Summary
Hjärnan kapillär pericytes är viktiga aktörer i regleringen av blod - hjärnbarriären egenskaper och blodflödet. Detta protokoll beskriver hur hjärnan kapillär pericytes kan isoleras, odlade, karakteriseras med avseende på celltyp och tillämpas för undersökningar av intracellulära kalcium signalering med fluorescerande sonder.
Abstract
Pericyter är associerade med endotelceller och astrocytiskt endfeet i en struktur som kallas neurovaskulära enheten (NVU). Hjärnan kapillär pericyte funktion är inte helt känd. Pericytes har föreslagits vara inblandade i kapillär utveckling, reglering av endotel barriär täthet och trancytosis verksamhet, reglering av kapillär tonen och att spela avgörande roller i vissa hjärnan patologier.
Pericyter är utmanande att undersöka i intakt hjärnan på grund av svårigheterna att visualisera processer i hjärnan parenkym, liksom närheten till de andra cellerna i NVU. Föreliggande protokoll beskriver en metod för isolering och kultur av primära bovint hjärnan kapillär pericytes och deras följande användning i kalcium imaging studier, där effekterna av agonister som deltar i hjärnan signalering och patologier kan undersökas. Kortikal kapillärfragment tillåts fästa på botten av odlingskolvar och efter 6 dagar har endotelceller och pericyter växt ut från kapillärfragmenten. Endotelcellerna avlägsnas genom mild trypsinization och pericyter odlas i 5 ytterligare dagar före passaging.
Isolerade pericyter är seedade i 96-brunnskulturplattor och laddade med kalciumindikatorfärgen (Fura-2 acetoxymethyl (AM)) för att möjliggöra mätningar av intracellulära kalciumnivåer i en plattläsaruppställning. Alternativt sås pericyter på täcken och monteras i cellkammare. Efter lastning med kalciumindikatorn (Cal-520 AM), kalcium live-imaging kan utföras med hjälp av confocal mikroskopi vid en magnetisering våglängd av 488 nm och utsläpp våglängd av 510-520 nm.
Den metod som beskrivs här har använts för att erhålla de första intracellulära kalciummätningarna från primära hjärnan kapillär pericytes, visar att pericytes stimuleras via ATP och har möjlighet att kontrakt in vitro.
Introduction
Hjärnan kapillär pericyter, tillsammans med endotelceller och astrocyter, utgör NVU1,2,3. De endotelceller, som utgör den strukturella grunden för kapillärerna, bildar långa cylindriska rör med en diameter på 5-8 μm. De endotelceller är sporadiskt täckt med pericyter och omgiven av utsprång från astrocyter; astrocyten endfeet.
Blod- hjärnbarriären (BBB), som ligger vid hjärnkaxillärerna, är den huvudsakliga platsen för utbyte av näringsämnen, gaser och avfallsprodukter mellan hjärnan och blodet. BBB skyddar också hjärnan från endogena och exogena neurotoxiner och fungerar som en barriär för leverans av ett stort antal läkemedelsföreningar. Barriärfunktionen är ett fokusområde, samt ett hinder, för läkemedelsföretagen som utvecklar läkemedel från centrala nervsystemet (CNS). Detta har sporrat ett stort intresse för att undersöka cellerna i NVU i kultur4. Hjärnans astrocyter och endotelceller har odlats och karakteriserats i ett antal studier, medan studierna och protokollen för pericytkulturen är glesa.
Tidigare publicerade protokoll har beskrivit generering av hjärnan kapillär pericyte kulturer till viss del, med hjälp av en rad olika metoder såsom immunopanning5, hög- och lågglukosmedia6, fluorescerande-aktiverad cellsortering7, densitet gradient centrifugering8, etc. Även om dessa metoder verkar tillräckligt för att erhålla kulturer av pericyter, vissa är tidskrävande, kostar dyrt och pericyter som erhållits kanske inte är idealisk på grund av antalet kultur passager som kan de-differentiera pericytes9. Dessutom har potentialen hos odlade pericyter i in vitro-signalstudier hittills varit ganska outforskad.
Det föreliggande arbetet fokuserar på generering av pericytekulturer från isolerade kapillärer från nötkreatur och den efterföljande uppställningen för mätningar och bildframställningsstudier av förändringar i intracellulärt kalcium, en viktig intracellulär andra budbärare. Vi beskriver kort isolering av kapillärer från när grå substans (för detaljer se Helms et al.10) och isolering och kultur av pericytes i ren monokultur utan kontaminering med endotel eller gliaceller. Vi tillhandahåller sedan ett protokoll för sådd av pericyter i 96-brunns plattor och lastning protokoll för kalcium sonden Fura-2 AM. Slutligen visar vi hur pericyter kan användas i realtid konfokal avbildning i mikroskop kulturkammare och beskriva protokollen för detta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av buffertar och lösningar för cellkulturing
- Bered lösning av kollagenlager genom att lösa upp 5 mg kollagen IV från moderkakan för människor i 50 mL PBS över natten vid 4 °C. Alikvotens stamlösning i 5 mL-portioner och förvara vid -20 °C.
