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Neuroscience

साइटोसोलिक कैल्शियम मापन और कैल्शियम इमेजिंग अध्ययन के लिए मस्तिष्क केपिलरी पेरिसिटस की संस्कृति

doi: 10.3791/61253 Published: May 27, 2020

Summary

मस्तिष्क केशिका पेरिसाइट्स रक्त-मस्तिष्क बाधा गुणों और रक्त प्रवाह के नियमन में आवश्यक खिलाड़ी हैं। यह प्रोटोकॉल बताता है कि मस्तिष्क केशिका पेरिसाइट्स को अलग, सुसंस्कृत, कोशिका प्रकार के संबंध में विशेषता और फ्लोरोसेंट जांच के साथ इंट्रासेलुलर कैल्शियम सिग्नलिंग की जांच के लिए कैसे लागू किया जा सकता है।

Abstract

पेरिसाइट्स न्यूरोवैस्कुलर यूनिट (एनवीयू) के रूप में जानी जाने वाली संरचना में एंडोथेलियल कोशिकाओं और एस्ट्रोसाइटिक एंडफीट से जुड़े होते हैं। मस्तिष्क केशिका पेरिसाइट फ़ंक्शन पूरी तरह से ज्ञात नहीं है। पेरिसिटस को केशिका विकास, एंडोथेलियल बैरियर जकड़न और ट्रांसिएंटोसिस गतिविधि के नियमन, केशिका टोन के नियमन और कुछ मस्तिष्क विकृतियों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए शामिल होने का सुझाव दिया गया है ।

मस्तिष्क परेन्चिमा में प्रक्रियाओं की कल्पना में कठिनाइयों के साथ-साथ एनवीयू की अन्य कोशिकाओं के करीब निकटता के कारण पेरिसाइट्स अक्षुण्ण मस्तिष्क में जांच करना चुनौतीपूर्ण हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल अलगाव और प्राथमिक गोजातीय मस्तिष्क केशिका pericytes की संस्कृति और कैल्शियम इमेजिंग अध्ययन में उनके निम्नलिखित उपयोग के लिए एक विधि का वर्णन करता है, जहां मस्तिष्क संकेत और विकृतियों में शामिल agonists के प्रभाव की जांच की जा सकती है । कॉर्टिकल केशिका के टुकड़ों को संस्कृति फ्लास्क के नीचे से संलग्न करने की अनुमति है और, 6 दिनों के बाद, एंडोथेलियल कोशिकाएं और पेरिसाइट्स केशिका टुकड़ों से बाहर हो गए हैं। एंडोथेलियल कोशिकाओं को कोमल ट्राइप्सिनाइजेशन द्वारा हटा दिया जाता है और पारिसाइट्स को पास बढ़ने से पहले 5 अतिरिक्त दिनों के लिए सुसंस्कृत किया जाता है।

अलग पेरिसाइट्स को 96-अच्छी संस्कृति प्लेटों में वरीयता प्राप्त किया जाता है और प्लेट रीडर सेटअप में इंट्रासेलुलर कैल्शियम के स्तर के माप के लिए अनुमति देने के लिए कैल्शियम इंडिकेटर डाई (फ्यूरा-2 एसीटॉक्सीमिथिल (एएम) से भरा हुआ है। वैकल्पिक रूप से, पेरिसाइट्स को कवरस्लिप पर वरीयता दी जाती है और सेल कक्षों में घुड़सवार किया जाता है। कैल्शियम इंडिकेटर (सीएएल-520 AM) के साथ लोड होने के बाद, कैल्शियम लाइव-इमेजिंग 488 एनएम की उत्तेजन तरंगदैर्ध्य और 510-520 एनएम की उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य पर कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके किया जा सकता है।

यहां वर्णित विधि प्राथमिक मस्तिष्क केशिका पेरिसाइट्स से पहले इंट्रासेलुलर कैल्शियम माप प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, यह प्रदर्शित करता है कि पेरिसाइट्स एटीपी के माध्यम से उत्तेजित होते हैं और विट्रो में अनुबंध करने में सक्षम होते हैं।

Introduction

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मस्तिष्क केशिका पेरिसाइट्स, एंडोथेलियल कोशिकाओं और एस्ट्रोसाइट्स के साथ, एनवीयू1,2,3 कागठनकरते हैं। एंडोथेलियल कोशिकाएं, जो केशिकाओं का संरचनात्मक आधार बनाती हैं, 5-8 माइक्रोन के व्यास के साथ लंबी बेलनाकार ट्यूब बनाती हैं। एंडोथेलियल कोशिकाएं कई मायनों में पेरिसाइट्स से ढकी होती हैं और एस्ट्रोसाइट्स से फलाव से घिरी होती हैं; एस्ट्रोसाइट एंडफीट।

मस्तिष्क केशिकाओं में स्थित रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) मस्तिष्क और रक्त के बीच पोषक तत्वों, गैसों और अपशिष्ट उत्पादों के आदान-प्रदान के लिए मुख्य स्थल है । बीबीबी मस्तिष्क को अंतर्जात और एक्सोजेनस न्यूरोटॉक्सिन से भी बचाता है और बड़ी संख्या में दवा यौगिकों के वितरण के लिए एक बाधा के रूप में कार्य करता है। बैरियर फ़ंक्शन केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) दवाओं के विकास वाली दवा कंपनियों के लिए एक फोकस क्षेत्र है, साथ ही एक बाधा है। इससे संस्कृति4में एनवीयू की कोशिकाओं की जांच करने में बड़ी रुचि बढ़ी है . मस्तिष्क एस्ट्रोसाइट्स और एंडोथेलियल कोशिकाओं को कई अध्ययनों में सुसंस्कृत और विशेषता दी गई है, जबकि पेरिसाइट संस्कृति के लिए अध्ययन और प्रोटोकॉल विरल हैं।

पहले प्रकाशित प्रोटोकॉलों में मस्तिष्क केशिका पेरिसाइट संस्कृतियों की पीढ़ी को कुछ हद तक वर्णित किया गया है, जिसमें इम्यूनोपैनिंग5,उच्च और कम ग्लूकोज मीडिया6,फ्लोरोसेंट-सक्रिय सेल छंटाई7,घनत्व ढाल अपकेंद्रितरण8आदि जैसे विभिन्न दृष्टिकोणों की एक श्रृंखला का उपयोग करके। यद्यपि ये विधियां पेरिसाइट्स की संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए पर्याप्त लगती हैं, कुछ समय लेने वाली होती हैं, लागत महंगी होती है और प्राप्त पेरिसाइट्स संस्कृति मार्गों की संख्या के कारण आदर्श नहीं हो सकते हैं जो पेरिसाइट्स9को डी-अंतर कर सकते हैं। इसके अलावा, इन विट्रो सिग्नलिंग अध्ययनों में सुसंस्कृत पेरिसाइट्स की क्षमता अब तक काफी बेरोज़गार है।

