 एमएल डीएपीआई समाधान के साथ दाग नमूने 30 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेटिंग।
  9. DAPI समाधान त्यागें और 1x पीबीएस के 1.5 एमएल में 2x नमूने कुल्ला। कवरस्लिप के साथ ग्लास स्लाइड पर माउंट करने के लिए तैयार होने तक, एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर किए गए अंधेरे में 1x पीबीएस के 1.5 एमएल में दाग ऊतक स्टोर करें। बढ़ते कदम 1 सप्ताह के भीतर किया जाना चाहिए।

4. सेल चक्र गतिविधि (एडू परख)

  1. क्लिक-iT किट से 10 एमएमएम एडू स्टॉक समाधान बनाएं (सामग्री की तालिकादेखें) डीएच20 में एडू पाउडर को भंग करके और ~ 15 मिनट के लिए मिश्रण जब तक पूरी तरह से भंग नहीं हो जाता है। स्टॉक समाधान को अलीकोट किया जा सकता है (250 माइक्रोन प्रति ट्यूब) और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. फ़ीड डीएच2ओ में 5 m m करने के लिए पहली बार कमजोर EdU स्टॉक द्वारा EdU मक्खियों । जब तक समाधान बादल छाए रहेंगे और संक्षेप में भंवर मिश्रण करने के लिए सूखी खमीर जोड़ें । 0.5 एमएल ट्यूब कैप काट लें और इसे फ्लाई फूड शीशी के नीचे रखें। टोपी को भोजन में धकेलें, इसलिए यह स्थिर है।
  3. मक्खियों को एनेस्थेटाइज करें और 3-5 दिन पुरानी मक्खियों को शीशी में स्थानांतरित करें। मक्खियों को एक किनारे पर टैप करें ताकि कोई भी टोपी में न फंसे।
  4. पिपेट 75 μL खमीर-EdU समाधान टोपी में। मक्खियों को हर दिन ताजा खमीर-एडू समाधान खिलाया जाना चाहिए और यह सुनिश्चित करने के लिए कि मक्खियां शीशी के नीचे में नहीं फंसती हैं, हर दूसरे दिन एक टोपी के साथ एक ताजा भोजन शीशी में स्थानांतरित हो जाएं।
  5. मक्खियों को स्थानांतरित करने के लिए, एक टोपी के साथ एक नई शीशी पर फ्लिप करें, मक्खियों को सोने के लिए रखें, मक्खियों को एक तरफ टैप करें, और ताजा खमीर-एडू समाधान जोड़ें।
  6. तीसरे दिन, मक्खियों को घायल करें और 2 डीपीआई(चित्रा 4ए)पर विच्छेदन तक खमीर-एडू को खिलाते रहें। विच्छेदन और निर्धारण विधियों के लिए प्रोटोकॉल धारा 2 देखें।
  7. एडू धुंधला अभिकरने वाले तैयार करें: बफर धोएं (0.3% ट्राइटन एक्स 100, 1x PBS में 0.3% बीएसए), परमीलाइजेशन बफर (1x पीबीएस में 0.5% ट्राइटन एक्स 100), बफर (1x पीबीएस में 3% बीएसए) को अवरुद्ध करना, और एडू परख किट (सामग्री की तालिकादेखें), जिसमें निर्माता द्वारा निर्देशित 1x प्रतिक्रिया बफर और 1x प्रतिक्रिया बफर योजक शामिल हैं।
  8. 1 घंटे के लिए नमूने धोएं, आरटी में 1.5 एमएल वॉश बफर में मिलाएं।
  9. 20 मिनट के लिए 1.5 एमएल परमीलाइजेशन बफर और इनक्यूबेट नमूने जोड़ें।
    नोट: गल और ५०० μL/प्लेट की मात्रा का उपयोग कर प्रतिक्रिया कॉकटेल समाधान तैयार करते हैं ।
  10. 1x पीबीएस के साथ 1x जल्दी से नमूने धोएं और फिर 1 एमएल ब्लॉकिंग बफर के साथ जल्दी से 3x।
  11. सभी शेष अवरुद्ध बफर से पिपेट करें और प्रति प्लेट प्रतिक्रिया कॉकटेल समाधान के 500 माइक्रोन जोड़ें। ऊतकों को सुनिश्चित करने के लिए भंवर प्लेटें पूरी तरह से कवर कर रहे हैं। आरटी में 1 घंटे के लिए अंधेरे में एक दराज में इनक्यूबेट ।
  12. 1.5 एमएल अवरुद्ध बफर के साथ 1x नमूने जल्दी धोएं।
  13. 30 मिनट के लिए वॉश बफर में 1:5,000 पर DAPI समाधान के 1.5 एमएल के साथ दाग।
  14. 1x PBS के साथ 2x जल्दी धोएं, पन्नी में लपेटें, और 3 दिनों के भीतर नमूनों को माउंट करने के लिए तैयार होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में स्टोर करें।