- Förbered fibronectin stamlösning genom att lösa upp 5 mg fibronectin i 5 mL sterilt vatten över natten. Förvara bestånden av fibronectin i alikvoter på 500 μL vid -20 °C. Vid upptining, tillsätt PBS till en slutlig volym på 50 mL för att förbereda arbetslösningen och förvara den vid 4 °C.
- Förbered Dulbeccos kompletterade medium (Modified Eagle Medium) (DMEM) genom att tillsätta 50 mL fetalt bovinserum (FBS), 5 mL MEM-nonessentiella aminosyror och 5 mL penicillin /streptomycin (0,1 g/L streptomycinsulfat och 100 000 U/L penicillin G natrium) till 500 mL DMEM.
- Bered 5 mg/mL heparin stamlösning genom att lösa upp heparinnatriumsalt i PBS och föra det genom ett 0,2 μm filter för sterilisering. Förvara stamlösningen vid 4 °C.
- Förbered tillväxtmedium (GM) omedelbart före användning; blanda 10 mL DMEM-comp och 250 μL heparinbeståndslösning per T75-kolv.
2. Isolering av kapillärer från färsk bovinhjärna
OBS: Bovint hjärnan kapillärer är isolerade och odlade som tidigare beskrivits (Helms et al.10).
- Samla hjärnor från kalvar, inte äldre än 12 månader, från ett slakteri och ta direkt till labbet på is.
- Ta bort hjärnhinnorna och samla in all grå substans från hjärnan med hjälp av en skalpell. Identifiera hjärnhinnorna som filmen som täcker hjärnan och den grå substansen genom sin gråa färg.
- Använd en 40 mL Dounce vävnadskvarn för att homogenisera den grå substansen i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM). Fyll den smala delen av vävnadskvarnen 1/5 med grå substansfjädring och tillsätt DMEM tills den smala delen är fylld.
- Separera kapillärerna från fria celler och mindre vävnadsstycken genom filtrering av homogenatet genom ett 160 μm nylonnätfilter. Spola filtren med DMEM-comp. Hämta kapillärerna och poola suspensionerna i 50 mL centrifugeringsrör.
- Resuspend kapillärerna i DMEM-comp och lägga till en enzym blandning av DNase I (170 U/mL), kollagenas typ III (200 U/mL) och trypsin (90 U/mL). Låt suspensionen vara i 1 h i ett 37 °C vattenbad för rötning av kapillärerna.
- Kör suspensionen genom ett 200 μm mesh-filter och resuspend i FBS med 10% dimetylsulfoxid (DMSO). Frys kapillärerna över natten vid -80 °C och flytta dem till flytande kväve dagen efter för långtidsförvaring.
OBS: Protokollet kan pausas här.
3. Sådd och kultföring av kapillärer av nötkreatur
- Dag 0: Blanda 0,7 mL kollagen IV-lager med 6,3 mL PBS. Tillsätt lösningen i en T75-kolv och låt kolven vara i 2 h vid rumstemperatur (RT) eller låt den vara över natten vid 4 °C.
- Ta ut kollagenlösningen ur kolven och tvätta tre gånger med PBS.
- Tillsätt 7 mL fibronectin arbetslösning och låt kolven vara i 30 min vid RT. Sedan, ta bort fibronectin lösningen och utsäde kapillärerna omedelbart efter.
- Under den 30 min väntetid, tina en injektionsflaska med kapillärer i en 37 °C vattenbad.
- När kapillärerna tinas, överför omedelbart till ett centrifugeringsrör med 30 mL DMEM-comp och centrifug i 5 min vid 500 x g och RT. Ta bort DMEM-comp från röret och åter upphäva kapillär-pelleten i 10 mL av färsk DMEM-comp.
- Överför 10 mL-suspensionen till den belagda T75-kolven och låt kapillärerna hålla fast vid botten av kolven i 4-6 h i en 37 °C-inkubator vid 10% CO2.
OBS: Celltillväxthastigheten är högre vid 10% CO2 snarare än den konventionella 5% CO2. - Efter 4-6 h inkubation inspektera kolven under ett ljus mikroskop. Fraktioner av kapillärer bör nu fästas på botten av kolven (Bild 1, dag 0).
- Förbered GM och aspirera DMEN-comp-mediet mycket försiktig från kapillärerna och ersätta den med 10 mL nygjord GM.
- Dag 2: Ta bort GM från kapillärerna och ersätt med 10 mL nygjord GM. Cellulär utväxt från kapillärerna ska synas i ett ljusmikroskop i denna punkt (Figur 1, dag 2-3).
4. Isolering av primära pericyter från kapillärer från nötkreatur
-
Dag 4: Inspektera kapillärerna under ett ljusmikroskop.
