Summary
Målet med denne artikel er at give en standardiseret tilgang til at fremkalde human hepatisk stamfader differentiering fra pluripotente stamceller. Udviklingen af denne procedure med brugsklare medieformuleringer giver brugeren et letkøbt system til at generere menneskelige leverceller til biomedicinsk forskning og oversættelse.
Abstract
Leversygdom er et eskalerende globalt sundhedsproblem. Mens levertransplantation er en effektiv form for terapi, patientdødelighed er steget på grund af mangel på donororgan tilgængelighed. Organknaphed påvirker også den rutinemæssige forsyning af menneskelige hepatocytter til grundforskning og klinikken. Derfor er udviklingen af vedvarende kilder til menneskelige lever stamfaderceller ønskelig og er målet med denne undersøgelse. For effektivt at kunne generere og implementere menneskelige leverformænd i stor skala blev der udviklet et reproducerbart leverforældreisystem. Denne protokol hjælper eksperimentel reproducerbarhed mellem brugere i en række cellekulturartikler formater og tillader differentiering ved hjælp af både, menneskelige embryonale og induceret pluripotente stamcellelinjer. Disse er vigtige fordele i forhold til de nuværende differentieringssystemer, der vil forbedre grundforskningen og bane vejen for klinisk produktudvikling.
Introduction
Leversygdom udgør en global sundhedsudfordring, der forårsager ca. 2 millioner dødsfald om året på verdensplan1. Selv om der findes en række modelsystemer til at studere leversygdomme og gribe klinisk ind, er den rutinemæssige brug af cellebaserede systemer begrænset af betydelige ulemper (til en gennemgang se Szkolnicka et al.2). Avanceret human pluripotente stamcellekultur (hPSC) kultur og somatiske celledifferentieringsmetoder repræsenterer lovende teknologier til at udvikle værktøjer til grundlæggende biomedicinsk forskning og vedvarende kilder til differentierede celler til klinikken3,4.
Til dato er der udviklet flere protokoller for hepatocyt-lignende celledifferentiering (HLC)5,6,7,8. Disse protokoller forsøger at genskabe aspekter af menneskets leverudvikling ved hjælp af en kombination af små molekyler og vækstfaktorer9,10. De fleste protokoller består af en trinvis differentieringsproces, hvor hPSC'er er primet til endelig endoderm, efterfulgt af lever stamfaderspecifikation11,12,13og slutter med HLC-specifikation. HLCs produceret af disse protokoller viser en blanding af føtale og voksne fænotyper. Dette omfatter udtrykket af alfa fetoprotein (AFP), såsom hepatocyt markører såsom HNF4α og albumin (ALB), samt narkotika metaboliserende kapacitet14,15,16. Mellem laboratorierne kan HLC-differentiering variere. derfor er det nødvendigt at udvikle standardiserede protokoller. Dette vil gøre det muligt for forskere effektivt at generere og anvende stamcellebaserede HLCs i stor skala til grundforskning og klinisk forskning.
En lever stamfader differentiering system blev udviklet, der kan anvendes på både menneskelige embryonale og induceret pluripotente stamcellelinjer ved hjælp af let at følge retningslinjer. Denne procedure giver homogene populationer af lever stamfaderer i forskellige cultureware formater, lige fra celle kultur kolber til 96 brønd plader. Nedenfor er protokollen til fremstilling af stamcelle-afledte lever stamfaderer i 24 og 96 brøndformater.
Celletæthed, der anvendes i nedenstående protokol, er angivet for en brønd på henholdsvis 24 og 96 brøndplade (se tabel 1). Optimering af startcellenummeret er påkrævet for de forskellige cellekulturpladeformater og cellelinjer. Den foreslåede startcelletæthed til protokoloptimering er 2 x 105 celler/cm2. Til tæthedsoptimering kan flere celletætheder testes ved at tilføje ± 50.000 celler/cm2 ad gangen.