5. माउंट दाग ऊतक

  1. बढ़ते के लिए सभी आवश्यक सामग्री प्राप्त करें: ग्लास स्लाइड, ग्लास कवरलिप, स्पष्ट नेल पॉलिश, बढ़ते मीडिया, संदंश की एक जोड़ी, और पोंछे।
  2. दागदार फ्लाई ऊतक को माउंट करने के लिए, स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत संदंश का उपयोग करके विच्छेदन प्लेट से पेट को अनपिन करें। एक ग्लास कवरलिप पर बढ़ते मीडिया के ~ 30 माइक्रोन में ऊतक स्थानांतरित करें धीरे-धीरे ऊतक को अपने पृष्ठीय पार्श्व द्वारा संदंश के साथ हथियाने के द्वारा, संदंश के साथ वेंट्रल क्षेत्र को छूने से बचने के लिए ध्यान रखते हुए।
  3. स्टीरियोमाइक्रोस्कोप ओरिएंट के तहत पेट के ऊतकों को इतना है कि अंदर कवरस्लिप की ओर नीचे का सामना करना पड़ रहा है (यानी, बाहरी क्यूटिकल/ब्रिस्टल ऊपर का सामना कर रहे हैं) । संदंश का उपयोग कर मीडिया बूंद के किनारे करने के लिए उन्मुख पेट खींचो। सतह तनाव ऊतक फ्लैट(चित्रा 1एफ)रखने में मदद मिलेगी ।
    नोट: इस स्तर पर एक कॉलम या पंक्ति में पेट को व्यवस्थित करने के लिए इमेजिंग के लिए उपयोगी है।
  4. एक ग्लास स्लाइड (यानी, नियंत्रण या प्रयोगात्मक) लेबल और धीरे-धीरे स्लाइड कवरस्लिप के करीब लाने के द्वारा कवरस्लिप उठाओ। फ्लिप स्लाइड पर और धीरे से एक पोंछ के साथ दाग अतिरिक्त बढ़ते मीडिया को दूर करने के लिए ।
  5. स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ कवरस्लिप के किनारों को सील करें और शेष सभी प्रयोगात्मक समूहों के लिए दोहराएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर एक स्लाइड बॉक्स में स्लाइड स्टोर जब तक छवि के लिए तैयार है ।

6. इमेजिंग और प्रोसेसिंग

  1. छवि पहले एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप(चित्रा 1बी),या तो एक बिंदु स्कैनर या एक संरचित रोशनी (ApoTome) एक 40x तेल या शुष्क उद्देश्य के साथ मेलानिन निशान का पता लगाने के द्वारा फ्लाई पेट घाव क्षेत्र ।
  2. प्रत्येक चैनल पर एक्सपोजर की जांच करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि सिग्नल संतृप्ति से नीचे है। इमेजिंग सेटिंग्स प्रतिभाशाली नमूना समूह पर आधारित होना चाहिए। यह प्लॉयड विश्लेषण के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है क्योंकि डीएनए सामग्री को सही ढंग से मापने के लिए DAPI चैनल को रैखिक रेंज में रहने की जरूरत है।
  3. स्लाइस के बीच कम से कम 0.50 माइक्रोन की इष्टतम दूरी के साथ तीनों चैनलों में एक पूर्ण जेड-स्टैक छवि लें। कैप्चर की गई छवियों को सहेजें और छवि विश्लेषण कार्यक्रम फिजी (जिसे इमेजजे के रूप में भी जाना जाता है) में फ़ाइल खोलें।
  4. प्रत्येक छवि के लिए, सभी चैनलों के लिए स्लाइस विकल्प के योग का उपयोग कर एक जेड-स्टैक प्रक्षेपण बनाएं।
  5. यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक छवियों को घुमाएं कि नाभिक को छवियों में क्षैतिज रूप से रेखांकित किया गया है(चित्र 3ए और चित्रा 4ई)।
  6. घाव स्थल या अघायल नियंत्रण के केंद्र के चारों ओर केंद्रित 300 माइक्रोन x 300 माइक्रोन के आयताकार चयन के लिए सभी छवियों को क्रॉप करें। आयत खींचकर और संपादित करने का चयन करके क्षेत्र की पहचान करें । चयन । निर्दिष्ट करें। जांच करें कि स्केल्ड इकाइयां माइक्रोन में हैं ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि सभी छवियों का विश्लेषण करने के लिए एक ही आकार के बॉक्स का उपयोग किया जाता है।