OBS: Kolven bör nu vara cirka 60-70 % konfluent för att ge en lämplig mängd pericyter (figur 1, dag 4). Om så inte är fallet; ersätta GM med 10 mL färskt medium och låt kolven vara kvar i inkubatorn en annan dag. - Aspirera mediet och tvätta cellerna försiktigt i PBS.
- Tillsätt 2 mL tinade Trypsin-EDTA för endotelceller och låt kolven vara kvar i inkubatorn i 1-3 min. Ta ut kolven ofta och observera med mikroskopet under denna tidsperiod.
OBS: Endotelcellerna ska runda av uppåt och lossna från kolven; pericyter bör vara synliga som celler med en "spöke"-morfologi och ändå vara fäst vid ytan av kolven. Detta är ett knepigt och viktigt steg. Det är viktigt att ta bort de flesta endotelceller för att undvika kontaminering av pericytmonokulturen, men långvarig trypsinization kan också lösgöra pericyterna. Trypsinizationtiden kan variera något från tid till annan, och det är därför av yttersta vikt att observera kolven ofta med mikroskopet under behandlingen. - Knacka försiktigt på kolven, när endotelcellerna har börjat runda upp, för att lossa de lossade endotelcellerna.
- För att stoppa trypsinizationen, lägg till 10 mL DMEM-comp i kolven. Spola kolven försiktigt några gånger med mediet för att avlägsna endotelcellerna. Aspirera endotelescellsupphängningen från kolven. Endotelcellerna kan nu användas för andra ändamål.
- Tillsätt 10 mL DMEM-comp i kolven. Titta under ljusmikroskopet för att försäkra pericyterna är fortfarande närvarande och fäst vid botten. Sätt tillbaka kolven i inkubatorn så att den pericytberikaderade kulturen kan växa.
OBS: Det är viktigt att observera kulturen under de följande dagarna. Om det fortfarande finns en hel del endotelceller växer en annan trypsin-behandling kan utföras. - Låt pericyte monokultur att växa med förändring av DMEM-comp. medium varje sekund dag. Kontrollera cellernas tillväxt under ljusmikroskopet (Figur 1, dag 5-8).
5. Generering och lagring av en monokultur av primära bovina pericyter
-
Dag 8-9: Inspektera kapillärerna under ett ljusmikroskop
OBS: Pericyterna ska nu ha nått 70-80% konfluency och växa i öar i kolven (Figur 1, dag 9). Om confluency av pericyterna är mindre än 70%, låt cellerna att växa för en annan dag. Pericyterna kommer inte att bilda en komplett monolayer som endotelcellerna skulle. - Aspirera DMEM-comp och tvätta pericyterna med 7 mL PBS.
- Tillsätt 2 mL trypsin-EDTA i kolven och låt den vara i inkubatorn i 2-3 min. Placera kolven ofta under ljusmikroskopet för att observera när pericyterna avrundar uppåt och lossnar från kolven. När pericyterna har börjat runda uppåt kan kolven försiktigt knackas för att lossa cellerna.
- Knacka försiktigt på kolven, när pericyterna har börjat runda upp, för att lossa cellerna.
- Lägg till 10 mL DMEM-comp i kolven för att stoppa trypsinization-processen. Spola kolven några gånger med mediet för att hjälpa till att ta bort de sista pericyterna.
- Överför 12 mL-cellsupphängningen till ett 50 mL centrifugationsrör och fyll på upp till 30 mL med DMEM-comp.
- Centrifugera cellen suspensionen i 5 min vid 500 x g och RT. Aspirera den DMEM-comp. försiktigt utan att vidröra cellpelletsen. Resuspend cell pelleten i 3 mL av FBS med 10% DMSO.
- Överför cellen suspensionen i cryovials; tillsätt 1 mL till varje, så det blir totalt 3 injektionsflaskor per T75-kolv pericyter. Frys pericyterna vid -80 °C över natten och flytta dem till flytande kväve dagen efter för långtidsförvaring.
OBS: Celler kan räknas före frysning för en senare uppskattning av överlevnadsprocent. Protokollet kan pausas här.
6. Inrättande av en pericytmonokultur för experiment
- Bestryk en T75-kolv med kollagen IV och fibronectin med samma förfarande som nämns i avsnitt 3.1-3.4.
- Medan kolven är belagd med fibronectin, tina en flaska pericyter i en 37 ° C vattenbad.
- Överför de nu tinade pericyterna från kryoial till ett centrifugeringsrör med 30 mL DMEM-comp. Centrifugera cellupphängningen i 5 min vid 500 x g, RT.
- Aspirera försiktigt mediet, lämnar cell pelleten i botten av röret. Åter upphäva pelleten i 10 mL DMEM-comp.
- Samla och överför cellupphängningen till den belagda kolven. Låt kolven med pericyter växa i en 37 °C-inkubator vid 10% CO2.
- Varannan dag, uppdatera mediet med 10 mL färsk DMEM-comp.