Protocol
1. Vedligeholdelse af pluripotente stamceller (hPSC) på laminin-521
- Humane pluripotente celler (hPSCs) ved 37 °C og 5% CO2 i en 6 brøndplade på laminin-521 (LN-521). Foder cellerne dagligt med 2 mL stamcellevedligeholdelsesmedium (dvs. mTeSR1 medium) pr. brønd af en 6 brøndplade op til den valgte sådag for differentiering (dag 0).
- Sørg for, at det ønskede cellekonfluens på 70-80% opnås før cellehøst.
2. Laminin-521 multiwell forberedelse og hPSC såning til differentiering
BEMÆRK: For hPSC'er, der ikke vedligeholdes på LN-521 (f.eks. matrigel eller fibronectin), opdeles hPSC'er på LN-521 og kultur i 1 uge før bestået og fremkalder differentiering for at forbedre effektiviteten af processen15,17,18.
- Laminin-belagt pladepræparat
- Optø et hætteglas med rekombinant LN-521 (100 μg/mL) ved 4 °C i 2 timer eller natten over.
- Der fremstilles en 8 μg/mL-opløsning ved at fortynde den optøede LN-521 i iskolde 1x DPBS med Ca2+/Mg2+.
- Der tilsættes 0,25 mL af 8 μg/mL LN-521-opløsningen til hver brønd på en 24 brøndplade eller 0,05 mL til hver brønd på en 96 brøndplade. Rock pladen forsigtigt fra side til side for jævnt at belægge brøndene med LN-521 opløsningen.
BEMÆRK: For 96 brøndpladeformat kan volumendispensering, cellesåning og mellemstore ændringer udføres ved hjælp af en halvautomatisk pipeline. For detaljer se Meseguer-Ripolles et al.19. - Forsegl ln-521-coatede plader med en halvgennemsigtig, fleksibel film og opbevares ved 4 °C natten over før brug.
BEMÆRK: LN-521 coatede plader kan anvendes i op til 2 uger, når de opbevares ved 4 °C. Undgå tørring af de laminin-coatede brønde.
- På dagen for cellesåningen opvarmes de formalede plader i en cellekulturkuvøse ved 37 °C i 30-60 min.
- Aspirere LN-521-løsningen.
BEMÆRK: Undgå direkte kontakt med aspiratoren med bunden af brønden for at forhindre skader på LN-521 belægningen. - Dispenser 0,5 mL stamcellevedligeholdelsesmedium med frisk suppleret 10 μM Rho-associeret kinase (ROCK) hæmmer Y27632 til hver brønd af en 24 brøndplade eller 0,05 mL til hver brønd af en 96 brøndplade. Placer pladen i inkubatoren, indtil den er klar til cellesåning.
- På den planlagte såningsdag (dag 0) og med et hPSC-sammenløb mellem 70-80%, markeres alle regioner med spontan differentiering på bunden af brøndene på 6 brøndpladen.
BEMÆRK: Spontan differentiering kan visualiseres ved en grov ændring i cellestørrelsen og/eller tilstedeværelsen af forskellige cellemorfologier ved hjælp af fasekontrastmikroskopi. - Aspirere og kassere de markerede regioner for differentiering og det brugte medium fra brøndene. Vask hver brønd med 1 mL DPBS uden Ca2+/ Mg2 + ved stuetemperatur (RT).
- Der tilsættes 1 mL enzymfrit dissociationsreagens (se Materialetabel)til hver brønd og inkuberes ved 37 °C i 8-10 min, indtil cellerne løsnes synligt fra pladen.
- Brug en celleskraber til forsigtigt at løsne cellerne fra brøndene. Pipette indholdet af hver godt op og ned 2-4x med en P1000 pipette til at give en enkelt celle suspension. For hver cellelinje samles celler fra alle vedligeholdelsesbjerne til et sterilt 50 ML-rør.
- Vask hver tømt godt med 1 mL af stamcellevedligeholdelsesmediet. Tilsæt vaskerne til det tilsvarende rør, der indeholder de grupperede celler fra den relevante cellelinje.
