Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Sitosolik Kalsiyum Ölçümleri ve Kalsiyum Görüntüleme Çalışmaları için Beyin Kılcal Perisit Kültürü

Published: May 27, 2020 doi: 10.3791/61253

Summary

Beyin kılcal perisitler kan-beyin bariyer özellikleri ve kan akışının düzenlenmesinde önemli oyunculardır. Bu protokol, beyin kapiller perisitlerin nasıl izole edilebildiğini, kültürlü, hücre tipine göre karakterize ve floresan problarla hücre içi kalsiyum sinyalizasyonunun araştırılması için nasıl uygulanabileceğini açıklamaktadır.

Abstract

Perisitler nörovasküler birim (NVU) olarak bilinen bir yapıda endotel hücreleri ve astrositik endfeet ile ilişkilidir. Beyin kılcal perisit fonksiyonu tam olarak bilinmemektedir. Perisitlerin kapiller gelişim, endotel bariyer sıkışması ve transitez aktivitesinin düzenlenmesi, kapiller tonun düzenlenmesi ve bazı beyin patolojilerinde önemli rol oynamaları ile ilgili olduğu ileri sürülmüştür.

Perisitler beyin parankim süreçlerinde görme zorlukları nedeniyle bozulmamış beyinde araştırmak için zor, yanı sıra NVU diğer hücrelere yakın. Bu protokol, beyin sinyalizasyonu ve patolojilerinde yer alan agonistlerin etkilerinin araştırılabildiği kalsiyum görüntüleme çalışmalarında birincil sığır beyin kılcal damarlarının izolasyonu ve kültürü ve aşağıdaki kullanımları için bir yöntem tanımlamaktadır. Kortikal kılcal damar parçaları kültür şişelerinin altına takılmak için izin verilir ve, 6 gün sonra, endotel hücreleri ve perisitler kılcal parçalar dan dışarı büyüdü. Endotel hücreleri nazik tripsinizasyon ile çıkarılır ve perisitler passaging önce 5 gün daha kültürlenir.

İzole perisitler 96-iyi kültür plakaları içinde tohumlu ve kalsiyum indikatör boya ile yüklenir (Fura-2 acetoxymethyl (AM)) bir plaka okuyucu kurulum hücre içi kalsiyum düzeylerinin ölçümleri için izin vermek için. Alternatif olarak, perisitler kapaklara tohumlanır ve hücre odalarına monte edilir. Kalsiyum indikatörü (Cal-520 AM) ile yüklendirin ardından, kalsiyum canlı görüntüleme 488 nm uyarma dalga boyunda ve 510-520 nm emisyon dalga boyunda konfokal mikroskopi ile yapılabilir.

Burada açıklanan yöntem, primer beyin kapiller perisitlerden ilk hücre içi kalsiyum ölçümlerini elde etmek için kullanılmıştır, perisitlerin ATP ile uyarıldığını ve in vitro olarak bulaşabildiğini göstermiştir.

Introduction

Beyin kapiller perisitler, endotel hücreleri ve astrositler ile birlikte, NVU1,2,3oluşturmaktadır. Kılcal damarların yapısal temelini oluşturan endotel hücreleri, çapı 5-8 m olan uzun silindirik tüpler oluştururlar. Endotel hücreleri düzensiz perisitlerle kaplıdır ve astrositlerden gelen çıkıntılarla çevrilidir; astrosit endfeet.

Kan-beyin bariyeri (BBB), beyin kılcal damarlarında bulunan, besin alışverişi için ana site, gazlar ve beyin ve kan arasında atık ürünler. BBB aynı zamanda endojen ve eksojen nörotoksinlerden beyni korur ve çok sayıda ilaç bileşiminin teslimi için bir engel görevi görehizmet eder. Bariyer fonksiyonu merkezi sinir sistemi (CNS) ilaçları geliştiren ilaç şirketleri için bir odak alanı, hem de bir engeldir. Bu kültür4NVU hücreleri soruşturma büyük bir ilgi mahmuzlu vardır. Beyin astrositleri ve endotel hücreleri bir dizi çalışmada kültürlenmiş ve karakterize edilmiş, perisit kültürü için çalışmalar ve protokoller seyrek tir.

Daha önce yayınlanan protokoller bir dereceye kadar beyin kılcal perisit kültürlerin nesil açıklanan, immünpanning gibi farklı yaklaşımlar bir dizi kullanarak5, yüksek- ve düşük glikoz medya6, floresan-aktive hücre sıralama7, yoğunluk gradyan santrifüj8, vb. Bu yöntemler perisit kültürlerini elde etmek için yeterli görünse de, bazıları zaman alıcı, pahalı ve elde edilen perisitler perisitleri farklılaştırabilen kültür pasajlarının sayısı nedeniyle ideal olmayabilir9. Ayrıca, in vitro sinyalizasyon çalışmalarında kültürlü perisitlerin potansiyeli şimdiye kadar keşfedilmemiştir.