OBS: Efter 5 dagars tillväxt ska pericyterna ha nått cirka 80 % konfluency. Om konfluency är mindre, lämna cellerna att växa för en annan dag eller två. Cellerna ska nu vara redo för sådd för ytterligare experiment.
7. Sådd av pericyter i en belagd 96-brunnsplatta
- Späd kollagen IV enligt beskrivningen i steg 3.1. Tillsätt 100 μL till varje brunn i en 96-brunnsplatta och inkubera i 2 h vid RT eller över natten vid 4 °C.
- Aspirera lösningen och tvätta brunnarna tre gånger med PBS.
- Tillsätt 100 μL utspädd fibronectin till varje brunn och inkubera vid RT i 30 min. Ta bort fibronectinlösningen och använd plattan omedelbart.
OBS: Beroende på hur väl pericytsatsen växer, bör det finnas tillräckligt med celler för sådd två plattor. - Ta ut pericyterna från inkubatorn och aspirera mediet. Tvätta cellerna med PBS.
- Lägg till 2 mL trypsin-EDTA till pericyterna och följ samma procedur som i steg 5,3-5,6.
- Aspirera mediet, utan att skada cellpelleten och åter upphäva pelleten i 1 mL av färsk DMEM-comp.
- Ta ut 12 μL cellfjädring och tillsätt till en räknekammare. Under ljusmikroskopet räknar du minst 3 av 3x3-rutnät och använder det genomsnittliga celltalet per rutnät.
- Använd ekvationen nedan för att beräkna volymen av cellfjädring som bör läggas till varje brunn till utsäde 10.000 celler per brunn, i 96-brunnsplattan.
- Lägg till DMEM-comp och den beräknade volymen av cellfjädring i varje brunn för att nå en slutlig volym på 200 μL.
- Placera 96-brunnsplattan i en 37 °C-inkubator vid 10 % CO2. Lämna cellerna att växa i 4 dagar med ett byte av medium efter 2 dagar.
8. Beredning av buffertar och lösningar för Ca2+-bildframställning
- Autoklav täckerlip cellkammare och täcksläpp.
- Analysbuffert: Tillsätt 1,19 g HEPES till 500 mL HBSS-buffert för en slutkoncentration på 10 mM HEPES. Justera pH-värdet till 7,4.
- Förbered 20% (w/v) Pluronic F127 + 1% (v/v) polyetoxylerad riktorolja stamlösning genom att lösa upp 0,5 g Pluronic F127 lösning i 2,5 mL vattenfri DMSO i en glasal. Värm till 40 °C i cirka 30 min eller tills upplöst och vortex. Tillsätt 25 μL polyetoxerad riktorolja och förvara på RT. Får inte frysas.
- Bered 2 mM Fura-2 AM lager genom att lösa upp 1 mg i 500 μL av vattenfri DMSO. Förvaras i alikvoter på 20 μL vid -20 °C skyddad mot ljus.
- Bered 5 μM Fura-2 AM lastningslösning genom att blanda 20 μL på 20% Pluronic F-127 + 1% polyetoxylerad riljolja stamlösning med 20 μL av 2 mM Fura-2 AM alikvot. Tillsätt 500 μL assay buffert och virvel. Lägg till assaybuffert till en slutlig volym på 8 mL. Lösningen bör beredas omedelbart före användning och skyddas från ljus.
- Förbered 4 mM Cal-520 AM genom att lösa upp 1 mg i 226,7 μL vattenfri DMSO. Förvaras i alikvoter på 20 μL vid -20 °C skyddad mot ljus.
- Bered 20 μM Cal-520 AM lastningslösning genom att blanda 20 μL av 20% Pluronic F-127 + 1% polyetoxylerad ricinolja stamlösning med 20 μL 4 mM Cal-520 aliquot. Tillsätt 500 μL assay buffert och virvel. Lägg till assaybuffert till en slutlig volym på 4 mL. Lösningen bör beredas omedelbart före användning och skyddas från ljus.
9. Lastning av pericyter med Fura-2 AM kalcium indikator färgämne i en tallrik-läsare setup
OBS: Alla lösningar ska vara på RT innan experimentet startar.
- Ta ut 96-brunnsplattan med celler från inkubatorn och aspirera mediet från brunnarna. Tvätta cellerna två gånger med analysbuffert.
- Tillsätt 100 μL lastlösning till varje brunn och linda plattan med aluminiumfolie, för att undvika fotoblekning. Inkubera i 45 min med 30 rpm skakningar vid RT.
OBS: Belasta inte Fura-2 AM vid 37 °C, eftersom det kan belasta invändiga fack. Kom ihåg att lämna brunnar med celler i assay buffert istället för att ladda buffert; dessa är de "ämnen" som används för mätning av bakgrundsfluorescens. - Aspirera lastbufferten och tvätta cellerna med analysbuffert två gånger. Tillsätt 100 μL färsk analysbuffert och låt cellerna inkubera i 30 min vid RT; detta möjliggör kontinuerlig klyvning av AM-estern och därigenom svällande Fura-2 AM inuti cellerna.