वर्तमान कार्य अलग गोजातीय मस्तिष्क केशिकाओं से पेरिसाइट संस्कृतियों की पीढ़ी और इंट्रासेलुलर कैल्शियम में परिवर्तन के माप और इमेजिंग अध्ययन के लिए बाद के सेटअप पर केंद्रित है, जो एक महत्वपूर्ण इंट्रासेलुलर दूसरा दूत है। हम संक्षेप में कॉर्टिकल ग्रे मैटर से केशिकाओं के अलगाव का वर्णन करते हैं (विवरण के लिए हेल्म्स एट अल10देखें) और एंडोथेलियल या ग्लियल कोशिकाओं के साथ संदूषण के बिना शुद्ध मोनोकल्चर में पेरिसाइट्स की अलगाव और संस्कृति। इसके बाद हम कैल्शियम प्रोब फ्यूरा-2 एएम के लिए 96-वेल प्लेटों और लोडिंग प्रोटोकॉल में पेरिसाइट्स के सीडिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। अंत में, हम दिखाते हैं कि माइक्रोस्कोप संस्कृति कक्षों में वास्तविक समय कॉन्फोकल इमेजिंग में पेरिसाइट्स का उपयोग कैसे किया जा सकता है और इसके लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।

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Protocol

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1. सेल खेती के लिए बफ़र्स और समाधान की तैयारी

  1. पीबीएस के 50 एमएल में मानव नाल से 5 मिलीग्राम कोलेजन चतुर्थ को 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर भंग करके कोलेजन स्टॉक समाधान तैयार करें। स्टॉक समाधान को 5 एमएल भागों में अलीकोट करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. रात भर बाँझ पानी के 5 मिलीग्राम फाइब्रोनेक्टिन में 5 मिलीग्राम फाइब्रोनेक्टिन को घोलकर फाइब्रोनेक्टिन स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर 500 माइक्रोन के एलिकोट्स में फाइब्रोनेक्टिन स्टॉक्स स्टोर करें। विगलन करते समय, काम समाधान तैयार करने के लिए 50 एमएल की अंतिम मात्रा में पीबीएस जोड़ें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), एमईएम गैरसंयोजीय अमीनो एसिड के 5 एमएल और पेनिसिल के 5 एमएल जोड़कर दुलबेको का संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम) पूर्ण माध्यम तैयार करें डीएमईएम के 500 एमएल तक स्ट्रेप्टोमाइसिन (0.1 ग्राम/एल स्ट्रेप्टोमाइसिन सल्फेट और 100,000 यू/एल पेनिसिलिन जी सोडियम) ।
  4. पीबीएस में हेपरिन सोडियम नमक को घोलकर 5 मिलीग्राम/एमएल हेपरिन स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करें और इसे नसबंदी के लिए ०.२ माइक्रोन फिल्टर के जरिए पास करें । स्टॉक सॉल्यूशन को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. उपयोग से तुरंत पहले विकास माध्यम (जीएम) तैयार करें; डीएमईएम-कॉम्प के 10 एमएल और 250 माइक्रोन का मिलाएं हेपरिन स्टॉक समाधान प्रति T75-फ्लास्क।

2. ताजा गोजातीय मस्तिष्क से केशिकाओं का अलगाव

नोट: गोजातीय मस्तिष्क केशिकाओं अलग और सुसंस्कृत के रूप में पहले वर्णित है (Helms एट अल10)

  1. बछड़ों से दिमाग ले लीजिए, 12 महीने से अधिक उम्र का कोई पुराना नहीं, एक कसाईघर से और सीधे बर्फ पर प्रयोगशाला में ले आओ ।
  2. मेनिंग्स को हटा दें और स्केलपेल का उपयोग करके मस्तिष्क से सभी ग्रे मैटर एकत्र करें। अपने भूरे रंग से मस्तिष्क और ग्रे पदार्थ को कवर फिल्म के रूप में meninges की पहचान करें ।
  3. दुलबेको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) में ग्रे मैटर को समरूप बनाने के लिए 40 एमएल डूंस टिश्यू ग्राइंडर का उपयोग करें। टिशू ग्राइंडर के स्लिम पार्ट को ग्रे मैटर सस्पेंशन के साथ भरें और जब तक स्लिम पार्ट भर न जाए तब तक डीएमईएम डालें।
  4. 160 माइक्रोन नायलॉन नेट फिल्टर के माध्यम से समरूप के निस्पंदन द्वारा मुफ्त कोशिकाओं और छोटे ऊतक टुकड़ों से केशिकाओं को अलग करें। डीएमईएम-कॉम्प के साथ फिल्टर फ्लश करें। केशिकाओं को पुनः प्राप्त करें और निलंबन को 50 एमएल सेंट्रलाइजिंग ट्यूबों में पूल करें।
  5. डीएमईएम-कॉम्प में केशिकाओं को फिर से खर्च करें और DNase I (170 यू/एमएल), कोलेजनेस टाइप III (200 यू/एमएल) और ट्राइप्सिन (90 यू/एमएल) का एंजाइम मिश्रण जोड़ें। केशिकाओं के पाचन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में 1 घंटे के लिए निलंबन छोड़ दें।
  6. 10% डिमेथाइल सल्फॉक्साइड (डीएमएसओ) के साथ एफबीएस में 200 माइक्रोन मेश फिल्टर और रिसिपेंड के माध्यम से निलंबन चलाएं। -80 डिग्री सेल्सियस पर रात भर केशिकाओं को फ्रीज करें और उन्हें लंबे समय तक भंडारण के बाद दिन में तरल नाइट्रोजन में ले जाएं।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है ।

3. बोजातीय केशिकाओं की सीडिंग और खेती

  1. दिन 0: पीबीएस के 6.3 एमएल के साथ कोलेजन चतुर्थ स्टॉक के 0.7 एमएल मिलाएं। एक T75-फ्लास्क के लिए समाधान जोड़ें और कमरे के तापमान (आरटी) पर 2 घंटे के लिए फ्लास्क छोड़ दें या इसे रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें।
  2. फ्लास्क से कोलेजन समाधान निकालें और पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
  3. फाइब्रोनेक्टिन वर्क सॉल्यूशन का 7 एमएल जोड़ें और आरटी में 30 मिनट के लिए फ्लास्क छोड़ दें। फिर, फाइब्रोनेक्टिन समाधान निकालें और तुरंत बाद केशिकाओं को बीज करें।
  4. 30 मिनट प्रतीक्षा समय के दौरान, 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में केशिकाओं की एक शीशी गल।
  5. जब केशिकाएं गल जाती हैं, तो 500 एक्स जी और आरटी में 5 मिनट के लिए डीएमईएम-कॉम्प और सेंट्रलाइज के 30 एमएल के साथ एक सेंट्रलाइजेशन ट्यूब पर तुरंत स्थानांतरित करें। DMEM-comp को ट्यूब से हटा दें और ताजा डीएमईएम-कॉम्प के 10 एमएल में केशिका-गोली को फिर से निलंबित करें।
  6. 10 एमएल निलंबन को लेपित T75-फ्लास्क में स्थानांतरित करें और केशिका को 10% सीओ2पर 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 4-6 घंटे के लिए फ्लास्क के नीचे का पालन करने के लिए छोड़ दें।
    नोट: सेल विकास दर पारंपरिक 5% सीओ2 के बजाय 10% सीओ2पर अधिक है ।
  7. इनक्यूबेशन के 4-6 घंटे के बाद एक हल्के माइक्रोस्कोप के नीचे फ्लास्क का निरीक्षण करें। केशिकाओं के अंशों को अब फ्लास्क(चित्रा 1,दिन 0) के नीचे से जोड़ा जाना चाहिए।
  8. जीएम तैयार करें और DMEN-comp माध्यम को केशिकाओं से बहुत सावधान करें और इसे 10 एमएल के साथ बदलें हौसले से बने जीएम।
  9. दूसरा दिन: केशिकाओं से जीएम को हटाएं और हौसले से बने जीएम के 10 एमएल के साथ बदलें। केशिकाओं से सेलुलर आउटग्रोथ इस बिंदु पर एक हल्के माइक्रोस्कोप के नीचे दिखाई देना चाहिए(चित्रा 1,दिन 2-3)।