- For hver cellelinje skal du udføre tre levedygtige celletal på de samlede prøver. Beregn det gennemsnitlige antal levende celler (levende celler/mL) for hver cellelinje.
- Centrifugere de samlede prøver ved 250 x g i 5 min på RT. Aspirere supernatanten, derefter genbruge cellepillen i 1-3 mL RT stamcelle vedligeholdelse medium, frisk suppleret med 10 μM ROCK hæmmer Y27632.
- For hver cellelinje beregnes det cellenummer, der er behov for pr. antallet af brønde, der er forberedt på trin 2.4 (se tabel 1). Genbrug det krævede cellenummer med stamcellevedligeholdelsesmedium, der er frisk suppleret med 10 μM ROCK-hæmmer Y27632.
- De beregnede volumener lægges i brøndene på de forberedte og forlakerede plader fra trin 2.4 uden at fjerne den tilsatte diskenhed. Den samlede volumen per brønd vil være 1 mL for en 24 brønd plade og 0,1 mL for en 96 brønd plade. Sten forsigtigt pladerne fra side til side og frem og tilbage for at sikre jævn cellespredning i hele brønden.
BEMÆRK: En jævn cellefordeling på tværs af brønden er nøglen til at sikre homogen cellesåning og vellykket differentiering. - Læg de seedede plader i inkubatoren og sten straks de seedede plader forsigtigt frem og tilbage og fra side til side for jævnt at fordele cellerne og opretholde kulturer ved 37 °C og 5% CO2.
3. Differentiere hPSCs til lever stamfaderer på laminin-521
- Forbered medier til endelig endoderm induktion (fase 1) ved hjælp af Endoderm Basal Medium suppleret med de korrekte tilsætningsstoffer.
- På dag 0 optøs flasken på Endoderm Basal Medium natten over ved 4 °C.
- Forbered fase 1 Medium 1 (til brug på dag 1) efter behov.
- Optø tillæg MR og supplement CJ på is.
- Fortynd supplement MR og supplement CJ 1:100 i Endoderm Basal Medium.
- Forbered fase 1 Medium 2 til brug på dag 2-4 efter behov.
- Fortynd tillæg CJ 1:100 i Endoderm Basal Medium.
- Forbered medier til den efterfølgende levercellespecifikation (fase 2) differentiering ved hjælp af Hepatic Progenitor Medium.
- På dag 4 optøs flasken med Hepatic Progenitor Medium natten over ved 4 °C.
BEMÆRK: Der blev anvendt 1 % penicillin/streptomycin (endelige koncentrationer på henholdsvis 100 IE/mL og 100 μg/mL) til dette forsøg. Antibiotika er ikke påkrævet; brug af antibiotika er efter brugerens skøn.
- På dag 4 optøs flasken med Hepatic Progenitor Medium natten over ved 4 °C.
- På dag 1 af differentiering, fjerne den brugte stamcelle vedligeholdelse medium med 10 μM ROCKi Y-27632 medium fra brønde og erstatte med 0,5 mL af komplet Stage 1 Medium 1 per brønd af en 24 brønd plade og 0,1 mL per brønd af en 96 brønd plade.
- På dag 2, 3 og 4 skal du fjerne det brugte medium og fodre hver brønd med 0,5 mL fase 1 Medium 2 pr. brønd for en 24 brøndplade eller 0,1 mL pr. brønd af en 96 brøndplade.
- På dag 5 skal brøndene fastgøres til endelig endodermdifferentieringsanalyse via immunocytokemi. For de resterende brønde, fjerne de brugte medium og foder hver brønd med 0,5 mL af Hepatic Stamfader Differentiering Medium per brønd for en 24 brønd plade eller 0,1 mL per brønd af en 96 brønd plade. Opdater mediet igen på dag 6, 7 og 9.
- På dag 10, høste brønde til lever stamfader differentiering analyse eller gå videre med yderligere hepatocyt-lignende celle differentiering.