- Före Ca2+ -bildåtergivningen,tvätta och ersätta bufferten med 100 μL färsk analysbuffert.
10. Well-platta fluorescens läsning av pericyter i en tallrik-läsare setup
- Ställ in plattans temperatur på 37 °C och överför 96-brunnsplattan med celler till provplattans läge. Placera reagensplattan med agonist vid reagensplattans position.
- Börja med att mäta lastning av cellerna för att säkerställa lika lastning av Fura-2 AM i alla brunnar.
- Utför mätningarna med excitation fluorescens våglängd vid 340 nm/380 nm och emissionsvåglängden vid 510 nm. Tillsätt 50 μL agonist med hastighet 150 μL/s från reagensplattan till varje brunn med celler i provplattans läge.
- Spara data och exportera som xlsx-filer för vidare analys. I figur 2 visas det cytosoliska Ca2+-responset mätt som förhållandet mellan de två excitationsvåglängderna över tiden, där bakgrundsfluorescens subtraheras.
OBS: Plattan-läsaren behöver vara en dubbel mikroplattläsare med plats för en "cellbricka" och ett "provbricka" och ett integrerat pipettorsystem.
11. Sådd av pericyter i en överdragen cellkammare för direktavbildning
OBS: Täckslips kan också placeras i botten av kultur brunnar, belagda och seedade med pericyter enligt beskrivningen ovan, och sedan monteras i kammaren före experiment.
- Montera en coverslip i cellkammaren och gör det tätt för att undvika läckage.
- Späd kollagen IV enligt beskrivningen i steg 3.1. Tillsätt 500 μL till varje cellkammare och inkubera i 2 h vid RT eller över natten vid 4 °C.
- Aspirera kollagenlösningen och tvätta kamrarna tre gånger med 500 μL PBS.
- Tillsätt 500 μL utspädd fibronectin till varje brunn och inkubera vid RT i 30 min. Ta bort fibronectinlösningen och använd cellkammaren rakt efteråt.
- Under tiden ta ut kolven med konfluenta pericyter och tvätta med 7 mL PBS.
- Lägg till 2 mL trypsin-EDTA till pericyterna och följ samma procedur som i steg 5,3-5,6.
- Fortsätt med att följa samma steg som i steg 8.6-8.7.
- Använd ekvationen nedan för att beräkna volymen av cellfjädring, som bör läggas till varje kammare för att så 90.000 celler per kammare.
- Lägg till DMEM-comp och den beräknade volymen cell suspension i varje kammare för att nå en slutlig volym på 500 μL.
- Placera cellkamrarna i inkubatorn vid 37 °C, 10% CO2. Låt cellerna växa i 6 dagar (eller tills de konfluent).
OBS: Den pericyter växa långsammare på glas-diabilder jämfört med plast; fler dagar av tillväxt är nödvändiga.
12. Lastning av pericyter med Cal-520 AM kalcium indikator färgämne för levande bildbehandling
OBS: Alla lösningar ska vara på RT innan experimentet startar.
- Preparera lastbufferten 20 μM Cal-520 AM: Blanda 20 μL på 20 % Pluronic F-127 + 1% polyetoxylerad ricinolja stamlösning med 20 μL 4 mM Cal-520 aliquot. Tillsätt 500 av μL-analysbuffert och virvel. Lägg till assaybuffert till en slutlig volym på 4 mL. Lösningen bör beredas omedelbart före användning och skyddas från ljus.
OBS: Skydda lösningar som innehåller Cal-520 AM mot ljusexponering. - Ta ut cellkamrarna från inkubatorn och aspirera mediet. Tvätta cellerna två gånger med analysbuffert.
- Tillsätt 500 μL lastbuffert till varje kammare och inkubera vid RT i 45 min.
- Aspirera lastbufferten och tvätta cellerna två gånger med analysbuffert.
- Tillsätt 500 μL färsk analysbuffert till varje kammare och inkubera i 30 min vid RT för att möjliggöra klyvning av AM-estern.
- Ersätt bufferten med 500 μL färsk analysbuffert innan du utför den levande avbildningen vid ett konfokalmikroskop.
13. Live avbildning av intracellulär Ca2+-nivåer
OBS: En mängd olika mikroskoptyper kan användas för bildåtergivningen. Upprätt eller inverterad konventionell fluorescensmikroskop, samt upprätt eller inverterad konfokal laserscanning mikroskop med lämplig excitation källa (488 nm) och utsläppsfilter (510-520 nm) kan användas. Mål bör vara lämpade för fluorescens och vara av hög kvalitet och med hög numerisk bländare (NA).
- Montera cellkammaren på scenen av konfokalmikroskopet så skonsamt som möjligt, för att undvika störningar av cellerna.