7. एंडोरिप्लिकेशन (प्लॉयडी) विश्लेषण

  1. फिजी का उपयोग करके, जीएच चैनल विंडो का चयन करें और छवि को डुप्लिकेट करें। फिर मास्क बनाने के लिए थ्रेसहोल्ड टूल का उपयोग करें। नाभिक को काफी हद तक सिकुड़ने के कारण(चित्रा 4डी)के कारण पृष्ठभूमि को कम करने के लिए शीर्ष बार फिसलने से सीमा को मैन्युअल रूप से समायोजित करें।
  2. यदि जीएच चैनल में कोई भी नाभिक दहलीज छवि में छू रहा है, तो नाभिक के बीच एक लाइन खींचने के लिए, पृष्ठभूमि के समान रंग में तूलिका उपकरण (2 पिक्सेल चौड़ाई) का उपयोग करें। अंतिम मुखौटा उत्पन्न करने के लिए समाप्त होने पर 1x लागू करने के लिए क्लिक करें।
  3. विश्लेषण कणों समारोह का उपयोग करके ब्याज (आरओआई) मानचित्र का एक क्षेत्र उत्पन्न करें: पृष्ठभूमि को शामिल किए बिना अधिकांश नाभिक को कैप्चर करने के लिए आकार को 5 माइक्रोन-60 माइक्रोन सेट करें।
  4. आरओआई प्रबंधक में आवश्यकतानुसार आरओआईमानचित्र को मैन्युअल रूप से समायोजित करें। ऐसे किसी भी चयन को हटा दें जो नाभिक नहीं हैं और उस सूची में किसी भी नाभिक को जोड़ते हैं जिसे फ्रीहैंड चयन उपकरण के साथ नाभिक को रेखांकित करके पहचाना नहीं गया था और इसे आरओआई प्रबंधक (चित्रा 4डी)में जोड़ दिया गया था।
  5. DAPI चैनल का चयन करें तो डीएपीआई चैनल पर जीआरएच चैनल में उत्पन्न आरओआई मानचित्र लागू करने के लिए आरओआई प्रबंधक में सभी शो पर क्लिक करें।
  6. किसी भी चयन को हटाएं जहां एपिथेलियल नाभिक आरओआई मानचित्र से नोपिथेलियल नाभिक (जैसे, मांसपेशियों या वसा से नाभिक) के साथ ओवरलैप होता है। दानेदार केवल एपिथेलियल नाभिक को दाग देता है, जबकि DAPI सभी नाभिक को दाग देता है। चेक करें कि प्रत्येक उल्लिखित चयन में केवल एक नाभिक होता है और एक से अधिक नाभिक के साथ किसी भी चयन को हटाया या संपादित करता है। संपादित आरओआई सूची सहेजें।
  7. फिजी में विश्लेषण उपकरणों का उपयोग करके आरओआई मानचित्र में प्रत्येक एपिथेलियल नाभिक के क्षेत्र और एकीकृत घनत्व को मापें। मूल्यों को स्प्रेडशीट कार्यक्रम में निर्यात करें।
  8. परिपत्र चयन उपकरण का उपयोग कर औसत छवि पृष्ठभूमि को मापें। तीन हलकों कि DAPI छवि के विभिन्न क्षेत्रों में किसी भी नाभिक के साथ ओवरलैप नहीं ड्रा। पृष्ठभूमि छवि चमक स्थापित करने के लिए प्रत्येक सर्कल के क्षेत्र और एकीकृत घनत्व को स्प्रेडशीट कार्यक्रम में जोड़ें।
  9. प्रत्येक पृष्ठभूमि एकीकृत घनत्व मूल्य को अपने संबंधित क्षेत्र द्वारा विभाजित करके प्रत्येक छवि के लिए प्रति इकाई क्षेत्र औसत पृष्ठभूमि की गणना करके शुरू करें। फिर प्रति इकाई क्षेत्र औसत पृष्ठभूमि प्राप्त करने के लिए छवि के लिए प्रति क्षेत्र माप तीन एकीकृत घनत्व का औसत।
  10. इसके बाद, नाभिक के क्षेत्र को प्रति इकाई क्षेत्र औसत पृष्ठभूमि से गुणा करके प्रत्येक डीएपीआई नाभिक की कुल पृष्ठभूमि की गणना करें। प्रत्येक नाभिक मापा के लिए सामान्यीकृत DAPI तीव्रता तो अपने मापा एकीकृत घनत्व से प्रत्येक नाभिक की कुल पृष्ठभूमि घटाकर गणना की जा सकती है ।
  11. अघायल एपिथेलियल नियंत्रण से सभी सामान्यीकृत DAPI तीव्रता मूल्यों का औसत। अघायल एपिथेलियल नाभिक की गणना पहले 2सी के प्लॉइडी मूल्य के लिए की गई थी और यह प्रायोगिक परिस्थितियों से एपिथेलियल नाभिक में प्लॉयडी की गणना के लिए एक संदर्भ के रूप में काम कर सकता है8.
  12. प्रत्येक नाभिक की सामान्यीकृत DAPI तीव्रता को संदर्भ अघायल एपिथेलियल नियंत्रण (2 सी) से सामान्यीकृत मूल्य द्वारा विभाजित करके प्रत्येक नाभिक की प्लॉयडी की गणना करें, फिर सामान्यीकृत प्लॉइडी (सी-वैल्यू) के बराबर मूल्य को 2 से गुणा करें:
    (न्यूक्लियर इंटीग्रेटेड डेंसिटी - बैकग्राउंड न्यूक्लियर इंटीग्रेटेड डेंसिटी)/एवरेज न्यूक्लियर इंटीग्रेटेड डेंसिटी (अघायल एपिथेलियल न्यूक्लियी = 2सी) x 2 = एपिथेलियल न्यूक्लियर प्लॉइडी (सी)
  13. एक डॉट प्लॉट, हिस्टोग्राम, या तदनुसार एक बार ग्राफ में समूहीकृत के रूप में प्लॉयडी मूल्यों के साथ ग्राफ नाभिक (यानी, 2C [0.6-2.9C], 4C [3.0-5.9C], 8C [6.0-12.9C], 16C [13.0-24.9C], और >32C [>25.0C](चित्रा 3)।

Representative Results

घाव-प्रेरित पॉलीप्लाइडाइजेशन (WIP) का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल के रूप में डी मेलनोगास्टर का उपयोग करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया जाता है। यह घाव उपचार मॉडल स्तनधारी और WIP के अन्य फ्लाई मॉडल पर कई फायदे प्रदान करता है। पॉलीप्लाइडी को आसानी से एक यांत्रिक पंचर द्वारा प्रेरित किया गया था जिसमें एक कीट पिन और पॉलीप्लॉयड कोशिकाएं थोड़े समय (2-3 डीपीआई)(चित्रा 1ए, 1B)4के भीतर उत्पन्न हुई थीं। प्रमुख चुनौती एपिथेलियम के लिए किसी भी क्षोभ के बिना बरकरार पेट के ऊतकों का विच्छेदन है। डी मेलनोगास्टर एपिथेलियम आसानी से गलती से टकरा जाता है या तेज विच्छेदन उपकरणों के साथ खरोंच जाता है। इसलिए, उपयोग और विश्लेषण से पहले इस प्रोटोकॉल के चरणों का अभ्यास किया जाना चाहिए।