Bu çalışma izole sığır beyin kılcal damarlarından perisit kültürlerin üretimi ve hücre içi kalsiyum değişiklikleri ölçümleri ve görüntüleme çalışmaları için sonraki kurulum üzerinde duruluyor, önemli bir hücre içi ikinci haberci. Kılcal damarların kortikal gri maddeden izolasyonunu kısaca anlatıyoruz (ayrıntılar için helms vd.10)ve perisitlerin izolasyonve kültürünü endotel veya glial hücrelerle kontaminasyon olmadan saf monokültürde tanımlıyoruz. Daha sonra 96-iyi plakalar ve kalsiyum probu Fura-2 için yükleme protokolleri perisit tohumlama için bir protokol sağlar. Son olarak, perisitlerin mikroskop kültür odalarında gerçek zamanlı konfokal görüntülemede nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz ve bunun protokollerini tanımlıyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Hücre culturing için tamponlar ve çözümlerhazırlanması

  1. 4 °C'de bir gecede 50 mL PBS'de insan plasentasından 5 mg kollajen IV eriterek kollajen stok çözeltisini hazırlayın. Aliquot stok çözeltisi 5 mL porsiyona ve -20 °C'de saklayın.
  2. Bir gecede 5 mL steril suda 5 mg fibronektin eriterek fibronektin stok çözeltisini hazırlayın. Fibronektin stoklarını -20 °C'de 500°L'lik aliquotlarda saklayın. Çözülürken, çalışma çözümünün hazırlanması için PBS'yi 50 mL'lik son bir hacme ekleyin ve 4 °C'de saklayın.
  3. 500 mL DMEM'e 50 mL fetal büyükbaş serum (FBS), 5 mL MEM esansiyel olmayan amino asit ve 5 mL penisilin/streptomisin (0,1 g/L streptomisin sülfat ve 100.000 U/L penisilin Gsodyum) ekleyerek Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortasını (DMEM) komple orta hazırlayın.
  4. PBS'de heparin sodyum tuzu eriterek 5 mg/mL heparin stok çözeltisi hazırlayın ve sterilizasyon için 0,2 μm filtreden geçirin. Stok çözeltisini 4 °C'de saklayın.
  5. Kullanımdan hemen önce büyüme ortamını (GM) hazırlayın; T75-flask başına 10 mL DMEM-comp ve 250 μL heparin stok çözeltisini karıştırın.

2. Taze sığır beyninden kılcal damarların izolasyonu

NOT: Sığır beyin kılcal damarları daha önce açıklandığı gibi izole edilmiş ve kültürlüdür (Helms vd.10).

  1. 12 aylıktan büyük olmayan buzağılardan, bir mezbahadan beyin toplayın ve doğrudan buz üzerinde laboratuvara getirin.
  2. Menenjitleri çıkarın ve bir neşter kullanarak beyinden tüm gri madde toplamak. Menenjitleri, gri rengiyle beyni ve gri maddeyi kaplayan film olarak tanımlayın.
  3. Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta (DMEM) gri madde homojenize için 40 mL Dounce doku öğütücü kullanın. Doku öğütücü1/5 ince kısmını gri madde süspansiyonu ile doldurun ve ince parça dolana kadar DMEM ekleyin.
  4. 160 μm naylon net filtre ile homojen filtrasyon ile serbest hücreler ve küçük doku parçaları kılcal ayırın. Filtreleri DMEM-comp ile temizleyin. Kılcal damarları alın ve süspansiyonları 50 mL santrifüj tüpüne birleştirin.
  5. DMEM-comp'daki kılcal damarları yeniden askıya alın ve DNase I (170 U/mL), kollajenaz tip III (200 U/mL) ve tripsin (90 U/mL) enzim karışımını ekleyin. Kılcal damarların sindirimi için 37 °C'lik su banyosunda süspansiyonu 1 saat bekletin.
  6. Süspansiyonu 200 m'lik bir kafes filtreden geçirin ve FBS'de %10 dimetil sülfoksit (DMSO) ile askıya alın. Kılcal damarları bir gecede -80 °C'de dondurun ve uzun süreli depolama için ertesi gün sıvı nitrojene taşıyın.
    NOT: Protokol burada duraklatılabilir.

3. Büyükbaş kılcal damarların tohumlanması ve kültüresi

  1. Gün 0: 0,7 mL kollajen IV stoğunu 6,3 mL PBS ile karıştırın. Çözeltiyi Bir T75 şişesine ekleyin ve şişeyi oda sıcaklığında (RT) 2 saat bekletin veya gece boyunca 4 °C'de bırakın.
  2. Kollajen çözeltisini şişeden çıkarın ve PBS ile üç kez yıkayın.
  3. 7 mL fibronectin çalışma çözeltisi ekleyin ve şişeyi RT'de 30 dk bekletin. Sonra, fibronectin çözeltisi çıkarın ve hemen sonra kılcal tohum.
  4. 30 dk bekleme süresi boyunca, 37 °C'lik bir su banyosunda bir şişe kılcal damarı eritin.
  5. Kılcal damarlar çözüldüğünde, 500 x g ve RT'de 5 dk 30 mL DMEM-comp ve santrifüj içeren bir santrifüj tüpüne hemen aktarın ve 10 mL taze DMEM-comp'da kılcal damar peleti yeniden askıya alın.
  6. 10 mL süspansiyonu kaplamalı T75 şişesine aktarın ve kılcal damarları şişenin dibine yapışmak için 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde %10 CO2'yeçıkarın.
    NOT: Hücre büyüme hızı geleneksel %5 CO2yerine %10 CO2'de daha yüksektir.
  7. Kuluçka 4-6 saat sonra bir ışık mikroskop altında şişe kontrol edin. Kılcal damar kesirleri artık şişenin altına iliştirilmelidir(Şekil 1, gün 0).
  8. GM'i hazırlayın ve DMEN-comp ortamını kılcal damarlardan çok dikkatli bir şekilde aspire edin ve 10 mL taze yapılmış GM ile değiştirin.
  9. 2. Gün: Gm'i kılcal damarlardan çıkarın ve 10 mL taze yapılmış GM ile değiştirin.