4. गोजातीय मस्तिष्क केशिकाओं से प्राथमिक pericytes के अलगाव

  1. 4 दिन: एक हल्के माइक्रोस्कोप के नीचे केशिकाओं का निरीक्षण करें।
    नोट: फ्लास्क अब लगभग 60-70% अनुकूल होना चाहिए ताकि उचित मात्रा में पेरिसाइट्स(चित्र 1,दिन 4) प्रदान किया जा सके। यदि यह मामला नहीं है; जीएम को ताजा माध्यम के 10 एमएल से बदलें और इनक्यूबेटर में फ्लास्क को दूसरे दिन के लिए छोड़ दें ।
  2. माध्यम को एस्पिरेट करें और पीबीएस में कोशिकाओं को धीरे से धोएं।
  3. एंडोथेलियल कोशिकाओं के लिए गल ट्रिपसिन-ईडीटीए का 2 मिलीएल जोड़ें और इनक्यूबेटर में फ्लास्क को 1-3 मिनट के लिए छोड़ दें। फ्लास्क को अक्सर बाहर निकालें और इस समय अवधि के दौरान माइक्रोस्कोप के साथ निरीक्षण करें।
    नोट: एंडोथेलियल कोशिकाओं को गोल करना चाहिए और फ्लास्क से अलग करना चाहिए; पेरिसाइट्स को "भूत"-आकृति विज्ञान के साथ कोशिकाओं के रूप में दिखाई देना चाहिए और अभी भी फ्लास्क की सतह से जुड़ा होना चाहिए। यह एक मुश्किल और महत्वपूर्ण कदम है । पेरिसाइट मोनोकल्चर के प्रदूषण से बचने के लिए अधिकांश एंडोथेलियल कोशिकाओं को हटाना आवश्यक है, लेकिन लंबे समय तक ट्राइप्सिनाइजेशन भी पेरिसाइट्स को अलग कर सकता है। ट्राइप्सिनाइजेशन समय समय-समय पर थोड़ा भिन्न हो सकता है, और इसलिए उपचार के दौरान माइक्रोस्कोप के साथ अक्सर फ्लास्क का निरीक्षण करना अत्यंत महत्वपूर्ण है।
  4. धीरे-धीरे फ्लास्क को टैप करें, जब एंडोथेलियल कोशिकाओं ने गोल करना शुरू कर दिया है, तो ढीली एंडोथेलियल कोशिकाओं को अलग करने के लिए।
  5. ट्राइपसिनाइजेशन को रोकने के लिए, फ्लास्क में डीएमईएम-कॉम्प के 10 एमएल जोड़ें। एंडोथेलियल कोशिकाओं को हटाने के लिए माध्यम के साथ कई बार फ्लास्क को सावधानी से फ्लश करें। फ्लास्क से एंडोथेलियल सेल सस्पेंशन को एस्पिरेट करें। एंडोथेलियल कोशिकाओं का उपयोग अब अन्य उद्देश्यों के लिए किया जा सकता है।
  6. फ्लास्क में डीएमईएम-कॉम्प का 10 एमएल जोड़ें। पेरिसाइट्स को आश्वस्त करने के लिए प्रकाश माइक्रोस्कोप के नीचे देखें अभी भी मौजूद हैं और नीचे से जुड़े हैं। फ्लास्क को वापस इनक्यूबेटर में रखें ताकि पेरिसाइट-समृद्ध संस्कृति को बढ़ने दिया जा सके।
    नोट: अगले दिनों के दौरान संस्कृति का पालन करना महत्वपूर्ण है। यदि अभी भी एंडोथेलियल कोशिकाओं की उचित मात्रा है जो एक और ट्राइप्सिन-उपचार को बढ़ा रही है।
  7. डीएमईएम-कॉम्प के परिवर्तन के साथ पेरिसाइट मोनोकल्चर को बढ़ने दें। मध्यम हर दूसरे दिन। प्रकाश माइक्रोस्कोप(चित्रा 1, दिन 5-8)के तहत कोशिकाओं के विकास की जांच करें।

5. प्राथमिक गोजातीय पेरिसाइट्स की मोनोकल्चर का उत्पादन और भंडारण

  1. दिन 8-9: एक हल्के माइक्रोस्कोप के तहत केशिकाओं का निरीक्षण करें
    नोट: pericytes अब 70-80% मांग तक पहुंच जाना चाहिए और फ्लास्क में द्वीपों में वृद्धि(चित्रा 1,दिन 9) । यदि पेरिसाइट्स की व्यापकता 70% से कम है, तो कोशिकाओं को एक और दिन के लिए बढ़ने दें। पेरिसाइट्स एंडोथेलियल कोशिकाओं के रूप में एक पूर्ण मोनोलेयर नहीं बनाएगा।
  2. डीएमईएम-कॉम्प को एस्पिरेट करें और पीबीएस के 7 एमएल के साथ पेरिसाइट्स को धोएं।
  3. फ्लास्क में ट्राइपसिन-ईडीटीए के 2 एमसीएल जोड़ें और इसे 2-3 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में छोड़ दें। जब पेरिसाइट्स गोल करते हैं और फ्लास्क से अलग हो जाते हैं तो फ्लास्क को प्रकाश माइक्रोस्कोप के नीचे अक्सर रखें। जब पेरिसाइट्स गोल करने लगे हैं, तो कोशिकाओं को अलग करने के लिए फ्लास्क को धीरे से टैप किया जा सकता है।
  4. धीरे-धीरे फ्लास्क को टैप करें, जब पेरिसाइट्स ने कोशिकाओं को अलग करने के लिए गोल करना शुरू कर दिया है।
  5. ट्राइप्सिनाइजेशन प्रक्रिया को रोकने के लिए फ्लास्क में डीएमईएम-कॉम्प की 10 एमएल जोड़ें। पिछले पेरिसाइट्स को अलग करने में मदद करने के लिए माध्यम के साथ कई बार फ्लास्क फ्लश करें।
  6. 12 एमएल सेल सस्पेंशन को 50 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में ट्रांसफर करें और डीएमईएम-कॉम्प के साथ 30 एमएल तक भरें।
  7. 500 x g और RT. DMEM-comp पर 5 मिनट के लिए सेल निलंबन अपसेंट्राइज। सेल पेलेट को छुए बिना ध्यान से। 10% DMSO के साथ एफबीएस के 3 एमसीएल में सेल गोली को फिर से खर्च करें।
  8. कोशिका निलंबन को क्रायोवियल्स में स्थानांतरित करें; प्रत्येक में 1 एमएल जोड़ें, इसलिए पेरिसाइट्स के टी 75-फ्लास्क प्रति कुल 3 शीशियों होंगे। पेरिसाइट्स को रात भर -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें और उन्हें लंबे समय तक भंडारण के बाद दिन में तरल नाइट्रोजन में ले जाएं।
    नोट: कोशिकाओं को अस्तित्व प्रतिशत के बाद के अनुमान के लिए ठंड से पहले गिना जा सकता है । यहां प्रोटोकॉल को रोका जा सकता है।