BEMÆRK: På dette tidspunkt blev prøverne enten rettet med 4% paraformaldehyd (PFA) til immuncytokemianalyse eller supernatant blev indsamlet til ELISA, og celler blev indsamlet til proteinkvantificering.
4. Karakterisering af hepatiske stamfader differentiering kulturer genereret fra hPSCs på laminin-521
- På dag 5 skal du opdage udtryk for endelige endodermspecifikke markører ved hjælp af immunstainning.
- På dag 10 skal du opdage udtryk for leverfaderspecifikke markører ved hjælp af immunstainning.
- På dag 10 måles AFP og ALB sekretion via ELISA ved hjælp af et kit efter producentens anvisninger og normaliserer per mg protein som bestemt af en bicinchoninsyre (BCA) protein assay.
- Vurder den hepatiske stamfadervariation af 96 brøndpladen ved at kvantificere procentdelen af HNF4α positive celler pr. Brønd.
5. Immuncytokemi og billedopsamling
- På dag 5 og 10 af differentiering, vaske celler 3x med 1x DPBS, med 0,5 mL per brønd af en 24 brønd plade og 0,1 mL pr brønd af en 96 brønd plade. Inkuber pladen med blid rysten i 2-5 min på RT.
BEMÆRK: Brug DPSB uden Ca2+/Mg2+ til immuncytokemi. - Fastgør cellerne med 4% paraformaldehyd (PFA) ved RT i 15-30 min ved at tilsætte 0,3 mL PFA pr. brønd for en 24 brøndplade og 0,1 mL pr. brønd af en 96 brøndplade.
- Vask 3x med 1x DPBS som beskrevet i trin 5.1.
- Permeabilize membranen med PBST ved hjælp af 0,1% Tween, 1x DPBS og inkubere i 20 min på RT ved at tilføje 0,3 mL PBST per brønd af en 24 brønd plade og 0,1 mL pr brønd af en 96 brønd plade.
- Proteinblokken skal udføres ved at inkubere cellerne med 10% BSA i PBST i 1 time, tilsættes 0,3 mL BSA pr. brønd af en 24 brøndplade og 0,1 mL BSA pr. brønd af en 96 brøndplade og ryster forsigtigt ved hjælp af en plade shaker.
- Efter proteinblokering erstattes blokeringsopløsningen med det primære antistof fortyndet i 1 % BSA i PBST og inkuberes ved 4 °C med skånsom rysten natten over.
BEMÆRK: Vask ikke mellem proteinblok og antistoftilsætning. - Efter 24 timer vaskes brønde 3x med PBST.
- Tilsættes det sekundære antistof i 1% BSA i PBST. Inkuber 1 time på RT i mørket med blid rysten.
- Efter sekundær antistofinkubation vaskes brønde 3x med 1x DPBS og dispensere Hoechst-pletten i henhold til producentens anvisninger i 10 min ved RT i mørke med blid rysten.
- Vask 3x med 1x DPBS. Pladerne er nu klar til billeddannelse.
BEMÆRK: Opbevar pladerne ved 4 °C i mørke indtil billeddannelse. - Billede multiwell plade ved hjælp af et højt indhold billeddannelse mikroskop efter immunohisto kemi. Billederhvervelse af flere synsområder anbefales for at opnå en sand repræsentation af brønden. Udtrykket af de forskellige markører blev vurderet via cellesegmenteringsanalyse ved hjælp af kommerciel software (se Materialetabel) (Figur 1).
BEMÆRK: Cellesegmentering kan også udføres ved hjælp af en billedanalyse open source-software som CellProfiler eller Fiji20,21.
