Summary
Hersencapillaire pericyten zijn essentiële spelers in de regulatie van bloed-hersenbarrière eigenschappen en bloedstroom. Dit protocol beschrijft hoe hersencapillaire pericyten kunnen worden geïsoleerd, gekweekt, gekenmerkt met betrekking tot celtype en toegepast voor onderzoeken van intracellulaire calcium signalering met fluorescerende sondes.
Abstract
Pericyten worden geassocieerd met endotheelcellen en astrocytische endfeet in een structuur die bekend staat als de neurovasculaire eenheid (NVU). Brain capillary pericyte functie is niet volledig bekend. Pericyten zijn voorgesteld om betrokken te zijn bij capillaire ontwikkeling, regulering van endotheelbarrièredichtheid en trancytoseactiviteit, regulering van capillaire toon en om cruciale rollen te spelen in bepaalde hersenpathologieën.
Pericyten zijn een uitdaging om te onderzoeken in de intacte hersenen als gevolg van de moeilijkheden bij het visualiseren van processen in de hersenen parenchyma, evenals de nabijheid van de andere cellen van de NVU. Het huidige protocol beschrijft een methode voor isolatie en cultuur van primaire boviene hersenen capillaire pericyten en hun volgende gebruik in calcium imaging studies, waar effecten van agonisten die betrokken zijn bij de hersenen signalering en pathologieën kunnen worden onderzocht. Corticale capillaire fragmenten mogen zich aan de bodem van kweekkolven hechten en na 6 dagen zijn endotheelcellen en pericyten uit de haarvaten gegroeid. De endotheelcellen worden verwijderd door zachte trypsinisatie en pericyten worden gekweekt voor 5 extra dagen alvorens te overgaan.
Geïsoleerde pericyten worden gezaaid in 96-well kweekplaten en geladen met de calciumindicatorkleurstof (Fura-2 acetoxymethyl (AM)) om metingen van intracellulaire calciumniveaus in een opstelling van de plaatlezer mogelijk te maken. Als alternatief worden pericyten op coverslips gezaaid en in celkamers gemonteerd. Na het laden met de calciumindicator (Cal-520 AM) kan calcium live-imaging worden uitgevoerd met behulp van confocale microscopie op een excitatiegolflengte van 488 nm en emissiegolflengte van 510-520 nm.
De hier beschreven methode is gebruikt om de eerste intracellulaire calciummetingen te verkrijgen van primaire hersencapillaaire pericyten, waaruit blijkt dat pericyten worden gestimuleerd via ATP en in vitro kunnen samentrekken.
Introduction
Hersencapillary pericyten vormen samen met endotheelcellen en astrocyten de NVU1,2,3. De endotheelcellen, die de structurele basis van de haarvaten vormen, vormen lange cilindrische buizen met een diameter van 5-8 μm. De endotheelcellen zijn sporadisch bedekt met pericyten en omgeven door uitsteeksels van astrocyten; de astrocyten eindvoeten.
De bloed-hersenbarrière (BBB), gelegen in de hersenvaten, is de belangrijkste plaats voor de uitwisseling van voedingsstoffen, gassen en afvalstoffen tussen de hersenen en het bloed. De BBB beschermt ook de hersenen tegen endogene en exogene neurotoxinen en dient als een barrière voor de levering van een groot aantal geneesmiddelenverbindingen. De barrièrefunctie is een aandachtsgebied, evenals een obstakel, voor farmaceutische bedrijven die geneesmiddelen ontwikkelen voor het centrale zenuwstelsel (CNS). Dit heeft een grote belangstelling aangespoord voor het onderzoek naar de cellen van de NVU in cultuur4. Hersen astrocyten en endotheelcellen zijn gekweekt en gekenmerkt in een aantal studies, terwijl de studies en protocollen voor pericyte cultuur zijn schaars.
Eerder gepubliceerde protocollen hebben de generatie van hersencapillaire pericyte culturen tot op zekere hoogte beschreven, met behulp van een reeks verschillende benaderingen, zoals immunopanning5,hoog- en laagglucose media6, fluorescerend geactiveerde celsorden7, dichtheidgradiëntcentrifugatie8, enz. Hoewel deze methoden voldoende lijken om culturen van pericyten te verkrijgen, zijn sommige tijdrovend, duur en de verkregen pericyten misschien niet ideaal vanwege het aantal cultuurpassages dat de pericyten9kan de-differentiëren. Bovendien is het potentieel van gekweekte pericyten in in vitro signaleringsstudies tot nu toe vrij onontgonnen.
Het huidige werk richt zich op het genereren van pericyte culturen uit geïsoleerde runderhersenvaten haarvaten en de daaropvolgende opstelling voor metingen en beeldvorming studies van veranderingen in intracellulair calcium, een belangrijke intracellulaire tweede boodschapper. We beschrijven kort de isolatie van haarvaten van corticale grijze stof (voor details zie Helms et al.10)en de isolatie en cultuur van pericyten in pure monocultuur zonder besmetting met endotheel of gliacellen. Vervolgens bieden we een protocol voor het zaaien van pericyten in 96-well platen en laadprotocollen voor de calciumsonde Fura-2 AM. Tot slot laten we zien hoe pericyten kunnen worden gebruikt in real-time confocale beeldvorming in microscoopcultuurkamers en beschrijven we de protocollen hiervoor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van buffers en oplossingen voor celkuring
- Bereid collageen voorraad oplossing door het oplossen van 5 mg collageen IV uit de menselijke placenta in 50 mL PBS 's nachts bij 4 °C. Aliquot de voorraadoplossing in 5 mL gedeelten en bewaar bij -20 °C.