6. प्रयोगों के लिए एक पेरिसाइट मोनोकल्चर स्थापित करना

  1. खंड 3.1-3.4 में उल्लिखित एक ही प्रक्रिया का उपयोग करके कोलेजन चतुर्थ और फाइब्रोनेक्टिन के साथ एक T75-फ्लास्क कोट करें।
  2. जबकि फ्लास्क को फाइब्रोनेक्टिन से लेपित किया जा रहा है, 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में पेरिसाइट्स की एक शीशी गल रही है।
  3. अब गल गए पेरिसाइट्स को क्रायोवियल से डीएमईएम-कॉम्प के 30 एमएल के साथ सेंट्रलाइज्ड ट्यूब में स्थानांतरित करें। 500 x g,आरटी पर 5 मिनट के लिए सेल निलंबन सेंट्रलाइज करें।
  4. ध्यान से माध्यम को आकांक्षी, ट्यूब के नीचे सेल गोली छोड़। 10 एमएल डीएमईएम-कॉम्प में गोली को फिर से सस्पेंड करें।
  5. लेपित फ्लास्क में सेल निलंबन को इकट्ठा करें और स्थानांतरित करें। 10% सीओ 2 पर 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में बढ़ने के लिए पेरिसाइट्स के साथ फ्लास्क छोड़दें।
  6. हर दूसरे दिन, ताजा DMEM-comp के 10 एमएल के साथ माध्यम ताज़ा।
    नोट: विकास के 5 दिनों के बाद, पेरिसाइट्स लगभग 80% की आपूर्ति तक पहुंच जाना चाहिए था। यदि संकुचितता कम है, तो कोशिकाओं को एक या दो दिन के लिए बढ़ने के लिए छोड़ दें। कोशिकाओं को अब आगे के प्रयोगों के लिए सीडिंग के लिए तैयार रहना चाहिए ।

7. एक लेपित 96-अच्छी प्लेट में पेरिसाइट्स की सीडिंग

  1. तनु कोलेजन चतुर्थ के रूप में कदम 3.1 में वर्णित है। एक 96-अच्छी तरह से प्लेट में प्रत्येक अच्छी तरह से 100 μL जोड़ें और आरटी में या रात 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  2. समाधान को एस्पिरेट करें और कुओं को पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
  3. प्रत्येक अच्छी तरह से पतला फाइब्रोनेक्टिन के 100 माइक्रोन जोड़ें और 30 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें। फाइब्रोनेक्टिन सॉल्यूशन निकालें और तुरंत प्लेट का इस्तेमाल करें।
    नोट: कितनी अच्छी तरह pericyte बैच बढ़ रहा है पर निर्भर करता है, वहां दो प्लेटों बोने के लिए पर्याप्त कोशिकाओं होना चाहिए ।
  4. इनक्यूबेटर से पेरिसाइट्स को बाहर निकालें और माध्यम को एस्पिरेट करें। कोशिकाओं को पीबीएस से धोएं।
  5. पेरिसाइट्स में ट्राइपसिन-ईडीटीए के 2 एमसीएल जोड़ें और चरण 5.3-5.6 के समान प्रक्रिया का पालन करें।
  6. सेल पेलेट को नुकसान पहुंचाए बिना माध्यम को एएसपिरेट करें और ताजा डीएमईएम-कॉम्प के 1 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें।
  7. कक्ष निलंबन के 12 माइक्रोन बाहर ले लो और एक गिनती कक्ष में जोड़ें। प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत, कम से कम 3 में से 3 ग्रिड की गणना करें और प्रति ग्रिड औसत सेल काउंट का उपयोग करें।
  8. नीचे दिए गए समीकरण का उपयोग कोशिका निलंबन की मात्रा की गणना करने के लिए करें जिसे प्रत्येक अच्छी तरह से 96-अच्छी प्लेट में 10.000 कोशिकाओं को अच्छी तरह से बीज में जोड़ा जाना चाहिए।
  9. डीएमईएम-कॉम्प और प्रत्येक कुएं में सेल निलंबन की गणना की गई मात्रा को 200 माइक्रोन की अंतिम मात्रा तक पहुंचने के लिए जोड़ें।
  10. 96-वेल प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 10% सीओ2पर रखें। कोशिकाओं को 2 दिनों के बाद माध्यम के परिवर्तन के साथ 4 दिनों के लिए बढ़ने के लिए छोड़ दें।

8. सीए2 +-इमेजिंग के लिए बफ़र्स और समाधान की तैयारी

  1. ऑटोक्लेव कवरलिप सेल कक्षों और कवरस्लिप।
  2. परख बफर: 10 एमएम एचईपी की अंतिम एकाग्रता के लिए एचबीएसएस बफर के 500 एमएल में 1.19 ग्राम एचईपीएस जोड़ें। पीएच को 7.4 पर समायोजित करें।
  3. एक ग्लास शीशी में 2.5 मिलीएल में 0.5 ग्राम प्लूरोनिक एफ127 घोल को भंग करके 20% (w/v) Pluronic F127 + 1% (v/v) पॉलीथॉक्सिकयुक्त अरंडी तेल स्टॉक समाधान तैयार करें। लगभग 30 मिनट के लिए या भंग और भंवर तक 40 डिग्री सेल्सियस तक गर्मी। पॉलीथॉक्सीलेटेड अरंडी का तेल के 25 माइक्रोन जोड़ें और आरटी में स्टोर करें। फ्रीज न करें।
  4. 2 एमएम फुरका-2 AM स्टॉक को 500 μL में 1 मिलीग्राम घोलकर तैयार करें। प्रकाश से संरक्षित -20 डिग्री सेल्सियस पर 20 माइक्रोन के एलिकोट्स में स्टोर करें।
  5. 2 एम फ्यूरा-2 एएम एलिकोट के 20 माइक्रोन के साथ 20% प्लूरोनिक एफ-127 + 1% पॉलीएथॉक्सीलेटेड अरंडी तेल स्टॉक घोल मिलाकर 5 माइक्रोन फ्यूरा-2 AM लोडिंग सॉल्यूशन तैयार करें। परख बफर और भंवर के 500 μL जोड़ें। 8 एमएल की अंतिम मात्रा में परख बफर जोड़ें। समाधान उपयोग से तुरंत पहले तैयार किया जाना चाहिए और प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए।
  6. 4 m Cal-520 AM को 226.7 में 1 मिलीग्राम भंग करके तैयार करें। प्रकाश से संरक्षित -20 डिग्री सेल्सियस पर 20 माइक्रोन के एलिकोट्स में स्टोर करें।
  7. 20 माइक्रोन कैल-520 AM लोडिंग सॉल्यूशन 20% प्लूरोनिक एफ-127 + 1% पॉलीथॉक्सीलेटेड अरंडी ऑयल स्टॉक सॉल्यूशन को 20 माइक्रोन 4 एमएम कैल-520 एलिकोट के साथ मिलाकर तैयार करें। परख बफर और भंवर के 500 μL जोड़ें। 4 एमएल की अंतिम मात्रा में परख बफर जोड़ें। समाधान उपयोग से तुरंत पहले तैयार किया जाना चाहिए और प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए।