Representative Results
Hepatisk stamfaderdifferentiering fra både hESC -linjerne (H9) og hiPSC -linjerne (P106) blev udført efter den trinvise protokol, der er beskrevet i figur 2. Her blev pluripotente stamceller sået som enkeltceller i LN-521-coatede plader før starten af differentiering. Cellekonfluens er nøglen til en robust og reproducerbar differentiering. Når det rette sammenløb var opnået (figur 2), blev der indledt differentiering. På dag 5 blev den endelige endoderm specifikation vurderet via Sox17 udtryk. I begge cellelinjer var Sox17 stærkt udtrykt med 80% ± henholdsvis 0,5% og 87,8% ± 0,5% SEM sox17-positive celler for henholdsvis H9 og P106 (figur 3). På dag 10 viste leverformænd en brostensbelagt-lignende morfologi (Figur 2). Derudover blev lever stamfaderspecifikationen vurderet for HNF4α, AFP, ALB og cytokeratin-19 (CK19) udtryk samt AFP- og ALB-proteinsekretion10,15,22 ( figur4). Både H9- og P106-leverkulturer udtrykte føtal levermarkører som HNF4α (91 % ± 0,5 % og 90 % ± 0,2 %), AFP (89,7 % ± 1,8 % og 86 % ± 1,2 %) og CK19 (78,5 % ± 3,2 % og 83,6 ± 1,8 %) (figur 4). AFP sekretion blev opdaget på dag 10 i begge cellelinjer (32,4 ± 1,6 og 47,8 ± 5,9 ng/mL/mg/24 h) (Figur 5). Albuminsyntesen blev observeret på lavere niveauer (30,7% ± 1,8% og 27,2% ± 1,1%) (figur 4) og blev ikke påvist via ELISA (figur 5).
Protokollen tillod standardiseret produktion af leverformænd fra 24 godt til 96 brøndplader. En halvautomatisk rørledning blev anvendt til at producere 96 brøndplader af leverformænd fra H9 og P106 cellelinjer som tidligere beskrevet17. Cellenummervariation og hepatisk stamfaderdifferentieringseffektivitet blev vurderet ved kvantificering af HNF4α-udtryk. Cellesegmentering blev udført til proteinkvantificering via immunofluorescence ved hjælp af et billedinstrument med højt indhold (Figur 1). På dag 10 viste leverformænd ingen signifikant variation på tværs af rækker med >94% af HNF4α-positive celler pr. brønd for H9 og 97% HNF4α-positive celler til P106 (Figur 6).
Figur 1: Oversigt over cellesegmenteringspipelinser. (A) Ved hjælp af det oprindelige billede blev (B)nuklear farvning anvendt til kernesegmentering. (C) Et kvalitetskontroltrin for nuklear segmentering baseret på form og størrelse blev udført for kun at kvantificere klart segmenterede kerner. (D) Herefter blev positive HNF4α-farvede kerner kvantificeret. (E) Endelig blev der anvendt en intensitetsbaseret tærskel til at identificere HNF4α-udtrykkende celler. I C og Erepræsenterer grønne kerner markerede celler, og magentakerner angiver kasserede celler. Skalalinje = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Hepatisk stamfaderdifferentiering fra hPSC'er. (A) Skematisk repræsentation af protokollen for hepatisk stamfaderdifferentiering. (B) Repræsentative billeder, der fremhæver de morfologiske ændringer under differentiering. På dag 0 (D0) præsenterede hPSCs en pakket monolag af celler. Herefter blev hPSC'erne primet til endelig endoderm på dag 5 (D5). Dette blev efterfulgt af hepatisk stamfader differentiering på dag 10 (D10). Lever stamfaderer viste en brosten-lignende cellemorfologi. Skalalinje = 75 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Karakterisering af endelige endoderm specifikation. På dag 5 blev celler farves til Sox17, en endelig endoderm markør. Procentdelen af Sox17-positive celler var 80 ± 0,5% for H9 og 87,8 ± 0,5% for P106. Den procentvise kvantificering var baseret på 10 separate brønde med 6 synsfelter pr. brønd. Data vises som den gennemsnitlige ± SEM. Skalalinje = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Hepatisk stamfaderkarakterisering. På dag 10 blev leverformænd plettet for levermarkører (A) HNF4α, (B) AFP og (C) ALB. For H9 var procentdelen af positive celler 91% ± 0,4%, 89,7% ± 1,8% og 30,7% ± 1,8% for henholdsvis HNF4α, AFP og ALB. For P106 var procentdelen af positive celler 90% ± 0,2%, 86% +/- 1,2% og 27,2% ± 1,1% for henholdsvis HNF4α, AFP og ALB. (D) Cholangiocyte afstamning potentiale blev vurderet via CK19 udtryk; H9-afledte leverformænd udtrykte 78,5% ± 3,2% CK19-positive celler, mens 83,6% ± 1,8% af CK19-positive celler blev observeret for P106 leverformænd. Immunoglobulin G (IgG) farvning blev brugt som en farvning kontrol. Den procentvise kvantificering var baseret på 10 separate brønde med 6 synsfelter pr. brønd. Data vises som den gennemsnitlige ± SEM. Skalalinje = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Hepatisk stamfader protein sekretion analyse. Udskillelsen af alpha fetoprotein (AFP) og albumin (ALB) blev analyseret i hepatiske stamfader kulturer på dag 10 i H9 og P109. Dataene repræsenterer tre biologiske kopier, og fejlstængerne repræsenterer SD. Udskillede proteiner blev kvantificeret fra 24 timers kulturmedium som nanogram udskillet protein pr. ML pr. mg protein, n = 3; ND = blev ikke fundet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Vurdering af brønd-til-brønd-variation i 96 brøndplade. (A) Visualisering af en 96 brønd plade visning af H9-afledte lever stamfaderer farves med HNF4α. (B) Kvantificering af de HNF4α-positive celler. Gennemsnit af celletal pr. brønd i rækker, fra seks synsfelter pr. vel kvantificeret. Det gennemsnitlige celletal på tværs af pladen var 94,81% ± 0,22 SEM HNF4α-positive celler pr. Brønd. Der blev ikke observeret nogen statistisk signifikante forskelle mellem brønde. (C) Visualisering af en 96 brønd plade visning af P106-afledte lever stamfaderer farves med HNF4α. (D) Kvantificering af HNF4α-positive celler. Det gennemsnitlige celletal pr. brønde i rækker fra seks synsfelter pr. brønd og kvantificeret. Det gennemsnitlige celletal på tværs af pladen var 97,7% ± 0,57 SEM HNF4α-positive celler pr. Brønd. Der blev ikke observeret nogen statistisk signifikante forskelle mellem rækkerne. Nå H12 blev brugt som en Immunoglobulin G (IgG) farvning kontrol. Skalastang = 1 mm. Envejs ANOVA med Tukeys post-hoc statistiske tests blev anvendt. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Pladeformat | Areal (cm2) | Celler pr. cm2 | Samlede celler pr. brønd | Dispenseringsvolumen (mL) | Cellekoncentration (celler/ml) |
| 24-brønds plade | 1.9 | 210526 | 400000 | 0.5 | 800000 |
| 96-brønd plade | 0.32 | 187500 | 60000 | 0.05 | 1200000 |
Tabel 1: Anbefalet celletæthed for de forskellige pladeformater for de hPSC-cellelinjer, der bruges i denne protokol.
Discussion
Generationen af menneskelige leverfaderceller fra pluripotente stamceller i stor skala kunne udgøre et lovende alternativ til kadaver-afledt materiale. Protokolstandardisering og reproducerbarhed er nøglen til at sikre teknologioversættelse og indvirkning på biomedicinsk forskning. For at løse dette har tidligere arbejde fokuseret på at udvikle en trinvis differentieringsprotokol fra hESC og iPSC'er ved hjælp af definerede tilsætningsstoffer og matricer15,23,24,25,26,27,28. Ved at gøre dette er hepatocyt fænotype og reproducerbarhed blevet forbedret, så semiautomatisering af differentieringsprocessen19. Det præsenterede system styrkes af dets kombination med off-the-shelf cellekulturmedier og et letkøbt hepatocytdifferentieringssystem.
