Summary
pericytes נימי המוח הם שחקנים חיוניים ברגולציה של תכונות מחסום דם - מוח וזרימת דם. פרוטוקול זה מתאר כיצד pericytes נימות המוח יכול להיות מבודד, תרבותי, מאופיין ביחס לסוג התא והגיש בקשה לחקירות של סידן תאי איתות עם בדיקות פלורסנט.
Abstract
Pericytes קשורים עם תאים אנדותל ו endfeet אסטרוציטים במבנה המכונה היחידה הנוירוסקולרית (NVU). תפקוד פריציט נמת המוח אינו ידוע במלואו. Pericytes הוצעו להיות מעורבים בפיתוח נימי, רגולציה של מחסום אנדותל ופעילות trancytosis, רגולציה של טון נימי ולשחק תפקידים מכריעים בפתולוגיות מוח מסוימות.
Pericytes מאתגרים לחקור במוח שלם בשל הקשיים בהדמיה תהליכים parenchyma במוח, כמו גם את הקרבה לתאים האחרים של NVU. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לבידוד ותרבות של pericytes נימות המוח הראשי של המוח של פר והשימוש הבא שלהם במחקרי הדמיית סידן, שבו ניתן לחקור השפעות של אגוניסטים המעורבים איתות מוחי ופתולוגיות. שברי נימים קליפתיים מותר לצרף לתחתית מבחנות תרבות, ולאחר 6 ימים, תאים אנדותל וpericytes גדלו מתוך שברי נימים. תאי אנדותל מוסרים על ידי טריפסינוזציה עדינה pericytes הם תרבותיים במשך 5 ימים נוספים לפני המעבר.
pericytes מבודד נזרעים 96-well צלחות תרבות טעון עם צבע מחוון סידן (Fura-2 acetoxymethyl (AM)) כדי לאפשר מדידות של רמות סידן תאי בהגדרת קורא צלחת. לחלופין, pericytes הם זרעים על כיסויים רכוב בתאי תא. לאחר טעינה עם מחוון הסידן (Cal-520 AM), סידן חי הדמיה יכול להתבצע באמצעות מיקרוסקופ confocal באורך גל העירור של 488 nm ואורך גל פליטה של 510-520 נה"מ.
השיטה המתוארת כאן שימשה כדי להשיג את מדידות סידן תאי הראשון מpericytes המוח הראשי, המוכיח כי pericytes מגורה באמצעות ATP והם מסוגלים להתכווץ במבחנה.
Introduction
פריציטים נימי המוח, יחד עם תאים אנדותל ואסטרוציטים, מהווים NVU1,2,3. תאי אנדותל, אשר מהווים את הבסיס המבני של הנימים, יוצרים צינורות גליליים ארוכים בקוטר של 5-8 μm. תאי ה אנדותל מכוסים באופן אקראי בpericytes ומוקפים בולטות של אסטרוקיטים; כפות החיים של האסטרוציט.
מחסום הדם - מוח (BBB), ממוקם נימים במוח, הוא האתר העיקרי להחלפת חומרים מזינים, גזים ומוצרי פסולת בין המוח והדם. BBB גם מגן על המוח מפני רעלנים עצביים אנדוגניים אקסוגניים ומשמש כמחסום למסירה של מספר רב של תרכובות סמים. פונקציית המחסום היא אזור מיקוד, כמו גם מכשול, עבור חברות תרופות המפתחות תרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS). זה עורר עניין רב בחקירת התאים של NVU בתרבות4. אסטרוקטים במוח ותאי אנדותל כבר תרבותיים ומאופיין במספר מחקרים, בעוד המחקרים והפרוטוקולים לתרבות pericyte הם שונים.
פרוטוקולים שפורסמו בעבר תיארו דור של תרבויות פריציט נימו המוח במידה מסוימת, באמצעות מגוון של גישות שונות כגון אימונופנינג5, מדיה גבוהה ונלוכה גלוקוז6, פלואורסצנט מופעל תאמיון 7, צנטריפוגההדרגתית צפיפות 8, וכו '. למרות ששיטות אלה נראות מספיקות כדי להשיג תרבויות של פריציטים, חלקן גוזלות זמן, בעלות יקרה והפריקיטים שהושגו לא יהיו אידיאליים בשל מספר מעברי התרבות שיכולים להבדיל בין ה pericytes9. יתר על כן, הפוטנציאל של pericytes מתורא במבחנה איתות מחקרים כבר די לא נחקר עד עכשיו.
העבודה הנוכחית מתמקדת בדור של תרביות פריציט מנימים מבודדים של מוח בקר וההגדרה הבאה למדידות ולחקרי הדמיה של שינויים בסידן תאי, שליח שני תאי חשוב. אנו מתארים בקצרה את הבידוד של נימים מחמר אפור קליפתי (לפרטים ראו הלמס ואח'10)ואת הבידוד והתרבות של pericytes במונוקולטורה טהורה ללא זיהום עם תאים אנדותל או גליה. לאחר מכן אנו מספקים פרוטוקול ל זריעת pericytes ב 96-באר צלחות וטעינת פרוטוקולים עבור גשושית סידן Fura-2 AM. לבסוף, אנו מראים כיצד ניתן להשתמש בפריציטים בהדמיה קונפוקלית בזמן אמת בחדרי תרבות מיקרוסקופ ומתארים את הפרוטוקולים לכך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת מאגרים ופתרונות לקליטת תאים
- להכין פתרון מלאי קולגן על ידי המסת 5 מ"ג קולגן הרביעי מהשיה האנושית ב 50 מ"ל של PBS לילה ב 4 ° C. Aliquot פתרון המניות לתוך 5 מ"ל מנות ולאחסן ב -20 ° C.