4. Büyükbaş beyin kılcal damarlarından birincil perisitlerin izolasyonu

  1. 4. Gün: Kılcal damarları ışık mikroskobu altında inceleyin.
    NOT: Şişe nin uygun miktarda perisit sağlaması için %60-70 oranında konfüçel olmalıdır(Şekil 1, gün 4). Bu durumda değilse; GM'i 10 mL taze orta ile değiştirin ve şişeyi kuvözde başka bir gün bekletin.
  2. Ortamı aspire edin ve pbs'de hücreleri nazikçe yıkayın.
  3. Endotel hücreleri için 2 mL çözülmüş Tripsin-EDTA ekleyin ve şişeyi kuvözde 1-3 dk bekletin. Şişeyi sık sık dışarı alın ve bu süre zarfında mikroskopla gözlemleyin.
    NOT: Endotel hücreleri toplanıp şişeden ayrılması gerekir; perisitler "hayalet" morfolojisi olan hücreler olarak görülebilmeli ve yine de şişenin yüzeyine iliştirilmelidir. Bu zor ve önemli bir adımdır. Bu perisit monokültür kontaminasyonönlemek için en endotel hücrelerinin kaldırmak için gereklidir, ancak uzun süreli tripsinizasyon da perisitler ayırmak olabilir. Tripsinizasyon süresi zaman zaman biraz değişebilir ve bu nedenle tedavi sırasında şişeyi mikroskopla sık sık gözlemlemek son derece önemlidir.
  4. Yavaşça şişe dokunun, endotel hücreleri toplamaya başladı, gevşemiş endotel hücreleri ayırmak için.
  5. Tripsinizasyonu durdurmak için şişeye 10 mL DMEM-comp ekleyin. Endotel hücrelerini çıkarmak için şişeyi orta ile birkaç kez dikkatlice temizle. Şişeden endotel hücre süspansiyonu aspire edin. Endotel hücreleri artık başka amaçlar için kullanılabilir.
  6. Şişeye 10 mL DMEM-comp ekleyin. Perisitlerin hala mevcut olduğundan ve dibe bağlı olduğundan emin olmak için ışık mikroskobunun altına bakın. Perisitle zenginleştirilmiş kültürün büyümesine izin vermek için şişeyi kuvöze geri koy.
    NOT: İlerleyen günlerde kültürü gözlemlemek önemlidir. Hala başka bir tripsin tedavisi büyüyen endotel hücrelerinin adil bir miktar varsa yapılabilir.
  7. Perisit monokültürünün DMEM-comp değişikliğiyle büyümesine izin verin. orta her iki günde bir. Işık mikroskobu altındaki hücrelerin büyümesini kontrol edin(Şekil 1, gün 5-8).

5. Birincil büyükbaş perisitlerin monokültürünün üretimi ve depolanması

  1. 8-9. Gün: Kılcal damarları ışık mikroskobu altında inceleyin
    NOT: Perisitler artık %70-80 birikme noktasına ulaşmış ve şişedeki adalarda yetişmiş olmalıdır(Şekil 1, gün 9). Perisitlerin birleşimi %70'ten azsa, hücrelerin bir gün daha büyümesine izin verin. Perisitler endotel hücrelerinin yapacağı gibi tam bir monokat oluşturmaz.
  2. DMEM-comp aspire edin ve perisitleri 7 mL PBS ile yıkayın.
  3. Şişeye 2 mL tripsin-EDTA ekleyin ve 2-3 dakika kuvözde bırakın. Perisitlerin ne zaman toplanıp şişeden koptuğunu gözlemlemek için şişeyi sık sık ışık mikroskobunun altına yerleştirin. Perisitler toplamaya başladığında, şişe hücreleri ayırmak için nazikçe dinlenebilir.
  4. Perisitler topolmaya başladığında hücreleri ayırmak için şişeye hafifçe dokunun.
  5. Trypsinizasyon işlemini durdurmak için şişeye 10 mL DMEM-comp ekleyin. Son perisitleri ayırmak için şişeyi birkaç kez orta ile temizle.
  6. 12 mL hücreli süspansiyonu 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve DMEM-comp ile 30 mL'ye kadar doldurun.
  7. 500 x g ve RT. DMEM-comp aspire 5 dakika hücre süspansiyon santrifüj. hücre pelet dokunmadan dikkatle. %10 DMSO ile FBS'nin 3 mL'inde hücre peletini yeniden askıya alın.
  8. Hücre süspansiyonunun cryovials'a aktarılması; her birine 1 mL ekleyin, böylece T75 şişesi başına toplam 3 şişe perisit olacaktır. Perisitleri bir gecede -80 °C'de dondurun ve uzun süreli depolama için ertesi gün sıvı nitrojene taşıyın.
    NOT: Hücreler donmadan önce sağkalım yüzdesi daha sonraki bir tahmin için sayılabilir. Protokol burada duraklatılmış olabilir.

6. Deneyler için perisit monokültür oluşturma

  1. Bölüm 3.1-3.4'te belirtilen prosedürü kullanarak kollajen IV ve fibronektin içeren bir T75 şişesi katın.
  2. Şişe fibronektin ile kaplanırken, 37 °C'lik bir su banyosunda bir şişe perisiti eritin.
  3. Şimdi çözülmüş perisitleri cryovial'dan 30 mL DMEM-comp içeren bir santrifüj tüpüne aktarın. 500 x g5 dakika hücre süspansiyon santrifüj , RT.
  4. Dikkatle tüp altında hücre pelet bırakarak, orta aspire. Peleti 10 mL DMEM-comp'da yeniden askıya alın.
  5. Hücre süspansiyonunu toplayın ve kaplamalı şişeye aktarın. Şişeyi perisitlerle birlikte bırakarak 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde %10 CO2'debüyütün.
  6. Her iki günde bir, 10 mL taze DMEM-comp ile ortamı yenileyin.
    NOT: 5 günlük büyümeden sonra perisitlerin yaklaşık %80 birleştiği yer ine ulaşmış olması gerekir. Birleşim daha az ise, hücreleri başka bir veya iki gün büyümeye bırakın. Hücreler artık daha fazla deney için tohumlama için hazır olmalıdır.