सबसे पहले, चोट वेंट्रल मादा पेट तक सीमित थी, जो इमेजिंग के लिए एक बड़े, फ्लैट अपारदर्शी ऊतक क्षेत्र को आदर्श प्रदान करती है। पंचर घावों को प्लूरिट एपिथेलियम में दिए गए थे, जो वेंट्रल मिडलाइन स्टर्नाइट्स के दोनों तरफ स्थित हैं और टर्जिट (टी) सेगमेंट T4-T5(चित्रा 1ए-सी)के बीच लक्षित हैं। यह घाव प्लेसमेंट एक बड़ा दृश्यमान क्षेत्र प्रदान करता है जो विच्छेदन से बाधित नहीं होता है। चुनौतीपूर्ण चरणों में पेट स्प्रिंग कैंची कट और पिनिंग चरण(चित्रा 1डी, 1E)शामिल हैं। वसंत काटने के कदम सबसे अच्छा काम किया जब पेट अनुग्रह के समाधान की एक कम मात्रा में कटौती कर रहे थे (~ 30 μL) ऊतक आंदोलन को कम करने के लिए । विच्छेदन प्लेट(चित्रा 1सी)पर खुला पिन करने के लिए पेट के पृष्ठीय फ्लैप्स पर पर्याप्त क्षेत्र प्रदान करने के लिए पृष्ठीय मिडलाइन के साथ एक अच्छी तरह से केंद्रित कट आवश्यक था। पेट को अत्यधिक बल(चित्रा 1ई)के बिना चार कोनों पर धीरे से टिकी होनी चाहिए। एक पिन पुश जो बहुत कठिन है पेट के ऊतकों को विकृत कर देगा और यहां तक कि ऊतक को विच्छेदन प्लेट में भी धकेल सकता है। यदि ऐसा होता है, तो ऊतक को त्याग दिया जाना चाहिए। एक बार पेट के ऊतकों को ठीक करने के बाद, यह विच्छेदन प्लेट पर तब तक बना रहा जब तक कि इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला पूरा नहीं हो गया था और पेट इमेजिंग(चित्रा 1एफ)के लिए ग्लास कवरलिप पर लगाए गए थे।

घाव भरने के लिए एक निरंतर एपिथेलियल शीट बनाने की आवश्यकता होती है, जो एंडोरियलेशन और सेल फ्यूजन4,,16पर निर्भर है। सेप्टेट जंक्शन प्रोटीन फासीआईआई, जो सेल-सेल जंक्शनों को लेबल करता है, ने तैयारी के दौरान किसी भी प्रसंस्करण क्षोभ(चित्रा 1जी, 1H)के लिए एक संकेतक प्रदान किया। बड़े खरोंच (अन दाग क्षेत्र) के साथ पेट जो घाव क्षेत्र को छोड़ दिया जाना चाहिए और आगे के विश्लेषण(चित्रा 1एच)के लिए उपयोग नहीं किया गया था।

अगले कदम के लिए WIP में किसी भी दोष के लिए बरकरार नमूनों का विश्लेषण किया गया । इस प्रोटोकॉल में WIP प्रतिक्रिया(चित्रा 2)के विभिन्न पहलुओं का पता लगाने के लिए अलग-अलग परख शामिल है। घाव की मरम्मत पूरी हो गई थी जब एक केंद्रीय, बड़े, बहुनीय कोशिका ने घाव पपड़ी(चित्रा 3ए)को कवर किया था। यहां फासीआईआई/जीआरएच के लिए धुंधला करके सेल फ्यूजन का पता लगाया गया और फासीआईआई में शामिल जीएच+ एपिथेलियल नाभिक की संख्याकीमात्रा निर्धारित की गई । घाव बंद होने या फिर से एपिथेलिलाइजेशन में दोषों का पता चला जब एपिथेलियल शीट में >10 माइक्रोन की कमियां देखी गईं(चित्रा 3बी,लाल तीर)। यह मामला था, उदाहरण के लिए, जब WIP एसटीजी, fzrRNAAiकी अभिव्यक्ति के माध्यम से मिटोटिक चक्र की सक्रियता से हिचकते थे, जैसा कि हाल ही में16रिपोर्ट किया गया था । इस आनुवांशिक स्थिति में, 52% घाव घाव पपड़ी(चित्रा 3बी, 3सी)के ऊपर एक निरंतर एपिथेलियल शीट बनाने में सक्षम नहीं थे।

इस मॉडल में घाव की मरम्मत को मापने के लिए एक और तरीका यूएएस-mCD8-ChRFP4 (चित्रा 2, चित्रा 3डी)की epithelial झिल्ली की कल्पना करके किया गया था। नियंत्रण में, 91% एपिथेलियल घाव पूरी तरह से 3 डीपीआई द्वारा बंद हो गए, लेकिन एनीकट(E2f1RNAi)और सेल फ्यूजन(RacDN)को एक साथ अवरुद्ध करके WIP को बाधित करते हैं, जैसा कि पहले बताया गया था, 92% एपिथेलियल घाव पूरी तरह से खुले रहने के कारण(चित्रा 3डी, 3E)8,,16। एसटीजी, एफजेडआरआरएनएआई की अभिव्यक्ति द्वारा माइटोटिक सेल चक्र की सक्रियता के परिणामस्वरूप एक एपिथेलियल घाव बंद करने का दोष भी हुआ। हालांकि, एपिथेलियल सेल झिल्ली की कल्पना करके, पुनः-एपीथेलिलाइजेशन दोष की सीमा निर्धारित की जा सकती है। WIP उत्परिवर्ती(E2f1RNAAi,RacDN)मक्खी घाव एसटीजी की तुलना में अधिक खुले थे, fzrRNAAi घाव(चित्रा 3डी,धराशायी लाल रूपरेखा)16। इस झिल्ली घाव उपचार परख घाव की मरम्मत दोष की सीमा के बारे में अधिक जानकारी प्रदान की है। नतीजतन, पुनः epithelialization दोषों को या तो पूरी तरह से खुला, आंशिक रूप से बंद (यानी, और 10 माइक्रोन अंतराल), या पूरी तरह से बंद(चित्रा 3डी, 3E)के रूप में समूहित किया जा सकता है ।