- להכין פתרון מלאי פיברונקטין על ידי המסת 5 מ"ג של פיברונקטין ב 5 מ"ל של מים סטריליים בן לילה. לאחסן את מניות פיברונטין ב aliquots של 500 μL ב -20 ° C. בעת הפשרה, הוסף PBS לנפח סופי של 50 מ"ל כדי להכין את פתרון העבודה ולאחסן אותו ב- 4 °C.
- להכין את דן הנשר המותאם (DMEM) של Dulbecco על ידי הוספת 50 מ"ל של סרום של פרווין עוברי (FBS), 5 מ"ל של חומצות אמינו MEM לא חיוניות ו 5 מ"ל של פניקillin / סטרפטומיצין (0.1 גרם / L סטרפטומיצין גופרתי ו 100,000 U / L פניצילין G נתרן) כדי 500 מ"ל של DMEM.
- להכין 5 מ"ג / מ"ל פתרון מלאי הפרין על ידי המסת מלח נתרן הפרין PBS ולהעביר אותו דרך מסנן 0.2 μm עבור עיקור. אחסן את פתרון המלאי ב- 4 °C.
- הכן את מדיום הצמיחה (GM) מיד לפני השימוש; לערבב 10 מ"ל של DMEM-comp ו 250 μL של פתרון מניות הפרין לכל T75-בקבוקון.
2. בידוד נימים ממוח של בשר טרי
הערה: נימי מוח של צב מבודדים ותרבותיים כפי שתואר קודם לכן (הלמס ואח'10).
- לאסוף מוחות מחזיריים, לא יותר מ 12 חודשים של גיל, מבית מטבחיים ולהביא ישירות למעבדה על קרח.
- הסר את קרום המוח ולאסוף את כל החומר האפור מהמוח באמצעות אזמל. זהה את קרום המוח כסרט המכסה את המוח ואת החומר האפור לפי צבעו האפור.
- השתמש מטחנת רקמה Dounce 40 מ"ל כדי homogenize החומר האפור במדיום הנשר שונה של Dulbecco (DMEM). ממלאים את החלק הדק של מטחנת הרקמה 1/5 עם מתלה חומר אפור ומוסיפים DMEM עד שהחלק הדק מתמלא.
- להפריד את הנימים מתאי חופשיים חתיכות רקמה קטנות יותר על ידי סינון של homogenate באמצעות מסנן רשת ניילון 160 μm. התרוקנו באמצעות DMEM-comp. לאחזר את הנימים ולאגבר את המתלים לתוך צינורות צנטריפוגה 50 מ"ל.
- תוסף מחדש את הנימים ב- DMEM-comp והוסף תערובת אנזימים של DNase I (170 U/mL), קולגנאז סוג III (200 U/mL) ו- trypsin (90 U/mL). השאירו את המתלים למשך שעה אחת באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס לעיכול הנימים.
- הפעל את המתלים דרך מסנן רשת 200 μm ואירוח מחדש ב- FBS עם 10% דימתיל sulfoxide (DMSO). מקפיאים את הנימים למשך הלילה ב-80°C ומעבירים אותם לחנקן נוזלי ביום שאחרי לאחסון ארוך טווח.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
3. זריעה ותיוג של נימים של בשר
- היום 0: ערבב 0.7 מ"ל של מניות קולגן IV עם 6.3 מ"ל של PBS. הוסף את הפתרון ל-T75-בקבוקון והשאיר את הבקבוקון למשך 2 שעות בטמפרטורת החדר (RT) או להשאיר אותו למשך הלילה ב-4°C.
- מוציאים את תמיסת הקולגן מהבוקון ושוטפים שלוש פעמים ב-PBS.
- להוסיף 7 מ"ל של פתרון עבודה פיברונקטין ולהשאיר את הבקבוקון במשך 30 דקות ב RT. לאחר מכן, הסר את תמיסת הפיברונקטין וזרע את הנימים מיד לאחר מכן.
- במהלך 30 דקות ההמתנה, להפשיר בקבוקון אחד של נימים באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
- כאשר הנימים מפשירים, להעביר באופן מיידי לצינור צנטריפוגה עם 30 מ"ל של DMEM-comp וצנטריפוגה במשך 5 דקות ב 500 x g ו RT. הסר DMEM-comp מהצינור ולהשעות מחדש את הנימים-גלולה ב 10 מ"ל של DMEM-comp טרי.
- להעביר את המתלים 10 מ"ל T75-בקבוקון מצופה ולהשאיר את הנימים לדבוק בתחתית הבקבוקון במשך 4-6 שעות ב אינקובטור 37 ° C ב 10% CO2.
הערה: שיעור צמיחת התא גבוה יותר ב- 10% CO2 במקום 5% CO2 הרגיל. - לאחר 4-6 שעות של דגירה לבדוק את הבקבוקון תחת מיקרוסקופ אור. כעת יש לחבר שברים של נימים לתחתית הבקבוקון(איור 1,יום 0).
- הכן GM ואפו את המדיום DMEN-comp זהיר מאוד מן הנימים ולהחליף אותו עם 10 מ"ל של GM טרי.
- היום השני: הסר GM מן הנימים ולהחליף עם 10 מ"ל של GM טרי.
4. בידוד של pericytes ראשוני מנימים במוח של קבי
-
היום ה-4: בדוק את הנימים תחת מיקרוסקופ אור.
