Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Kultur av hjernekapillære pericytter for cytosoliske kalsiummålinger og kalsiumavbildningsstudier

Published: May 27, 2020 doi: 10.3791/61253
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Pharmacy, The Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen

Summary

Hjernekapillære pericytes er essensielle aktører i reguleringen av blod-hjerne barriere egenskaper og blodstrøm. Denne protokollen beskriver hvordan hjernekapillære pericytes kan isoleres, kultiveres, karakteriseres med hensyn til celletype og brukes til undersøkelser av intracellulær kalsiumsignalering med fluorescerende sonder.

Abstract

Pericytter er forbundet med endotelceller og astrocytisk endfeet i en struktur kjent som den nevrovaskulære enheten (NVU). Hjernekapillær perikyttfunksjon er ikke fullt kjent. Pericytes har blitt foreslått å være involvert i kapillær utvikling, regulering av endotelbarriere tetthet og trancytose aktivitet, regulering av kapillær tone og å spille avgjørende roller i visse hjernepatologier.

Pericytes er utfordrende å undersøke i den intakte hjernen på grunn av vanskelighetene med å visualisere prosesser i hjernen parenchyma, samt nærhet til de andre cellene i NVU. Den nåværende protokollen beskriver en metode for isolasjon og kultur av primære storfe hjernekapillær pericytes og deres følgende bruk i kalsiumavbildningsstudier, hvor effekter av agonister involvert i hjernesignalering og patologier kan undersøkes. Kortikale kapillære fragmenter får lov til å feste seg til bunnen av kulturflasker, og etter 6 dager har endotelceller og pericytes vokst ut fra kapillære fragmenter. Endotelcellene fjernes ved mild trypsinisering og pericytter dyrkes i 5 ekstra dager før passaging.

Isolerte pericytter er seeded i 96-brønns kulturplater og lastet med kalsiumindikatorfargestoff (Fura-2 acetoksymetyl (AM)) for å tillate målinger av intracellulære kalsiumnivåer i et plateleseroppsett. Alternativt er pericytes seeded på dekkglass og montert i cellekamre. Etter lasting med kalsiumindikatoren (Cal-520 AM), kan kalsium live-imaging utføres ved hjelp av konfokal mikroskopi ved en eksitasjon bølgelengde på 488 nm og utslipp bølgelengde på 510-520 nm.

Metoden som er beskrevet her har blitt brukt til å oppnå de første intracellulære kalsiummålingene fra primære hjernekapillære perikytter, som viser at pericytter stimuleres via ATP og er i stand til å trekke in vitro sammen.

Introduction

Hjernekapillære pericytter, sammen med endotelceller og astrocytter, utgjør NVU1,2,3. Endotelcellene, som danner det strukturelle grunnlaget for kapillærene, danner lange sylindriske rør med en diameter på 5-8 μm. Endotelcellene er sporadisk dekket med pericytter og omgitt av fremspring fra astrocytter; astrocyttendehennetten.

Blod-hjernebarrieren (BBB), som ligger ved hjernens kapillærer, er hovedstedet for utveksling av næringsstoffer, gasser og avfallsprodukter mellom hjernen og blodet. BBB beskytter også hjernen mot endogene og eksogene nevrotoksiner og fungerer som en barriere for levering av et stort antall legemiddelforbindelser. Barrierefunksjonen er et fokusområde, samt et hinder, for legemiddelselskaper som utvikler sentralnervesystemet (CNS) medisiner. Dette har ansporet en stor interesse i å undersøke cellene i NVU i kultur4. Hjerneastrocytter og endotelceller har blitt dyrket og karakterisert i en rekke studier, mens studier og protokoller for perikyttkultur er sparsomme.

Tidligere publiserte protokoller har beskrevet generering av hjernekapillærpericyte kulturer til en viss grad, ved hjelp av en rekke forskjellige tilnærminger som immunopanning5,høy- og lav-glukose media6, fluorescerende-aktivert celle sortering7, tetthet gradient sentrifugering8, etc. Selv om disse metodene synes tilstrekkelig til å oppnå kulturer av pericytes, noen er tidkrevende, koster dyrt og pericytes oppnådd kan ikke være ideelt på grunn av antall kulturpassasjer som kan de-differensiere pericytes9. Videre har potensialet for kultiverte pericytter i in vitro signalstudier vært ganske uutforsket til nå.