सेल फ्यूजन के अलावा, एपिथेलियल कोशिकाएं एंडोरेप्लिकेशन द्वारा आकार में बढ़ती हैं, एक अधूरा कोशिका चक्र जो परमाणु डीएनए सामग्री को दोगुना करता है। एंडोरेप्लिकेशन को सेल चक्र गतिविधि और प्रत्यक्ष परमाणु डीएनए प्लॉयडी माप(चित्रा 2 और चित्रा 4)दोनों द्वारा आसक्त किया गया था। यहां, अजवायन एनालॉग, एडु(चित्रा 4ए, 4B)के समावेश द्वारा सेल चक्र गतिविधि का पता चला था। D. मेलानोगास्टर एपिथेलियल कोशिकाओं को एंडोसाइकिल में प्रवेश करने के लिए पाया गया, एक अधूरा कोशिका चक्र जो एस और जी चरणों के बीच एक हस्तक्षेप एम चरण,4,12के बिना दोलन करता है। वयस्क डी मेलनोगास्टर आहार को चोट से पहले एडू+ भोजन के साथ पूरक किया गया था और मक्खियों को 2 डीपीआई(चित्रा 4ए)में विच्छेदन तक एडू+ आहार पर बनाए रखा गया था। इसके बाद एडु को निर्माता के क्लिक-iT प्रोटोकॉल का उपयोग करके पता चला। इस EdU परख का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया गया था कि घाव के जवाब में एस चरण में प्रवेश करने के लिए कहां, कब, और कितने नाभिक शुरू किए गए थे। Gal4/UAS प्रणाली का उपयोग करना, यह हाल ही में पाया गया था कि myc के epithelial विशिष्ट अभिव्यक्ति या तो ब्लॉक कर सकतेहै (mycRNAAi)या बढ़ा (Myc overexpression) एपीथेलियल कोशिकाओं की क्षमता एस चरण में प्रवेश करने के लिए । परिणामस्वरूप, यह दिखाया गया है कि माईसी पोस्टमिटोटिक कोशिकाओं में एंडोरेंटेशन को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त है, यहां तक कि चोट के बिना16,,22।