7. Kaplamalı 96 kuyulu bir tabakta perisit lerin tohumlanması

  1. Adım 3.1'de açıklandığı gibi seyreltik kollajen IV. 96 kuyulu bir plakada her kuyuya 100°L ekleyin ve RT'de 2 saat veya gece boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
  2. Çözeltiyi aspire edin ve kuyuları PBS ile üç kez yıkayın.
  3. Her kuyuya 100 μL seyreltilmiş fibronektin ekleyin ve 30 dakika boyunca RT'de kuluçkaya yatırın. Fibronektin çözeltisini çıkarın ve hemen plakayı kullanın.
    NOT: Perisit innene bağlı olarak, iki tabak tohumlama için yeterli hücre olmalıdır.
  4. Perisitleri kuvözden alın ve ortayı aspire edin. Hücreleri PBS ile yıkayın.
  5. Perisitlere 2 mL tripsin-EDTA ekleyin ve adım 5.3-5.6'daki gibi aynı prosedürü uygulayın.
  6. Hücre peletine zarar vermeden ortamı aspire edin ve pele'yi 1 mL taze DMEM-comp'da yeniden askıya alın.
  7. Hücre süspansiyonunun 12 μL'sini çıkarve sayma odasına ekleyin. Işık mikroskobu altında, 3x3 ızgaraların en az 3'ünü sayın ve ızgara başına ortalama hücre sayısını kullanın.
  8. 96 kuyuplakasında, her kuyuya ekilmesi gereken hücre süspansiyonhacmini hesaplamak için aşağıdaki denklemi kullanın.
  9. 200 μL'lik son hacme ulaşmak için DMEM-comp ve her kuyudaki hücre süspansiyonunun hesaplanan hacmini ekleyin.
  10. 96 kuyulu plakayı 37 °C'lik bir kuluçka makinesine %10 CO2'yeyerleştirin. 2 gün sonra orta bir değişiklik ile 4 gün büyümeye hücreleri bırakın.

8. Ca2+-görüntüleme için tampon ve çözümlerin hazırlanması

  1. Otoklav kapak hücre odaları ve kapakları.
  2. Tahlil tamponu: 10 mM HEPES son konsantrasyonu için 500 mL HBSS tamponuna 1,19 g HEPES ekleyin. pH'ı 7.4 olarak ayarlayın.
  3. %20 (w/v) Pluronik F127 + %1 (v/v) polietosite castor yağı çözeltisini, bir cam şişede 2,5 mL susuz DMSO'da 0,5 g Pluronic F127 çözeltisini eriterek hazırlayın. Yaklaşık 30 dakika veya çözünmüş ve girdap kadar 40 °C'ye ısıtın. 25 μL polietositli hint yağı ekleyin ve RT'de saklayın. Donma.
  4. 1 mg'ı 500 μL'lik susuz DMSO'da eriterek 2 mM Fura-2 stokhazırlayın. -20 °C'de ışıktan korunan 20°L'lik aliquotlarda saklayın.
  5. 2 0 μL 20 mM Fura-2 aliquot 20 μL ile % 20 Pluronic F-127 + %1 polietoksitli hint yağı stok çözeltisini karıştırarak 5 μM Fura-2 yükleme çözeltisini hazırlayın. 500 μL'lik bir arabellek ve girdap ekleyin. 8 mL'lik son bir ses ekine tahlil arabelleği ekleyin. Çözelti kullanılmadan hemen önce hazırlanmalı ve ışıktan korunmalıdır.
  6. 4 mM Cal-520 AM'i 1 mg'ı 226.7 μL susuz DMSO'da eriterek hazırlayın. -20 °C'de ışıktan korunan 20°L'lik aliquotlarda saklayın.
  7. 20 μL Cal-520 yükleme çözeltisini 20 μL 20 Pluronic F-127 + %1 polietonik castor yağı çözeltisini 20 μL 4 mM Cal-520 aliquot ile karıştırarak hazırlayın. 500 μL'lik bir arabellek ve girdap ekleyin. 4 mL'lik son bir ses ekine tahlil arabelleği ekleyin. Çözelti kullanılmadan hemen önce hazırlanmalı ve ışıktan korunmalıdır.

9. Perisitlerin Fura-2 kalsiyum indikatör boyası ile bir plaka okuyucu kurulumunda yüklenmesi

NOT: Tüm çözümler deneme başlamadan önce RT'de olmalıdır.

  1. 96 kuyulu plakayı kuvözdeki hücrelerle birlikte alın ve ortayı kuyulardan aspire edin. Hücreleri iki kez tsay arabelleği ile yıkayın.
  2. Her kuyuya 100 μL yükleme çözeltisi ekleyin ve fotoğraf beyazlatma önlemek için plakafolyo ile sarın. RT sallayarak 30 rpm ile 45 dakika boyunca kuluçka.
    NOT: İç bölmeleri yükleyebileceğinden Fura-2 AM'i 37 °C'de yüklemeyin. Arabellek yükleme yerine, arabellek tesbit hücreleri ile kuyubırakmayı unutmayın; bunlar arka plan floresanını ölçmek için kullanılan "boşluklar"dır.
  3. Yükleme arabelleği aspire ve iki kez istinat arabellek ile hücreleri yıkayın. 100 μL taze tazyik arabelleği ekleyin ve hücreleri RT'de 30 dakika kuluçkaya yatırmaya bırakın; bu AM-ester sürekli bölünme ve böylece hücrelerin içinde Fura-2 bindirme sağlar.
  4. Ca2+-görüntülemeden önce, arabelleği 100 μL taze arama arabelleği ile yıkayın ve değiştirin.