9. एक प्लेट-रीडर सेटअप में फ्यूरा-2 AM कैल्शियम इंडिकेटर डाई के साथ पेरिसाइट्स की लोडिंग

नोट: प्रयोग शुरू होने से पहले सभी समाधान आरटी पर होने चाहिए।

  1. इनक्यूबेटर से कोशिकाओं के साथ ९६ अच्छी थाली बाहर ले लो और कुओं से माध्यम aspirate । कोशिकाओं को परख बफर से दो बार धोएं।
  2. फोटो ब्लीचिंग से बचने के लिए प्रत्येक कुएं में लोडिंग समाधान के 100 माइक्रोल जोड़ें और प्लेट को टिनफॉइल से लपेटें। आरटी में 30 आरपीएम मिलाते हुए ४५ मिनट के लिए इनक्यूबेट ।
    नोट: 37 डिग्री सेल्सियस पर फुरा-2 AM लोड न करें, क्योंकि यह आंतरिक डिब्बों को लोड कर सकता है। बफर लोड करने के बजाय परख बफर में कोशिकाओं के साथ कुओं को छोड़ना याद रखें; ये पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस को मापने के लिए उपयोग किए जाने वाले "रिक्त स्थान" हैं।
  3. लोडिंग बफर को एस्पिरेट करें और कोशिकाओं को दो बार परख बफर से धोएं। ताजा परख बफर के 100 माइक्रोन जोड़ें और कोशिकाओं को आरटी में 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करने के लिए छोड़ दें; यह एएम-एस्टर के निरंतर दरार के लिए अनुमति देता है और इस तरह कोशिकाओं के अंदर फुरा-2 AM को फंसाने की अनुमति देता है।
  4. सीए2 +-इमेजिंग से पहले, बफर को ताजा परख बफर के 100 माइक्रोन के साथ धोएं और प्रतिस्थापित करें।

10. एक प्लेट-रीडर सेटअप में पेरिसाइट्स की अच्छी तरह से प्लेट फ्लोरेसेंस पढ़ना

  1. प्लेट रीडर के तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें और कोशिकाओं के साथ 96-अच्छी प्लेट को नमूना प्लेट स्थिति में स्थानांतरित करें। रिएजेंट प्लेट पोजीशन पर एगोनिस्ट के साथ रिएजेंट प्लेट रखें।
  2. सभी कुओं में फुरा-2 AM की समान लोडिंग सुनिश्चित करने के लिए कोशिकाओं की लोडिंग को मापकर शुरू करें।
  3. 340 एनएम/380 एनएम पर उत्तेजन फ्लोरेसेंस वेवलेंथ और 510 एनएम पर उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य के साथ माप करें। नमूना प्लेट की स्थिति में कोशिकाओं के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से अभिकर्षक प्लेट से 150 μL/
  4. आगे के विश्लेषण के लिए एक्सएलएक्स फाइल के रूप में डेटा और निर्यात को सहेजें। चित्रा 2 साइटोसोलिक सीए2 +-प्रतिक्रिया को समय के साथ दो उत्तेजन तरंगदैर्ध्य के बीच अनुपात के रूप में मापा जाता है, जहां पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस घटाया जाता है।
    नोट: प्लेट-रीडर को "सेल ट्रे" और "नमूना ट्रे" और एक एकीकृत पिपेटर सिस्टम के लिए कमरे के साथ एक दोहरी माइक्रोप्लेट रीडर होने की आवश्यकता है।

11. लाइव इमेजिंग के लिए एक लेपित सेल कक्ष में पेरिसाइट्स की सीडिंग

नोट: कवरस्लिप को संस्कृति कुओं के तल में भी रखा जा सकता है, ऊपर वर्णित पेरिसाइट्स के साथ लेपित और वरीयता प्राप्त है, और फिर प्रयोगों से पहले कक्ष में घुड़सवार किया जा सकता है।

  1. सेल कक्ष में एक कवरलिप माउंट और रिसाव से बचने के लिए इसे तंग करते हैं।
  2. तनु कोलेजन चतुर्थ के रूप में कदम 3.1 में वर्णित है। प्रत्येक कक्ष कक्ष में 500 माइक्रोन जोड़ें और आरटी में 2 घंटे के लिए या रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  3. कोलेजन समाधान को एस्पिरेट करें और पीबीएस के 500 माइक्रोन के साथ कक्षों को तीन बार धोएं।
  4. प्रत्येक अच्छी तरह से पतला फाइब्रोनेक्टिन के 500 माइक्रोन जोड़ें और 30 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें। फाइब्रोनेक्टिन समाधान निकालें और बाद में सीधे सेल चैंबर का उपयोग करें।
  5. इस दौरान, फ्लास्क को कॉन्फ्ल्यूंट पेरिसाइट्स के साथ बाहर निकालें और पीबीएस के 7 एमएल से धोएं।
  6. पेरिसाइट्स में ट्राइपसिन-ईडीटीए के 2 एमसीएल जोड़ें और चरण 5.3-5.6 के समान प्रक्रिया का पालन करें।
  7. चरण 8.6-8.7 में एक ही चरण का पालन करके आगे बढ़ें।
  8. सेल निलंबन की मात्रा की गणना करने के लिए नीचे दिए गए समीकरण का उपयोग करें, जिसे प्रत्येक कक्ष में प्रति कक्ष 90.000 कोशिकाओं को बीज में जोड़ा जाना चाहिए।
  9. डीएमईएम-कॉम्प और प्रत्येक कक्ष में सेल निलंबन की गणना की गई मात्रा को 500 माइक्रोन की अंतिम मात्रा तक पहुंचने के लिए जोड़ें।
  10. इनक्यूबेटर में सेल चैंबर्स को 37 डिग्री सेल्सियस, 10% सीओ2रखें । कोशिकाओं को 6 दिनों (या कॉन्फ्ल्यूरेंट तक) के लिए बढ़ने के लिए छोड़ दें।
    नोट: प्लास्टिक की तुलना में कांच-स्लाइड पर पेरिसाइट्स धीमी गति से बढ़ते हैं; विकास के अधिक दिन आवश्यक हैं।

12. लाइव इमेजिंग के लिए Cal-520 AM कैल्शियम इंडिकेटर डाई के साथ पेरिसाइट्स की लोडिंग