הערה: הבקבוקון צריך להיות כעת כ 60-70% confluent כדי לספק כמות מתאימה של pericytes(איור 1,יום 4). אם זה לא המקרה; להחליף את GM עם 10 מ"ל של בינוני טרי ולהשאיר את הבקבוקון באינקובטור ליום אחר. - שאפפו את המדיום ושטפו את התאים בעדינות ב-PBS.
- הוסף 2 מ"ל של טריפסין-EDTA מופשרת לתאי אנדותל ולהשאיר את הבקבוקון באינקובטור במשך 1-3 דקות. להוציא את הבקבוקון לעתים קרובות ולהתבונן עם המיקרוסקופ במהלך פרק זמן זה.
הערה: תאי ה אנדותל צריכים לאסוף ולנתק מהבוקון; pericytes צריך להיות גלוי כתאים עם "רוח רפאים"-מורפולוגיה ועדיין להיות מחובר לפני השטח של הבקבוקון. זהו צעד מסובך וחשוב. זה חיוני כדי להסיר את רוב התאים אנדותל כדי למנוע זיהום של monoculture pericyte, אבל trypsinization ממושך יכול גם לנתק את pericytes. זמן trypsinization יכול להשתנות מעט מפעם לפעם, ולכן יש חשיבות עליונה כדי לצפות הבקבוקון לעתים קרובות עם המיקרוסקופ במהלך הטיפול. - הקש בעדינות על הבקבוקון, כאשר תאי ה אנדותל החלו להתעגל, כדי לנתק את תאי ה אנדותל משוחררים.
- כדי לעצור את הנספסינון, הוסף 10 מ"ל של DMEM-comp לבקבוקון. לשטוף את הבקבוקון בזהירות כמה פעמים עם המדיום כדי להסיר את תאי אנדותל. שאף את מתלי תא ה אנדותל מהבוקון. כעת ניתן להשתמש בתאי אנדותל למטרות אחרות.
- הוסף 10 מ"ל של DMEM-comp לבקבוקון. החפש מתחת למיקרוסקופ האור כדי להבטיח שהפרציטים עדיין קיימים ומצורפים לתחתית. להחזיר את הבקבוקון לאקובטור כדי לאפשר לתרבות המועשרת בפריציט לגדול.
הערה: חשוב לשמור על התרבות בימים הבאים. אם יש עדיין כמות נכבדה של תאים אנדותל גדל טיפול טריפסין אחר יכול להתבצע. - אפשר למונוקולטורה pericyte לגדול עם שינוי של DMEM-comp. מדיום כל יומיים. בדוק את הצמיחה של התאים תחת מיקרוסקופ האור(איור 1,יום 5-8).
5. דור ואחסון של מונוקולטורה של פריציטים ראשיים של בשרים
-
היום ה-8-9: בדוק את הנימים תחת מיקרוסקופ אור
הערה: ההטבות היו אמורות להגיע כעת ל-70%-80% קונפלואנציום ולגדול באיים הבקבוקון(איור 1,יום 9). אם ההתלות של pericytes הוא פחות מ 70%, לאפשר לתאים לגדול ליום אחר. pericytes לא יהיה ליצור שכבת מונו-שכבה מלאה כמו התאים אנדותל היה. - שאיפה DMEM-comp ולשטוף את pericytes עם 7 מ"ל של PBS.
- מוסיפים 2 מ"ל של טריפסין-EDTA לבקבוקון ומשאירים אותו באינקובטור למשך 2-3 דקות. מניחים את הבקבוקון לעתים קרובות מתחת למיקרוסקופ האור כדי להתבונן כאשר הפריציטים לאסוף ולהתנתק מהבוקון. כאשר הצביות החלו להתעגל, ניתן לטפח בעדינות על הבקבוקון כדי לנתק את התאים.
- הקש בעדינות על הבקבוקון, כאשר pericytes החלו להתעגל, כדי לנתק את התאים.
- הוסף 10 מ"ל של DMEM-comp לבקבוקון כדי לעצור את תהליך ה trypsinization. לשטוף את הבקבוקון כמה פעמים עם המדיום כדי לעזור לנתק את pericytes האחרון.
- העבר את מתלי תא 12 מ"ל לצינור צנטריפוגציה של 50 מ"ל ומלא עד 30 מ"ל ב-DMEM-comp.
- צנטריפוגה מתלי התא במשך 5 דקות ב 500 x g ו RT. לשאוף DMEM-comp. בזהירות מבלי לגעת בכדור התא. תולה מחדש את גלולת התא ב 3 מ"ל של FBS עם 10% DMSO.
- העבר את מתלי התא ל- cryovials; להוסיף 1 מ"ל לכל אחד, כך יהיה סך של 3 בקבוקונים לכל T75-בקבוקון של pericytes. מקפיאים את הפריציטים ב-80°C למשך הלילה ומעבירים אותם לחנקן נוזלי ביום שאחרי לאחסון לטווח ארוך.
הערה: ניתן לספור תאים לפני ההקפאה עבור הערכה מאוחרת יותר של אחוזי הישרדות. ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
6. הקמת מונוקולטורה pericyte לניסויים
- ציפוי T75-בקבוקון עם קולגן IV ופיברונטין באמצעות אותו הליך כפי שהוזכר בסעיף 3.1-3.4.
- בעוד הבקבוקון מצופה בפיברונקטין, להפשיר בקבוקון אחד של pericytes באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
- להעביר את pericytes עכשיו מ cryovial לצינור צנטריפוגציה עם 30 מ"ל של DMEM-comp. צנטריפוגה מתלי התא במשך 5 דקות ב 500 x g, RT.