10. Bir plaka okuyucu kurulumunda perisitlerin iyi plaka floresan okuması

  1. Plaka okuyucunun sıcaklığını 37 °C'ye ayarlayın ve hücrelerle birlikte 96 kuyulu plakayı örnek plaka konumuna aktarın. Reaktif plakasını agonist ile reaktif plakası pozisyonuna yerleştirin.
  2. Tüm kuyularda Fura-2 eşit yükleme sağlamak için hücrelerin yükleme ölçerek başlayın.
  3. Ölçümleri 340 nm/380 nm ve emisyon dalga boyu 510 nm'de uyarma floresan dalga boyu ile gerçekleştirin. Reaktif plakasından numune plaka sıyrık konumundaki hücrelerle birlikte her kuyuya 150 μL/s hızda 50 μL agonist ekleyin.
  4. Daha fazla analiz için verileri kaydedin ve xlsx dosyaları olarak dışa aktarın. Şekil 2, arka plan floresansının çıkarıldığı zaman içinde iki uyarma dalga boyu arasındaki oran olarak ölçülen sitosolik Ca2+-tepkisini gösterir.
    NOT: Plaka okuyucu bir "hücre tepsisi" ve bir "örnek tepsi" ve entegre pipettor sistemi için oda ile çift mikroplaka okuyucu olması gerekir.

11. Canlı görüntüleme için perisitlerin kaplamalı hücre haznesinde tohumlanması

NOT: Kapaklar, yukarıda açıklandığı gibi kültür kuyularının altına da yerleştirilebilir, kaplanabilir ve perisitlerle kaplanabilir ve deneylerden önce hazneye monte edilebilir.

  1. Hücre odasına bir kapak kayması monte edin ve sızıntıyı önlemek için sıkı olun.
  2. Adım 3.1'de açıklandığı gibi seyreltik kollajen IV. Her hücre odasına 500°L ekleyin ve RT'de 2 saat veya gece boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
  3. Kollajen çözeltisini aspire edin ve odaları 500 μL PBS ile üç kez yıkayın.
  4. Her kuyuya 500 μL seyreltilmiş fibronektin ekleyin ve 30 dakika boyunca RT'de kuluçkaya yatırın. Fibronektin çözeltisini çıkarın ve hücre odasını hemen ardından kullanın.
  5. Bu arada, confluent perisitler ile şişe çıkarmak ve PBS 7 mL ile yıkayın.
  6. Perisitlere 2 mL tripsin-EDTA ekleyin ve adım 5.3-5.6'daki gibi aynı prosedürü uygulayın.
  7. Adım 8.6-8.7'deki gibi aynı adımları izleyerek devam edin.
  8. Hücre süspansiyon hacmini hesaplamak için aşağıdaki denklemi kullanın, oda başına 90.000 hücre tohumlamak için her odaya eklenmelidir.
  9. 500 μL'lik son hacme ulaşmak için her odada DMEM-comp ve hesaplanan hücre süspansiyon hacmini ekleyin.
  10. Hücre odalarını 37 °C, %10 CO2'dekuvözde yerleştirin. Hücreleri 6 gün (veya konfluent kadar) büyümeye bırakın.
    NOT: Perisitler plastik ile karşılaştırıldığında cam slaytlar üzerinde yavaş büyür; büyüme gün daha gereklidir.

12. Canlı görüntüleme için perisitlerin Cal-520 kalsiyum indikatör boyası ile yüklenmesi

NOT: Tüm çözümler deneme başlamadan önce RT'de olmalıdır.

  1. 20 μM Cal-520 yükleme tamponunu hazırlayın: 20 μL 4 mM Cal-520 aliquot ile %20 Pluronic F-127 + %1 polietosite castor yağı stok çözeltisini karıştırın. 500 μL tsay arabellek ve girdap ekleyin. 4 mL'lik son bir ses ekine tahlil arabelleği ekleyin. Çözelti kullanılmadan hemen önce hazırlanmalı ve ışıktan korunmalıdır.
    NOT: Cal-520 içeren çözümleri ışığa maruz kalmaktan koruyun.
  2. Hücre odalarını kuvözden alın ve ortayı aspire edin. Hücreleri iki kez tsay arabelleği ile yıkayın.
  3. Her hazneye 500 μL yükleme tamponu ekleyin ve RT'de 45 dakika kuluçkaya yatırın.
  4. Yükleme tamponuna aspire edin ve hücreleri iki kez tsay arabelleği ile yıkayın.
  5. Her odaya 500 μL taze test tamponu ekleyin ve AM-esterin bölünmesine izin vermek için RT'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
  6. Bir konfokal mikroskopta canlı görüntüleme gerçekleştirmeden önce arabelleği 500 μL taze arsay arabelleği ile değiştirin.

13. Hücre içi Ca2+seviyelerinin canlı görüntülemesi

NOT: Görüntüleme için çeşitli mikroskop tipleri kullanılabilir. Dik veya ters konvansiyonel floresan mikroskopların yanı sıra uygun uyarma kaynağı (488 nm) ve emisyon filtrelerine (510-520 nm) sahip dik veya ters konfokal lazer tarama mikroskopları kullanılabilir. Hedefler floresan için uygun olmalı ve yüksek kalitede ve yüksek sayısal diyafram (NA) ile olmalıdır.