Det nåværende arbeidet fokuserer på generering av pericytekulturer fra isolerte storfe hjernekapillærer og det påfølgende oppsettet for målinger og bildestudier av endringer i intracellulær kalsium, en viktig intracellulær andre budbringer. Vi beskriver kort isolasjonen av kapillærer fra kortikal grå materie (for detaljer se Helms et al.10) og isolasjon og kultur av pericytes i ren monokultur uten forurensning med endotel- eller glialceller. Vi gir deretter en protokoll for såing av pericytes i 96-brønnsplater og lasteprotokoller for kalsiumsonden Fura-2 AM. Til slutt viser vi hvordan pericytes kan brukes i sanntid confocal imaging i mikroskop kulturkamre og beskrive protokollene for dette.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Utarbeidelse av buffere og løsninger for celle culturing

  1. Forbered kollagen lagerløsning ved å oppløse 5 mg kollagen IV fra human placenta i 50 ml PBS over natten ved 4 °C. Aliquot lagerløsningen i 5 ml porsjoner og lagre ved -20 °C.
  2. Forbered fibronectin lageroppløsning ved å oppløse 5 mg fibronectin i 5 ml sterilt vann over natten. Oppbevar fibronectinbestandene i aliquots på 500 μL ved -20 °C. Når du tiner, legg PBS til et endelig volum på 50 ml for å klargjøre arbeidsløsningen og oppbevar den ved 4 °C.
  3. Forbered Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) komplett medium ved å legge til 50 ml føtal storfe serum (FBS), 5 ml MEM ikke-essensielle aminosyrer og 5 ml penicilli (0,1 g/l streptomycinsulfat og 100 000 E/L penicillin G natrium) til 500 ml DMEM.
  4. Forbered 5 mg /ml heparin lagerløsning ved å oppløse heparinnatriumsalt i PBS og passere den gjennom et 0,2 μm filter for sterilisering. Oppbevar lageroppløsningen ved 4 °C.
  5. Forbered vekstmedium (GM) umiddelbart før bruk; 10 ml DMEM-comp og 250 μL heparinlageroppløsning per T75-kolbe.

2. Isolering av kapillærer fra frisk storfe hjerne

MERK: Storfehjernekapillærer er isolert og kultivert som tidligere beskrevet (Helms et al.10).

  1. Samle hjerner fra kalver, ikke eldre enn 12 måneders alder, fra et slakteri og ta direkte til laboratoriet på is.
  2. Fjern meninges og samle alle grå materie fra hjernen ved hjelp av en skalpell. Identifiser meninges som filmen som dekker hjernen og den grå materien med sin grå farge.
  3. Bruk en 40 ml Dounce vevsliper for å homogenisere den grå materien i Dulbeccos modifiserte Eagle Medium (DMEM). Fyll den slanke delen av vevskvernen 1/5 med grå materiefjæring og tilsett DMEM til den slanke delen er fylt.
  4. Skill kapillærer fra frie celler og mindre vevsbiter ved filtrering av homogenatet gjennom et 160 μm nylonnettfilter. Skyll filtrene med DMEM-comp. Hent kapillærene og lag suspensjonene i 50 ml sentrifugeringsrør.
  5. Resuspend kapillærene i DMEM-comp og tilsett en enzymblanding av DNase I (170 U/ml), kollagennase type III (200 U/ml) og trypsin (90 U/ml). La suspensjonen stå i 1 time i et 37 °C vannbad for fordøyelse av kapillærene.
  6. Kjør fjæringen gjennom et 200 μm nettingfilter og gjenoppliv i FBS med 10 % dimetylsulfoksid (DMSO). Frys kapillærene over natten ved -80 °C og flytt dem til flytende nitrogen dagen etter for langtidslagring.
    MERK: Protokollen kan settes på pause her.

3. Seeding og dyrking av storfe kapillærer

  1. Dag 0: Bland 0,7 ml kollagen IV lager med 6,3 ml PBS. Tilsett oppløsningen i en T75-kolbe og la kolben stå i 2 timer ved romtemperatur (RT) eller la den stå over natten ved 4 °C.
  2. Fjern kollagenoppløsningen fra kolben og vask tre ganger med PBS.
  3. Tilsett 7 ml fibronectin arbeidsløsning og la kolben stå i 30 min ved RT. Fjern deretter fibronectinoppløsningen og frø kapillærene umiddelbart etterpå.
  4. I løpet av 30 min ventetid, tine ett hetteglass med kapillærer i et 37 ° C vannbad.
  5. Når kapillærene er tint, overføres umiddelbart til et sentrifugeringsrør med 30 ml DMEM-comp og sentrifuge i 5 min ved 500 x g og RT. Fjern DMEM-comp fra røret og suspender kapillær-pellet i 10 ml fersk DMEM-comp.
  6. Overfør 10 ml suspensjon til den belagte T75-kolben og la kapillærene holde seg til bunnen av kolben i 4-6 timer i en 37 °C inkubator ved 10% CO2.
    MERK: Celleveksten er høyere ved 10% CO2 i stedet for den konvensjonelle 5% CO2.
  7. Etter 4-6 timer inkubasjon inspisere kolben under et lett mikroskop. Fraksjoner av kapillærer skal nå festes til bunnen av kolben (figur 1, dag 0).
  8. Forbered GM og aspirer DMEN-comp-mediet veldig forsiktig fra kapillærene og erstatt det med 10 ml nylaget GM.
  9. Dag 2: Fjern GM fra kapillærene og erstatt med 10 ml nylaget GM. Cellulær utvekst fra kapillærene skal være synlig under et lett mikroskop på dette tidspunktet (figur 1, dag 2-3).