- בזהירות לשאוף את המדיום, עוזב את גלולת התא בתחתית הצינור. להשעות מחדש את הכדור ב 10 מ"ל DMEM-comp.
- לאסוף ולהעביר את מתלי התא לנבפון מצופה. השאירו את הבקבוקון עם pericytes לגדול באינקובטור 37 °C ב 10% CO2.
- בכל יום שני, רענן את המדיום עם 10 מ"ל של DMEM-comp טרי.
הערה: לאחר 5 ימים של צמיחה, pericytes היה צריך להגיע כ 80% conluency. אם הקונפלציה היא פחות, להשאיר את התאים לגדול לעוד יום או יומיים. התאים צריכים להיות מוכנים כעת לניסויים נוספים.
7. זריעת פריציטים בצלחת מצופה 96 באר
- דילו קולגן 4 כמתואר בשלב 3.1. מוסיפים 100 μL לכל באר בצלחת 96-באר דגירה במשך 2 שעות ב RT או לילה ב 4 ° C.
- לשאוף את הפתרון ולשטוף את הבארים שלוש פעמים עם PBS.
- להוסיף 100 μL של פיברונקטין מדולל לכל באר דגירה ב RT במשך 30 דקות. הסר את תמיסת הפיברונקטין והשתמש בצלחת באופן מיידי.
הערה: בהתאם לאופן שבו גדלה האצווה pericyte, צריך להיות מספיק תאים עבור זריעת שתי צלחות. - להוציא את pericytes מהאינקובטור ולאסוף את המדיום. לשטוף את התאים עם PBS.
- הוסף 2 מ"ל של נסה-EDTA pericytes ובצע את אותו הליך כמו בשלב 5.3-5.6.
- לשאוף את המדיום, מבלי לפגוע כדורי התא ולהשעות מחדש את הכדור ב 1 מ"ל של DMEM-comp טרי.
- להוציא 12 μL של מתלה תא ולהוסיף לתא ספירה. תחת מיקרוסקופ האור, לספור לפחות 3 של רשתות 3x3 ולהשתמש בספירת התאים הממוצעת לכל רשת.
- השתמש במשוואה שלהלן כדי לחשב את נפח המתלה התא שיש להוסיף לכל באר זרע 10.000 תאים לבאר, בצלחת 96-באר.
- הוסף DMEM-comp ואת אמצעי האחסון המחושב של מתלה תא בכל באר כדי להגיע לנפח סופי של 200 μL.
- מניחים את צלחת 96 באר ב אינקובטור 37 °C ב 10% CO2. להשאיר את התאים לגדול במשך 4 ימים עם שינוי של מדיום לאחר 2 ימים.
8. הכנת מאגרים ופתרונות עבור Ca2+-הדמיה
- אוטוקלב מכסה תאי סליפ וכיסויים.
- מאגר תסה: הוסף 1.19 גרם של HEPES ל- 500 מ"ל של מאגר HBSS עבור ריכוז סופי של 10 מ"מ HEPES. כוונן את ה-pH ל- 7.4.
- הכן 20% (w /v) F127 פלורוני + 1% (v /v) פוליאתוקסילציה שמן קיק פתרון על ידי המסת 0.5 גר ' של פתרון F127 Pluronic ב 2.5 מ"ל של DMSO ahydrous בקבוקון זכוכית. מחממים ל-40 מעלות צלזיוס כ-30 דקות או עד להמסה ומערבולת. להוסיף 25 μL של שמן קיק פוליאתוקסילציה ולאחסן ב RT. אל תקפא.
- להכין 2 mM Fura-2 מניות על ידי המסת 1 מ ג ב 500 μL של DMSO anhydrous. לאחסן ב aliquots של 20 μL ב -20 ° C מוגן מפני אור.
- להכין 5 μM Fura-2 AM טעינת פתרון על ידי ערבוב 20 μL של 20% F-127 Pluronic + 1% פוליאתוקסילציה קיק שמן פתרון עם 20 μL של 2 mM Fura-2 AM aliquot. הוסף 500 μL של מאגר תסה ומערבולת. הוסף מאגר assay לנפח סופי של 8 מ"ל. יש להכין את הפתרון מיד לפני השימוש ולהגן מפני אור.
- להכין 4 mM Cal-520 AM על ידי המסת 1 מ ג ב 226.7 μL של DMSO anhydrous. לאחסן ב aliquots של 20 μL ב -20 ° C מוגן מפני אור.
- להכין 20 μM Cal-520 AM טעינת פתרון על ידי ערבוב 20 μL של 20% Pluronic F-127 + 1% פוליאתוקסילציה שמן קיק פתרון עם 20 μL 4 mM Cal-520 aliquot. הוסף 500 μL של מאגר תסה ומערבולת. הוסף מאגר אחסון לנפח סופי של 4 מ"ל. יש להכין את הפתרון מיד לפני השימוש ולהגן מפני אור.
9. טעינת pericytes עם צבע מחוון סידן Fura-2 AM בהגדרת קורא לוחות
הערה: כל הפתרונות צריכים להיות ב- RT לפני תחילת הניסוי.
- להוציא את צלחת 96-באר עם תאים מהאינקובטור ושאף את המדיום מהבארות. לשטוף את התאים פעמיים עם מאגר תסה.
- להוסיף 100 μL של פתרון טעינה לכל באר ולעטוף את הצלחת עם נייר כסף, כדי למנוע הלבנת תמונה. דגירה במשך 45 דקות עם 30 סל"ד רועד ב RT.