  1. Hücrelerin bozulmasını önlemek için hücre odasını mümkün olduğunca nazik bir şekilde konfokal mikroskobun sahnesine monte edin.
  2. 488 nm uyarma dalga boyu, 515 nm emisyon, 5 saniye aralıklarla sıralı görüntü edinimi, 512 x 512 piksel XY görüntü boyutu seçin ve temel kalsiyum sinyallerini ölçmek için 2 dk ölçün.
  3. Bir pipet ile hücre odasına 100 mM ATP 3 μL ekleyin ve sıralı görüntü edinimi devam edin. Eklemeyi, hazırlığı bozmamak ve hücreleri odak dışına taşımak için yavaş ve nazikçe gerçekleştirin.
  4. Değişikliklerin derecesini gözlemleyin ve daha fazla morfolojik değişiklik belirtilmeden yaklaşık 18 dk boyunca gerektiği gibi zaman aralığını artırın(Şekil 3).
  5. Hızlandırılmış görüntüleri kaydedin ve daha fazla analiz için bunları TIFF ve/veya AVI dosyaları olarak dışa aktarın.
    NOT: Bir perisit şişesi 1-2 96-iyi plakalar ve çeşitli kapaklar içinde tohumlama için yeterli hücre vermelidir, yani her iki tip kalsiyum ölçümleri için de hücreleri hazırlayabilirsiniz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sığır beyin kılcal damarları taze beyin dokusundan izole edildi ve Şekil 1 gün içinde kılcal tohumlama ve hücresel büyüme ve perisitlerin sonraki saflaştırma sını ortaya koy. Kılcal damarlar 1. 4 gün sonra hücresel büyüme son derece belirgindir(Şekil 1, gün 4a) ve endotel hücreleri açıklanan protokole göre nazik tripsinizasyon ile uzaklaştırılır. Kılcal damarların kalıntıları tripsinizasyondan sonra bulunabilir, ancak sonraki günlerde şişeden kaybolur(Şekil 1, gün 4b-6). Endotel tabakası nın çıkarılmasından sonra perisitler endotel hücrelerinden farklı morfoloji ile kolayca tespit edilir. Perisitler şişeye güçlü bir şekilde bağlanan parmak benzeri süreçler sunarlar(Şekil 1, gün 4b). Daha sonra perisitlerin biraraya gelene kadar büyümesine izin verilir(Şekil 1, gün 4b-9) ve 9. Bu, 4.

ATP hücre içi Ca2+-sinyal1 iyi bilinen endojen indükleyici ve perisitlerde Ca 2+düzeylerinde sitosolik değişiklikler neden olmak için bir ekstrasellüler uyarıcı olarak kullanılmıştır. Açıklanan protokole göre Fura-2 yüklü perisitlere ATP eklenmesi, Şekil 2'degösterildiği gibi floresan oranı olarak ölçülen sitosolik Ca2+seviyelerinde artışa yol açmıştır. ATP kaynaklı yanıt perisitlere ATP eklenmesinden hemen sonra oluşur ve ölçülen zaman dilimi içinde yavaş yavaş azalır.

Hücre içi Ca2+yanıtlarının gerçek zamanlı konfokal görüntülemesi için bu protokolü kullanan perisitler, kaplanmış kapaklara yerleştirildi, Cal-520 ile yüklendi ve konfokal mikroskoba yerleştirildi. Şekil 3 (0 s) tedavi den önce floresan temel düzeyleri ile perisitgösterir. Canlı kayıt sırasında perisitlere ATP eklenir ve (64 s) kısa bir süre sonra güçlü bir hücre içi Ca2+yanıtı belirgindir. Kısa bir süre sonra, sitosolik Ca2 + hücrelerde bölümlere ve hücre alanında bir azalma görülebilir (189 s). Kayıtların 300 s. sonrası başlangıcında, hücre alanı ağır bir şekilde azalır ve Ca2+-sinyali bazal floresan yakın yoğunluk tadmıştır.

Figure 1
Şekil 1: Kılcal damarların culturing ve perisitizolasyon. Kılcal damarlar taze sığır beyninden izole edilmiş ve 0. Büyükbaş beyin kılcal damarlarıve perisitlerin izole edilmesi gün boyunca ışık mikroskobu ile takip edildi. Gün 4a endotel hücreleri kaldırmak için tripsin ile tedavi öncesi endotel hücre büyümesini gösterir ve gün 4b tedaviden hemen sonra kalıntıları gösterir. Gün 8a odak düzlemi gösterir, herhangi bir kılcal kalıntılar görünür olacağını, gün 8b perisitlerin büyüme görünür olduğu düzlemüzerinde odaklanmış ise.  Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Fura-2 kalsiyum indikatör boyakullanılarak hücre içi kalsiyum ölçümünün temsili örneği. Primer perisitler 96 kuyu plakasında tohumlanmış ve hücre içi kalsiyumdaki değişiklikleri görselleştirmek için Fura-2 ile yüklenmiştir. 30 s. de perisitlere 10 μM ATP eklenir ve sitosolik Ca2+-yanıt iki uyarma dalga boyu arasındaki oran olarak ölçülür; Zaman içinde 340 nm ve 380 nm. Ölçek çubukları standart sapma olarak tanımlanır (N=3, n=1). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Cal-520 kalsiyum indikatör boyakullanılarak hücre içi kalsiyum canlı görüntülemenin temsili örneği. Primer perisitler hücre içi kalsiyum ve hücre morfolojisindeki değişiklikleri görselleştirmek için bir hücre odasında tohumlanmış ve Cal-520 ile yüklenmiştir. Perisitlere 600 μM ATP eklenir ve canlı görüntüleme sırasında farklı zaman noktalarından anlık görüntüler burada sunulur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu çalışmada, primer perisitleri büyükbaş beyinlerden izole etmek için bir yöntem sunduk. Açıklanan protokol, bu aksi takdirde erişilemeyen hücre tipi nin kültürüne izin verir. Daha sonra elde edilen hücre kültürü perisitlerin neredeyse homojen bir popülasyon, çok az veya hiç hücre morfolojisi ve protein ekspresyonuna dayalı glial hücreler ile kontaminasyon oldu12. Ayrıca, perisitleri ca2+görüntüleme için kalsiyum boyalarla doldurmak için basit ve basit bir yöntem gösterdik.