Tidligere blev pluripotente celletæthed forud for starten af differentieringsprotokollen fremhævet som en nøglevariabel for at opnå en homogen population af lever stamfaderceller26. Ved hjælp af denne mere raffinerede procedure er det muligt at generere et stort antal stamcellebaserede leverformænd på en trinvis måde ved hjælp af en række startcelletætheder (tabel 1). På dag 5 blev endelig endoderm induktion valideret af Sox17 farvning (Figur 3). Der blev opnået en effektiv og robust differentiering i den endelige ende af 1980 med både testede ESC- og iPSC-linjer, idet mere end 80 % udtrykte Sox17 (figur 3). På dag 10, lever stamfaderer viste en ensartet brosten-lignende morfologi, og leveren stamcelle markører var højt beriget for både AFP og HNF4α (>86%, Figur 4). Ved hjælp af en kombination af manuelle og halvautomatiske teknologier var det muligt at udføre differentiering i flere pladeformater19.
I sin nuværende form er celledifferentiering velegnet til in vitro-baserede eksperimenter. Celleberigelse vil dog sandsynligvis være påkrævet før klinisk anvendelse for at sikre, at en homogen population af leverformænd er forberedt til levering.
Afslutningsvis giver den protokol, der er beskrevet her, feltet en standardiseret tilgang til fremstilling af leverformænd i stor skala. Det fremtidige arbejde vil fokusere på produktion af et nyt medium til efterfølgende HLC-differentiering, modning og vedligeholdelse.
Disclosures
David C. Hay er medstifter og aktionær i Stemnovate Ltd. Resten af forfatterne bekræfter, at de ikke har nogen interessekonflikter i emnet eller materialer, der diskuteres i denne artikel.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet med priser fra MRC Ph.d.-uddannelse Partnerskab (MR/K501293/1), uk Regenerative Medicine Platform (MRC MR/L022974/1 og MR/K026666/1), Chief Scientist Office (TCS/16/37).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS with Calcium and Magnesium | ThermoFisher | 14040133 | |
| Gentle cell dissociation reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | |
| Hoechst 33342 Ready Flow Reagent | thermofisher | R37165 | |
| Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LN521-02 | |
| Human Serum Albumin ELISA | Alpha Diagnostics | 1190 | |
| Human Serum Alpha Fetoprotein ELISA | Alpha Diagnostics | 500 | |
| mTeSR1 medium | STEMCELL Technologies | 5850 | |
| Operetta High-Content Imaging System | PerkinElmer | HH12000000 | |
| PBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190250 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
| Rho-associated kinase (ROCK)inhibitor Y27632 | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | |
| STEMdiff Definitive Endoderm Supplement CJ | STEMCELL Technologies | ||
| STEMdiff Definitive Endoderm Supplement MR | STEMCELL Technologies | ||
| STEMdiff Endoderm Basal Medium | STEMCELL Technologies | ||
| STEMdiff Hepatic Progenitor Medium | STEMCELL Technologies | ||
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Antibodies | |||
| Albumin | Sigma-Aldrich | A6684 | 1:200 (mouse) |
| Alpha-fetoprotein | Sigma-Aldrich | A8452 | 1:400 (mouse) |
| HNF-4α | Santa Cruz | sc-8987 | 1:400 (rabbit) |
| IgG | DAKO | 1:400 | |
| Sox17 | R&D Systems, Inc. | AF1924 | 1:200 (Goat) |
| Software | |||
| Columbus Image Data Storage and Analysis system | PerkinElmer |
References
- Asrani, S. K., Devarbhavi, H., Eaton, J., Kamath, P. S. Burden of liver diseases in the world. Journal of Hepatology. 70 (1), 151-171 (2019).
- Szkolnicka, D., Hay, D. C. Concise Review: Advances in Generating Hepatocytes from Pluripotent Stem Cells for Translational Medicine. Stem Cells Dayton Ohio. 34 (6), 1421-1426 (2016).
- Heslop, J. A., Duncan, S. A. The Use of Human Pluripotent Stem Cells for Modeling Liver Development and Disease. Hepatology. 69 (3), 1306-1316 (2019).