הערה: אין לטעון את Fura-2 AM ב- 37°C, שכן הוא עשוי לטעון תאים פנימיים. זכור להשאיר בארות עם תאים במאגר תסאג במקום לטעון מאגר; אלה הם "כדורי סרק" המשמשים למדידת פלואורסס היין ברקע. - שאף את מאגר הטעינה ושטוף את התאים עם מאגר ה- Assay פעמיים. להוסיף 100 μL של מאגר assay טרי ולהשאיר את התאים דגירה במשך 30 דקות ב RT; זה מאפשר מחשוף מתמשך של AM-אסתר ובכך ללכוד Fura-2 AM בתוך התאים.
- לפני Ca2+-הדמיה, לשטוף ולהחליף את המאגר עם 100 μL של מאגר assay טרי.
10. קריאת פלואורסצנס של pericytes בהגדרת קורא צלחות
- הגדר את הטמפרטורה של קורא הצלחות ל- 37°C והעבר את הלוח בן 96 הבאר עם תאים למיקום לוח המדגם. מניחים את צלחת הריגנט עם אגוניסט במיקום צלחת הריגנט.
- התחל על ידי מדידת טעינה של התאים כדי להבטיח טעינה שווה של Fura-2 AM בכל בארות.
- בצע את המדידות עם אורך גל פלואורסצנס פלורסצ'ינג ב 340 נאר/380 צפון צפון ואורך גל הפליטה ב- 510 צפון-שעה. להוסיף 50 μL של אגוניסט במהירות 150 μL / s מצלחת reagent לכל באר עם תאים במיקום צלחת מדגם.
- שמור את הנתונים וייצוא כקבצי xlsx לניתוח נוסף. איור 2 מציג את ה-Ca2+-תגובה הציטוסולית הנמדדת כיחס בין שני אורכי גל העירור לאורך זמן, כאשר פלואורסצנת הרקע מנוקבת.
הערה: קורא לוחות צריך להיות קורא מיקרו-פלטה כפול עם מקום ל"מגש תא" ו"מגש לדוגמה" ומערכת pipettor משולבת.
11. זריעת פריציטים בתא מצופה להדמיה חיה
הערה: כיסויים עשויים להיות ממוקמים גם בתחתית בארות התרבות, מצופה וזרעים עם pericytes כמתואר לעיל, ולאחר מכן רכוב בתא לפני ניסויים.
- הר כיסוי לתוך תא התא והפוך אותו חזק כדי למנוע דליפה.
- דילו קולגן 4 כמתואר בשלב 3.1. להוסיף 500 μL לכל תא תא דגירה במשך 2 שעות ב RT או לילה ב 4 ° C.
- לשאוף את תמיסת הקולגן ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם 500 μL של PBS.
- להוסיף 500 μL של פיברונקטין מדולל לכל באר דגירה ב RT במשך 30 דקות. הסר את תמיסת הפיברונקטין והשתמש בתא ישר לאחר מכן.
- בינתיים, להוציא את הבקבוקון עם pericytes confluent ולשטוף עם 7 מ"ל של PBS.
- הוסף 2 מ"ל של נסה-EDTA pericytes ובצע את אותו הליך כמו בשלב 5.3-5.6.
- המשך על-ידי ביצוע אותם שלבים כמו בשלב 8.6-8.7.
- השתמש במשוואה שלהלן כדי לחשב את אמצעי האחסון של מתלה התא, אשר יש להוסיף לכל תא זרע 90.000 תאים לכל תא.
- הוסף DMEM-comp ואת אמצעי האחסון המחושב של מתלה תא בכל תא כדי להגיע לנפח סופי של 500 μL.
- מניחים את תאי התא באינקובטור ב-37°C, 10% CO2. השאר את התאים לגדול במשך 6 ימים (או עד לתאיך).
הערה: pericytes לגדול לאט יותר על שקופיות זכוכית לעומת פלסטיק; יש צורך בעוד ימים של צמיחה.
12. טעינת pericytes עם צבע מחוון סידן Cal-520 AM להדמיה חיה
הערה: כל הפתרונות צריכים להיות ב- RT לפני תחילת הניסוי.
- להכין את 20 μM Cal-520 AM טעינה מאגר: לערבב 20 μL של 20% Pluronic F-127 + 1% פוליאתוקסילציה שמן קיק פתרון עם 20 μL 4 mM Cal-520 aliquot. הוסף 500 של מאגר חסן μL ומערבולת. הוסף מאגר אחסון לנפח סופי של 4 מ"ל. יש להכין את הפתרון מיד לפני השימוש ולהגן מפני אור.
הערה: הגן על פתרונות המכילים את Cal-520 AM מפני חשיפה לאור. - להוציא את תאי התא מהאינקובטור ושאף את המדיום. לשטוף את התאים פעמיים עם מאגר תסה.
- הוסף 500 μL של מאגר טעינה לכל תא ותדגור ב RT במשך 45 דקות.
- שאף את מאגר הטעינה ושטוף את התאים פעמיים באמצעות מאגר תכלית.
- להוסיף 500 μL של מאגר assay טרי לכל תא דגירה במשך 30 דקות ב RT כדי לאפשר מחשוף של AM-אסתר.
- החלף את המאגר ב- 500 μL של מאגר תסה טרי לפני ביצוע ההדמיה החיה במיקרוסקופ confocal.
13. הדמיה חיה של Ca תאי2+-רמות
הערה: ניתן להשתמש במגוון סוגי מיקרוסקופים עבור ההדמיה. מיקרוסקופי פלואורסצנס קונבנציונליים זקוף או הפוך, כמו גם מיקרוסקופים זקוף או הפוך סורקים לייזר קונפוקל עם מקור העירור המתאים (488 ננ"ר) ומסנני פליטה (510-520 ננ"מ) ניתן להשתמש. מטרות צריכות להיות מתאימות לפלואורסץ ולהיות באיכות גבוהה עם צמצם מספרי גבוה (NA).
- הר התא על הבמה של מיקרוסקופ confocal עדין ככל האפשר, על מנת למנוע הפרעה של התאים.
- בחר אורך גל של 488 00 00 00 00 00:00,000,000 00:00,000 00:00,000,000 00:00,000-&10:00,000 00:00,000 00:00,000 00:00,000 00:00,000 00:00,000 00:00,000 00:00,000 00:00,000 00:00,000 00:0
- הוסף 3 μL של 100 mM ATP לתא התא עם פיפטה, ולהמשיך את רכישת תמונה רציפת. בצע את התוספת לאט ובעדינות כדי לא להפריע להכנה ולהזיז את התאים מחוץ לפוקוס.
- שימו לב לדרגת השינויים ולהגדיל את מרווח הזמן לאורך זמן כ-18 דקות עד שלא יבחינו בשינוי מורפולוגינוסף (איור 3).
- שמור תמונות זמן לשגות ולייצא אותם כמו TIFF ו / או AVI קבצים לניתוח נוסף.
הערה: בקבוקון אחד של pericytes צריך לתת מספיק תאים עבור זריעה 1-2 96-well צלחות וכמה כיסויים, כלומר אתה יכול להכין תאים עבור שני סוגי מדידות סידן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
נימים במוח של פר בודדו רקמת מוח טרייה ואיור 1 מציג את זריעת הנימים ואת ההתגלות התאית במשך ימים וטיהור של pericytes לאחר מכן. הנימים מחוברים באופן מלא לנבון ביום הראשון וביום השני נבט אנדותל הפך גלוי(איור 1,יום 2). לאחר 4 ימים, ההתגלות הסלולרית היא ייחודיתמאוד (איור 1,יום 4א) ותאי אנדותל מוסרים על ידי טריפסינוזציה עדינה כפי על פי הפרוטוקול המתואר. שרידי הנימים יכולים להיות נוכחים לאחר הנספים, אך ייעלמו מהבקבוקון בימים הבאים(איור 1,יום 4ב-6). לאחר הסרת שכבת אנדותל, pericytes מזוהים בקלות עם מורפולוגיה שונה תאי אנדותל. הצנבים מציגים תהליכים כמו אצבע המצורפים בחוזקה לבקבוקון(איור 1,יום 4ב). לאחר מכן, פריציטים רשאים לגדול עד ההתלבטות(איור 1,יום 4b-9) וביום 9, ההטבות הגיעו לכ-80% קונפלומה וגדלו באיים. זאת בניגוד לתאי אנדותל שיוצרים מגע עם מונו-שכבתית מעוכבת שנצפתה ביום 4.
ATP הוא ממריץ אנדוגני ידוע של Ca2+-איתות11, שימש ממריץ חוץ תאי כדי לגרום לשינויים ציטוסוליים ב Ca2+ -רמותpericytes. תוספת של ATP לpericytes טעון Fura-2, כפי על פי הפרוטוקול המתואר, הביא לעלייה ברמות cytosolic Ca2+- נמדד כמו יחס פלורסנט כפי המוצג איור 2. התגובה המושרה ATP מתרחשת מיד לאחר הוספת ATP pericytes וידרדר לאט לאורך תקופת הזמן שנמדדה.
באמצעות פרוטוקול זה עבור הדמיה קונפוקלית בזמן אמת של Ca2+ תאיים- תגובות, pericytes היו זרעים על כיסויים מצופים, טעון Cal-520 AM והוצב במיקרוסקופ confocal. איור 3 (0 s) מציג את ההטבות עם רמות בסיסיות של פלואורסצנס לפני הטיפול. במהלך הקלטה חיה, ATP מתווסף pericytes וחזק intracellular Ca2+-תגובה ניכרת זמן קצר לאחר (64 s). זמן קצר לאחר מכן, cytosolic Ca2+ ממודר בתאים וירידה באזור התא גלוי (189 s). ב 300 s. פוסט תחילת ההקלטות, אזור התא הוא מופחת מאוד Ca2 +-אות ירד לעוצמה קרוב לפלואורסצסצנציה הבסיסית.
איור 1: תפירת נימים ובידוד של פריציטים. נימים בודדו ממוח של בשר טרי ונזרעו במבחנות תרבות ביום 0. גידול ים מן נימים במוח של פר והבידוד הבא של pericytes היו במעקב במשך ימים עם מיקרוסקופ אור. יום 4a מראה את הצמיחה תא אנדותל לפני הטיפול עם נסהלין כדי להסיר תאים אנדותל ויום 4b מראה את השרידים מיד לאחר הטיפול. היום 8a מראה את מישור המיקוד, שבו כל שרידי נימות יהיה גלוי, בעוד היום 8b מתמקדים במטוס שבו הצמיחה של pericytes גלוי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: דוגמה מייצגת למדידת סידן תאי באמצעות צבע מחוון סידן Fura-2. pericytes העיקרי כבר זרעו 96 צלחות גם וטען עם Fura-2 AM על מנת לדמיין שינויים בסידן תאי. ATP 10 μM מתווסף pericytes ב 30 s. ואת cytosolic Ca2+-תגובה נמדדת כיחס בין שני אורכי גל העירור; 340 נה"מ ו-380 00 00 00 00:00 לאורך זמן. נהיו מוגדרים כסתיית תקן (N= 3, n=1). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: דוגמה מייצגת של דימות חי סידן תאי באמצעות צבע מחוון סידן Cal-520. pericytes העיקרי כבר זרעו בתא תא וטעון עם Cal-520 על מנת לדמיין שינויים בסידן תאי ומורפולוגיה תא. ATP 600 μM מתווסף pericytes ותמונות מנקודות זמן שונות במהלך הדמיה חיה מוצגים כאן. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במחקר זה, אנו הציגו שיטה לבודד pericytes ראשוני ממוחות של קבר. הפרוטוקול המתואר מאפשר תרבות מסוג תא זה, שאחרת אינו נגיש. תרבות התא שהושגה לאחר מכן הייתה אוכלוסייה כמעט הומוגנית של pericytes, עם זיהום קטן או ללא עם תאים אנדותל ותאי גליה המבוססים על מורפולוגיה של תאים וביטויחלבון 12. יתר על כן, הראינו שיטה פשוטה וישירה כדי לטעון את pericytes עם צבעי סידן עבור Ca2+-הדמיה באמצעות שתי שיטות שונות, בהתאם לתוצאה המיועדת.