Beyin dokusundan birincil hücreleri izole ederken ana konulardan biri dokuya sınırlı erişimdir. Birkaç önceki çalışmalarda, sıçan lar ve fareler kullanılan geleneksel model hayvanlar, ancak bu küçük hayvanların beyin dokusu seyrek6,13. İnsan beyninden izolasyon da yapılmıştır14; ancak, etik sorunlar nedeniyle bu kolayca erişilebilir değildir. Bu nedenle, mevcut bir kaynaktan yüksek hücre verimi tercih edilir. Tek bir büyükbaş beyinden izolasyondan elde edilen hücre şişelerinin sayısı fare veya sıçandan elde edilen miktarı çok daha fazla bularak sığır dokusunu bahsedilen diğer kaynaklara göre avantajlı hale getirir. Burada açıklanan yöntemin bir diğer avantajı perisitsaf bir kültür elde etmek için düşük geçiş numarasıdır. Duvar hücrelerinin geçişi de-diferansiyasyonalabilirsiniz 15 ve bu nedenle, tercihen kaçınılmalıdır. Bu protokolde, endotel hücre tabakasıkaldırmak için nazik trypsinization perisitler izole etmek için kullanılan tek bir adım dır ve bu nedenle de bu protokolde açıklanan en kritik adımlardan biridir. Tripsinizasyon uzamışsa, perisitler endotel hücreleri ile birlikte şişeden kopmaya başlar, bu da sadece küçük bir verime yol açacaktır. Öte yandan, sadece çok kısa bir tripsinizasyon süresine izin vermek perisitlerin saf olmayan bir kültürüne neden olabilir. Bu nedenle tripsinizasyon adımısırasında hücreleri çok sık gözlemlemek son derece önemlidir. Tripsinizasyon işlemi sırasında iki hücre tipini ayırt edebilmek için perisitler ve endotel hücreleri arasındaki morfolojik farklılıkların farkında olmak gerekir. Rağmen, Bu adım bazı eğitim gerektirebilir, yöntem daha az zaman alıcı ve diğer yöntemlere göre ucuz saf perisitkültürlerielde etmek için kullanılan 7,8,14. Ayrıca, burada perisitelde kültürü parmak benzeri süreçleri ile tipik "hayalet" benzeri morfoloji gösterdi ve α-SMA, PDGFR-β ve Nestin gibi birkaç özel belirteçleri ifade (veri burada gösterilmez)12, hangi kültürdebirincil perisitler için iyi bilinen işaretleri 1 .

Burada floresan kalsiyum indikatör boyaları kullanarak Ca2+-görüntüleme için basit bir yöntem sunduk. Perisitlerin boyalarla (Fura-2 ve Cal-520) yüklenmesi 37 °C'de değil, RT'de yapılmalıdır. Çeşitli çalışmalar 37 °C16,17esterlerinin yüklenmesi gerçekleştirilmiştir, ancak bu sıcaklıkta yükleme, esterlerin endoplazmik retikulum gibi hücre içi bölmelere girmesine yol açabilir. Fura-2 serbest Ca 2 bağlanabilir gibi bu tercih edilmez+ iç mağazalarda sıkışıp ve böylece floresan ölçümleri daha düşük bir artış alabilirsiniz. Bu nedenle, yanlış sonuçlara neden olabilir. RT'de perisitlerin yüklenmesinde herhangi bir zorluk yaşamamış olsak da, eğer bir sorun yaşanıyorsa, hücrelerin yüklenmesinden önce ultrason banyosunda 5 dakika boyunca yükleme çözeltisinin sonication ile yüklemeyi optimize etmeyi düşünebilirsiniz.

Açıklanan yöntemle, perisitlerin daralması ile birlikte hücre içi Ca2+sinyali canlı kayıtlar sırasında kolayca gözlemlenir ve bu da daha ileri analiziçin ölçülebilir. Yöntem daha önce in vitro Ca2 +-sinyalizasyon ve beyin kapiller perisit12kasılması ilk gösteri yapmak için kullanılmıştır. Önceki çalışmalarda hücre dışı uyaran18,19,20sonucunda hücre daralmasını ölçmek ve ölçmek için çeşitli yöntemler kullanılmıştır. Ancak, doğrudan hücrelerin kasılması takip ön hücre içi yanıtı gözlemleyerek bu çalışmalarda bir olasılık değildi. Mevcut çalışmada hücre içi sinyalizasyonunu ve aşağıdaki hücrelerin daralmasını gözlemlemek mümkündür ve her iki ölçüm de aynı deneyde ölçülebilir. Böylece, daha fazla zaman alan ek deneyleri ortadan kaldırır ve hücre içi Ca2+sinyali ile morfolojik değişiklikler arasındaki doğrudan bağlantıyı gösterir.

Sonuç olarak, bu çalışma birincil beyin perisitlerinin izole ve culturing için basit ve etkili bir yöntemi temsil eder. Buna ek olarak, kültürlü perisitlerde hücre içi Ca2+sinyalizasyonunu incelemek için kolay ve tekrarlanabilir bir yöntem gösteriyoruz. Burada açıklanan yöntemler, perisit biyolojisi ve perisit içi sinyalizasyon in vitro çalışma güçlü araçlar ile alanında diğer araştırmacılar sağlamalıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları beyan.