नोट: प्रयोग शुरू होने से पहले सभी समाधान आरटी पर होने चाहिए।

  1. 20 माइक्रोन कैल-520 AM लोडिंग बफर तैयार करें: 20 माइक्रोन 4 एमएम कैल-520 एलिकोट के साथ 20% प्लूरोनिक एफ-127 + 1% पॉलीथॉक्सीलेटेड अरंडी तेल स्टॉक समाधान के 20 माइक्रोनल मिलाएं। μL परख बफर और भंवर के 500 जोड़ें। 4 एमएल की अंतिम मात्रा में परख बफर जोड़ें। समाधान उपयोग से तुरंत पहले तैयार किया जाना चाहिए और प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए।
    नोट: प्रकाश जोखिम से Cal-520 AM युक्त समाधानों की रक्षा करें।
  2. इनक्यूबेटर से सेल कक्षों को बाहर निकालें और माध्यम को एस्पिरेट करें। कोशिकाओं को परख बफर से दो बार धोएं।
  3. प्रत्येक कक्ष में लोडिंग बफर के 500 माइक्रोन जोड़ें और 45 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें।
  4. लोडिंग बफर को एस्पिरेट करें और कोशिकाओं को परख बफर के साथ दो बार धोएं।
  5. प्रत्येक कक्ष में ताजा परख बफर के 500 μL जोड़ें और आर टी में 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करने के लिए AM-एस्टर के दरार की अनुमति है।
  6. एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर लाइव इमेजिंग प्रदर्शन करने से पहले ताजा परख बफर के 500 माइक्रोन के साथ बफर की जगह।

13. इंट्रासेल्युलर सीए2 +-स्तरों की लाइव इमेजिंग

नोट: इमेजिंग के लिए विभिन्न प्रकार के माइक्रोस्कोप प्रकारों का उपयोग किया जा सकता है। ईमानदार या उल्टे पारंपरिक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप, साथ ही उचित उत्तेजन स्रोत (488 एनएम) और उत्सर्जन फिल्टर (510-520 एनएम) के साथ ईमानदार या उल्टे कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग किया जा सकता है। उद्देश्य फ्लोरेसेंस के लिए अनुकूल होना चाहिए और उच्च गुणवत्ता का होना चाहिए और उच्च संख्यात्मक एपर्चर (एनए) के साथ होना चाहिए।

  1. कोशिकाओं की अशांति से बचने के लिए, कोशिकाओं की अशांति से बचने के लिए, जितना संभव हो उतना कोमल कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के चरण पर सेल कक्ष माउंट करें।
  2. 488 एनएम की एक उत्तेजन तरंगदैर्ध्य का चयन करें, 515 एनएम पर उत्सर्जन, 5 सेकंड अंतराल के साथ अनुक्रमिक छवि अधिग्रहण, 512 x 512 पिक्सल का एक XY छवि आकार और बेसलाइन कैल्शियम संकेतों को मापने के लिए 2 मिनट के लिए उपाय करें।
  3. एक पिपेट के साथ सेल चैंबर में 100 mm एटीपी के 3 माइक्रोन जोड़ें, और अनुक्रमिक छवि अधिग्रहण जारी रखें। तैयारी को परेशान न करने और कोशिकाओं को ध्यान से बाहर ले जाने के लिए धीरे-धीरे और धीरे-धीरे इसके अतिरिक्त प्रदर्शन करें।
  4. परिवर्तनों की डिग्री का निरीक्षण करें और समय के साथ समय अंतराल में वृद्धि के रूप में लगभग 18 मिनट के लिए की जरूरत के रूप में कोई और रूपात्मक परिवर्तन(चित्रा 3)उल्लेख किया है ।
  5. समय-चूक छवियों को सहेजें और आगे के विश्लेषण के लिए उन्हें झगड़ा और/या AVI फ़ाइलों के रूप में निर्यात करें ।
    नोट: पेरिसाइट्स की एक शीशी 1-2 96-अच्छी प्लेटों और कई कवरस्लिप में सीडिंग के लिए पर्याप्त कोशिकाएं देनी चाहिए, जिसका अर्थ है कि आप दोनों प्रकार के कैल्शियम-माप के लिए कोशिकाओं को तैयार कर सकते हैं।

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Representative Results

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गोजातीय मस्तिष्क केशिकाओं को ताजा मस्तिष्क के ऊतकों से अलग किया गया था और चित्रा 1 दिन में केशिका सीडिंग और सेलुलर वृद्धि और पेरिसाइट्स के बाद शुद्धि प्रस्तुत करता है। केशिका पूरी तरह से 1 दिन में फ्लास्क से जुड़ी हुई हैं और दिन 2 एंडोथेलियल अंकुरण दिखाई दे रही है(चित्र 1,दिन 2)। 4 दिनों के बाद, सेलुलर वृद्धि अत्यधिक विशिष्ट है(चित्र 1,दिन 4a) और एंडोथेलियल कोशिकाओं को वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार कोमल ट्राइपसिनाइजेशन द्वारा हटा दिया जाता है। केशिकाओं के अवशेष ट्राइपसिनाइजेशन के बाद मौजूद हो सकते हैं, लेकिन अगले दिनों में फ्लास्क से गायब होजाएंगे (चित्रा 1,दिन 4b-6)। एंडोथेलियल-लेयर को हटाने के बाद, पेरिसाइट्स को एंडोथेलियल कोशिकाओं से अलग आकृति विज्ञान के साथ आसानी से पता लगाया जाता है। पेरिसाइट्स उंगली जैसी प्रक्रियाएं पेश करते हैं जोफ्लास्क (चित्रा 1,दिन 4b) से दृढ़ता से संलग्न होते हैं। इसके बाद, पेरिसाइट्स को तब तक बढ़ने की अनुमति है जब तक कि फिट्लुस(चित्र 1,दिन 4b-9) और 9 दिन, पेरिसाइट्स लगभग 80% तक पहुंच गए हैं और द्वीपों में बढ़ते हैं। यह एंडोथेलियल कोशिकाओं के विपरीत है जो 4 दिन में मनाए गए संपर्क बाधित मोनोलेयर बनाते हैं।

एटीपी इंट्रासेलुलर सीए2 +-सिग्नलिंग11 का एक प्रसिद्ध अंतर्जात प्रेरक है और इसका उपयोग पेरिसाइट्स में सीए2 +-स्तरों में साइटोसोलिक परिवर्तनों को प्रेरित करने के लिए एक बाहकालीन उत्तेजक के रूप में किया गया था। वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार, फ्यूरा-2 लोडेड पेरिसाइट्स में एटीपी के अलावा, साइटोसोलिक सीए2 +-स्तरों में वृद्धि हुई, जैसा कि चित्र 2 में दिखायागया है फ्लोरोसेंट अनुपात के रूप में मापा गया है। एटीपी-प्रेरित प्रतिक्रिया पेरिसाइट्स के लिए एटीपी के अलावा तुरंत बाद होता है और मापा समय अवधि में धीरे-धीरे गिरावट आती है।