- Alwahsh, S. M., Rashidi, H., Hay, D. C. Liver cell therapy: is this the end of the beginning. Cell and Molecular Life Sciences. 75 (8), 1307-1324 (2018).
- Hay, D. C., et al. Efficient differentiation of hepatocytes from human embryonic stem cells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo. Stem Cells Dayton Ohio. 26 (4), 894-902 (2008).
- Si-Tayeb, K., et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).
- Hannan, N. R. F., Segeritz, C. -P., Touboul, T., Vallier, L. Production of hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 8 (2), 430-437 (2013).
- Basma, H., et al. Differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived hepatocytes. Gastroenterology. 136 (3), 990-999 (2009).
- Meseguer-Ripolles, J., Khetani, S. R., Blanco, J. G., Iredale, M., Hay, D. C. Pluripotent Stem Cell-Derived Human Tissue: Platforms to Evaluate Drug Metabolism and Safety. The AAPS Journal. 20 (1), 20 (2017).
- Si-Tayeb, K., Lemaigre, F. P., Duncan, S. A. Organogenesis and development of the liver. Developmental Cell. 18 (2), 175-189 (2010).
- D'Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).
- Shin, D., et al. Bmp and Fgf signaling are essential for liver specification in zebrafish. Development Cambridge England. 134 (11), 2041-2050 (2007).
- DeLaForest, A., et al. HNF4A is essential for specification of hepatic progenitors from human pluripotent stem cells. Development Cambridge England. 138 (19), 4143-4153 (2011).
- Baxter, M., et al. Phenotypic and functional analyses show stem cell-derived hepatocyte-like cells better mimic fetal rather than adult hepatocytes. Journal of Hepatology. 62 (3), 581-589 (2015).
- Cameron, K., et al. Recombinant Laminins Drive the Differentiation and Self-Organization of hESC-Derived Hepatocytes. Stem Cell Reports. 5 (6), 1250-1262 (2015).
- Szkolnicka, D., et al. Reducing Hepatocyte Injury and Necrosis in Response to Paracetamol Using Noncoding RNAs. Stem Cells Translational Medicine. 5 (6), 764-772 (2016).
- Domogatskaya, A., Rodin, S., Boutaud, A., Tryggvason, K. Laminin-511 but Not -332, -111, or -411 Enables Mouse Embryonic Stem Cell Self-Renewal In Vitro. Stem Cells. 26 (11), 2800-2809 (2008).
- Kanninen, L. K., et al. Laminin-511 and laminin-521-based matrices for efficient hepatic specification of human pluripotent stem cells. Biomaterials. 103, 86-100 (2016).
- Meseguer-Ripolles, J., Lucendo-Villarin, B., Wang, Y., Hay, D. C. Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (137), e57995 (2018).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7, 100 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Raven, A., et al. Cholangiocytes act as Facultative Liver Stem Cells during Impaired Hepatocyte Regeneration. Nature. 547 (7663), 350-354 (2017).
- Hay, D. C., et al. Unbiased screening of polymer libraries to define novel substrates for functional hepatocytes with inducible drug metabolism. Stem Cell Research. 6 (2), 92-102 (2011).
- Medine, C. N., et al. Developing High-Fidelity Hepatotoxicity Models from Pluripotent Stem Cells. Stem Cells Translational Medicine. 2 (7), 505-509 (2013).
- Szkolnicka, D., et al. Accurate prediction of drug-induced liver injury using stem cell-derived populations. Stem Cells Translational Medicine. 3 (2), 141-148 (2014).
- Wang, Y., et al. Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (121), e55355 (2017).
- Villarin, B. L., et al. Polymer Supported Directed Differentiation Reveals a Unique Gene Signature Predicting Stable Hepatocyte Performance. Advanced Healthcare Materials. 4 (12), 1820-1825 (2015).
- Wang, Y., et al. Multiomics Analyses of HNF4α Protein Domain Function during Human Pluripotent Stem Cell Differentiation. iScience. 16, 206-217 (2019).