- Bereid fibronectine voorraad oplossing door het oplossen van 5 mg fibronectine in 5 mL steriel water 's nachts. Bewaar de fibronectinvoorraden in aliquots van 500 μL bij -20 °C. Voeg bij het ontdooien PBS toe aan een eindvolume van 50 mL om de werkoplossing voor te bereiden en op te slaan op 4 °C.
- Bereid dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) compleet medium voor door 50 mL foetale runderserum (FBS), 5 mL mem-niet-essentiële aminozuren en 5 mL penicilline/streptomycine (0,1 g/L streptomycinesulfaat en 100.000 U/L penicilline G natrium) tot 500 mL DMEM.
- Bereid 5 mg/mL heparine voorraadoplossing voor door heparine natriumzout in PBS op te lossen en door een 0,2 μm filter te laten gaan voor sterilisatie. Bewaar de voorraadoplossing op 4 °C.
- Bereid groeimedium (GM) vlak voor gebruik voor; meng 10 mL DMEM-comp en 250 μL heparine voorraadoplossing per T75-kolf.
2. Isolatie van haarvaten van verse runderhersenen
OPMERKING: Rundersne hersenvaten worden geïsoleerd en gekweekt zoals eerder beschreven (Helms et al.10).
- Verzamel hersenen van kalveren, niet ouder dan 12 maanden, uit een slachthuis en breng direct naar het lab op ijs.
- Verwijder de hersenvliezen en verzamel alle grijze stof uit de hersenen met behulp van een scalpel. Identificeer de hersenvliezen als de film die de hersenen en de grijze stof door zijn grijze kleur.
- Gebruik een 40 mL Dounce weefselmolen om de grijze stof te homogeniseren in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM). Vul het slanke deel van de weefselmolen 1/5 met een suspensie van grijze stof en voeg DMEM toe totdat het slanke deel is gevuld.
- Scheid de haarvaten van vrije cellen en kleinere weefselstukken door filtratie van het homogenaat door middel van een 160 μm nylon netfilter. Spoel de filters door met DMEM-comp. Haal de haarvaten op en verberg de suspensies in 50 mL centrifugatiebuizen.
- Resuspend de haarvaten in DMEM-comp en voeg een enzymmix van DNase I (170 U/mL), collagenase type III (200 U/mL) en trypsine (90 U/mL). Laat de suspensie 1 uur in een waterbad van 37 °C voor de vertering van de haarvaten.
- Voer de suspensie door een 200 μm mesh filter en resuspend in FBS met 10% dimethylsulfoxide (DMSO). Vries de haarvaten 's nachts bij -80 °C en verplaats ze de dag erna naar vloeibare stikstof voor langdurige opslag.
LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken.
3. Zaaien en kweken van rundervaten
- Dag 0: Meng 0,7 mL collageen IV-bouillon met 6,3 mL PBS. Voeg de oplossing toe aan een T75-kolf en laat de kolf 2 uur bij kamertemperatuur (RT) staan of laat deze 's nachts op 4 °C.
- Haal de collageenoplossing uit de kolf en was drie keer met PBS.
- Voeg 7 mL fibronectin werkoplossing toe en laat de kolf 30 minuten bij RT. Verwijder vervolgens de fibronectine-oplossing en zaad de haarvaten onmiddellijk daarna.
- Ontdooi tijdens de wachttijd van 30 minuten één flesje haarvaten in een waterbad van 37 °C.
- Wanneer de haarvaten ontdooid zijn, moet u onmiddellijk met 30 mL DMEM-comp en centrifuge gedurende 5 minuten bij 500 x g en RT. Verwijder DMEM-comp uit de buis en schors de capillaire pellet opnieuw in 10 mL verse DMEM-comp.
- Breng de 10 mL-ophanging over op de gecoate T75-kolf en laat de haarvaten 4-6 uur aan de bodem van de kolf hechten in een 37 °C-incubator bij 10% CO2.
LET OP: De celgroei is hoger met 10% CO2 in plaats van de conventionele 5% CO2. - Na 4-6 uur incubatie inspecteer de kolf onder een lichtmicroscoop. Fracties van haarvaten moeten nu aan de bodem van de kolf worden bevestigd(figuur 1, dag 0).
- Bereid GM en aanzuigen de DMEN-comp medium zeer voorzichtig uit de haarvaten en vervang het door 10 mL vers gemaakte GM.
- Dag 2: Verwijder GM uit de haarvaten en vervang met 10 mL vers gemaakte GM. Cellulaire uitgroei uit de haarvaten moet zichtbaar zijn onder een lichtmicroscoop op dit punt(figuur 1, dag 2-3).
4. Isolatie van primaire pericyten van runderhersenvaten haarvaten
-
Dag 4: Inspecteer de haarvaten onder een lichtmicroscoop.
OPMERKING: De kolf moet nu ongeveer 60-70% samenvloeien om een passende hoeveelheid pericyten te verstrekken (figuur 1, dag 4). Als dit niet het geval is; de GM vervangen door 10 ml vers medium en laat de kolf nog een dag in de couveuse staan. - Aspirate het medium en was de cellen zachtjes in PBS.