इसके बाद, एपिथेलियल प्लॉयडी सीधे परमाणु डीएनए सामग्री को मापने के द्वारा निर्धारित किया गया था । एपिथेलियल नाभिक की पहचान एपिथेलियल विशिष्ट मार्कर, जीआरएच(चित्रा 4डी)के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग द्वारा की गई थी। फिजी इमेजिंग सॉफ्टवेयर में, एपिथेलियल नाभिक को व्यवस्थित रूप से पहचाना गया था और फिर जीआरएच परमाणु दाग का उपयोग करके दहलीज किया गया था। नाभिक तो अलग कर दिया गया और ROIs ढेर DAPI छवि(चित्रा 4डी,हरे तीर) की राशि पर मढ़ा । चयनित नाभिक के एकीकृत घनत्व(चित्रा 4डी,लाल तीर) को मापा गया था, इससे पहले किसी भी अतिव्यापी नाभिक को मैन्युअल रूप से हटा दिया गया था। यह अर्ध- औमाण विधि किसी को घायल और मरम्मत की गई फ्लाई पेट एपिथेलियम8में अधिकांश नाभिक के वितरण और प्लॉयडी की मात्रा निर्धारित करने की अनुमति देती है । जैसा कि हाल ही में बताया गया है, घाव के आसपास के एपिथेलियल नाभिक 3 डीपीआई (चित्रा 4ई, 4एफ)16में 3सी से अधिक डीएनए सामग्री के साथ44%पॉलीप्लाइड नाभिक से बना था। एडू परिणामों से उम्मीद के अनुसार, माईक के नॉकआउट ने एंडोरेलिकेशन में एक महत्वपूर्ण ब्लॉक का नेतृत्व किया, क्योंकि केवल 9% एपिथेलियल नाभिक पॉलीप्लाइड थे, जबकि माईक के अतिव्यवहार के परिणामस्वरूप घाव स्थल(चित्रा 4एफ)16के आसपास 100% पॉलीप्लाइड एपिथेलियल नाभिक हुआ। एपिथेलियल परमाणु आकार भी या तो कम या बढ़े हुए नाभिक मौजूद के साथ myc अभिव्यक्ति से प्रभावित दिख रहा था । हालांकि, परमाणु क्षेत्र प्लॉयडी और शारीरिक प्रभावों का सटीक उपाय नहीं है, क्योंकि सेल स्ट्रेचिंग जैसे कारक भी परमाणु डीएनए सामग्री20को प्रभावित किए बिना परमाणु आकार को प्रभावित कर सकते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: वयस्क फल पेट घायल, विच्छेदन, और ऊतक बढ़ते उड़ना । (A)वयस्क पेट के घायल परख का आरेख । मक्खियों को पेट के दोनों ओर टर्जिट 4 (टी 4) पर घायल होना चाहिए। (ख)वयस्क मादा फल घाव भरने (सफेद बॉक्स) से गठित मेलेनिन पपड़ी के साथ 3 डीपीआई फ्लाई। स्केल बार = 50 माइक्रोन(सी)विच्छेदित वयस्क पेट, पृष्ठीय दृश्य, टेर्गिट्स लेबल के साथ। पेट को पृष्ठीय पक्ष (सफेद धराशायी रेखा) के मिडलाइन के नीचे भरा गया था। स्केल बार = 50 माइक्रोन.(D)पिनिंग से पहले विच्छेदित और भरा हुआ वयस्क पेट। स्केल बार = 50 माइक्रोन(ई)एक विच्छेदन प्लेट पर वयस्क पेट पर टिकी। पेट के चारों कोनों में से प्रत्येक में एक पिन पृष्ठीय पक्ष पर रखा गया था। ऊतक धीरे खोला गया था, लेकिन फैला नहीं है, फाड़ से बचने के लिए । (एफ)वयस्क पेट घुड़सवार और एक ग्लास कवरस्लिप पर रखा गया था पेट के अंदर के साथ कवरस्लिप और क्यूटिकल फोल्ड की ओर नीचे का सामना करना पड़ ग्लास स्लाइड की ओर । (जी)FasIII कोई प्रसंस्करण क्षोभ और एक केंद्रीय सिंकीयटम (धराशायी पीली रेखा) के साथ बरकरार घाव क्षेत्र के धुंधला । स्केल बार = 50 माइक्रोन(एच)एक अन दागदार FasIII क्षेत्र के साथ एक खरोंच घाव क्षेत्र की छवि (*) जो सिंक्म को बाधित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: WIP विश्लेषण कार्यप्रवाह। फ्लिकचार्ट में इस अध्ययन में वर्णित तीन परखों को दर्शाया गया है और WIP प्रतिक्रिया का पता लगाने और मापने के लिए ओवरलैपिंग और अलग-अलग कदम उठाए गए हैं। EdU परख उपाय सेल चक्र गतिविधि (नीले बक्से), प्लॉय और फिर से epithelialization Grh/FasIII इम्यूनोस्टेपिंग (हरे बक्से) द्वारा पता लगाया जाता है, और झिल्ली आरएफपी की अभिव्यक्ति एपिथेलियल घाव बंद करने (गुलाबी बक्से) की सीमा के माप की अनुमति देता है । सामान्य कदम ग्रे बक्से में हैं और डी मेलानोगास्टर स्ट्रेन जीनोटाइप ऊपर सूचीबद्ध हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: WIP के दौरान फिर से एपिथेलाइजेशन का पता लगाने के तरीके। जब WIP आनुवंशिक रूप से बाधित किया गया था तो पुनः एपीथेलिलाइजेशन बेफिक्र था। 3 डीपीआई पर नियंत्रण की इम्यूनोफ्लोरोसेंट छवियां(ए)और एसटीजी, एफजेडआरआरएनएआई (बी)। एपिथेलियल न्यूक्लियी और सेप्टेट जंक्शनों को क्रमशः जीआरएच (ग्रीन) और फासीआईआई (मजेंटा) से दाग दिया गया था। (ए' और बी') अकेले FasIII धुंधला से पता चला है कि एसटीजी, एफजेडआरआरएनएआई एपिथेलियम में पुनः एपिथेलाइजेशन (लाल तीर) बिगड़ा हुआ था। स्केल बार = 50 माइक्रोन (C)पुनः एपिथेलाइजेशन दोषों का मात्राकरण (%) 3 डीपीआई (ग्रे) पर: नियंत्रण (एन = 8), एसटीजी, एफजेडआरआरएनएआई (एन = 6)। त्रुटि सलाखों मानक त्रुटि का संकेत मिलता है; सांख्यिकीय महत्व छात्र के टी-टेस्ट, * * पी & 0.01 के माध्यम से मापा गया था। घाव की मरम्मत के दौरान पुनः एपीथिलाइजेशन का पता ईपीआई-Gal4, यूएएस-mCD8-RFP का उपयोग करके झिल्ली से जुड़े आरएफपी की अभिव्यक्ति द्वारा भी लगाया जा सकता है। (घ)नियंत्रण की इम्यूनोफ्लोरोसेंट छवियां, E2F1आरएनएआई,आरएसीडीएन,और एसटीजी, एफजेडआरआरएनएआई 3 डीपीआई पर। स्केल बार = 20 माइक्रोन। घाव पपड़ी (पीले रंग की रूपरेखा) और खुला एपिथेलियल घाव क्षेत्र (लाल रूपरेखा)। (ई)सीटीआरएल में घाव बंद होने का क्वांटिफिकेशन (एन = 11), ई2एफ1आरएनएआई,आरएसीडीएन (एन = 13), और एसटीजी, एफजेडआरआरएनएआई (एन = 13)। ग्रेंडलर एट अल16से अनुकूलित । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: WIP के दौरान एंडोरेप्लिकेशन का पता लगाने के तरीके। (A)एडू परख की टाइमलाइन: वयस्क ड्रोसोफिला को चोट से 2 दिन पहले हर दिन 5 एमएम यीस्ट-एडू के 75 माइक्रोन खिलाए जाते थे और 2 डीपीआई तक जारी रहते थे। (ख)फ्लाई स्ट्रेन में एडू लेबल की इम्यूनोफ्लोरोसेंट छवियां 2 डीपीआई पर epi-Gal4/UAS प्रणाली के साथ व्यक्त की गई हैं । घाव पपड़ी (डब्ल्यू)। स्केल बार = 50 माइक्रोन (C)2 डीपीआई पर प्रति फ्लाई एडू + एपिथेलियल न्यूक्लियी की औसत संख्या: सीटीआरएल (एन = 37), माईसीआरएनएआई # 1 (एन = 10), और माईक (एन = 8)। त्रुटि सलाखों मानक त्रुटि का संकेत मिलता है; सांख्यिकीय महत्व छात्र के टी-टेस्ट के माध्यम से मापा गया था, * पी एंड एलटी; 0.05, **पी एंड एलटी; 0.01। (घ)एपिथेलियल न्यूक्लियर प्लॉयडी का पता लगाने और मापन की योजनाबद्ध। एपिथेलियल नाभिक की पहचान की गई थी और फिजी में विरोधी जीआरएच दाग द्वारा सीमा की गई थी। अतिव्यापी एपिथेलियल नाभिक को अलग किया गया (हरे तीर) या हटा दिया गया (लाल एरोहेड) यदि नोपिथेलियल नाभिक द्वारा मढ़ा जाता है। इसी DAPI दाग नाभिक छवि के एकीकृत घनत्व और परमाणु क्षेत्र मापा गया । (ई)एपिथेलियल न्यूक्लियर साइज (जीएचएच) को 3 डीपीआई पर माईसी एक्सप्रेशन ने बदल दिया था । (एफ)एपिथेलियल न्यूक्लियर प्लॉइडी (%) 3 डीपीआई पर: सीटीआरएल (एन = 4), माईसीआरएनएआई #1 (एन = 6), और माईक (एन = 3)। ग्रेंडलर एट अल16से अनुकूलित । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