4. Isolering av primære pericytter fra storfe hjernekapillærer

  1. Dag 4: Inspiser kapillærene under et lett mikroskop.
    MERK: Kolben skal nå være ca. 60-70 % samløpet for å gi en passende mengde perikytter (figur 1, dag 4). Hvis dette ikke er tilfelle; erstatte GM med 10 ml friskt medium og la kolben i inkubatoren for en annen dag.
  2. Aspirer mediet og vask cellene forsiktig i PBS.
  3. Tilsett 2 ml tint Trypsin-EDTA for endotelceller og la kolben stå i inkubatoren i 1-3 min. Ta ut kolben ofte og observer med mikroskopet i denne tidsperioden.
    MERK: Endotelcellene skal runde opp og løsne fra kolben; pericytter skal være synlige som celler med en "spøkelse"-morfologi og fortsatt festes til overflaten av kolben. Dette er et vanskelig og viktig skritt. Det er viktig å fjerne de fleste endotelceller for å unngå forurensning av pericyte monokulturen, men langvarig trypsinisering kan også løsne pericytene. Trypsiniseringstiden kan variere noe fra tid til annen, og det er derfor av største betydning å observere kolben ofte med mikroskopet under behandlingen.
  4. Trykk forsiktig på kolben, når endotelcellene har begynt å runde opp, for å løsne de løsnede endotelcellene.
  5. Hvis du vil stoppe trypsiniseringen, legger du til 10 ml DMEM-comp i kolben. Skyll kolben forsiktig et par ganger med mediet for å fjerne endotelcellene. Aspirer endeotelcelleopphenget fra kolben. Endotelcellene kan nå brukes til andre formål.
  6. Legg til 10 ml DMEM-comp i kolben. Se under det lette mikroskopet for å sikre at pericyttene fortsatt er tilstede og festet til bunnen. Sett kolben tilbake i inkubatoren for å la den pericyte-berikede kulturen vokse.
    MERK: Det er viktig å observere kulturen i løpet av de følgende dagene. Hvis det fortsatt er en god del endotelceller som vokser en annen trypsin-behandling kan utføres.
  7. La pericyte monokulturen vokse med endring av DMEM-comp. medium annenhver dag. Kontroller veksten av cellene under lysmikroskopet (Figur 1, dag 5-8).

5. Generering og lagring av en monokultur av primære storfe pericytes

  1. Dag 8-9: Inspiser kapillærene under et lett mikroskop
    MERK: Pericytene skal nå ha nådd 70-80% samløpet og vokse i øyer i kolben (Figur 1, dag 9). Hvis samløpet av pericytter er mindre enn 70%, la cellene vokse for en annen dag. Pericytes vil ikke danne en komplett monolayer som endotelcellene ville.
  2. Aspirer DMEM-comp og vask pericytene med 7 ml PBS.
  3. Tilsett 2 ml trypsin-EDTA i kolben og la den stå i inkubatoren i 2-3 min. Plasser kolben ofte under det lette mikroskopet for å observere når perikytter runde opp og løsne fra kolben. Når pericytene har begynt å runde opp, kan kolben forsiktig tappes for å løsne cellene.
  4. Trykk forsiktig på kolben, når pericytene har begynt å runde opp, for å løsne cellene.
  5. Legg til 10 ml DMEM-comp i kolben for å stoppe trypsiniseringsprosessen. Skyll kolben et par ganger med mediet for å hjelpe til med å løsne de siste perikyttene.
  6. Overfør 12 ml cellefjæring til et 50 ml sentrifugeringsrør og fyll opp til 30 ml med DMEM-comp.
  7. Sentrifuger cellefjæringen i 5 min ved 500 x g og RT. Aspirer DMEM-komp. forsiktig uten å berøre cellepellet. Resuspend cellepellet i 3 ml FBS med 10% DMSO.
  8. Overfør cellesuspensjonen til kryovialer; tilsett 1 ml til hver, så det vil være totalt 3 hetteglass per T75-kolbe pericytes. Frys pericytene ved -80 °C over natten og flytt dem til flytende nitrogen dagen etter for langtidslagring.
    MERK: Celler kan telles før frysing for et senere anslag over overlevelsesprosenten. Protokollen kan settes på pause her.

6. Sette opp en pericyte monokultur for eksperimenter

  1. Coat en T75-kolbe med kollagen IV og fibronectin ved hjelp av samme prosedyre som nevnt i pkt. 3.1-3.4.
  2. Mens kolben blir belagt med fibronectin, tin ett hetteglass med pericytter i et 37 ° C vannbad.
  3. Overfør de nå tinte perikytter fra kryovial til en sentrifugering tube med 30 ml DMEM-comp. Sentrifuger cellefjæringen i 5 min ved 500 x g, RT.
  4. Aspirer forsiktig mediet, og la cellepelleten nederst på røret. Re-suspendere pellet i 10 ml DMEM-comp.
  5. Samle og overfør cellefjæringen til den belagte kolben. La kolben være med pericytes å vokse i en 37 ° C inkubator ved 10% CO2.
  6. Annenhver dag kan du oppdatere mediet med 10 ml fersk DMEM-comp.
    MERK: Etter 5 dagers vekst skal perikyttene ha nådd ca. 80 % samløpet. Hvis samløpet er mindre, la cellene vokse for en annen dag eller to. Cellene skal nå være klare for såing for videre eksperimenter.