- Välj en excitation våglängd på 488 nm, utsläpp vid 515 nm, sekventiell bild förvärv med 5 sekunders intervall, en XY bildstorlek på 512 x 512 pixlar och mått för 2 min för att mäta baslinjen kalciumsignaler.
- Tillsätt 3 μL av 100 mM ATP till cellkammaren med en pipett, och fortsätt den sekventiella bildförvärvet. Utför tillägget långsamt och försiktigt för att inte störa preparatet och flytta cellerna ur fokus.
- Observera graden av förändringar och öka tidsintervallet över tiden efter behov för cirka 18 min tills ingen ytterligare morfologisk förändring noteras (Bild 3).
- Spara timelapse-bilder och exportera dem som TIFF- och/eller AVI-filer för vidare analys.
OBS: En injektionsflaska med pericyter bör ge tillräckligt med celler för sådd i 1-2 96-brunnsplattor och flera täckplattor, vilket innebär att du kan förbereda celler för båda typerna av kalcium-mätningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nötkreatur hjärnan kapillärerna var isolerade från färska hjärnan vävnad och figur 1 presenterar kapillär sådd och cellulära utväxt under dagar och efterföljande rening av pericytes. Kapillärerna är helt fästa vid kolven vid dag 1 och dag 2 har endotelsspirandet spirande blivit synligt (figur 1, dag 2). Efter 4 dagar är cellulär utväxten mycket distinkt (Figur 1, dag 4a) och endotelcellerna avlägsnas genom mild trypsinization som enligt det beskrivna protokollet. Rester av kapillärerna kan vara närvarande efter trypsinizationen, men kommer att försvinna från kolven under de följande dagarna (Bild 1, dag 4b-6). Efter avlägsnande av endoteliala-skiktet, pericyter lätt detekteras med morfologi skild från de endotelceller. Pericyterna presenterar fingerliknande processer som fäster starkt vid kolven (Figur 1, dag 4b). Därefter tillåts pericyter att växa fram till konfluency (figur 1, dag 4b-9) och dag 9 har pericyterna nått ungefär 80% konfluency och växer på öar. Detta är i motsats till de endotelceller som gör skapa en kontakt hämmad monolayer observerats vid dag 4.
ATP är en välkänd endogen inducerare av intracellulära Ca2 +-signalering11 och användes som en extracellulär stimulerande att inducera cytosoliska förändringar i Ca2 +-nivåer i pericyter. Tillägg av ATP till de Loaded pericyterna Fura-2, som enligt det beskrivna protokollet, resulterade i en ökning av cytosolic Ca2+-nivåer mätt som fluorescerande förhållande enligt figur 2. Atp-inducerad svar sker omedelbart efter tillägg av ATP till pericytes och minskar långsamt under den uppmätta tidsperioden.
Med hjälp av detta protokoll för realtid confocal bildbehandling av intracellulära Ca2 +-svar, pericytes var seedade på belagda coverslips, lastade med Cal-520 AM och placeras vid confocal mikroskop. Figur 3 (0 s) visar pericyterna med utgångsnivåer av fluorescens före behandling. Under live-inspelning, atp läggs till pericytes och en stark intracellulära Ca2 +-svar är uppenbart strax efter (64 s). Strax efter, den cytosoliska Ca2 + compartmentalizes i cellerna och en minskning av cellen området är synlig (189 s). Vid 300 s. post start av inspelningarna, cellområdet är kraftigt reducerad och Ca2 +-signalen har minskat till intensitet nära baslinjen fluorescens.
Figur 1: Kultivering av kapillärer och isolering av pericyter. Kapillärer har isolerats från färsk bovinhjärna och sådd i odlingskolvar dag 0. Utväxt från bovin hjärnan kapillärerna och följande isolering av pericyter följdes under dagar med ett ljus mikroskop. Dag 4a visar endotelcellstillväxt före behandling med trypsin för att avlägsna endotelceller och dag 4b visar resterna direkt efter behandlingen. Dag 8a visar fokusplanet, där eventuella kapillärrester skulle vara synliga, medan dag 8b är inriktade på planet där pericyternas tillväxt är synlig. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: Representativt exempel på intracellulärt kalcium-mätning med användning av Fura-2 kalciumindikatorfärgämne. Primära pericyter har sådts i 96 brunnsplattor och laddats med Fura-2 AM för att visualisera förändringar i intracellulärt kalcium. 10 μM ATP tillsätts till pericyterna vid 30 s. och cytosolic Ca2+-responsen mäts som förhållandet mellan de två excitationsvåglängderna; 340 nm och 380 nm över tid. Skalstreck definieras som standardavvikelse (N=3, n=1). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: Representativt exempel på intracellulär kalcium live-imaging med hjälp av Cal-520 kalcium indikator färgämne. Primära pericyter har sådd i en cellkammare och laddad med Cal-520 i syfte att visualisera förändringar i intracellulära kalcium och cell morfologi. 600 μM ATP läggs till pericyterna och ögonblicksbilder från olika tidspunkter under live-avbildningen presenteras här. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna studie har vi lagt fram en metod för att isolera primära pericyter från bovin hjärnor. Det beskrivna protokollet tillåter kultur av denna annars ganska otillgängliga celltyp. Den därefter erhållna cellkulturen var en nästan homogen population av pericyter, med liten eller ingen kontaminering med endotelceller och gliaceller baserade på cellmorfologi och proteinuttryck12. Vidare visade vi en enkel och okomplicerad metod för att ladda pericyterna med kalciumfärgämnen för Ca2+-avbildning med två olika metoder, beroende på det avsedda utfallet.