प्रस्तुत कैसे विच्छेदन और वयस्क डी मेलनोगेस्टर पेट एपिथेलियम का उपयोग करने के लिए अध्ययन कैसे जीन घाव की मरंमत16के दौरान फिर से epithelialization और अंतःकरण में फेरबदल करके WIP को विनियमित करने पर एक विस्तृत प्रोटोकॉल है । इस विधि का उपयोग करते हुए, प्रोटो-ऑन्कोजीन माइक को हाल ही में WIP के एक प्रमुख नियामक के रूप में पहचाना गया था। माईक के लिए एपिथेलियल कोशिकाओं के लिए चोट के बाद एंडोरेंट करने की आवश्यकता होती है और यह वयस्क फ्लाई एपिथेलियम और सहायक ग्रंथियों16,22दोनों में अंत : एपिथेलियल कोशिकाओं को एंडोसाइकिल करने के लिए पर्याप्त है । यह भी पाया गया कि एसटीजी की अभिव्यक्ति द्वारा एपिथेलियल कोशिकाओं को मिटोटिक सेल चक्र में स्विच करना, एफजेडआरआरएनएआई घाव की मरम्मत के लिए हानिकारक है। इस विधि का उपयोग कर जारी अध्ययन WIP के दौरान पुनः epithelialization और अंतःकरण को विनियमित करने के लिए आवश्यक अन्य जीन की पहचान करेगा, दोनों समानताएं और मतभेदों को उजागर कैसे पॉलीप्लाइडी विनियमित है और ऊतकों की एक किस्म में कार्य करता है ।

यह मॉडल और विधि एक यांत्रिक पंचर के साथ पॉलीप्लाइडी के आसान शामिल होने और तथ्य यह है कि पॉलीप्लॉयड कोशिकाओं को4दिनों के भीतर उत्पन्न कर रहे हैं सहित अद्वितीय लाभ प्रदान करते हैं। ऊतक विच्छेदन और तैयारी प्रोटोकॉल लार्वा विच्छेदनतकनीकों परआधारित हैं, लेकिन वयस्क फ्लाई पेट अधिक कठोर है और इसलिए आसानी से परेशान है। नतीजतन, इस प्रोटोकॉल को WIP का अध्ययन करने के लिए एक अक्षुण्ण ऊतक को अलग करने के लिए अभ्यास और परिशुद्धता की आवश्यकता होती है। एक बार विच्छेदन होने के बाद, हालांकि, एपिथेलियम स्पष्ट रूप से दिखाई देता है और आसानी से चित्रित होता है, जिससे घाव भरने की प्रक्रिया का स्नैपशॉट होता है। यह विधि वयस्क फ्लाई के एपिथेलियल संगठन, सेल और सिंक्टियम आकार, और कोशिकाओं और व्यक्तिगत नाभिक की प्लॉयडी के बारे में जानकारी का खजाना प्रदान करती है। जबकि लाइव इमेजिंग अभी तक अपने अपारदर्शी क्यूटिकल के कारण अक्षुण्ण फल मक्खी के भीतर संभव नहीं है, इस प्रोटोकॉल को वर्तमान में उपलब्ध पूर्व वीवो संस्कृति शर्तों को शामिल करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है जो अल्पकालिक लाइव इमेजिंग अध्ययन24करने के लिए डी मेलानोगास्टर में उपयोग किया जाता है।

भविष्य में, यह मॉडल सेल-टू-सेल क्रॉसटॉक का अध्ययन करने और अन्य सेल प्रकारों के योगदान को अन्य सेल प्रकारों में Gal4/UAS प्रणाली के साथ जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करके WIP में आदर्श होगा । इसी तरह के सवालों के जवाब भी कई तरह की जेनेटिक और म्यूटेंट बैकग्राउंड का इस्तेमाल कर सकते हैं । विच्छेदित वयस्क फ्लाई पेट में विभिन्न प्रकार के सेल प्रकार होते हैं जिन्हें वसा शरीर और ओनोसाइट्स, पार्श्व मांसपेशी फाइबर, संवेदी न्यूरॉन्स, ट्रेकिया और मैक्रोफेज जैसे हेमोसाइट्स सहित इस विधि का उपयोग करके आसानी से कल्पना की जा सकती है। इसके अलावा, यह मॉडल शोधकर्ताओं को यह जांच करने की अनुमति देगा कि शारीरिक चर सेक्स, आहार, संक्रमण, उम्र और पर्यावरणीय तनाव सहित WIP को कैसे प्रभावित करते हैं। जबकि प्रोटोकॉल अपने बड़े आकार के कारण वयस्क मादा फ्लाई का उपयोग करता है, WIP पुरुष फल फ्लाई (Gjelsvik और Losick, अप्रकाशित) में भी होता है। स्तनधारी जिगर, मस्तिष्क, आंख और दिल12में उम्र बढ़ने और उम्र से जुड़ी बीमारी के दौरान पॉलीप्लाइड कोशिकाएं उत्पन्न पाई गई हैं । फ्रूट फ्लाई मॉडल शोधकर्ताओं को शारीरिक और रोग के संदर्भों में पॉलीप्लॉयाइजेशन का अध्ययन करने में सक्षम बनाएगा क्योंकि मानव रोग से संबंधित जीन अत्यधिक संरक्षित हैं ।

Disclosures

कोई नहीं।

Acknowledgments

बोस्टन कॉलेज में, हम बुनियादी ढांचे और समर्थन के लिए बोस्टन कॉलेज इमेजिंग कोर में इमेजिंग और Bret Judson के लिए अपनी प्रयोगशाला के कैमरे और स्टीरियोस्कोप माइक्रोस्कोप सेटअप के उपयोग के लिए डॉ एरिक Folker शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । हम फ्लाई सामुदायिक संसाधनों का भी शुक्रिया अदा करना चाहेंगे: ब्लूमिंगटन ड्रोसोफिला स्टॉक सेंटर (NIH P40OD018537), वियना ड्रोसोफिला रिसोर्स सेंटर, और हार्वर्ड मेडिकल स्कूल में TRiP केंद्र (NIH/NIGMS R01-GM084947) इस अध्ययन में इस्तेमाल ट्रांसजेनिक स्टॉक प्रदान करने के लिए । माउस FasIII एंटीबॉडी एनआइएच के NICHD द्वारा समर्थित विकासात्मक अध्ययन Hybridoma बैंक से प्राप्त किया गया था और आयोवा विश्वविद्यालय, जीव विज्ञान विभाग, आयोवा सिटी, आईए में बनाए रखा । इस प्रकाशन में सूचित शोध पुरस्कार संख्या R35GM124691 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के राष्ट्रीय सामान्य चिकित्सा विज्ञान संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था । सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करता है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm Petri dishes Fisher Scientific FB0875713 For creating plates to dissect in
50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-432-22 For preparing staining reagents in
AxioImager M2 with Apotome Zeiss NA For imaging samples
Blowgun mini Genesee Scientific 54-104M For anethesizing D. melanogaster strains
Bovine Serum Albumin, 30% Sigma A7284-500ML For immuostaining
Carbon dioxide tank various distributors N/A For anethesizing D. melanogaster strains
Click-iT EdU 594 Kit Thermofisher C10339 For EdU assay
Coverslips Thermofisher 3406 For mounting
DAPI Sigma D9542-10MG For immuostaining
Dissecting Plates (use Sylgard 184 Sil Elastic Kit) Ellsworth Adhesives 184SIL For creating plates to dissect in. Mix epoxy as directed, let dry overnight
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Thermofisher A21206 For secondary immuostaining
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 conjugate Thermofisher A10042 For secondary immuostaining
Drosophila tubing and fittings Genesee Scientific 59-124C, 59-123, 59-140 For anethesizing D. melanogaster strains
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20 For dissecting
epi-Gal4 Bloomington Drosophila Stock Center (b) b38793 Losick et al. Current Biology, 2013
epi-Gal4, UAS-mCD8.RFP Bloomington Drosophila Stock Center (b) b38793, b27392 Losick et al. Current Biology, 2013
Excel Microsoft For performing ploidy calculations
Fiji/ImageJ (image analysis software) NIH https://imagej.nih.gov/ij For image analysis
Fly food Archon Scientific N/A Corn Syrup/Soy food
Flystuff Flypad Genesee Scientific 59-114 For anethesizing D. melanogaster strains
Glass dissecting dish Fisher Scientific 13-748B For performing dissections in
Glass slides Fisher Scientific 12-518-104C For mounting
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Thermofisher A11001 For secondary immuostaining
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 conjugate Thermofisher A11031 For secondary immuostaining
Grace's Insect Medium, unsupplemented Thermofisher 11595030 For dissecting in
Insect pins Fine Science Tools 26002-10 For wounding and pinning fly abdomens flat
Mouse anti-Fasciclin III (Drosophila) Primary Antibody Developmental Studies Hybridoma Bank 7G10 For immunostaining epithelial cell-cell junctions
Mouting media Vector Laboratories H-1000 Anti-fade mounting media to prevent photo bleaching during imaging
Nail polish Electron Microscopy Sciences 72180 For sealing slides
Ortibal shaker Fisher Scientific 02-217-988 For immuostaining
Phosphate Buffered Saline, PH 7.4 Sigma P3813-10PAK For staining
Pin holders Fine Science Tools 91606-07 For wounding
Rabbit anti-Grainyhead Primary Antibody N/A N/A For immunostaining epithelial nuclei. Protocol to make antibody can be found (Ref. #4 and 8)
Rabbit anti-RFP Primary Antibody MBL PM005 For immunostaining mCD8-RFP fly epithelium
Stereomicroscope Olympus SZ51 For dissecting and mounting fly tissue
Triton X-100 Sigma 10789704001 For immuostaining
UAS-E2F RNAi, UAS-RacDN VDRC (v) and Bloomington Drosophila Stock Center (b) v108837, b6292 Losick et al. Current Biology, 2013
UAS-fzr RNAi, UAS-Stg VDRC (v) and Bloomington Drosophila Stock Center (b) v25550, b56562 Grendler et al. Development, 2019
UAS-Myc Bloomington Drosophila Stock Center (b) b9674 Grendler et al. Development, 2019
UAS-myc RNAi Bloomington Drosophila Stock Center (b) b36123 Grendler et al. Development, 2019
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-00 For dissecting

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References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 160 घाव भरने ऊतक मरम्मत एंडोरेप्लिकेशन पॉलीप्लाइडी माईक ड्रोसोफिला
घाव-प्रेरित पॉलीप्लाइडाइजेशन का अध्ययन करने के लिए एक <em>ड्रोसोफिला</em> मॉडल
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Bailey, E. C., Dehn, A. S., Gjelsvik, K. J., Besen-McNally, R., Losick, V. P. A Drosophila Model to Study Wound-induced Polyploidization. J. Vis. Exp. (160), e61252, doi:10.3791/61252 (2020).

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