7. Seeding av pericytes i en belagt 96-brønns plate

  1. Fortynn kollagen IV som beskrevet i trinn 3.1. Tilsett 100 μL i hver brønn i en 96-brønns plate og inkuber i 2 timer ved RT eller over natten ved 4 °C.
  2. Aspirer oppløsningen og vask brønnene tre ganger med PBS.
  3. Tilsett 100 μL fortynnet fibronectin til hver brønn og inkuber ved RT i 30 min. Fjern fibronectinoppløsningen og bruk platen umiddelbart.
    MERK: Avhengig av hvor godt pericyte batch vokser, bør det være nok celler for såing to plater.
  4. Ta ut pericytter fra inkubatoren og aspirere mediet. Vask cellene med PBS.
  5. Legg til 2 ml trypsin-EDTA i pericytene og følg samme prosedyre som i trinn 5.3-5.6.
  6. Aspirer mediet, uten å skade cellepellet og re-suspendere pellet i 1 ml fersk DMEM-comp.
  7. Ta ut 12 μL cellesuspensjon og legg til et tellekammer. Under det lette mikroskopet teller minst 3 av 3x3 rutenett og bruker gjennomsnittlig celletall per rutenett.
  8. Bruk ligningen nedenfor til å beregne volumet av cellesuspensjon som skal legges til hver brønn til frø 10.000 celler per brønn, i 96-brønnplaten.
  9. Tilsett DMEM-comp og det beregnede volumet av cellefjæring i hver brønn for å nå et endelig volum på 200 μL.
  10. Plasser 96-brønnsplaten i en 37 °C inkubator ved 10 % CO2. La cellene vokse i 4 dager med en endring av medium etter 2 dager.

8. Utarbeidelse av buffere og løsninger for Ca2+-bildebehandling

  1. Autoklave dekkerlips cellekamre og dekkslips.
  2. Analysebuffer: Legg til 1,19 g HEPES til 500 ml HBSS-buffer for en endelig konsentrasjon på 10 mM HEPES. Juster pH-en til 7,4.
  3. Forbered 20% (w / v) Pluronic F127 + 1% (v / v) polyetoksylert ricinusolje lagerløsning ved å oppløse 0,5 g Pluronic F127 oppløsning i 2,5 ml vannfri DMSO i et hetteglass med glass. Varm til 40 °C i ca. 30 min eller til den er oppløst og virvel. Tilsett 25 μL polyetoksylert ricinusolje og oppbevar ved RT. Ikke frys.
  4. Forbered 2 mM Fura-2 AM lager ved å oppløse 1 mg i 500 μL vannfri DMSO. Oppbevares i aliquots på 20 μL ved -20 °C beskyttet mot lys.
  5. Forbered 5 μM Fura-2 AM lasteløsning ved å blande 20 μL på 20% Pluronic F-127 + 1% polyetoksylert ricinusoljelagerløsning med 20 μL på 2 mM Fura-2 AM aliquot. Tilsett 500 μL analysebuffer og virvel. Legg til analysebuffer i et endelig volum på 8 ml. Oppløsningen skal tilberedes umiddelbart før bruk og beskyttes mot lys.
  6. Forbered 4 mM Cal-520 AM ved å oppløse 1 mg i 226,7 μL vannfri DMSO. Oppbevares i aliquots på 20 μL ved -20 °C beskyttet mot lys.
  7. Forbered 20 μM Cal-520 AM lasteløsning ved å blande 20 μL på 20% Pluronic F-127 + 1% polyetoksylert ricinusoljelagerløsning med 20 μL 4 mM Cal-520 aliquot. Tilsett 500 μL analysebuffer og virvel. Legg til analysebuffer i et endelig volum på 4 ml. Oppløsningen skal tilberedes umiddelbart før bruk og beskyttes mot lys.

9. Lasting av pericytter med Fura-2 AM kalsiumindikator fargestoff i en plateleser oppsett

MERK: Alle løsninger bør være på RT før eksperimentet starter.

  1. Ta ut 96-brønnsplaten med celler fra inkubatoren og aspirer mediet fra brønnene. Vask cellene to ganger med analysebuffer.
  2. Tilsett 100 μL lasteoppløsning til hver brønn og pakk platen med tinfoil, for å unngå bleking av bilder. Inkuber i 45 min med 30 rpm risting ved RT.
    MERK: Ikke last Fura-2 AM ved 37 °C, da det kan laste innvendige rom. Husk å forlate brønner med celler i analysebuffer i stedet for å laste buffer; dette er "blanks" som brukes til å måle bakgrunnsfluorescens.
  3. Aspirer lastbufferen og vask cellene med analysebuffer to ganger. Tilsett 100 μL fersk analysebuffer og la cellene inkubere i 30 min ved RT; dette gjør det mulig for kontinuerlig spaltning av AM-ester og dermed fange Fura-2 AM inne i cellene.
  4. Før Ca2+ bildebehandling,vask og skift bufferen med 100 μL fersk analysebuffer.

10. Well-plate fluorescens lesing av pericytes i en plate-leser oppsett

  1. Sett temperaturen på plateleseren til 37 °C og overfør 96-brønnsplaten med celler til prøveplateposisjonen. Sett reagensplaten med agonist i reagensplateposisjonen.
  2. Start med å måle lasting av cellene for å sikre lik lasting av Fura-2 AM i alle brønner.
  3. Utfør målingene med eksitasjonsfluorescensbølgelengde på 340 nm/380 nm og utslippsbølgelengden på 510 nm. Tilsett 50 μL agonist ved hastighet 150 μL/s fra reagensplaten til hver brønn med celler i prøveplateposisjonen.
  4. Lagre dataene og eksporter som xlsx-filer for videre analyse. Figur 2 viser den cytosoliske Ca2+-responsen målt som forholdet mellom de to eksitasjonsbølgelengdene over tid, hvor bakgrunnsfluorescens trekkes fra.
    MERK: Plateleseren må være en dobbel mikroplateleser med plass til en "celleskuff" og et "prøvebrett" og et integrert pipettorsystem.

11. Seeding av pericytes i et belagt cellekammer for levende bildebehandling

MERK: Dekkglass kan også plasseres i bunnen av kulturbrønner, belagt og seeded med pericytter som beskrevet ovenfor, og deretter monteres i kammeret før eksperimenter.

  1. Monter en dekkslip i cellekammeret og gjør det stramt for å unngå lekkasje.
  2. Fortynn kollagen IV som beskrevet i trinn 3.1. Tilsett 500 μL i hvert cellekammer og inkuber i 2 timer ved RT eller over natten ved 4 °C.
  3. Aspirer kollagenoppløsningen og vask kamrene tre ganger med 500 μL PBS.
  4. Tilsett 500 μL fortynnet fibronectin til hver brønn og inkuber ved RT i 30 min. Fjern fibronectinoppløsningen og bruk cellekammeret rett etterpå.
  5. I mellomtiden, ta ut kolben med samtidige pericytes og vask med 7 ml PBS.
  6. Legg til 2 ml trypsin-EDTA i pericytene og følg samme prosedyre som i trinn 5.3-5.6.
  7. Fortsett med å følge de samme trinnene som i trinn 8.6-8.7.
  8. Bruk ligningen nedenfor til å beregne volumet av cellesuspensjon, som skal legges til hvert kammer for å frø 90.000 celler per kammer.
  9. Tilsett DMEM-comp og det beregnede volumet av cellefjæring i hvert kammer for å nå et endelig volum på 500 μL.
  10. Plasser cellekamrene i inkubatoren ved 37 °C, 10 % CO2. La cellene vokse i 6 dager (eller til samløpet).
    MERK: Pericytes vokser langsommere på glasssklier sammenlignet med plast; flere dager med vekst er nødvendig.

12. Lasting av pericytes med Cal-520 AM kalsiumindikator fargestoff for levende bildebehandling

MERK: Alle løsninger bør være på RT før eksperimentet starter.

  1. Klargjør 20 μM Cal-520 AM lasting buffer: Bland 20 μL av 20% Pluronic F-127 + 1% polyetoksylert ricinusolje lagerløsning med 20 μL 4 mM Cal-520 aliquot. Tilsett 500 μL-analysebuffer og virvel. Legg til analysebuffer i et endelig volum på 4 ml. Oppløsningen skal tilberedes umiddelbart før bruk og beskyttes mot lys.
    MERK: Beskytt løsninger som inneholder Cal-520 AM mot lyseksponering.
  2. Ta ut cellekamrene fra inkubatoren og aspirer mediet. Vask cellene to ganger med analysebuffer.
  3. Tilsett 500 μL lastbuffer til hvert kammer og inkuber ved RT i 45 min.
  4. Aspirer lastbufferen og vask cellene to ganger med analysebuffer.
  5. Tilsett 500 μL fersk analysebuffer til hvert kammer og inkuber i 30 min ved RT for å tillate spaltning av AM-ester.
  6. Bytt bufferen med 500 μL fersk analysebuffer før du utfører den levende avbildningen ved et konfokalt mikroskop.

13. Levende avbildning av intracellulær Ca2+-nivåer

MERK: En rekke mikroskoptyper kan brukes til avbildningen. Oppreist eller invertert konvensjonelle fluorescensmikroskoper, samt oppreist eller invertert konfokal laserskanning mikroskoper med passende eksitasjonskilde (488 nm) og utslippsfiltre (510-520 nm) kan brukes. Mål bør være egnet for fluorescens og være av høy kvalitet og med høy numerisk blenderåpning (NA).

  1. Monter cellekammeret på scenen av det konfokale mikroskopet så skånsomt som mulig, for å unngå forstyrrelser av cellene.
  2. Velg en eksitasjonsbølgelengde på 488 nm, utslipp ved 515 nm, sekvensiell bildeoppkjøp med 5 andre intervaller, en XY-bildestørrelse på 512 x 512 piksler og mål i 2 min for å måle baseline kalsiumsignaler.
  3. Tilsett 3 μL på 100 mM ATP i cellekammeret med en pipette, og fortsett det sekvensielle bildeoppkjøpet. Utfør tillegget sakte og forsiktig for ikke å forstyrre preparatet og flytt cellene ut av fokus.
  4. Følg graden av endringer og øk tidsintervallet over tid etter behov i ca. 18 min til det ikke er notert ytterligere morfologisk endring (figur 3).
  5. Lagre tidsforløpsbilder og eksporter dem som TIFF- og/eller AVI-filer for videre analyse.
    MERK: Ett hetteglass med pericytter bør gi nok celler til såing i 1-2 96-brønnplater og flere dekkslips, noe som betyr at du kan forberede celler for begge typer kalsiummålinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Storfe hjernekapillærer ble isolert fra friskt hjernevev og figur 1 presenterer kapillær såing og cellulær utvekst over dager og påfølgende rensing av pericytes. Kapillærene er helt festet til kolben på dag 1, og på dag 2 har endotelspirering blitt synlig (figur 1, dag 2). Etter 4 dager er cellulær utvekst svært særegen (figur 1, dag 4a) og endotelcellene fjernes ved mild trypsinisering som i henhold til den beskrevne protokollen. Rester av kapillærene kan være til stede etter trypsiniseringen, men vil forsvinne fra kolben i de følgende dagene (Figur 1, dag 4b-6). Etter fjerning av endotellaget oppdages pericytter lett med morfologi forskjellig fra endotelcellene. Pericytes presentere finger-lignende prosesser som festes sterkt til kolben (Figur 1, dag 4b). Deretter får pericytes lov til å vokse til samløpet (figur 1, dag 4b-9) og på dag 9 har pericytene nådd ca 80% samløpet og vokse på øyer. Dette er i motsetning til endotelcellene som skaper en kontakt hemmet monolayer observert på dag 4.

ATP er en velkjent endogen induktor av intracellulær Ca2 +-signalisering11 og ble brukt som en ekstracellulær sentralstimulerende for å indusere cytosoliske endringer i Ca2 +nivåer i pericytes. Tillegg av ATP til Fura-2 lastet pericytes, som i henhold til den beskrevne protokollen, resulterte i en økning i cytosoliske Ca2 +nivåer målt som fluorescerende forhold som vist i figur 2. Den ATP-induserte responsen oppstår umiddelbart etter tilsetning av ATP til pericytene og avtar sakte over den målte tidsperioden.

Ved hjelp av denne protokollen for sanntids konfokal avbildning av intracellulær Ca2 +svar, ble pericytter seeded på belagte dekkslips, lastet med Cal-520 AM og plassert på det konfokale mikroskopet. Figur 3 (0 s) viser pericytene med baseline nivåer av fluorescens før behandling. Under live-opptak legges ATP til pericytene, og en sterk intracellulær Ca2 +-respons er tydelig kort tid etter (64 s). Kort tid etter er den cytosoliske Ca2 + compartmentalizes i cellene og en reduksjon i celleområdet er synlig (189 s). Ved 300 s. etter starten av opptakene er celleområdet sterkt redusert og Ca2 +-signalet har falt til intensitet nær baseline fluorescens.

Figure 1
Figur 1: Dyrking av kapillærer og isolering av pericytter. Kapillærer har blitt isolert fra frisk storfe hjerne og seeded i kultur kolber på dag 0. Utvekst fra storfe hjernekapillærer og følgende isolering av pericytes ble fulgt over dager med et lett mikroskop. Dag 4a viser endotelcelleveksten før behandling med trypsin for å fjerne endotelceller og dag 4b viser restene umiddelbart etter behandlingen. Dag 8a viser fokusplanet, hvor eventuelle kapillære rester ville være synlige, mens dag 8b er fokusert på flyet der veksten av pericytes er synlig.  Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Representativt eksempel på intracellulær kalsiummåling ved hjelp av Fura-2 kalsiumindikatorfargestoff. Primære pericytes har blitt seeded i 96 brønnplater og lastet med Fura-2 AM for å visualisere endringer i intracellulær kalsium. 10 μM ATP legges til pericytene ved 30 s. og cytosolisk Ca2 +-respons måles som forholdet mellom de to eksitasjonsbølgelengdene; 340 nm og 380 nm over tid. Skaleringsstolper defineres som standardavvik (N=3, n=1). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Representativt eksempel på intracellulær kalsium live-imaging ved hjelp av Cal-520 kalsiumindikator fargestoff. Primære pericytes har blitt seeded i et cellekammer og lastet med Cal-520 for å visualisere endringer i intracellulær kalsium og cellemorfologi. 600 μM ATP legges til pericytter og øyeblikksbilder fra forskjellige tidspunkter under live-imaging presenteres her. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne studien har vi presentert en metode for å isolere primære pericytter fra storfehjerner. Den beskrevne protokollen tillater kultur av denne ellers ganske utilgjengelig celletype. Den senere oppnådde cellekulturen var en nesten homogen populasjon av pericytter, med liten eller ingen forurensning med endotelceller og glialceller basert på cellemorfologi og proteinuttrykk12. Videre demonstrerte vi en enkel og grei metode for å laste pericytene med kalsiumfargestoffer for Ca2 +-avbildning ved hjelp av to forskjellige metoder, avhengig av det tiltenkte utfallet.

En av de viktigste problemene når isolere primære celler fra hjernevev er begrenset tilgang til vev. I flere tidligere studier er rotter og mus de tradisjonelle modelldyrene som brukes, men hjernevevet fra disse små dyrene er sparsomme6,13. Isolasjon fra menneskelig hjerne har også blitt utført14; Men på grunn av etiske spørsmål er dette ikke lett tilgjengelig. Derfor er et høyt celleutbytte fra en tilgjengelig kilde foretrukket. Antall celle ampuller hentet fra isolasjon fra en enkelt storfe hjerne overgår mengden hentet fra enten mus eller rotte langt, noe som gjør storfe vev fordelaktig sammenlignet med de andre nevnte kildene. En annen fordel med metoden som er beskrevet her er det lave passasjenummeret for å oppnå en ren kultur av pericytes. Passaging av veggmalericeller kan føre til de-differensiering15 og bør derfor fortrinnsvis unngås. I denne protokollen er skånsom trypsinisering for å fjerne endeotelcellelaget et enkelt trinn som brukes til å isolere pericyttene, og derfor også et av de mest kritiske trinnene som er beskrevet i denne protokollen. Hvis trypsiniseringen er forlenget, vil pericytene begynne å løsne fra kolben sammen med endotelcellene, noe som fører til bare et lite utbytte. På den annen side kan bare å tillate en svært kort trypsiniseringstid forårsake en uren kultur av pericytes. Det er derfor av største betydning å observere cellene svært ofte under trypsiniseringstrinnet. Man bør være klar over de morfologiske forskjellene mellom pericytter og endotelceller for å kunne skille mellom de to celletypene under trypsiniseringsprosedyren. Selv om dette trinnet kan kreve litt opplæring, er metoden mindre tidkrevende og billig sammenlignet med andre metoder som brukes til å oppnå rene pericytekulturer 7,8,14. Videre viste den oppnådde kulturen av pericytes her den typiske "spøkelse"-lignende morfologi med fingerlignende prosesser og uttrykte flere spesifikke markører som α-SMA, PDGFR-β og Nestin (data som ikke vises her)12, som er kjente markører for primære pericytes i kultur1.

Her presenterte vi også en enkel metode for Ca2 + -avbildningved hjelp av fluorescerende kalsiumindikatorfargestoffer. Lasting av pericytter med fargestoffer (Fura-2 og Cal-520) bør utføres ved RT og ikke ved 37 °C. Flere studier har utført lasting av AM-estere ved 37 °C16,17, men lasting ved denne temperaturen kan føre til at esterne kommer inn i intracellulære rom som endoplasmatisk retikuulum. Dette er ikke å foretrekke, da Fura-2 AM kan binde seg til gratis Ca2 + fanget i de interne butikkene og dermed resultere i en lavere økning i fluorescerende målinger. Derfor kan det føre til falske resultater. Selv om vi ikke har opplevd noen store problemer med lasting av pericytene ved RT, hvis man opplever problemer uansett, kan man vurdere å optimalisere lasting ved sonikering av lasteløsningen i 5 min i et ultralydbad før lasting av cellene.

Med den beskrevne metoden observeres intracellulær Ca2+-signalering sammen med sammentrekning av pericytene lett under live-opptak, som også kan kvantifiseres for videre analyse. Metoden har tidligere blitt brukt til å gjøre den første demonstrasjonen av in vitro Ca2 +signalisering og sammentrekning av hjernen kapillær pericytes12. I tidligere studier har ulike metoder blitt brukt til å måle og kvantifisere cellesammentrekning som følge av ekstracellulærstimulans 18,19,20. Å observere den foreløpige intracellulære responsen direkte etterfulgt av sammentrekning av cellene var imidlertid ikke en mulighet i disse studiene. I den nåværende studien er det mulig å observere intracellulær signalisering og følgende sammentrekning av cellene, og begge målingene kan kvantifiseres i samme eksperiment. Dermed eliminerer det flere eksperimenter, som også er mer tidkrevende, og viser den direkte koblingen mellom intracellulær Ca2 +signalering og morfologiske endringer.

Til slutt representerer denne studien en enkel og effektiv metode for å isolere og kultivere primære hjernepericytter. I tillegg demonstrerer vi en enkel og reproduserbar metode for å studere intracellulær Ca2 +-signalering i kultiverte pericytes. Metodene som er beskrevet her bør gi andre forskere på feltet sterke verktøy for å studere pericytebiologi og intracellulær signalisering i pericytes in vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å anerkjenne finansiering fra Lundbeck Foundation Research-initiativet on Brain Barriers and Drug Delivery (RIBBDD) og Simon Hougners Family Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ATP Tocris 3245
Cal-520 AM AAT Bioquest 21130
Cell incubator Thermo Fisher
Centrifuge Thermo Fisher Heraeus Multifuge 3SR+ Standard large volume centrifuge for spinning down cells
Collagen IV Sigma Aldrich C5533
Confocal laser scanning microscope Carl Zeiss Zeiss LSM 510 Inverted microscope
Counting chamber FastRead 102
Coverslip cell chamber Airekacells SC15022
Cremophor EL Sigma Aldrich C5135 Formerly known as Kolliphor EL
DMSO Sigma Aldrich 471267
Dulbecco's Modified Eagles Medium Sigma Aldrich D0819
Fetal bovine serum (FBS) PAA/GE Healthcare A15-101
Fibronectin Sigma Aldrich F1141
Fura-2 AM Thermo Fisher F1201
Glass coverslips 22x22 mm VWR International 631-0123
HBSS Gibco 14065-049
Heparin Sigma Aldrich H3149
HEPES AppliChem Panreac A1069
Light microscope Olympus Olympus CK2 Upright light microscope with phase contrast
MEM nonessential amino acids Sigma Aldrich M7145
Microplate Reader BMG LabTech NOVOstar
PBS Sigma Aldrich D8537 Phosphate-buffered saline
penicillin G sodium/streptomycin sulfate Sigma Aldrich P0781
Pluronic F127 Sigma Aldrich P2443
Trypsin-EDTA Sigma Aldrich T4299
T-75 flask Sigma Aldrich CLS3972
96-well plate Corning incorporated 3603

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: Developmental, Physiological, and Pathological Perspectives, Problems, and Promises. Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
  2. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  3. Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. The Perivascular Astroglial Sheath Provides a Complete Covering of the Brain Microvessels: An Electron Microscopic 3D Reconstruction. Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).
  4. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
  5. Zhou, L., Sohet, F., Daneman, R. Purification of Pericytes from Rodent Optic Nerve by Immunopanning. Cold Spring Harbor Protocols. , 608-617 (2014).
  6. Liu, G. H., et al. Isolation, Purification, and Cultivation of Primary Retinal Microvascular Pericytes: A Novel Model Using Rats. Microcirculation. 21 (6), 478-489 (2014).
  7. Nayak, R. C., Herman, I. M. Bovine retinal microvascular pericytes: isolation, propagation, and identification. Methods In Molecular Medicine. 46, 247-263 (2001).
  8. Nees, S., et al. Isolation, bulk cultivation, and characterization of coronary microvascular pericytes: the second most frequent myocardial cell type in vitro. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 302 (1), H69-H84 (2012).
  9. Armulik, A., Abramsson, A., Betsholtz, C. Endothelial/pericyte interactions. Circulation Research. 97 (6), 512-523 (2005).
  10. Helms, H. C., Brodin, B. Methods in Molecular Biology. Cerebral Angiogenesis: Methods and Protocols. Milner, R. 1135, Humana Press Inc. 365-382 (2014).
  11. Abbracchio, M. P., Burnstock, G., Verkhratsky, A., Zimmermann, H. Purinergic signalling in the nervous system: an overview. Trends in Neurosciences. 32 (1), 19-29 (2009).
  12. Cai, C., et al. Stimulation-induced rises in cerebral blood flow and local capillary vasoconstriction depend on conducted vascular responses in brain capillaries. PNAS. , (2018).
  13. Tigges, U., Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. A novel and simple method for culturing pericytes from mouse brain. Microvascular Research. 84 (1), 74-80 (2012).
  14. Maier, C. L., Shepherd, B. R., Yi, T., Pober, J. S. Explant Outgrowth, Propagation and Characterization of Human Pericytes. Microcirculation. 17 (5), 367-380 (2010).
  15. Orlidge, A., Damore, P. A. Cell specific effects of glycosaminoglycans on the attachment and proliferation of vascular wall components. Microvascular Research. 31 (1), 41-53 (1986).
  16. Rhinehart, K., Zhang, Z., Pallone, T. L. Ca2+ signaling and membrane potential in descending vasa recta pericytes and endothelia. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 283, F852-F860 (2002).
  17. Bintig, W., et al. Purine receptors and Ca2+ signalling in the human blood-brain barrier endothelial cell line hCMEC/D3. Purinergic Signalling. 8 (1), 71-80 (2012).
  18. Neuhaus, A. A., Couch, Y., Sutherland, B. A., Buchan, A. M. Novel method to study pericyte contractility and responses to ischaemia in vitro using electrical impedance. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2013-2024 (2017).
  19. Kamouchi, M., et al. Calcium influx pathways in rat CNS pericytes. Molecular Brain Research. 126 (2), 114-120 (2004).
  20. Das, A., et al. ATP Causes Retinal Pericytes to Contract In vitro. Experimental Eye Research. 46, 349-362 (1988).

Tags

Nevrovitenskap Utgave 159 Pericyte ATP Ca2 +signalisering Fura-2 AM Cal-520 AM cellekultur plateleser konfokal laserskanning mikroskopi
Kultur av hjernekapillære pericytter for cytosoliske kalsiummålinger og kalsiumavbildningsstudier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hørlyck, S., Helms, H. C. C.,… More

Hørlyck, S., Helms, H. C. C., Brodin, B. Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies. J. Vis. Exp. (159), e61253, doi:10.3791/61253 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter