Summary
Målet med denna artikel är att tillhandahålla ett standardiserat tillvägagångssätt för att inducera mänskliga lever stamceller differentiering från pluripotenta stamceller. Utvecklingen av detta förfarande med färdiga medieformuleringar erbjuder användaren ett enkelt system för att generera mänskliga leverceller för biomedicinsk forskning och översättning.
Abstract
Leversjukdom är en eskalerande global hälsofråga. Medan levertransplantation är ett effektivt behandlingssätt, har patientdödligheten ökat på grund av brist på donatororgantillgänglighet. Organbrist påverkar också den rutinmässiga tillgången på mänskliga hepatocyter för grundforskning och kliniken. Därför är utvecklingen av förnybara källor till mänskliga lever stamceller önskvärd och är målet för denna studie. För att effektivt kunna generera och distribuera mänskliga lever avkomma i stor skala, utvecklades ett reproducerbart lever stamceller differentieringssystem. Detta protokoll underlättar experimentell reproducerbarhet mellan användare i en rad cellkulturprogram format och tillåter differentiering med hjälp av både, mänskliga embryonala och inducerad pluripotent stamcellslinjer. Dessa är viktiga fördelar jämfört med nuvarande differentieringssystem som kommer att förbättra grundforskningen och kan bana väg för klinisk produktutveckling.
Introduction
Leversjukdom utgör en global hälsoutmaning som orsakar cirka 2 miljoner dödsfall per år över hela världen1. Även om det finns ett antal modellsystem för att studera leversjukdomar och ingripa kliniskt, begränsas den rutinmässiga användningen av cellbaserade system av betydande nackdelar (för en översyn se Szkolnicka et al.2). Avancerad human pluripotent stamcellskultur (hPSC) och somatiska celldifferentieringsmetoder representerar lovande teknik för att utveckla verktyg för grundläggande biomedicinsk forskning och förnybara källor till differentierade celler förkliniken 3,4.
Hittills har flera protokoll för hepatocytliknande cell (HLC) differentiering utvecklats5,6,7,8. Dessa protokoll försöker återskapa aspekter av mänsklig leverutveckling genom att använda en kombination av små molekyler ochtillväxtfaktorer 9,10. De flesta protokoll består av en stegvis differentieringsprocess, där hPSCs är primade till slutgiltig endoderm, följt av lever stamceller specifikation11,12,13, och slutar med HLC-specifikation. HLCs som produceras av dessa protokoll visar en blandning av fetala och vuxna fenotyper. Detta inkluderar uttryck av alfa fetoprotein (AFP), såsom hepatocyt markörer såsom HNF4α och albumin (ALB), samt drogmetaboliserandekapacitet 14,15,16. Mellan laboratorier kan HLC-differentiering variera; Därför är utvecklingen av standardiserade protokoll nödvändig. Detta kommer att göra det möjligt för forskare att effektivt generera och tillämpa stamcellsbaserade HLCs i stor skala för grundläggande och klinisk forskning.
Ett lever stamceller differentieringssystem utvecklades som kan tillämpas på både mänskliga embryonala och inducerad pluripotenta stamcellslinjer med hjälp av lätt att följa riktlinjer. Detta förfarande ger homogena populationer av lever avkomma i olika odlingsmaterialformat, allt från cellodlingsflaskor till 96 brunnsplattor. Nedan följer protokollet för att producera stamcellsbaserade leverprogenitorer i 24 och 96 brunnsformat.
Celltäthet som används i det protokoll som presenteras nedan anges för en brunn på en 24 respektive 96 brunnsplatta (se tabell 1). Optimering av startcellsnumret krävs för de olika cellkulturplåtformaten och cellinjerna. Föreslagen startcellsdensitet för protokolloptimering är 2 x 105 celler/cm2. För densitetsoptimering kan flera celltätheter testas genom att lägga till ± 50 000 celler/cm2 åt gången.
Protocol
1. Underhåll av pluripotenta stamceller (hPSC) på laminin-521
- Håll mänskliga pluripotenta celler (hPSCs) vid 37 °C och 5% CO2 i en 6 brunnsplatta på laminin-521 (LN-521). Mata cellerna dagligen med 2 ml stamcellsunderhållsmedium (dvs. mTeSR1-medium) per brunn på en 6 brunnsplatta fram till den valda sådddagen för differentiering (dag 0).
- Se till att önskad cellkonfluens på 70–80% uppnås före cellskörd.
2. Laminin-521 multiwell beredning och hPSC sådd för differentiering
OBS: För hPSCs som inte upprätthålls på LN-521 (t.ex. matrigel eller fibronectin), dela hPSCs på LN-521 och kultur i 1 vecka före passaging och framkalla differentiering för att förbättra effektiviteten i processen15,17,18.
- Lamininbelagd plåtberedning
- Tina en flaska rekombinant LN-521 (100 μg/ml) vid 4 °C i 2 timmar eller över natten.
- Förbered en 8 μg/ml-lösning genom att späda ut det tinade LN-521 i iskallt 1x DPBS med Ca2+/Mg2+.
- Tillsätt 0,25 ml av 8 μg/ml LN-521-lösning till varje brunn på en 24 brunnsplatta eller 0,05 ml till varje brunn på en 96 brunnsplatta. Gunga plattan försiktigt från sida till sida för att jämnt täcka brunnarna med LN-521-lösningen.
OBS: För 96-brunnsplattans format kan volymdispensering, cellfröning och medelstora förändringar utföras med hjälp av en halvautomatisk pipeline. För mer information se Meseguer-Ripolles et al.19. - Försegla de belagda LN-521-plattorna med en halvtransparent, flexibel film och förvara den vid 4 °C över natten före användning.
OBS: LN-521 belagda plattor kan användas i upp till 2 veckor när de förvaras vid 4 °C. Undvik torkning av de lamininbelagda brunnarna.
- På cellens sådddag, värm upp de förbelagda plattorna i en cellkulturinkubator vid 37 °C i 30-60 min.
- Aspirera LN-521-lösningen.
OBS: Undvik direktkontakt med spiatorn med brunnens botten för att förhindra skador på LN-521-beläggningen. - Dispensera 0,5 ml stamcellsunderhållsmedium med nyför kompletterad 10 μM Rho-associerad kinashämmare (ROCK) Y27632 till varje brunn på en 24 brunnsplatta eller 0,05 ml till varje brunn på en 96 brunnsplatta. Placera plattan i inkubatorn tills den är klar för cellsådd.
- På den schemalagda sådddagen (dag 0) och med en hPSC-sammanflöde mellan 70-80%, markera alla regioner med spontan differentiering på botten av brunnarna på 6-brunnsplattan.
OBS: Spontan differentiering kan visualiseras genom en bruttoförändring i cellstorleken och/eller förekomsten av olika cellmorfologier med hjälp av faskontrastmikroskopi. - Aspirera och kassera de markerade områdena av differentiering och det använda mediet från brunnarna. Tvätta varje brunn med 1 ml DPBS utan Ca2+/ Mg2 + vid rumstemperatur (RT).
- Tillsätt 1 ml enzymfritt dissociationsreagens (se materialförteckning)till varje brunn och inkubera vid 37 °C i 8–10 min tills cellerna synligt lossar från plattan.
- Använd en cellskrapa för att försiktigt lossa cellerna från brunnarna. Pipett innehållet i varje brunn upp och ner 2-4x med en P1000 pipett för att ge en encellig suspension. För varje cellinje, poolceller från alla underhållsbrunnar till ett sterilt 50 ml-rör.
- Tvätta varje tömd brunn med 1 ml stamcellsunderhållsmedium. Tillsätt tvättarna i motsvarande rör som innehåller de poolade cellerna från lämplig cellinje.
- För varje cellinje utför du tre livskraftiga cellantal på de poolade exemplen. Beräkna det genomsnittliga antalet levande celler (levande celler/ml) för varje cellinje.
- Centrifugera de poolade proverna vid 250 x g i 5 min vid RT. Aspirera supernatanten och återanvänd sedan cellpelleten i 1–3 ml RT stamcellsunderhållsmedium, nykom kompletterat med 10 μM ROCK-hämmare Y27632.
- För varje cellinje beräknar du det cellnummer som behövs per antalet brunnar som förberetts vid steg 2.4 (se tabell 1). Återanvänd det önskade cellnumret med stamcellsunderhållsmedium som nyligen kompletterats med 10 μM ROCK-hämmare Y27632.
- Tillsätt de beräknade volymerna i brunnarna på de beredda och förbelagda plattorna från steg 2.4 utan att ta bort volymen som lagts till tidigare. Den totala volymen per brunn kommer att vara 1 ml för en 24 brunnsplatta och 0,1 ml för en 96 brunnsplatta. Gunga försiktigt plattorna från sida till sida och fram och tillbaka för att säkerställa jämn cellspridning genom hela brunnen.
OBS: En jämn cellfördelning över brunnen är nyckeln till att säkerställa homogen cellsådd och framgångsrik differentiering. - Placera de sådda plattorna i inkubatorn och vagga omedelbart de sådda plattorna försiktigt fram och tillbaka och från sida till sida för att fördela cellerna jämnt och bevara kulturer vid 37 °C och 5 % CO2.
3. Differentiera hPSCs till lever avkomma på laminin-521
- Förbered media för definitiv endokderminduktion (steg 1) med hjälp av Endoderm Basal Medium kompletterat med rätt tillsatser.
- På dag 0, tina flaskan på Endoderm Basal Medium över natten vid 4 °C.
- Förbered steg 1 Medium 1 (för användning dag 1) efter behov.
- Tina Tillägg MR och Tillägg CJ på is.
- Späd ut tillägg MR och tillägg CJ 1:100 i Endoderm Basal Medium.
- Förbered steg 1 Medium 2 för användning dag 2–4 efter behov.
- Späd ut tillägg CJ 1:100 i Endoderm Basal Medium.
- Förbered media för efterföljande lever stamceller specifikation (steg 2) differentiering med hjälp av hepatiska stamceller Medium.
- På dag 4, tina flaskan av Hepatic Progenitor Medium över natten vid 4 °C.
OBS: 1% penicillin/streptomycin (slutliga koncentrationer på 100 IE/ml respektive 100 μg/ml) användes för detta experiment. Antibiotika krävs inte; antibiotikaanvändning är enligt användarens gottfinnande.
- På dag 4, tina flaskan av Hepatic Progenitor Medium över natten vid 4 °C.
- På dag 1 av differentiering, ta bort det förbrukade stamcellsunderhållsmediet med 10 μM ROCKi Y-27632 medium från brunnarna och ersätt med 0,5 ml komplett steg 1 Medium 1 per brunn på en 24 brunnsplatta och 0,1 mL per brunn på en 96 brunnsplatta.
- På dagarna 2, 3 och 4, ta bort det spenderade mediet och mata varje brunn med 0,5 ml steg 1 Medium 2 per brunn för en 24 brunnsplatta eller 0,1 ml per brunn på en 96 brunnsplatta.
- På dag 5, fixa brunnarna för slutgiltig endoderm differentiering analys via immunocytochemistry. För de återstående brunnarna, ta bort det förbrukade mediet och mata varje brunn med 0,5 ml leverprogenitor differentieringsmedium per brunn för en 24 brunnsplatta eller 0,1 mL per brunn på en 96 brunnsplatta. Uppdatera mediet igen dag 6, 7 och 9.
- På dag 10, skörda brunnar för lever stamceller differentiering analys eller fortsätta med ytterligare hepatocyt-liknande cell differentiering.
OBS: Vid denna tidpunkt var proverna antingen fixerade med 4% paraformaldehyd (PFA) för immunocytokemi analys eller supernatant samlades in för ELISA och celler samlades in för protein kvantifiering.
4. Karakterisering av lever stamceller differentiering kulturer genereras från hPSCs på laminin-521
- På dag 5, detektera uttryck för slutgiltiga endoderm-specifika markörer med hjälp av immunostaining.
- På dag 10, detektera uttryck av lever stamceller-specifika markörer med hjälp av immunostaining.
- På dag 10, mät AFP och ALB utsöndring via ELISA med hjälp av ett kit enligt tillverkarens instruktioner och normalisera per mg protein enligt en bicinchoninic syra (BCA) proteintest.
- Utvärdera den lever stamceller variabiliteten hos 96 brunn plattan genom att kvantifiera andelen HNF4α positiva celler per brunn.
5. Immunocytokemi och bildförvärv
- På dagarna 5 och 10 av differentiering, tvätta cellerna 3x med 1x DPBS, med 0,5 ml per brunn på en 24 brunnsplatta och 0,1 ml per brunn på en 96 brunnsplatta. Inkubera plattan med skonsam skakning i 2–5 min på RT.
OBS: Använd DPSB utan Ca2+/Mg2+ för immunocytokemi. - Fixera cellerna med 4% paraformaldehyd (PFA) på RT i 15-30 min genom att lägga till 0,3 ml PFA per brunn för en 24 brunnsplatta och 0,1 mL per brunn på en 96 brunnsplatta.
- Tvätta 3x med 1x DPBS enligt beskrivningen i steg 5.1.
- Permeabilisera membranet med PBST med 0,1% interpolering, 1x DPBS och inkubera i 20 min vid RT genom att lägga till 0,3 ml PBST per brunn på en 24 brunnsplatta och 0,1 ml per brunn på en 96 brunnsplatta.
- Utför proteinblocket genom att inkubera cellerna med 10% BSA i PBST i 1 h, tillsätt 0,3 ml BSA per brunn på en 24-brunnsplatta och 0,1 ml BSA per brunn på en 96 brunnsplatta, skaka försiktigt med en plattskakapparat.
- Efter proteinblockering, ersätt blockeringslösningen med den primära antikroppen utspädd i 1% BSA i PBST och inkubera vid 4 °C med skonsam skakning över natten.
OBS: Tvätta inte mellan proteinblock och antikroppstillskott. - Efter 24 h, tvätta brunnar 3x med PBST.
- Tillsätt den sekundära antikroppen i 1% BSA i PBST. Inkubera 1 timme på RT i mörkret med mild skakning.
- Efter sekundär antikroppsinkubation, tvätta brunnar 3x med 1x DPBS och dispensera Hoechst-fläck enligt tillverkarens instruktioner i 10 minuter på RT i mörkret med mild skakning.
- Tvätta 3x med 1x DPBS. Plattorna är nu klara för avbildning.
OBS: Förvara plattorna vid 4 °C i mörker tills de avbildningar. - Avbilda multiwellplattan med hjälp av ett högkvalitativt bildmikroskop efter immunohistokemi. Bildförvärv av flera synfält rekommenderas för att få en sann representation av brunnen. Uttrycket för de olika markörerna bedömdes genom cellsegmenteringsanalys med hjälp av kommersiell programvara (se materialförteckning)(figur 1).
OBS: Cellsegmentering kan också utföras med hjälp av en bildanalys programvara med öppen källkod som CellProfiler eller Fiji20,21.
Representative Results
Leverprogenitor differentiering från både hESC (H9) och hiPSC (P106) linjer utfördes enligt stegvis protokollet beskrivs i figur 2. Här såddes pluripotenta stamceller som enstaka celler i LN-521-belagda plattor före differentieringsstarten. Cellkonfluens är nyckeln till en robust och reproducerbar differentiering. När rätt sammanflöde uppnåddes (figur 2) inleddes differentiering. Dag 5 bedömdes slutgiltig endoderm specifikation via Sox17 uttryck. I båda cellinjerna uttrycktes Sox17 starkt med 80% ± 0,5% respektive 87,8% ± 0,5% SEM av Sox17-positiva celler för H9 respektive P106 (Figur 3). På dag 10 visade leverprogenatorer en kullerstensliknande morfologi (figur 2). Dessutom bedömdes leverprogenitorspecifikation för uttrycket HNF4α, AFP, ALB och cytokeratin-19 (CK19) samt AFP- och ALB-proteinsekretion10,15,22 ( figur4). Både H9 och P106 lever stamceller kulturer uttryckt fetala lever markörer såsom HNF4α (91% ± 0,5% och 90% ± 0,2%), AFP (89,7 % ± 1,8 % och 86 % ± 1,2 %) och CK19 (78,5 % ± 3,2 % och 83,6 ± 1,8 %) (figur 4). AFP-utsöndring upptäcktes dag 10 i båda cellinjerna (32,4 ± 1,6 och 47,8 ± 5,9 ng/mL/mg/24 h) (Figur 5). Albuminsyntes observerades på lägre nivåer (30,7% ± 1,8% och 27,2% ± 1,1%) (Figur 4) och upptäcktes inte via ELISA (Figur 5).
Protokollet tillät standardiserad produktion av lever avkommor från 24 brunn till 96 brunnsplattor. En halvautomatisk rörledning användes för att producera 96 brunnsplattor av leverprogenitorer från H9- och P106-cellinjer som tidigare beskrivits17. Cell nummer variabilitet och lever stamceller differentiering effektivitet bedömdes genom kvantifiering av HNF4α uttryck. Cellsegmentering utfördes för proteink kvantifiering via immunofluorescens med hjälp av ett högkvalitativt bildinstrument (figur 1). Dag 10 visade leverprogenitorer ingen signifikant variabilitet mellan raderna med >94% av HNF4α-positiva celler per brunn för H9 och 97% HNF4α-positiva celler för P106 (Figur 6).
Bild 1:Översikt över cellsegmenteringspipeline. (A) Med hjälp av den ursprungliga bilden användes( B) kärnfärgning för nukleisegmentering. C)Ett kvalitetskontrollsteg för kärnsegmentering baserat på form och storlek utfördes för att endast kvantifiera tydligt segmenterade kärnor. D)Efter detta kvantifierades positiva HNF4α-färgade kärnor. E)Slutligen användes en intensitetsbaserad tröskel för att identifiera HNF4α-uttrycksceller. I C och Erepresenterar gröna kärnor markerade celler och magentakärnor indikerar kasserade celler. Skalstreck = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Differentiering av leverprogenitorer från hPSCs. (A) Schematisk representation av protokollet för differentiering av leverprogenitorer. B)Representativa bilder som belyser de morfologiska förändringarna under differentiering. På dag 0 (D0) presenterade hPSCs en packad monoskikt av celler. Efter detta, hPSCs primed i slutgiltiga endoderm på dag 5 (D5). Detta följdes av lever stamceller differentiering på dag 10 (D10). Lever avkommoratorer visade en kullersten-liknande cell morfologi. Skalstreck = 75 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Karakterisering av slutgiltig endodermspecifikation. På dag 5, celler var färgade för Sox17, en slutgiltig endoderm markör. Andelen Sox17-positiva celler var 80 ± 0,5% för H9 och 87,8 ± 0,5% för P106. Den procentuella kvantifieringen baserades på 10 separata brunnar med 6 synfält per brunn. Data visas som den genomsnittliga ± SEM. Skalstreck = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 4: Lever avkomma karakterisering. Dag 10 var lever avkomma fläckade för lever markörer (A) HNF4α, ( B )AFP,och (C) ALB. För H9 var andelen positiva celler 91% ± 0,4%, 89,7% ± 1,8% respektive 30,7% ± 1,8% för HNF4α, AFP respektive ALB. För P106 var andelen positiva celler 90% ± 0,2%, 86% +/- 1,2%, respektive 27,2% ± 1,1% för HNF4α, AFP och ALB. D)Cholangiocyte härstamning potential bedömdes via CK19 uttryck. H9-härledda lever stamceller uttryckt 78,5% ± 3,2% CK19-positiva celler, medan 83,6% ± 1,8% av CK19-positiva celler observerades för P106 lever stamceller. Immunoglobulin G (IgG) färgning användes som en färgning kontroll. Den procentuella kvantifieringen baserades på 10 separata brunnar med 6 synfält per brunn. Data visas som den genomsnittliga ± SEM. Skalstreck = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Analys av leverprogenitorproteinsekretion. Utsöndring av alfa fetoprotein (AFP) och albumin (ALB) analyserades i lever stamceller kulturer på dag 10 i H9 och P109. Data representerar tre biologiska replikat och felstaplarna representerar SD. Utsöndrade proteiner kvantifierades från 24 h odlingsmedium som nanogram av utsöndrat protein per ml per mg protein, n = 3; ND = inte detekterat. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 6: Bedömning av brunnsvariation i 96 brunnsplatta. (A) Visualisering av en 96 brunn platta vy av H9-härledda lever stamceller färgas med HNF4α. B)Kvantifiering av de HNF4α-positiva cellerna. Medelvärde för cellnummer per brunn i rader, från sex synfält per väl kvantifierad. Det genomsnittliga cellnumret över plattan var 94,81% ± 0,22 SEM HNF4α-positiva celler per brunn. Inga statistiskt signifikanta skillnader observerades mellan brunnar. (C) Visualisering av en 96 brunn platta vy av P106-härledda lever stamceller färgas med HNF4α. D)Kvantifiering av HNF4α-positiva celler. Det genomsnittliga cellnumret per brunnar i rader, från sex synfält per brunn och kvantifierat. Det genomsnittliga cellnumret över plattan var 97,7% ± 0,57 SEM HNF4α-positiva celler per brunn. Inga statistiskt signifikanta skillnader observerades mellan raderna. Tja H12 användes som en Immunoglobulin G (IgG) färgning kontroll. Skalstång = 1 mm. Enkelvägs ANOVA med Tukeys post hoc-statistiska tester användes. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| Plåtformat | Yta (cm2) | Celler per cm2 | Totalt antal celler per brunn | Dispenseringsvolym (ml) | Cellkoncentration (celler/ml) |
| 24-brunnsplatta | 1.9 | 210526 | 400000 | 0.5 | 800000 |
| 96-brunnsplatta | 0.32 | 187500 | 60000 | 0.05 | 1200000 |
Tabell 1: Rekommenderad celltäthet för de olika plåtformaten för hPSC-cellinjer som används i det här protokollet.
Discussion
Genereringen av mänskliga lever stamceller från pluripotenta stamceller i stor skala kan utgöra ett lovande alternativ till kadaver-härledda material. Protokollstandardisering och reproducerbarhet är nyckeln till att säkerställa tekniköversättning och påverkan för biomedicinsk forskning. För att ta itu med detta har tidigare arbete fokuserat på att utveckla ett stegvis differentieringsprotokoll från hESC och iPSCs med hjälp av definierade tillsatser ochmatriser 15,23,24,25,26,27,28. Genom att göra detta har hepatocyt fenotyp och reproducerbarhet förbättrats, vilket möjliggör halvautomatisering av differentieringsprocessen19. Systemet som presenteras förstärks av sin kombination med off-the-shelf cell kultur media och ett facile hepatocyte differentieringssystem.
Tidigare lyftes pluripotent celltäthet före början av differentiering protokollet som en viktig variabel för att uppnå en homogen population av lever stamceller26. Med hjälp av detta mer raffinerade förfarande är det möjligt att generera ett stort antal stamcellsbaserade leverprogenitorer stegvis med hjälp av ett intervall av startcellstätheter (tabell 1). Dag 5 validerades den definitiva induktionen av endoderm genom Sox17-färgning (figur 3). Effektiv och robust differentiering till definitiv endoderm uppnåddes med både testade ESC- och iPSC-linjer, där mer än 80 % uttryckte Sox17 (figur 3). Dag 10 uppvisade leverprogenitorer en enhetlig kullerstensliknande morfologi, och leverstamcellsmarkörer var mycket berikade för både AFP och HNF4α (>86%, figur 4). Med hjälp av en kombination av manuell och halvautomatisk teknik var det möjligt att utföra differentiering i flera plåtformat19.
I sin nuvarande form är cell differentiering lämplig för in vitro-baserade experiment. Cellberikning skulle dock sannolikt krävas före klinisk applicering för att säkerställa att en homogen population av leverprogenitorer förbereds för leverans.
Sammanfattningsvis ger protokollet som beskrivs här fältet ett standardiserat tillvägagångssätt för att producera leveravkommor i stor skala. Framtida arbete kommer att fokusera på produktion av ett nytt medium för efterföljande HLC-differentiering, mognad och underhåll.
Disclosures
David C. Hay är medgrundare och aktieägare i Stemnovate Ltd. Resten av författarna intygar att de inte har några intressekonflikter i ämnet eller material som diskuteras i denna artikel.
Acknowledgments
Denna studie stöddes med utmärkelser från MRC Doctoral Training Partnership (MR/K501293/1), UK Regenerative Medicine Platform (MRC MR/L022974/1 och MR/K026666/1), Chief Scientist Office (TCS/16/37).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS with Calcium and Magnesium | ThermoFisher | 14040133 | |
| Gentle cell dissociation reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | |
| Hoechst 33342 Ready Flow Reagent | thermofisher | R37165 | |
| Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LN521-02 | |
| Human Serum Albumin ELISA | Alpha Diagnostics | 1190 | |
| Human Serum Alpha Fetoprotein ELISA | Alpha Diagnostics | 500 | |
| mTeSR1 medium | STEMCELL Technologies | 5850 | |
| Operetta High-Content Imaging System | PerkinElmer | HH12000000 | |
| PBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190250 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
| Rho-associated kinase (ROCK)inhibitor Y27632 | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | |
| STEMdiff Definitive Endoderm Supplement CJ | STEMCELL Technologies | ||
| STEMdiff Definitive Endoderm Supplement MR | STEMCELL Technologies | ||
| STEMdiff Endoderm Basal Medium | STEMCELL Technologies | ||
| STEMdiff Hepatic Progenitor Medium | STEMCELL Technologies | ||
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Antibodies | |||
| Albumin | Sigma-Aldrich | A6684 | 1:200 (mouse) |
| Alpha-fetoprotein | Sigma-Aldrich | A8452 | 1:400 (mouse) |
| HNF-4α | Santa Cruz | sc-8987 | 1:400 (rabbit) |
| IgG | DAKO | 1:400 | |
| Sox17 | R&D Systems, Inc. | AF1924 | 1:200 (Goat) |
| Software | |||
| Columbus Image Data Storage and Analysis system | PerkinElmer |
References
- Asrani, S. K., Devarbhavi, H., Eaton, J., Kamath, P. S. Burden of liver diseases in the world. Journal of Hepatology. 70 (1), 151-171 (2019).
- Szkolnicka, D., Hay, D. C. Concise Review: Advances in Generating Hepatocytes from Pluripotent Stem Cells for Translational Medicine. Stem Cells Dayton Ohio. 34 (6), 1421-1426 (2016).
- Heslop, J. A., Duncan, S. A. The Use of Human Pluripotent Stem Cells for Modeling Liver Development and Disease. Hepatology. 69 (3), 1306-1316 (2019).
- Alwahsh, S. M., Rashidi, H., Hay, D. C. Liver cell therapy: is this the end of the beginning. Cell and Molecular Life Sciences. 75 (8), 1307-1324 (2018).
- Hay, D. C., et al. Efficient differentiation of hepatocytes from human embryonic stem cells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo. Stem Cells Dayton Ohio. 26 (4), 894-902 (2008).
- Si-Tayeb, K., et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).
- Hannan, N. R. F., Segeritz, C. -P., Touboul, T., Vallier, L. Production of hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 8 (2), 430-437 (2013).
- Basma, H., et al. Differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived hepatocytes. Gastroenterology. 136 (3), 990-999 (2009).
- Meseguer-Ripolles, J., Khetani, S. R., Blanco, J. G., Iredale, M., Hay, D. C. Pluripotent Stem Cell-Derived Human Tissue: Platforms to Evaluate Drug Metabolism and Safety. The AAPS Journal. 20 (1), 20 (2017).
- Si-Tayeb, K., Lemaigre, F. P., Duncan, S. A. Organogenesis and development of the liver. Developmental Cell. 18 (2), 175-189 (2010).
- D'Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).
- Shin, D., et al. Bmp and Fgf signaling are essential for liver specification in zebrafish. Development Cambridge England. 134 (11), 2041-2050 (2007).
- DeLaForest, A., et al. HNF4A is essential for specification of hepatic progenitors from human pluripotent stem cells. Development Cambridge England. 138 (19), 4143-4153 (2011).
- Baxter, M., et al. Phenotypic and functional analyses show stem cell-derived hepatocyte-like cells better mimic fetal rather than adult hepatocytes. Journal of Hepatology. 62 (3), 581-589 (2015).
- Cameron, K., et al. Recombinant Laminins Drive the Differentiation and Self-Organization of hESC-Derived Hepatocytes. Stem Cell Reports. 5 (6), 1250-1262 (2015).
- Szkolnicka, D., et al. Reducing Hepatocyte Injury and Necrosis in Response to Paracetamol Using Noncoding RNAs. Stem Cells Translational Medicine. 5 (6), 764-772 (2016).
- Domogatskaya, A., Rodin, S., Boutaud, A., Tryggvason, K. Laminin-511 but Not -332, -111, or -411 Enables Mouse Embryonic Stem Cell Self-Renewal In Vitro. Stem Cells. 26 (11), 2800-2809 (2008).
- Kanninen, L. K., et al. Laminin-511 and laminin-521-based matrices for efficient hepatic specification of human pluripotent stem cells. Biomaterials. 103, 86-100 (2016).
- Meseguer-Ripolles, J., Lucendo-Villarin, B., Wang, Y., Hay, D. C. Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (137), e57995 (2018).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7, 100 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Raven, A., et al. Cholangiocytes act as Facultative Liver Stem Cells during Impaired Hepatocyte Regeneration. Nature. 547 (7663), 350-354 (2017).
- Hay, D. C., et al. Unbiased screening of polymer libraries to define novel substrates for functional hepatocytes with inducible drug metabolism. Stem Cell Research. 6 (2), 92-102 (2011).
- Medine, C. N., et al. Developing High-Fidelity Hepatotoxicity Models from Pluripotent Stem Cells. Stem Cells Translational Medicine. 2 (7), 505-509 (2013).
- Szkolnicka, D., et al. Accurate prediction of drug-induced liver injury using stem cell-derived populations. Stem Cells Translational Medicine. 3 (2), 141-148 (2014).
- Wang, Y., et al. Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (121), e55355 (2017).
- Villarin, B. L., et al. Polymer Supported Directed Differentiation Reveals a Unique Gene Signature Predicting Stable Hepatocyte Performance. Advanced Healthcare Materials. 4 (12), 1820-1825 (2015).
- Wang, Y., et al. Multiomics Analyses of HNF4α Protein Domain Function during Human Pluripotent Stem Cell Differentiation. iScience. 16, 206-217 (2019).