इंट्रासेल्युलर सीए2 +-प्रतिक्रियाओं के वास्तविक समय कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, पेरिसाइट्स को लेपित कवरस्लिप पर वरीयता प्राप्त किया गया था, जो सीएएल-520 AM से भरा हुआ था और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप में रखा गया था। चित्रा 3 (0 एस) उपचार से पहले फ्लोरेसेंस के आधारभूत स्तर के साथ पेरिसाइट्स को दिखाता है। लाइव-रिकॉर्डिंग के दौरान, एटीपी को पेरिसाइट्स में जोड़ा जाता है और एक मजबूत इंट्रासेल्युलर सीए2 +-प्रतिक्रिया (64 एस) के तुरंत बाद स्पष्ट होती है। इसके तुरंत बाद, साइटोसोलिक सीए2 + कोशिकाओं में विभाजित होता है और कोशिका क्षेत्र में कमी दिखाई देती है (189 एस)। रिकॉर्डिंग के 300 एस पोस्ट शुरू में, सेल क्षेत्र भारी कम हो गया है और सीए2 +-सिग्नल बेसलाइन फ्लोरेसेंस के करीब तीव्रता में गिरावट आई है।

Figure 1
चित्रा 1: केशिकाओं की खेती और पेरिसाइट्स का अलगाव। केशिकाओं ताजा गोजातीय मस्तिष्क से अलग किया गया है और 0 दिन पर संस्कृति फ्लास्क में वरीयता प्राप्त । गोजातीय मस्तिष्क केशिकाओं से आउटग्रोथ और पेरिसाइट्स के निम्नलिखित अलगाव का प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ दिनों में पालन किया गया था। दिन 4a एंडोथेलियल कोशिकाओं को हटाने के लिए ट्रिप्सिन के साथ उपचार से पहले एंडोथेलियल सेल विकास दिखाता है और दिन 4b उपचार के तुरंत बाद अवशेष दिखाता है। दिन 8a फोकस विमान से पता चलता है, जहां किसी भी केशिका अवशेष दिखाई देगा, जबकि दिन 8b विमान पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं, जहां pericytes के विकास दिखाई दे रहा है ।  कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: फ्यूरा-2 कैल्शियम इंडिकेटर डाई का उपयोग करके इंट्रासेलुलर कैल्शियम-माप का प्रतिनिधि उदाहरण। इंट्रासेलुलर कैल्शियम में परिवर्तन की कल्पना करने के लिए प्राथमिक पेरिसाइट्स को 96 अच्छी प्लेटों में वरीयता दी गई है और फुरा-2 AM से भरा हुआ है। 10 माइक्रोन एटीएम एटीपी को 30 एस पर पेरिसाइट्स में जोड़ा जाता है और साइटोसोलिक सीए2 +-प्रतिक्रिया को दो उत्तेजन तरंगदैर्ध्य के बीच अनुपात के रूप में मापा जाता है; समय के साथ 340 एनएम और 380 एनएम। स्केल बार को मानक विचलन (एन = 3, एन = 1) के रूप में परिभाषित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: कैल-520 कैल्शियम इंडिकेटर डाई का उपयोग करके इंट्रासेलुलर कैल्शियम लाइव-इमेजिंग का प्रतिनिधि उदाहरण। इंट्रासेलुलर कैल्शियम और सेल आकृति विज्ञान में परिवर्तन की कल्पना करने के लिए प्राथमिक पेरिसाइट्स को सेल कक्ष में वरीयता दी गई है और सीएएल-520 से भरा हुआ है। 600 माइक्रोन एटीएम पेरिसाइट्स में जोड़ा जाता है और लाइव इमेजिंग के दौरान अलग-अलग समय बिंदुओं से स्नैपशॉट यहां प्रस्तुत किए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

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इस अध्ययन में, हमने प्राथमिक पेरिसाइट्स को गोजातीय दिमाग से अलग करने का एक तरीका प्रस्तुत किया है। वर्णित प्रोटोकॉल इस अन्यथा दुर्गम सेल प्रकार की संस्कृति की अनुमति देता है। बाद में प्राप्त कोशिका संस्कृति पेरिसाइट्स की लगभग समरूप आबादी थी, जिसमें कोशिका आकृति विज्ञान और प्रोटीन अभिव्यक्ति12के आधार पर एंडोथेलियल कोशिकाओं और ग्लियल कोशिकाओं के साथ कम या कोई संदूषण नहीं था। इसके अलावा, हमने इच्छित परिणाम के आधार पर दो अलग-अलग तरीकों का उपयोग करके सीए2 +-इमेजिंग के लिए कैल्शियम रंगों के साथ पेरिसाइट्स को लोड करने के लिए एक सरल और सरल विधि का प्रदर्शन किया।

मस्तिष्क के ऊतकों से प्राथमिक कोशिकाओं को अलग करते समय मुख्य मुद्दों में से एक ऊतक तक सीमित पहुंच है। पहले के कई अध्ययनों में, चूहे और चूहे पारंपरिक मॉडल जानवर हैं, लेकिन इन छोटे जानवरों से मस्तिष्क के ऊतक विरल6,13हैं। मानव मस्तिष्क से अलगाव भी किया गया है14 हालांकि, नैतिक मुद्दों के कारण यह आसानी से सुलभ नहीं है। इसलिए, उपलब्ध स्रोत से एक उच्च सेल उपज पसंद की जाती है। एक गोजातीय मस्तिष्क से अलगाव से प्राप्त कोशिका शीशियों की संख्या माउस या चूहे से प्राप्त राशि को दूर तक अधिक कर देती है, जिससे गोजातीय ऊतक अन्य उल्लिखित स्रोतों की तुलना में लाभप्रद हो जाता है। यहां वर्णित विधि का एक और लाभ पेरिसाइट्स की शुद्ध संस्कृति प्राप्त करने के लिए कम मार्ग संख्या है। भित्ति कोशिकाओं के पासेजिंग से डी-विभेदन15 हो सकता है और इसलिए, अधिमानतः से बचा जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल में, एंडोथेलियल सेल लेयर को हटाने के लिए कोमल ट्राइपसिनाइजेशन एक एकल कदम है जो पेरिसाइट्स को अलग करने के लिए उपयोग किया जाता है और इसलिए इस प्रोटोकॉल में वर्णित सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक है। यदि ट्राइपसिनाइजेशन लंबे समय तक होता है, तो पेरिसाइट्स एंडोथेलियल कोशिकाओं के साथ फ्लास्क से अलग होना शुरू हो जाएगा, जिससे केवल एक छोटी उपज होगी। दूसरी ओर, केवल एक बहुत ही कम ट्रिप्सिनाइजेशन समय की अनुमति देने से पेरिसाइट्स की अशुद्ध संस्कृति पैदा हो सकती है। इसलिए ट्राइपसिनाइजेशन चरण के दौरान कोशिकाओं का अक्सर निरीक्षण करना अत्यंत महत्वपूर्ण है। ट्राइपसिनाइजेशन प्रक्रिया के दौरान दो सेल प्रकारों को अलग करने में सक्षम होने के लिए पेरिसाइट्स और एंडोथेलियल कोशिकाओं के बीच रूपात्मक मतभेदों के बारे में पता होना चाहिए। यद्यपि, इस चरण के लिए कुछ प्रशिक्षण की आवश्यकता हो सकती है, शुद्ध पेरिसाइट संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए उपयोग किए जाने वाले अन्य तरीकों की तुलना में विधि कम समय लेने वाली और सस्ती है7,8,14। इसके अलावा, यहां पेरिसाइट्स की प्राप्त संस्कृति ने उंगली जैसी प्रक्रियाओं के साथ विशिष्ट "भूत" जैसी आकृति विज्ञान को दिखाया और α-SMA, PDGFR-β और नेस्टिन (डेटा यहां नहीं दिखाया गया है)12,जो संस्कृति1में प्राथमिक पेरिसाइट्स के लिए प्रसिद्ध मार्कर हैं जैसे कई विशिष्ट मार्कर व्यक्त किए गए।