En av de viktigaste frågorna när isolera primära celler från hjärnvävnad är den begränsade tillgången till vävnad. I flera tidigare studier, råttor och möss är de traditionella modellen djur som används, men hjärnvävnaden från dessa små djur ärglesa 6,13. Isolering från mänsklig hjärna har också genomförts14; men på grund av etiska frågor är detta inte lättillgängligt. Därav, en hög cell avkastning från en tillgänglig källa är att föredra. Antalet cellals som erhållits från isolering från en enda bovinhjärna är fler än den mängd som erhålls från antingen mus eller råtta i särklass, vilket gör nötkreatursvävnaden fördelaktig jämfört med de andra nämnda källorna. En annan fördel med den metod som beskrivs här är det låga passagenumret för att erhålla en ren kultur av pericyter. Passaging av väggmålning celler kan leda till de-differentiering15 och därför, bör helst undvikas. I det här protokollet är mild trypsinization för att ta bort endotelcellskiktet ett enda steg som används för att isolera pericyterna och därför också ett av de mest kritiska stegen som beskrivs i det här protokollet. Om trypsiniseringen förlängs kommer pericyterna att börja lossna från kolven tillsammans med endotelcellerna, vilket leder till endast ett litet utbyte. Å andra sidan, bara tillåta en mycket kort trypsinization tid kan orsaka en oren kultur av pericyter. Det är därför av yttersta vikt att observera cellerna mycket ofta under trypsinization-steget. Man bör vara medveten om de morfologiska skillnaderna mellan pericyter och endotelceller för att kunna skilja de två celltyperna under trypsinization-proceduren. Även om, detta steg kan kräva viss utbildning, är metoden mindre tidskrävande och billig jämfört med andra metoder som används för att få ren pericyte kulturer7,8,14. Vidare visade den erhållna kulturen av pericyter här den typiska "spöke"-liknande morfologin med fingerliknande processer och uttryckte flera specifika markörer som α-SMA, PDGFR-β och Nestin (data som inte visas här)12, som är välkända markörer för primära pericyter i kultur1.
Här presenterade vi också en enkel metod för Ca2 +-imaging med hjälp av fluorescerande kalcium indikator färgämnen. Inläsning av pericyterna med färgämnena (Fura-2 och Cal-520) ska utföras vid RT och inte vid 37 °C. Flera studier har utfört lastning av AM-estrar vid 37 °C16,17, men lastning vid denna temperatur kan leda till att estraren kommer in i intracellulära fack som endoplasmatiskt retikulum. Detta är inte att föredra, eftersom Fura-2 AM kan binda till fri Ca2+ instängd i de interna butikerna och därigenom resultera i en lägre ökning av de fluorescerande mätningarna. Därav, Det kan orsaka falska resultat. Även om vi inte har upplevt några större svårigheter med lastning av pericytes vid RT, om man upplever problem ändå, kan man överväga att optimera lastning av ultraljudsbehandling av lastning lösning för 5 min i ett ultraljud bad före lastning av cellerna.
Med den beskrivna metoden observeras lätt intracellulära Ca2+-signalering tillsammans med kontraktion av pericyterna under liveinspelningar, som också kan kvantifieras för vidare analys. Metoden har tidigare använts för att göra den första demonstrationen av in vitro Ca2+-signalering och sammandragning av hjärnan kapillär pericytes12. I tidigare studier olika metoder har använts för att mäta och kvantifiera cellkontraktion som en följd av extracellulära stimulans18,19,20. Men observera preliminära intracellulära svar direkt följt av sammandragning av cellerna var inte en möjlighet i dessa studier. I den aktuella studien är det möjligt att observera den intracellulära signalering och följande sammandragning av cellerna och båda mätningarna kan kvantifieras i samma experiment. Således eliminerar det ytterligare experiment, som är mer tidskrävande också, och visar den direkta kopplingen mellan intracellulära Ca2 +-signalering och de morfologiska förändringar.