אחת הבעיות העיקריות בעת בידוד תאים ראשוניים מרקמות המוח היא הגישה המוגבלת לרקמות. בכמה מחקרים קודמים, חולדות ועכברים הם בעלי החיים מודל מסורתי בשימוש, אבל רקמת המוח מבעלי חיים קטנים אלההם דללים 6,13. בידוד מהמוח האנושי נערך גם14; עם זאת, בשל בעיות אתיות זה לא נגיש בקלות. לפיכך, תשואה גבוהה של תאים ממקור זמין עדיפה. מספר הבקבוקונים התאים המתקבלים מבידוד ממוח של שורן יחיד עולה על הכמות המתקבלת מעכבר או חולדה עד כה, מה שהופך את רקמת השוור ליתרון בהשוואה למקורות האחרים שהוזכרו. יתרון נוסף של השיטה המתוארת כאן הוא מספר המעבר הנמוך כדי להשיג תרבות טהורה של pericytes. מעבר של תאי ציור קיר יכול להוביל דה-בידול15 ולכן, רצוי להימנע. בפרוטוקול זה, trypsinization עדין כדי להסיר את שכבת תא אנדותל הוא שלב אחד המשמש לבידוד pericytes ולכן גם אחד השלבים הקריטיים ביותר המתוארים בפרוטוקול זה. אם trypsinization ממושך, pericytes יתחיל להתנתק מהבוקון יחד עם תאי אנדותל, המוביל רק תשואה קטנה. מצד שני, רק מתן זמן טריפסינוזציה קצר מאוד יכול לגרום לתרבות טמאה של pericytes. לכן יש חשיבות עליונה כדי להתבונן בתאים לעתים קרובות מאוד במהלך שלב trypsinization. אחד צריך להיות מודע להבדלים מורפולוגיים בין pericytes ותאים אנדותל כדי להיות מסוגל להבחין בין שני סוגי התאים במהלך הליך trypsinization. למרות שצעד זה עשוילדרוש הכשרהמסוימת, השיטה היא פחות זמן רב ולא יקר בהשוואה לשיטות אחרות המשמשות להשגת תרבויות pericyte טהור 7,8,14. יתר על כן, התרבות שהושגה של pericytes כאן הראה את מורפולוגיה טיפוסית "רוח רפאים" כמו עם תהליכים כמו אצבע והביעה מספר סמנים ספציפיים כגון α-SMA, PDGFR-β ו Nestin (נתונים לא מוצגיםכאן) 12, אשר ידועים סמנים עבור pericytes העיקריבתרבות 1.
כאן, אנו גם הציגו שיטה פשוטה עבור Ca2+-הדמיה באמצעות צבעי מחוון סידן פלורסנט. יש לבצע טעינת pericytes עם הצבעים (Fura-2 ו- Cal-520) ב- RT ולא ב- 37 °C. מספר מחקרים ביצעו טעינה של אסטרים AM ב 37 °C16,17, אבל טעינה בטמפרטורה זו יכולה להוביל אסתרים הזנת תאים תאיים כגון רטיקולום אנדופלסמי. זה לא עדיף, כמו Fura-2 AM יכול לאגד לשחרר Ca2+ לכוד בחנויות הפנימיות ובכך לגרום לעלייה נמוכה יותר במדידות פלורסנט. לפיכך, זה יכול לגרום לתוצאות כוזבות. למרות, לא חווינו כל קשיים גדולים עם טעינת pericytes ב RT, אם אחד נתקל בבעיות בכל מקרה, אחד עשוי לשקול אופטימיזציה טעינה על ידי sonication של פתרון הטעינה במשך 5 דקות באמבט אולטרסאונד לפני טעינת התאים.
בשיטה המתוארת, Ca2+תאית - איתות יחד עם התכווצות של pericytes נצפתה בקלות במהלך הקלטות חיות, אשר ניתן גם לכמת לניתוח נוסף. השיטה שימשה בעבר כדי להפוך את ההדגמה הראשונה שלבמבחנה Ca 2+-איתות והתכווצות של pericytes נימות המוח12. במחקרים קודמים נעשה שימוש בשיטות שונות כדי למדוד ולכומת התכווצות תאים כתוצאה שלגירוי חוץ תאי 18,19,20. עם זאת, התבוננות בתגובה תאית ראשונית ישירות לאחר התכווצות של התאים לא הייתה אפשרות במחקרים אלה. במחקר הנוכחי ניתן לצפות באיתות תאי ואת ההתכווצות הבאה של התאים ואת שתי המדידות ניתן לכמת באותו ניסוי. לכן, הוא מבטל ניסויים נוספים, אשר צורכים יותר זמן גם כן, ומראה את הקשר הישיר בין Ca2+ תאית-איתות לבין השינויים המורפולוגיים.
לסיכום, מחקר זה מייצג שיטה פשוטה ויעילה לבידוד ולתחינת pericytes המוח הראשי. בנוסף, אנו מדגימים שיטה קלה ותו לא כדי ללמוד Ca2+תאית - איתות בפריציטים תרבותיים. השיטות המתוארות כאן אמורות לספק לחוקרים אחרים בתחום כלים חזקים לחקר הביולוגיה pericyte ואיתות תאי בpericytes במבחנה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
המחברים רוצים להכיר במימון מיוזמת המחקר של קרן לונדבק על מחסומי מוח ואספקת סמים (RIBBDD) וקרן משפחת סיימון הוגר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ATP | Tocris | 3245 | |
| Cal-520 AM | AAT Bioquest | 21130 | |
| Cell incubator | Thermo Fisher | ||
| Centrifuge | Thermo Fisher | Heraeus Multifuge 3SR+ | Standard large volume centrifuge for spinning down cells |
| Collagen IV | Sigma Aldrich | C5533 | |
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | Zeiss LSM 510 | Inverted microscope |
| Counting chamber | FastRead | 102 | |
| Coverslip cell chamber | Airekacells | SC15022 | |
| Cremophor EL | Sigma Aldrich | C5135 | Formerly known as Kolliphor EL |
| DMSO | Sigma Aldrich | 471267 | |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium | Sigma Aldrich | D0819 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAA/GE Healthcare | A15-101 | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fisher | F1201 | |
| Glass coverslips 22x22 mm | VWR International | 631-0123 | |
| HBSS | Gibco | 14065-049 | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149 | |
| HEPES | AppliChem Panreac | A1069 | |
| Light microscope | Olympus | Olympus CK2 | Upright light microscope with phase contrast |
| MEM nonessential amino acids | Sigma Aldrich | M7145 | |
| Microplate Reader | BMG LabTech | NOVOstar | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | Phosphate-buffered saline |
| penicillin G sodium/streptomycin sulfate | Sigma Aldrich | P0781 | |
| Pluronic F127 | Sigma Aldrich | P2443 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4299 | |
| T-75 flask | Sigma Aldrich | CLS3972 | |
| 96-well plate | Corning incorporated | 3603 |
References
- Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: Developmental, Physiological, and Pathological Perspectives, Problems, and Promises. Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
- Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
- Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. The Perivascular Astroglial Sheath Provides a Complete Covering of the Brain Microvessels: An Electron Microscopic 3D Reconstruction. Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).
- Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
- Zhou, L., Sohet, F., Daneman, R. Purification of Pericytes from Rodent Optic Nerve by Immunopanning. Cold Spring Harbor Protocols. , 608-617 (2014).
- Liu, G. H., et al. Isolation, Purification, and Cultivation of Primary Retinal Microvascular Pericytes: A Novel Model Using Rats. Microcirculation. 21 (6), 478-489 (2014).
- Nayak, R. C., Herman, I. M. Bovine retinal microvascular pericytes: isolation, propagation, and identification. Methods In Molecular Medicine. 46, 247-263 (2001).
- Nees, S., et al. Isolation, bulk cultivation, and characterization of coronary microvascular pericytes: the second most frequent myocardial cell type in vitro. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 302 (1), H69-H84 (2012).
- Armulik, A., Abramsson, A., Betsholtz, C. Endothelial/pericyte interactions. Circulation Research. 97 (6), 512-523 (2005).
- Helms, H. C., Brodin, B. Methods in Molecular Biology. Cerebral Angiogenesis: Methods and Protocols. Milner, R. 1135, Humana Press Inc. 365-382 (2014).
- Abbracchio, M. P., Burnstock, G., Verkhratsky, A., Zimmermann, H. Purinergic signalling in the nervous system: an overview. Trends in Neurosciences. 32 (1), 19-29 (2009).
- Cai, C., et al. Stimulation-induced rises in cerebral blood flow and local capillary vasoconstriction depend on conducted vascular responses in brain capillaries. PNAS. , (2018).
- Tigges, U., Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. A novel and simple method for culturing pericytes from mouse brain. Microvascular Research. 84 (1), 74-80 (2012).
- Maier, C. L., Shepherd, B. R., Yi, T., Pober, J. S. Explant Outgrowth, Propagation and Characterization of Human Pericytes. Microcirculation. 17 (5), 367-380 (2010).
- Orlidge, A., Damore, P. A. Cell specific effects of glycosaminoglycans on the attachment and proliferation of vascular wall components. Microvascular Research. 31 (1), 41-53 (1986).
- Rhinehart, K., Zhang, Z., Pallone, T. L. Ca2+ signaling and membrane potential in descending vasa recta pericytes and endothelia. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 283, F852-F860 (2002).
- Bintig, W., et al. Purine receptors and Ca2+ signalling in the human blood-brain barrier endothelial cell line hCMEC/D3. Purinergic Signalling. 8 (1), 71-80 (2012).
- Neuhaus, A. A., Couch, Y., Sutherland, B. A., Buchan, A. M. Novel method to study pericyte contractility and responses to ischaemia in vitro using electrical impedance. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2013-2024 (2017).
- Kamouchi, M., et al. Calcium influx pathways in rat CNS pericytes. Molecular Brain Research. 126 (2), 114-120 (2004).
- Das, A., et al. ATP Causes Retinal Pericytes to Contract In vitro. Experimental Eye Research. 46, 349-362 (1988).