- Voeg 2 mL ontdooide Trypsin-EDTA toe voor endotheelcellen en laat de kolf 1-3 min in de couveuse. Neem de kolf regelmatig en observeer met de microscoop tijdens deze periode.
OPMERKING: De endotheelcellen moeten naar boven afronden en loskomen van de kolf; pericyten moeten zichtbaar zijn als cellen met een "spook"-morfologie en nog steeds worden bevestigd aan het oppervlak van de kolf. Dit is een lastige en belangrijke stap. Het is essentieel om de meeste endotheelcellen te verwijderen om besmetting van de pericyte monocultuur te voorkomen, maar langdurige trypsinisatie kan ook de pericyten losmaken. De trypsinisatietijd kan van tijd tot tijd enigszins variëren en het is daarom van het grootste belang om de kolf vaak met de microscoop te observeren tijdens de behandeling. - Tik voorzichtig op de kolf, wanneer de endotheelcellen zijn begonnen naar boven te afronden, om de losgemaakte endotheelcellen los te maken.
- Voeg 10 ml DMEM-comp toe aan de kolf om de trypsinisatie te stoppen. Spoel de kolf voorzichtig een paar keer met het medium om de endotheelcellen te verwijderen. Aspirate de endotheelcel suspensie uit de kolf. De endotheelcellen kunnen nu voor andere doeleinden worden gebruikt.
- Voeg 10 mL DMEM-comp toe aan de kolf. Kijk onder de lichtmicroscoop om ervoor te zorgen dat de pericyten nog steeds aanwezig zijn en aan de onderkant zijn bevestigd. Doe de kolf terug in de couveuse om de met pericyten verrijkte cultuur te laten groeien.
LET OP: Het is belangrijk om de cultuur te observeren tijdens de volgende dagen. Als er nog een behoorlijke hoeveelheid endotheelcellen groeit, kan een andere trypsine-behandeling worden uitgevoerd. - Laat de pericyte monocultuur groeien met verandering van DMEM-comp. medium elke tweede dag. Controleer de groei van de cellen onder de lichtmicroscoop(figuur 1, dag 5-8).
5. Productie en opslag van een monocultuur van primaire boviene peryten
-
Dag 8-9: Inspecteer de haarvaten onder een lichtmicroscoop
OPMERKING: De pericyten moeten nu 70-80% samenvloeiing hebben bereikt en groeien op eilanden in de kolf(figuur 1, dag 9). Als de samenvloeiing van de pericyten minder dan 70% is, laat de cellen groeien voor een andere dag. De pericyten zullen geen volledige monolaag vormen zoals de endotheelcellen dat zouden doen. - Aspirate DMEM-comp en was de pericyten met 7 mL PBS.
- Voeg 2 mL trypsin-EDTA toe aan de kolf en laat deze 2-3 min in de couveuse. Plaats de kolf vaak onder de lichtmicroscoop om te observeren wanneer de pericyten naar boven afronden en losmaken van de kolf. Wanneer de pericyten zijn begonnen te ronden, kan de kolf voorzichtig worden getapt om de cellen los te maken.
- Tik voorzichtig op de kolf, wanneer de pericyten zijn begonnen te ronden, om de cellen los te maken.
- Voeg 10 mL DMEM-comp toe aan de kolf om het trypsinisatieproces te stoppen. Spoel de kolf een paar keer door met het medium om de laatste pericyten los te maken.
- Breng de 12 mL celsuspensie over naar een 50 mL centrifugatiebuis en vul tot 30 mL met DMEM-comp.
- Centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 min bij 500 x g en RT. Aspirate de DMEM-comp. voorzichtig zonder de celkorrel aan te raken. Resuspend de celpellet in 3 mL FBS met 10% DMSO.
- Breng de celsuspensie over in cryovials; voeg 1 mL aan elk, dus er zal een totaal van 3 flesjes per T75-kolf van pericyten. Bevries de pericyten 's nachts bij -80 °C en verplaats ze de dag erna naar vloeibare stikstof voor langdurige opslag.
OPMERKING: Cellen kunnen worden geteld voor het bevriezen voor een latere schatting van het overlevingspercentage. Het protocol kan hier worden onderbroken.
6. Opzetten van een pericyte monocultuur voor experimenten
- Bedek een T75-kolf met collageen IV en fibronectine met dezelfde procedure als vermeld in punt 3.1-3.4.
- Terwijl de kolf wordt bedekt met fibronectine, ontdooit u een flesje pericyten in een waterbad van 37 °C.
- Breng de nu ontdooide pericyten van de cryovial naar een centrifugatie buis met 30 mL van DMEM-comp. Centrifuge de cel suspensie gedurende 5 min op 500 x g, RT.
- Voorzichtig aspirate het medium, waardoor de cel pellet aan de onderkant van de buis. Stel de pellet opnieuw op in 10 mL DMEM-comp.
- Verzamel en breng de celsuspensie over naar de gecoate kolf. Laat de kolf met pericyten groeien in een 37 °C incubator met 10% CO2.
- Vernieuw het medium elke tweede dag met 10 mL verse DMEM-comp.