Sammanfattningsvis representerar denna studie en enkel och effektiv metod för att isolera och culturing primära hjärnans pericyter. Dessutom visar vi en enkel och reproducerbar metod för att studera intracellulära Ca2+-signalering i odlade pericyter. De metoder som beskrivs här bör ge andra forskare inom området starka verktyg för att studera pericytbiologin och intracellulär signalering i pericyter in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författarna vill uppmärksamma finansiering från Lundbecks stiftelse Research initiative on Brain Barriers and Drug Delivery (RIBBDD) och Simon Hougners Family Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ATP | Tocris | 3245 | |
| Cal-520 AM | AAT Bioquest | 21130 | |
| Cell incubator | Thermo Fisher | ||
| Centrifuge | Thermo Fisher | Heraeus Multifuge 3SR+ | Standard large volume centrifuge for spinning down cells |
| Collagen IV | Sigma Aldrich | C5533 | |
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | Zeiss LSM 510 | Inverted microscope |
| Counting chamber | FastRead | 102 | |
| Coverslip cell chamber | Airekacells | SC15022 | |
| Cremophor EL | Sigma Aldrich | C5135 | Formerly known as Kolliphor EL |
| DMSO | Sigma Aldrich | 471267 | |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium | Sigma Aldrich | D0819 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAA/GE Healthcare | A15-101 | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fisher | F1201 | |
| Glass coverslips 22x22 mm | VWR International | 631-0123 | |
| HBSS | Gibco | 14065-049 | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149 | |
| HEPES | AppliChem Panreac | A1069 | |
| Light microscope | Olympus | Olympus CK2 | Upright light microscope with phase contrast |
| MEM nonessential amino acids | Sigma Aldrich | M7145 | |
| Microplate Reader | BMG LabTech | NOVOstar | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | Phosphate-buffered saline |
| penicillin G sodium/streptomycin sulfate | Sigma Aldrich | P0781 | |
| Pluronic F127 | Sigma Aldrich | P2443 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4299 | |
| T-75 flask | Sigma Aldrich | CLS3972 | |
| 96-well plate | Corning incorporated | 3603 |
References
- Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: Developmental, Physiological, and Pathological Perspectives, Problems, and Promises. Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
- Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
- Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. The Perivascular Astroglial Sheath Provides a Complete Covering of the Brain Microvessels: An Electron Microscopic 3D Reconstruction. Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).
- Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
- Zhou, L., Sohet, F., Daneman, R. Purification of Pericytes from Rodent Optic Nerve by Immunopanning. Cold Spring Harbor Protocols. , 608-617 (2014).
- Liu, G. H., et al. Isolation, Purification, and Cultivation of Primary Retinal Microvascular Pericytes: A Novel Model Using Rats. Microcirculation. 21 (6), 478-489 (2014).
- Nayak, R. C., Herman, I. M. Bovine retinal microvascular pericytes: isolation, propagation, and identification. Methods In Molecular Medicine. 46, 247-263 (2001).
- Nees, S., et al. Isolation, bulk cultivation, and characterization of coronary microvascular pericytes: the second most frequent myocardial cell type in vitro. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 302 (1), H69-H84 (2012).
- Armulik, A., Abramsson, A., Betsholtz, C. Endothelial/pericyte interactions. Circulation Research. 97 (6), 512-523 (2005).
- Helms, H. C., Brodin, B. Methods in Molecular Biology. Cerebral Angiogenesis: Methods and Protocols. Milner, R. 1135, Humana Press Inc. 365-382 (2014).
- Abbracchio, M. P., Burnstock, G., Verkhratsky, A., Zimmermann, H. Purinergic signalling in the nervous system: an overview. Trends in Neurosciences. 32 (1), 19-29 (2009).
- Cai, C., et al. Stimulation-induced rises in cerebral blood flow and local capillary vasoconstriction depend on conducted vascular responses in brain capillaries. PNAS. , (2018).
- Tigges, U., Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. A novel and simple method for culturing pericytes from mouse brain. Microvascular Research. 84 (1), 74-80 (2012).
- Maier, C. L., Shepherd, B. R., Yi, T., Pober, J. S. Explant Outgrowth, Propagation and Characterization of Human Pericytes. Microcirculation. 17 (5), 367-380 (2010).
- Orlidge, A., Damore, P. A. Cell specific effects of glycosaminoglycans on the attachment and proliferation of vascular wall components. Microvascular Research. 31 (1), 41-53 (1986).
- Rhinehart, K., Zhang, Z., Pallone, T. L. Ca2+ signaling and membrane potential in descending vasa recta pericytes and endothelia. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 283, F852-F860 (2002).
- Bintig, W., et al. Purine receptors and Ca2+ signalling in the human blood-brain barrier endothelial cell line hCMEC/D3. Purinergic Signalling. 8 (1), 71-80 (2012).
- Neuhaus, A. A., Couch, Y., Sutherland, B. A., Buchan, A. M. Novel method to study pericyte contractility and responses to ischaemia in vitro using electrical impedance. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2013-2024 (2017).
- Kamouchi, M., et al. Calcium influx pathways in rat CNS pericytes. Molecular Brain Research. 126 (2), 114-120 (2004).
- Das, A., et al. ATP Causes Retinal Pericytes to Contract In vitro. Experimental Eye Research. 46, 349-362 (1988).