यहां, हमने फ्लोरोसेंट कैल्शियम संकेतक रंगों का उपयोग करके सीए2 +-इमेजिंग के लिए एक सरल विधि भी प्रस्तुत की। रंगों (फुरा-2 और कैल-520) के साथ पेरिसाइट्स की लोडिंग आरटी पर की जानी चाहिए न कि 37 डिग्री सेल्सियस पर। कई अध्ययनों ने 37 डिग्री सेल्सियस16, 17पर एएम एस्टर की लोडिंग की है, लेकिन इस तापमान पर लोड होने से एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम जैसे इंट्रासेलर डिब्बों में प्रवेश करने वाले एस्टर हो सकते हैं। यह बेहतर नहीं है, क्योंकि फ्यूरा-2 AM आंतरिक दुकानों में फंसे सीए2 + को मुक्त करने के लिए बाध्य कर सकता है और इस तरह फ्लोरोसेंट माप में कम वृद्धि हुई है। इसलिए, यह झूठे परिणाम पैदा कर सकता है। हालांकि, हमने आरटी में पेरिसाइट्स की लोडिंग के साथ किसी भी बड़ी कठिनाइयों का अनुभव नहीं किया है, यदि कोई किसी भी तरह की समस्याओं का सामना कर रहा है, तो कोशिकाओं के लोड होने से पहले अल्ट्रासाउंड स्नान में 5 मिनट के लिए लोडिंग समाधान के सोनीफिकेशन द्वारा लोडिंग को अनुकूलित करने पर विचार कर सकता है।

वर्णित विधि के साथ, इंट्रासेल्युलर सीए2 +-सिग्नलिंग लाइव रिकॉर्डिंग के दौरान आसानी से मनाया जाता है, जिसे आगे के विश्लेषण के लिए भी निर्धारित किया जा सकता है। इस विधि का उपयोग पहले इन विट्रो Ca2 +-सिग्नलिंग और मस्तिष्क केशिका पेरिसाइट्स12के संकुचन के पहले प्रदर्शन को करने के लिए किया गया है। पिछले अध्ययनों में18 , 19,20को बाहुलकर उत्तेजना के परिणामस्वरूप कोशिका संकुचन को मापने और निर्धारित करने के लिए विभिन्न तरीकों का उपयोग किया गया है । हालांकि, कोशिकाओं के संकुचन के बाद सीधे प्रारंभिक इंट्रासेलुलर प्रतिक्रिया को देखते हुए इन अध्ययनों में कोई संभावना नहीं थी। वर्तमान अध्ययन में इंट्रासेलुलर सिग्नलिंग का निरीक्षण करना संभव है और कोशिकाओं के निम्नलिखित संकुचन और दोनों मापों को एक ही प्रयोग में निर्धारित किया जा सकता है। इस प्रकार, यह अतिरिक्त प्रयोगों को समाप्त करता है, जो अधिक समय लेने वाले होते हैं, और इंट्रासेल्युलर सीए2 +-सिग्नलिंग और रूपात्मक परिवर्तनों के बीच सीधा संबंध दिखाता है।

अंत में, यह अध्ययन प्राथमिक मस्तिष्क पेरिसिटस को अलग-थलग करने और बनाने के लिए एक सरल और प्रभावी विधि का प्रतिनिधित्व करता है। इसके अलावा, हम सुसंस्कृत पेरिसाइट्स में इंट्रासेलुलर सीए2 +-सिग्नलिंग का अध्ययन करने के लिए एक आसान और प्रजनन योग्य विधि प्रदर्शित करते हैं। यहां वर्णित तरीकों को इस क्षेत्र में अन्य शोधकर्ताओं को मजबूत उपकरण प्रदान करने चाहिए ताकि परिसाइट जीव विज्ञान और इन विट्रो में पेरिसाइट्स में इंट्रासेलुलर सिग्नलिंग का अध्ययन किया जा सके।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा करते हैं ।

Acknowledgments

लेखक ब्रेन बैरियर्स एंड ड्रग डिलिवरी (रिब्बडीडी) और साइमन होगनर्स फैमिली फाउंडेशन पर लुंडबेक फाउंडेशन रिसर्च इनिशिएटिव से फंडिंग को स्वीकार करना चाहते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ATP Tocris 3245
Cal-520 AM AAT Bioquest 21130
Cell incubator Thermo Fisher
Centrifuge Thermo Fisher Heraeus Multifuge 3SR+ Standard large volume centrifuge for spinning down cells
Collagen IV Sigma Aldrich C5533
Confocal laser scanning microscope Carl Zeiss Zeiss LSM 510 Inverted microscope
Counting chamber FastRead 102
Coverslip cell chamber Airekacells SC15022
Cremophor EL Sigma Aldrich C5135 Formerly known as Kolliphor EL
DMSO Sigma Aldrich 471267
Dulbecco's Modified Eagles Medium Sigma Aldrich D0819
Fetal bovine serum (FBS) PAA/GE Healthcare A15-101
Fibronectin Sigma Aldrich F1141
Fura-2 AM Thermo Fisher F1201
Glass coverslips 22x22 mm VWR International 631-0123
HBSS Gibco 14065-049
Heparin Sigma Aldrich H3149
HEPES AppliChem Panreac A1069
Light microscope Olympus Olympus CK2 Upright light microscope with phase contrast
MEM nonessential amino acids Sigma Aldrich M7145
Microplate Reader BMG LabTech NOVOstar
PBS Sigma Aldrich D8537 Phosphate-buffered saline
penicillin G sodium/streptomycin sulfate Sigma Aldrich P0781
Pluronic F127 Sigma Aldrich P2443
Trypsin-EDTA Sigma Aldrich T4299
T-75 flask Sigma Aldrich CLS3972
96-well plate Corning incorporated 3603

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References

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साइटोसोलिक कैल्शियम मापन और कैल्शियम इमेजिंग अध्ययन के लिए मस्तिष्क केपिलरी पेरिसिटस की संस्कृति
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Hørlyck, S., Helms, H. C. C., Brodin, B. Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies. J. Vis. Exp. (159), e61253, doi:10.3791/61253 (2020).More

Hørlyck, S., Helms, H. C. C., Brodin, B. Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies. J. Vis. Exp. (159), e61253, doi:10.3791/61253 (2020).

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