LET OP: Na 5 dagen van groei, moeten de pericyten ongeveer 80% samenvloeiing hebben bereikt. Als de samenvloeiing minder is, laat de cellen groeien voor een dag of twee. De cellen moeten nu klaar zijn voor het zaaien voor verdere experimenten.
7. Zaaien van pericyten in een gecoate 96-put plaat
- Verdun collageen IV zoals beschreven in stap 3.1. Voeg 100 μL toe aan elke put in een 96-putplaat en incubbate voor 2 uur bij RT of 's nachts bij 4 °C.
- Spoel de oplossing aan en was de putten drie keer met PBS.
- Voeg 100 μL verdunde fibronectine toe aan elke put en incubbate bij RT gedurende 30 minuten. Verwijder de fibronectin-oplossing en gebruik de plaat onmiddellijk.
OPMERKING: Afhankelijk van hoe goed de pericyte batch groeit, moeten er genoeg cellen zijn voor het zaaien van twee platen. - Haal de pericyten uit de couveuse en aspirate het medium. Was de cellen met PBS.
- Voeg 2 mL trypsin-EDTA toe aan de pericyten en volg dezelfde procedure als in stap 5.3-5.6.
- Aspirate het medium, zonder schade aan de cel pellet en opnieuw op te schorten de pellet in 1 mL van verse DMEM-comp.
- Neem 12 μL celsuspensie en voeg toe aan een telkamer. Tel onder de lichtmicroscoop minstens 3 van de 3x3 rasters en gebruik het gemiddelde aantal cellen per raster.
- Gebruik de onderstaande vergelijking om het volume van de cel suspensie die moet worden toegevoegd aan elke put te 10.000 cellen per goed te berekenen, in de 96-put plaat.
- Voeg DMEM-comp en het berekende volume van celsuspensie in elke put toe om een eindvolume van 200 μL te bereiken.
- Plaats de 96-put plaat in een 37 °C incubator op 10% CO2. Laat de cellen 4 dagen groeien met een verandering van medium na 2 dagen.
8. Voorbereiding van buffers en oplossingen voor Ca2+-imaging
- Autoclave covertlip celkamers en coverslips.
- Assay buffer: Voeg 1,19 g HEPES toe aan 500 mL HBSS-buffer voor een uiteindelijke concentratie van 10 mM HEPES. Pas de pH aan op 7,4.
- Bereid 20% (w/v) Pluronic F127 + 1% (v/v) polyethoxylated ricinusoliebouillonoplossing voor door 0,5 g Pluronic F127-oplossing op te lossen in 2,5 mL watervrije DMSO in een glazen flacon. Verwarm tot 40 °C gedurende ongeveer 30 min of tot opgelost en vortex. Voeg 25 μL polyethoxylhoudende ricinusolie toe en bewaar bij RT. Niet bevriezen.
- Bereid 2 mM Fura-2 AM voorraad door het oplossen van 1 mg in 500 μL van watervrije DMSO. Bewaar in aliquots van 20 μL bij -20 °C beschermd tegen licht.
- Bereid 5 μM Fura-2 AM laadoplossing voor door 20 μL van 20% Pluronic F-127 + 1% polyethoxylated ricinusolievoorraadoplossing te mengen met de 20 μL van 2 mM Fura-2 AM aliquot. Voeg 500 μL testbuffer en vortex toe. Voeg testbuffer toe aan een eindvolume van 8 mL. De oplossing moet onmiddellijk voor gebruik worden voorbereid en tegen licht worden beschermd.
- Bereid 4 mM Cal-520 AM voor door 1 mg op te lossen in 226,7 μL watervrije DMSO. Bewaar in aliquots van 20 μL bij -20 °C beschermd tegen licht.
- Bereid 20 μM Cal-520 AM laadoplossing voor door 20 μL van 20% Pluronic F-127 + 1% polyethoxylated ricinusolievoorraadoplossing te mengen met de 20 μL 4 mM Cal-520 aliquot. Voeg 500 μL testbuffer en vortex toe. Voeg testbuffer toe aan een eindvolume van 4 mL. De oplossing moet onmiddellijk voor gebruik worden voorbereid en tegen licht worden beschermd.
9. Laden van pericyten met Fura-2 AM calcium indicator kleurstof in een plaatlezer setup
OPMERKING: Alle oplossingen moeten bij RT zijn voordat het experiment begint.
- Haal de 96-put plaat met cellen uit de couveuse en aspirate het medium uit de putten. Was de cellen twee keer met testbuffer.
- Voeg 100 μL laadoplossing toe aan elke put en wikkel de plaat met aluminiumfolie, om fotobleken te voorkomen. Incubeer voor 45 min met 30 rpm schudden op RT.
LET OP: Laad Fura-2 AM niet bij 37 °C, omdat het interne compartimenten kan laden. Vergeet niet om putten te verlaten met cellen in testbuffer in plaats van laadbuffer; dit zijn de "blanks" die worden gebruikt voor het meten van achtergrondfluorescentie. - Spoel de laadbuffer aan en was de cellen twee keer met een testbuffer. Voeg 100 μL verse testbuffer toe en laat de cellen 30 minuten inzuigen bij RT; dit zorgt voor continue decolleté van de AM-ester en daardoor het vangen van Fura-2 AM in de cellen.
- Vóór de Ca2+-imaging, was en vervang de buffer door 100 μL verse testbuffer.
10. Well-plate fluorescentie lezing van pericyten in een plaat-reader setup
- Stel de temperatuur van de plaatlezer in op 37 °C en breng de 96-putplaat met cellen over op de positie van de monsterplaat. Plaats de reagensplaat met agonist op de reagensplaatpositie.
- Begin met het meten van het laden van de cellen om gelijke belasting van Fura-2 AM in alle putten te garanderen.
- Voer de metingen uit met excitatiefluorescentiegolflengte bij 340 nm/380 nm en de emissiegolflengte bij 510 nm. Voeg 50 μL agonist met snelheid 150 μL/s van de reagensplaat toe aan elke put met cellen in de positie van de monsterplaat.
- Sla de gegevens op en exporteer als xlsx-bestanden voor verdere analyse. Figuur 2 toont de cytosolische Ca2+-respons gemeten als de verhouding tussen de twee excitatiegolflengten in de tijd, waarbij achtergrondfluorescentie wordt afgetrokken.
OPMERKING: De plaatlezer moet een dubbele microplatelezer zijn met ruimte voor een "cellade" en een "sample tray" en een geïntegreerd pipettorsysteem.
11. Zaaien van pericyten in een gecoate celkamer voor live beeldvorming
OPMERKING: Coverslips kunnen ook worden geplaatst in de bodem van de cultuur putten, bekleed en gezaaid met pericyten zoals hierboven beschreven, en vervolgens gemonteerd in de kamer voorafgaand aan experimenten.
- Monteer een coverslip in de celkamer en maak het strak om lek te voorkomen.
- Verdun collageen IV zoals beschreven in stap 3.1. Voeg 500 μL toe aan elke celkamer en broed gedurende 2 uur bij RT of 's nachts bij 4 °C.
- Spoel de collageenoplossing aan en was de kamers drie keer met 500 μL PBS.
- Voeg 500 μL verdunde fibronectine toe aan elke put en incubbate bij RT gedurende 30 minuten. Verwijder de fibronectin-oplossing en gebruik de celkamer direct daarna.
- Haal ondertussen de kolf met confluent pericyten eruit en was met 7 mL PBS.
- Voeg 2 mL trypsin-EDTA toe aan de pericyten en volg dezelfde procedure als in stap 5.3-5.6.
- Ga door dezelfde stappen te volgen als in stap 8.6-8.7.
- Gebruik de onderstaande vergelijking om het volume van de celsuspensie te berekenen, die aan elke kamer moet worden toegevoegd om 90.000 cellen per kamer te zaaien.
- Voeg DMEM-comp en het berekende volume van celsuspensie in elke kamer toe om een eindvolume van 500 μL te bereiken.
- Plaats de celkamers in de couveuse op 37 °C, 10% CO2. Laat de cellen 6 dagen groeien (of tot confluent).
OPMERKING: De pericyten groeien langzamer op glazen glijbanen in vergelijking met plastic; meer dagen van groei nodig zijn.
12. Laden van pericyten met Cal-520 AM calciumindicatorkleurstof voor levende beeldvorming
OPMERKING: Alle oplossingen moeten bij RT zijn voordat het experiment begint.
- Bereid de 20 μM Cal-520 AM laadbuffer voor: Meng 20 μL van 20% Pluronic F-127 + 1% polyethoxylated ricinusolievoorraadoplossing met de 20 μL 4 mM Cal-520 aliquot. Voeg 500 van μL testbuffer en vortex toe. Voeg testbuffer toe aan een eindvolume van 4 mL. De oplossing moet onmiddellijk voor gebruik worden voorbereid en tegen licht worden beschermd.
OPMERKING: Bescherm oplossingen die Cal-520 AM bevatten tegen blootstelling aan licht. - Haal de celkamers uit de couveuse en aspiraat het medium. Was de cellen twee keer met testbuffer.
- Voeg 500 μL laadbuffer toe aan elke kamer en broed 45 minuten in rt.
- Aspirate de laadbuffer en was de cellen twee keer met testbuffer.
- Voeg 500 μL verse testbuffer toe aan elke kamer en broed gedurende 30 minuten in RT om decolleté van de AM-ester mogelijk te maken.
- Vervang de buffer door 500 μL verse testbuffer voordat u de live beeldvorming uitvoert op een confocale microscoop.
13. Live beeldvorming van intracellulaire Ca2+-niveaus
OPMERKING: Een verscheidenheid aan microscooptypes kan worden gebruikt voor de beeldvorming. Rechtopstaande of omgekeerde conventionele fluorescentiemicroscopen, evenals rechtopstaande of omgekeerde confocale laserscanmicroscopen met geschikte excitatiebron (488 nm) en emissiefilters (510-520 nm) kunnen worden gebruikt. Doelstellingen moeten geschikt zijn voor fluorescentie en van hoge kwaliteit zijn en met een hoog numeriek diafragma (NA).
- Zet de celkamer op het stadium van de confocale microscoop zo zacht mogelijk, om verstoring van de cellen te vermijden.
- Selecteer een excitatiegolflengte van 488 nm, emissie bij 515 nm, sequentiële beeldverwerving met intervallen van 5 seconden, een XY-afbeeldingsgrootte van 512 x 512 pixels en meet gedurende 2 minuten om basiscalciumsignalen te meten.
- Voeg 3 μL van 100 mM ATP toe aan de celkamer met een pipet en zet de sequentiële beeldverwerving voort. Voer de toevoeging langzaam en voorzichtig uit om de voorbereiding niet te verstoren en de cellen onscherp te verplaatsen.
- Let op de mate van veranderingen en verhoog het tijdsinterval in de loop van de tijd als dat nodig is gedurende ongeveer 18 minuten totdat er geen verdere morfologische verandering wordt opgemerkt(figuur 3).
- Bespaar time-lapse-afbeeldingen en exporteer ze als TIFF- en/of AVI-bestanden voor verdere analyse.
OPMERKING: Een flesje pericyten moet voldoende cellen geven voor het zaaien in 1-2 96-well platen en verschillende coverslips, wat betekent dat je cellen voorbereiden op beide soorten calciummetingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Runderhersenvaten haarvaten werden geïsoleerd uit vers hersenweefsel en figuur 1 presenteert de capillaire zaaien en cellulaire uitgroei over dagen en de daaropvolgende zuivering van pericyten. De haarvaten zijn op dag 1 volledig aan de kolf bevestigd en op dag 2 is het ontkiemen zichtbaar geworden(figuur 1, dag 2). Na 4 dagen is de cellulaire uitgroei zeer onderscheidend(figuur 1, dag 4a) en worden de endotheelcellen verwijderd door zachte trypsinisatie volgens het beschreven protocol. Resten van de haarvaten kunnen aanwezig zijn na de trypsinisatie, maar verdwijnen in de volgende dagen uit de kolf(figuur 1, dag 4b-6). Na verwijdering van de endotheellaag worden pericyten gemakkelijk gedetecteerd met morfologie die zich onderscheidt van de endotheelcellen. De pericyten presenteren vingerachtige processen die sterk hechten aan de kolf(figuur 1, dag 4b). Vervolgens mogen pericyten groeien tot de samenloop(figuur 1, dag 4b-9) en op dag 9 hebben de pericyten ongeveer 80% samenvloeiing bereikt en op eilanden groeien. Dit in tegenstelling tot de endotheelcellen die wel een contactgeremde monolaag veroorzaken die op dag 4 wordt waargenomen.
ATP is een bekende endogene aansporing van intracellulaire Ca2+-signalering11 en werd gebruikt als een extracellulaire stimulans om cytosolische veranderingen in Ca2+-niveaus in pericyten te induceren. Toevoeging van ATP aan de Fura-2 geladen pericyten, zoals volgens het beschreven protocol, resulteerde in een toename van cytosolische Ca2 +-niveaus gemeten als de fluorescerende verhouding zoals weergegeven in figuur 2. De atp-geïnduceerde respons treedt onmiddellijk op na toevoeging van ATP aan de pericyten en daalt langzaam gedurende de gemeten periode.
Met behulp van dit protocol voor real-time confocale beeldvorming van intracellulaire Ca2 +-reacties, pericyten werden gezaaid op gecoate coverslips, geladen met Cal-520 AM en geplaatst op de confocale microscoop. Figuur 3 (0 s) toont de pericyten met basislijnniveaus van fluorescentie voorafgaand aan de behandeling. Tijdens de live-opname wordt ATP toegevoegd aan de pericyten en kort daarna is een sterke intracellulaire Ca2+-respons zichtbaar (64 s). Kort daarna wordt de cytosolische Ca2+ compartimenten in de cellen gecompartimenteert en is een vermindering van het celgebied zichtbaar (189 s). Bij 300 s. na het begin van de opnames, is het celgebied sterk verminderd en is het Ca2+-signaal gedaald tot intensiteit dicht bij de baseline fluorescentie.
Figuur 1: Culturing van haarvaten en isolatie van pericyten. Haarvaten zijn geïsoleerd van verse runderhersenen en op dag 0 in kweekkolven gezaaid. Uitgroei van de boviene hersenen haarvaten en de volgende isolatie van pericyten werden gevolgd over dagen met een lichtmicroscoop. Dag 4a toont de endotheelcelgroei voorafgaand aan de behandeling met trypsine om endotheelcellen te verwijderen en dag 4b toont de restanten onmiddellijk na de behandeling. Dag 8a toont het focusvlak, waar capillaire restanten zichtbaar zouden zijn, terwijl dag 8b gericht is op het vlak waar de groei van de pericyten zichtbaar is. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Representatief voorbeeld van intracellulaire calciummeting met fura-2 calciumindicatorkleurstof. Primaire pericyten zijn gezaaid in 96 putplaten en geladen met Fura-2 AM om veranderingen in intracellulair calcium te visualiseren. 10 μM ATP wordt toegevoegd aan de pericyten bij 30 s. en de cytosolische Ca2+-respons wordt gemeten als de verhouding tussen de twee excitatiegolflengten; 340 nm en 380 nm na verloop van tijd. Schaalbalken worden gedefinieerd als standaarddeviatie (N=3, n=1). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Representatief voorbeeld van intracellulaire calcium live-imaging met cal-520 calciumindicatorkleurstof. Primaire pericyten zijn gezaaid in een celkamer en geladen met Cal-520 om veranderingen in intracellulaire calcium- en celmorfologie te visualiseren. 600 μM ATP wordt toegevoegd aan de pericyten en snapshots van verschillende tijdstippen tijdens de live-imaging worden hier gepresenteerd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie hebben we een methode gepresenteerd om primaire pericyten te isoleren van runderhersenen. Het beschreven protocol staat cultuur van dit anders eerder ontoegankelijke celtype toe. De later verkregen celkweek was een bijna homogene populatie van pericyten, met weinig of geen besmetting met endotheelcellen en gliacellen op basis van celmorfologie en eiwitexpressie12. Bovendien hebben we een eenvoudige en eenvoudige methode aangetoond om de pericyten te laden met calciumkleurstoffen voor Ca2+-imaging met behulp van twee verschillende methoden, afhankelijk van de beoogde uitkomst.
Een van de belangrijkste problemen bij het isoleren van primaire cellen uit hersenweefsel is de beperkte toegang tot weefsel. In verschillende eerdere studies, ratten en muizen zijn de traditionele modeldieren gebruikt, maar het hersenweefsel van deze kleine dieren zijn schaars6,13. Isolatie van het menselijk brein is ook uitgevoerd14; vanwege ethische kwesties is dit echter niet gemakkelijk toegankelijk. Daarom heeft een hoge celopbrengst van een beschikbare bron de voorkeur. Het aantal celcontrals dat is verkregen uit isolatie van één runderhersenen, is veruit groter dan het bedrag dat is verkregen van muizen of ratten, waardoor het runderweefsel voordelig is ten opzichte van de andere genoemde bronnen. Een ander voordeel van de hier beschreven methode is het lage passageaantal om een zuivere cultuur van pericyten te verkrijgen. Het doorgeven van muurschilderingcellen kan leiden tot de-differentiatie15 en moet daarom bij voorkeur worden vermeden. In dit protocol is zachte trypsinisatie om de endotheelcellaag te verwijderen een enkele stap die wordt gebruikt om de pericyten te isoleren en daarom ook een van de meest kritieke stappen beschreven in dit protocol. Als de trypsinisatie wordt verlengd, zullen de pericyten beginnen los te komen van de kolf samen met de endotheelcellen, wat leidt tot slechts een kleine opbrengst. Aan de andere kant, alleen waardoor een zeer korte trypsinization tijd kan leiden tot een onzuivere cultuur van pericyten. Het is daarom van het grootste belang om de cellen zeer vaak te observeren tijdens de trypsinisatiestap. Men moet zich bewust zijn van de morfologische verschillen tussen pericyten en endotheelcellen om de twee celtypen te kunnen onderscheiden tijdens de trypsinisatieprocedure. Hoewel deze stap enige opleiding vereist, is de methode minder tijdrovend en goedkoop in vergelijking met andere methoden die worden gebruikt om pure pericyte culturen te verkrijgen7,8,14. Bovendien toonde de verkregen cultuur van pericyten hier de typische "spook"-achtige morfologie met vingerachtige processen en drukte verschillende specifieke markers uit, zoals α-SMA, PDGFR-β en Nestin (gegevens die hier niet worden weergegeven)12, die bekende markers zijn voor primaire pericyten in cultuur1.
Hier presenteerden we ook een eenvoudige methode voor Ca2 +-imaging met behulp van fluorescerende calcium indicator kleurstoffen. Het laden van de pericyten met de kleurstoffen (Fura-2 en Cal-520) moet worden uitgevoerd bij RT en niet bij 37 °C. Verschillende studies hebben het laden van AM-esters uitgevoerd bij 37 °C16,17, maar laden bij deze temperatuur kan ertoe leiden dat de esters intracellulaire compartimenten binnendringen, zoals het endoplasmische reticulum. Dit heeft niet de voorkeur, omdat de Fura-2 AM kan binden aan gratis Ca2 + gevangen in de interne winkels en daardoor resulteren in een lagere toename van de fluorescerende metingen. Vandaar, het kan leiden tot valse resultaten. Hoewel we geen grote problemen hebben ondervonden met het laden van de pericyten bij RT, als men hoe dan ook problemen ondervindt, zou men kunnen overwegen het laden te optimaliseren door de laadoplossing gedurende 5 minuten in een ultrasoonbad voorafgaand aan het laden van de cellen.
Met de beschreven methode wordt intracellulaire Ca2+-signalering samen met samentrekking van de pericyten gemakkelijk waargenomen tijdens live-opnames, die ook kunnen worden gekwantificeerd voor verdere analyse. De methode is eerder gebruikt om de eerste demonstratie van in vitro Ca2 +-signalering en samentrekking van brain capillary pericyten12. In eerdere studies zijn verschillende methoden gebruikt om celcontractie te meten en te kwantificeren als gevolg van extracellulaire stimulus18,19,20. Het observeren van de voorlopige intracellulaire respons die direct werd gevolgd door samentrekking van de cellen was in deze studies echter geen mogelijkheid. In het huidige onderzoek is het mogelijk om de intracellulaire signalering en de volgende samentrekking van de cellen te observeren en beide metingen kunnen in hetzelfde experiment worden gekwantificeerd. Zo elimineert het extra experimenten, die ook tijdrovender zijn, en toont het directe verband tussen intracellulaire Ca2+-signalering en de morfologische veranderingen.
Tot slot, deze studie vertegenwoordigt een eenvoudige en effectieve methode voor het isoleren en culturing primaire hersenen pericyten. Daarnaast demonstreren we een eenvoudige en reproduceerbare methode om intracellulaire Ca2+-signalering in gekweekte pericyten te bestuderen. De hier beschreven methoden moeten andere onderzoekers in het veld voorzien van sterke instrumenten om de pericytebiologie en intracellulaire signalering in pericyten in vitro te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
De auteurs willen de financiering van de Lundbeck Foundation Research initiatief on Brain Barriers and Drug Delivery (RIBBDD) en Simon Hougners Family Foundation te erkennen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ATP | Tocris | 3245 | |
| Cal-520 AM | AAT Bioquest | 21130 | |
| Cell incubator | Thermo Fisher | ||
| Centrifuge | Thermo Fisher | Heraeus Multifuge 3SR+ | Standard large volume centrifuge for spinning down cells |
| Collagen IV | Sigma Aldrich | C5533 | |
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | Zeiss LSM 510 | Inverted microscope |
| Counting chamber | FastRead | 102 | |
| Coverslip cell chamber | Airekacells | SC15022 | |
| Cremophor EL | Sigma Aldrich | C5135 | Formerly known as Kolliphor EL |
| DMSO | Sigma Aldrich | 471267 | |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium | Sigma Aldrich | D0819 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAA/GE Healthcare | A15-101 | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fisher | F1201 | |
| Glass coverslips 22x22 mm | VWR International | 631-0123 | |
| HBSS | Gibco | 14065-049 | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149 | |
| HEPES | AppliChem Panreac | A1069 | |
| Light microscope | Olympus | Olympus CK2 | Upright light microscope with phase contrast |
| MEM nonessential amino acids | Sigma Aldrich | M7145 | |
| Microplate Reader | BMG LabTech | NOVOstar | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | Phosphate-buffered saline |
| penicillin G sodium/streptomycin sulfate | Sigma Aldrich | P0781 | |
| Pluronic F127 | Sigma Aldrich | P2443 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4299 | |
| T-75 flask | Sigma Aldrich | CLS3972 | |
| 96-well plate | Corning incorporated | 3603 |
References
- Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: Developmental, Physiological, and Pathological Perspectives, Problems, and Promises. Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
- Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
- Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. The Perivascular Astroglial Sheath Provides a Complete Covering of the Brain Microvessels: An Electron Microscopic 3D Reconstruction. Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).
- Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
- Zhou, L., Sohet, F., Daneman, R. Purification of Pericytes from Rodent Optic Nerve by Immunopanning. Cold Spring Harbor Protocols. , 608-617 (2014).
- Liu, G. H., et al. Isolation, Purification, and Cultivation of Primary Retinal Microvascular Pericytes: A Novel Model Using Rats. Microcirculation. 21 (6), 478-489 (2014).
- Nayak, R. C., Herman, I. M. Bovine retinal microvascular pericytes: isolation, propagation, and identification. Methods In Molecular Medicine. 46, 247-263 (2001).
- Nees, S., et al. Isolation, bulk cultivation, and characterization of coronary microvascular pericytes: the second most frequent myocardial cell type in vitro. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 302 (1), H69-H84 (2012).
- Armulik, A., Abramsson, A., Betsholtz, C. Endothelial/pericyte interactions. Circulation Research. 97 (6), 512-523 (2005).
- Helms, H. C., Brodin, B. Methods in Molecular Biology. Cerebral Angiogenesis: Methods and Protocols. Milner, R. 1135, Humana Press Inc. 365-382 (2014).
- Abbracchio, M. P., Burnstock, G., Verkhratsky, A., Zimmermann, H. Purinergic signalling in the nervous system: an overview. Trends in Neurosciences. 32 (1), 19-29 (2009).
- Cai, C., et al. Stimulation-induced rises in cerebral blood flow and local capillary vasoconstriction depend on conducted vascular responses in brain capillaries. PNAS. , (2018).
- Tigges, U., Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. A novel and simple method for culturing pericytes from mouse brain. Microvascular Research. 84 (1), 74-80 (2012).
- Maier, C. L., Shepherd, B. R., Yi, T., Pober, J. S. Explant Outgrowth, Propagation and Characterization of Human Pericytes. Microcirculation. 17 (5), 367-380 (2010).
- Orlidge, A., Damore, P. A. Cell specific effects of glycosaminoglycans on the attachment and proliferation of vascular wall components. Microvascular Research. 31 (1), 41-53 (1986).
- Rhinehart, K., Zhang, Z., Pallone, T. L. Ca2+ signaling and membrane potential in descending vasa recta pericytes and endothelia. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 283, F852-F860 (2002).
- Bintig, W., et al. Purine receptors and Ca2+ signalling in the human blood-brain barrier endothelial cell line hCMEC/D3. Purinergic Signalling. 8 (1), 71-80 (2012).
- Neuhaus, A. A., Couch, Y., Sutherland, B. A., Buchan, A. M. Novel method to study pericyte contractility and responses to ischaemia in vitro using electrical impedance. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2013-2024 (2017).
- Kamouchi, M., et al. Calcium influx pathways in rat CNS pericytes. Molecular Brain Research. 126 (2), 114-120 (2004).
- Das, A., et al. ATP Causes Retinal Pericytes to Contract In vitro. Experimental Eye Research. 46, 349-362 (1988).