Acknowledgments

Yazarlar Beyin Bariyerleri ve İlaç Dağıtım Lundbeck Vakfı Araştırma girişimi (RIBBDD) ve Simon Hougners Aile Vakfı fon kabul etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ATP Tocris 3245
Cal-520 AM AAT Bioquest 21130
Cell incubator Thermo Fisher
Centrifuge Thermo Fisher Heraeus Multifuge 3SR+ Standard large volume centrifuge for spinning down cells
Collagen IV Sigma Aldrich C5533
Confocal laser scanning microscope Carl Zeiss Zeiss LSM 510 Inverted microscope
Counting chamber FastRead 102
Coverslip cell chamber Airekacells SC15022
Cremophor EL Sigma Aldrich C5135 Formerly known as Kolliphor EL
DMSO Sigma Aldrich 471267
Dulbecco's Modified Eagles Medium Sigma Aldrich D0819
Fetal bovine serum (FBS) PAA/GE Healthcare A15-101
Fibronectin Sigma Aldrich F1141
Fura-2 AM Thermo Fisher F1201
Glass coverslips 22x22 mm VWR International 631-0123
HBSS Gibco 14065-049
Heparin Sigma Aldrich H3149
HEPES AppliChem Panreac A1069
Light microscope Olympus Olympus CK2 Upright light microscope with phase contrast
MEM nonessential amino acids Sigma Aldrich M7145
Microplate Reader BMG LabTech NOVOstar
PBS Sigma Aldrich D8537 Phosphate-buffered saline
penicillin G sodium/streptomycin sulfate Sigma Aldrich P0781
Pluronic F127 Sigma Aldrich P2443
Trypsin-EDTA Sigma Aldrich T4299
T-75 flask Sigma Aldrich CLS3972
96-well plate Corning incorporated 3603

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: Developmental, Physiological, and Pathological Perspectives, Problems, and Promises. Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
  2. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  3. Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. The Perivascular Astroglial Sheath Provides a Complete Covering of the Brain Microvessels: An Electron Microscopic 3D Reconstruction. Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).
  4. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
  5. Zhou, L., Sohet, F., Daneman, R. Purification of Pericytes from Rodent Optic Nerve by Immunopanning. Cold Spring Harbor Protocols. , 608-617 (2014).
  6. Liu, G. H., et al. Isolation, Purification, and Cultivation of Primary Retinal Microvascular Pericytes: A Novel Model Using Rats. Microcirculation. 21 (6), 478-489 (2014).
  7. Nayak, R. C., Herman, I. M. Bovine retinal microvascular pericytes: isolation, propagation, and identification. Methods In Molecular Medicine. 46, 247-263 (2001).
  8. Nees, S., et al. Isolation, bulk cultivation, and characterization of coronary microvascular pericytes: the second most frequent myocardial cell type in vitro. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 302 (1), H69-H84 (2012).
  9. Armulik, A., Abramsson, A., Betsholtz, C. Endothelial/pericyte interactions. Circulation Research. 97 (6), 512-523 (2005).
  10. Helms, H. C., Brodin, B. Methods in Molecular Biology. Cerebral Angiogenesis: Methods and Protocols. Milner, R. 1135, Humana Press Inc. 365-382 (2014).
  11. Abbracchio, M. P., Burnstock, G., Verkhratsky, A., Zimmermann, H. Purinergic signalling in the nervous system: an overview. Trends in Neurosciences. 32 (1), 19-29 (2009).
  12. Cai, C., et al. Stimulation-induced rises in cerebral blood flow and local capillary vasoconstriction depend on conducted vascular responses in brain capillaries. PNAS. , (2018).
  13. Tigges, U., Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. A novel and simple method for culturing pericytes from mouse brain. Microvascular Research. 84 (1), 74-80 (2012).
  14. Maier, C. L., Shepherd, B. R., Yi, T., Pober, J. S. Explant Outgrowth, Propagation and Characterization of Human Pericytes. Microcirculation. 17 (5), 367-380 (2010).
  15. Orlidge, A., Damore, P. A. Cell specific effects of glycosaminoglycans on the attachment and proliferation of vascular wall components. Microvascular Research. 31 (1), 41-53 (1986).
  16. Rhinehart, K., Zhang, Z., Pallone, T. L. Ca2+ signaling and membrane potential in descending vasa recta pericytes and endothelia. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 283, F852-F860 (2002).
  17. Bintig, W., et al. Purine receptors and Ca2+ signalling in the human blood-brain barrier endothelial cell line hCMEC/D3. Purinergic Signalling. 8 (1), 71-80 (2012).
  18. Neuhaus, A. A., Couch, Y., Sutherland, B. A., Buchan, A. M. Novel method to study pericyte contractility and responses to ischaemia in vitro using electrical impedance. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2013-2024 (2017).
  19. Kamouchi, M., et al. Calcium influx pathways in rat CNS pericytes. Molecular Brain Research. 126 (2), 114-120 (2004).
  20. Das, A., et al. ATP Causes Retinal Pericytes to Contract In vitro. Experimental Eye Research. 46, 349-362 (1988).

Tags

Nörobilim Sayı 159 Perisit ATP Ca2+-sinyal Fura-2 Cal-520 hücre kültürü plaka okuyucu konfokal lazer tarama mikroskopisi
Sitosolik Kalsiyum Ölçümleri ve Kalsiyum Görüntüleme Çalışmaları için Beyin Kılcal Perisit Kültürü
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hørlyck, S., Helms, H. C. C.,More

Hørlyck, S., Helms, H. C. C., Brodin, B. Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies. J. Vis. Exp. (159), e61253, doi:10.3791/61253 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter