Summary
该协议描述了一种非放射性检测，用于测量小DNA和RNA基质上多核苷酸激酶（PNKs）的激酶活性。
Abstract
多核苷酸激酶（PNKs）是催化DNA和RNA寡核苷酸5'羟基端磷酸化的酶。可以直接或间接地对PNK的活动进行量化。此处介绍的是一种直接的体外测量 PNK 活性的方法，它依赖于荧光标记的寡核苷酸基质和聚丙烯酰胺凝胶电泳。这种方法提供磷酸化产品的分辨率，同时避免使用放射性标记基板。协议详细介绍了如何设置磷酸化反应，准备和运行大型聚丙烯酰胺凝胶，并量化反应产品。这种测定技术上最具挑战性的部分是浇注和运行大型聚丙烯酰胺凝胶;因此，提供了克服共同困难的重要细节。该协议针对Grc3进行了优化，Grk是一种PNK，它结合其结合伙伴Las1核酸酶组装成一个义务性前核糖体RNA处理复合物。然而，此协议可以适应测量其他PNK酶的活性。此外，这种测定也可以被修改，以确定反应的不同成分的影响，如核苷三磷酸盐，金属离子和寡核苷酸。
Introduction
多核苷酸激酶（PNK）在许多DNA和RNA处理途径中起着至关重要的作用，如DNA修复和核糖体组装1、2、3、4、5。,2,3,4,5这些基本酶催化终端（伽马）单磷酸盐从核苷三磷酸盐（NTP，最常见的ATP）转移到核苷酸基质的5'羟基端。PNK最具有最良好特征之一是细菌T4,PNK，它具有广泛的基质特异性，被分子生物学实验室大量利用，将放射性同位素标签整合到DNA或RNA基质,,,6、7、8、9、10、11、127,8的5个术语中。91011PNK酶的另一个例子是CLP1，它存在于尤卡里亚、尤菌和阿奇亚，并牵连到几个RNA处理途径4，13，14，15。,14,154,
从历史上看，大多数测量多核苷酸激酶活性的测定都依赖于放射性同位素标记和随后的自体造影术,5，16。近年来，还开发了一些用于测量PNK活性的附加检测方法，包括单分子方法、微芯片电泳、分子信标，以及基于,色度和发光的测定17、18、19、20、21、22。,18,19,2021,22虽然许多新方法提供了增强的检测限值并避免使用放射性，但每种方法都有缺点，例如成本、对固定树脂的依赖以及基板选择的限制。
Grc3是一种多核苷酸激酶，在核糖体前RNA2、3、23,3,的处理中起着关键作用。Grc3与内白蛋白酶Las1形成一个义务复合体，它切割了前核糖体RNA3的内部转录空间2（ITS2）。Las1的 ITS2 的裂解产生一种含有 5' 羟基的产品，随后由 Grc3 激酶3 磷酸化。为了研究Grc3的核苷酸和基质特异性，需要一种廉价的测定方法，允许对不同的寡核苷酸基质进行检测。因此，利用荧光标记基材开发了PNK磷酸化测定。该测定成功地用于确定Grc3可以利用任何NTP进行磷酸转移活性，但有利于ATP24。该协议调整原始测定，以测量Grc3的PNK活性，其RNA模拟其前核糖体RNA基质（SC-ITS2，表1）。这种基于荧光的方法的一个具有挑战性的方面是依靠大型聚丙烯酰胺凝胶来有效解决磷酸化和非磷化基材。该协议提供了有关如何倒这些大凝胶的具体细节，并避免在这样做时常见的陷阱。
使用RNA需要特别小心，因为它极易降解。有简单的预防措施，可以采取，以限制核糖核酸酶污染。单独的RNA工作站，可以很容易地用含有RNase抑制剂的清洁剂处理，通常是有帮助的。处理样品时始终佩戴手套，并且必须使用无 RNase 认证的耗材。由于水是另一种常见的污染源，因此最好使用新鲜纯净的水，并使用 0.22 μm 过滤器对所有溶液进行消毒。
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Protocol
1. 准备
- 准备缓冲液和试剂。
- 通过组合 20 μL 的 1 M Tris （pH = 8.0）、40 μL 的 5 M 氯化钠、2.5 μL 的 2 M 氯化镁、100 μL 的 50%（v/v）甘油和无 1 mL 的 RNase 水，制成 1x 反应缓冲液，达到 1 mL 的总体积。
- 通过组合 4.8 g 尿素、200 μL 的 1 M Tris （pH = 8.0）、20 μL 的 0.5 M EDTA （pH = 8.0）、0.5 mL 的 1% （w/v） 肉酚蓝色和无 Rse-0 水，使尿素加载染料达到 10 mL 的总体积。
- 通过组合 108 g Tris 碱基、55 g 的玻酸、40 mL 的 0.5 M EDTA （pH = 8.0） 和无 RNase 水，使 10x TBE 缓冲液达到 1 L 的总体积。
- 使 10% （w/v） 铵硫酸盐 （APS）。重量 0.5 g APS，加入 3 mL 无 RNase 水溶解固体。加入无 RNase 水，总体积达到 5 mL。将管子用铝箔包裹，将溶液储存在4°C。
注： 溶解的 APS 会随时间而衰减。每 2 周更换 10% 的 APS 库存。
- 获得多核苷酸激酶酶。
- 获得纯Las1-Grc3 PNK酶2存储在反应 缓冲液中（见步骤1.1.1），库存浓度为20μM。存储缓冲区将因特定的 PNK 而异。
- 准备核酸基板。
注：该协议监测含有Las1-Grc3处理场址（C2）的27 nt RNA基材的5'-磷酸化，该基质位于糖Saccharomyces cerevisiae精糖前核子体内部转录器2（SC-ITS2;见表1）2，25，26。2,25,26- 化学合成含有5'-羟基端的RNA寡核苷酸基质，以及3'荧光标签。荧光泳将用于RNA的可视化。确保荧光团位于不用于磷酸化的RNA端。作为商业来源的替代方案，可以使用具有成本效益的协议27对RNA基材进行内部和终端荧光标记。
- 通过HPLC纯化28去除RNA标签反应中多余的荧光团。
- 使用无 RNase 水将冻干RNA重新暂停至500 nM。
- 将RNA等分在-80°C储存，用于长期储存，或-20°C储存，用于短期储存。
- 准备 ATP 浓度系列。
- 使用反应缓冲器制作 20 mM 的 ATP 工作库存（参见步骤 1.1.1）。使用此工作库存生成 4 个串行稀释，范围为 20 mM-0.02 mM。
- 为了进行浓度系列的第一次稀释，将 20 mM ATP 工作库存的 1 μL 与 9 μL 的反应缓冲液混合。这将导致 ATP 的稀释 10 倍，最终浓度为 2 mM。
- 使用步骤 1.4.2 中生成的 2 mM ATP 库存进行浓度系列中的下一次稀释。将 2 mM ATP 库存的 1 μL 与 9 μL 的反应缓冲液混合。这将使新的ATP库存浓度为0.2 mM。
- 继续用 9 μL 的反应缓冲液稀释先前 ATP 库存的 1 μL，以使随后的 ATP 库存在浓度系列中。
2. 体外RNA激酶反应
注：此测定可用于测量多个变量，如时间、核苷酸水平或酶浓度。本实验的目标是在存在恒定的 Las1-Grc3 复杂和不同的 ATP 水平的情况下评估磷酸化 RNA 的含量。
- 对于每种RNA酶激酶反应，结合1 μL的500 nM RNA基质，8.3μL的130 nM Las1-Grc3，和0.2 μL的5 mM EDTA。
注：如果进行多次反应，准备RNA酶混合物的主库存和该主混合物的9.5μL到每个反应管。 - 开始检测。
- 将热块设置为 37 °C。
- 在 10 s 间隔下，将步骤 1.4 中制备的 ATP 浓度系列中的 0.5 μL 与一个 RNA 酶混合物混合，将反应放在 37°C 热块中。
注：将0.5μL的反应缓冲液代替ATP加入一个RNA酶混合物，进行PNK阴性控制。也使用另一种必要的控制（即，在没有PNK酶的情况下，RNA基质）。 - 在37°C下孵育60分钟的反应。
注：荧光标记的RNA对光敏感;因此，用铝箔覆盖反应。 - 使用与步骤 2.2.2 相同的顺序，使用 10 μL 的尿素加载染料将反应尖化，每 10 s 淬火一次（参见步骤 1.1.2）。
注：除了4M尿素外，在此步骤中可添加蛋白酶K来降解酶。按照供应商提供的说明确定所需的蛋白酶量和反应条件。 - 立即使用淬火体外RNA激酶反应进行下游分析（见第3节）或在-20°C下储存，稍后进行分析。
3. 凝胶电泳
- 准备 15% 丙烯酰胺/8 M 尿素凝胶溶液。
注意：必须小心处理丙烯酰胺，因为它是神经毒素。处理时，请始终戴上手套、实验室外套和护目镜。- 在 150 mL 玻璃烧杯中，将 22.5 mL 预混 40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺 29：1 溶液、6 mL 10x TBE（参见步骤 1.1.3）、28.8 g 尿素和无 RNase 水混合到总体积为 59 mL。轻轻搅拌溶液。
注：根据RNA基板长度，改变聚丙烯酰胺的百分比可改善未磷酸化和磷酸化RNA之间的分辨率。 - 要溶解尿素，在微波炉中加热溶液20 s，搅拌液体，并立即将溶液放回微波炉中再加热20s。轻轻搅拌溶液，直到尿素完全溶解。
- 将玻璃烧杯放入含有冷水的浅水浴中，慢慢冷却溶液。确保玻璃烧杯周围的冷水水平高于玻璃烧杯内溶液的水平。这将促进有效的传热。等待 5 分钟。
注：如果玻璃烧杯感觉温暖，请勿继续使用本协议;水应低于25°C。 如果5分钟后仍然感觉温暖，则用新鲜的冷水代替水浴中的水，再等5分钟。 - 使用 0.22 μm 一次性过滤装置过滤和除气溶液，以去除颗粒物和微气泡。
- 在 150 mL 玻璃烧杯中，将 22.5 mL 预混 40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺 29：1 溶液、6 mL 10x TBE（参见步骤 1.1.3）、28.8 g 尿素和无 RNase 水混合到总体积为 59 mL。轻轻搅拌溶液。
- 倒变性凝胶。
- 使用肥皂和温水清洁短而长的玻璃板，用于整体尺寸为 31.0 厘米 x 38.5 厘米的凝胶。用 95% 乙醇喷洒每个玻璃板，擦拭玻璃以去除任何水分。
注：两个板中的一个可以硅化，以防止分离玻璃板夹层时对凝胶造成损坏。但是，此步骤是没有必要的，因为此协议旨在可视化RNA而不分离玻璃板。 - 将长玻璃板水平放在盒子顶部，以便从台面上升高。
注意：丙烯酰胺是有毒的，因此凝胶浇注站必须覆盖在可以吸收任何溢出液体的长凳纸中，并在程序完成后立即放置在废袋中。 - 沿长玻璃板的长边放置一个干净的 0.4 mm 分张。
- 将短玻璃板放在长板上，确保短板、长板和垫片的边缘对齐。使用三个均匀的金属夹夹夹住每侧。
- 在步骤 3.1 中制备的 15% 丙烯酰胺/8 M 尿素溶液中加入 24 μL 的 TEMED，然后混合溶液。
- 在步骤 3.2.5 中，将 600 μL 的 10%（w/v）APS（参见步骤 1.1.4）添加到溶液中，然后轻轻混合溶液。
- 立即将溶液倒在玻璃板之间。
注：为避免气泡，在浇注溶液时点按玻璃。 - 小心地在玻璃板三明治的顶部添加一个干净的 0.4 mm、32 个井梳子。
- 丙烯酰胺聚合至少30分钟。
- 使用肥皂和温水清洁短而长的玻璃板，用于整体尺寸为 31.0 厘米 x 38.5 厘米的凝胶。用 95% 乙醇喷洒每个玻璃板，擦拭玻璃以去除任何水分。
- 运行变性凝胶。
- 将热块设置为 75 °C。
- 拆下将玻璃板三明治放在一起的金属夹，彻底清洗和干燥玻璃板三明治。
- 将玻璃板夹层放入凝胶装置中，短板朝内。
- 通过将 100 mL 的 10x TBE 与 1.9 L 无 RNase 水相结合，准备 0.5 倍 TBE 运行缓冲液。将 600 mL 的运行缓冲液添加到凝胶装置的上部和下腔。
- 轻轻取下梳子，使用注射器彻底冲洗孔。
注：此步骤对于从井中去除尿素至关重要。 - 在 50 W. 电压约为 2，000 V 时预运行凝胶 30 分钟。
注意：这种凝胶装置在高瓦数下工作，用户应表现出预防措施。 - 使用注射器彻底冲洗孔。
注：此步骤对于将样品甚至装入井中至关重要。 - 脉冲从步骤 2.2.5 旋转淬火反应。然后在75°C下孵育管子3分钟。重复脉冲旋转。
- 立即每井装载 10 μL 样品，并在 50 W 下运行凝胶 3 小时。
注：荧光标记的RNA对光敏感;因此，用铝箔盖住凝胶装置。
- 图像变性凝胶。
- 关闭电源并排空凝胶装置的上腔。
- 用肥皂和水清洗和干燥玻璃板三明治的外侧。运输凝胶时，用铝箔盖住玻璃板三明治。
- 将玻璃板夹层安装到激光扫描仪的舞台上，激光扫描仪能够进行定量和灵敏的荧光检测。
注：这种凝胶非常薄，具有最大的分辨率。因此，此协议旨在通过玻璃板直接可视化荧光标记的 RNA，以避免从玻璃板三明治中去除凝胶的困难。使用市售的低荧光玻璃板将增加捕获的信号，提高信噪比。 - 为所需的荧光波设置激光扫描仪的激发和发射波长。
注：特定荧光团的最佳激发和发射波长可能不同。对于 FAM 荧光团，激发和发射波长分别是 495 nm 和 535 nm。 - 定义激光扫描仪舞台上要可视化的区域，并根据制造商的说明对凝胶进行成像（图 1）。
4. 图像分析和信号量化
- 将步骤 3.4.5 中获取的数字凝胶图像加载到图像过程软件中（ 参见材料表）。
- 使用鼠标的左键，单击并拖动一个矩形以定义一个模板框，以标记数字凝胶图像上用于量化每个 RNA 波段的边界。在没有PNK酶的情况下，在反应混合物中看到的RNA带通常是生成此模板的好波段。
注：为避免背景信号导致偏置，所测每个RNA带周围的区域必须相同。因此，最好使用相同的模板框来标定每个RNA带。 - 在"工具"下打开 ROI管理器，然后单击"添加"标记模板框的位置。
注：量化程序还可以根据软件用户手册自动绘制框。 - 使用鼠标的左键，单击模板框并将其拖动到下一个 RNA 波段，然后重复步骤 4.3。继续这个过程，直到每个反应中所有未磷化和磷酸化RNA波段的位置被标记。
- 单击 ROI 管理器中的"测量"，测量每个框中的集成密度。
- 要计算反应中磷酸化RNA的相对量，将磷酸化RNA波段的集成密度除以同一反应中未磷酸化和磷酸化RNA波段的集成密度之和。这种方法也可以用于计算未磷化RNA的相对量。
- 为了可视化磷酸化RNA产品的积累和ATP浓度中未磷化RNA基质的相应耗竭，绘制步骤4.6中计算的相对RNA量与ATP浓度。
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Representative Results
图1中显示了ATP滴定与固定数量的Las1-Grc3复合物的成功代表性 变性凝胶。酶的加入导致SC-ITS2 RNA基质的Las1中导RNA裂解，导致定义的RNA片段（5-OH C2 RNA）。添加ATP后，C2 RNA片段由Grc3 PNK（5-P C2 RNA）磷酸化。在变性凝胶中，磷酸化RNA的迁移速度比其未磷化RNA的迁移速度要快。如图 2所示，C2RNA片段的磷酸化可以通过绘制未磷化和磷酸化C2RNA的相对量与ATP浓度进行可视化。Grc3 PNK 还对未切割 SC-ITS2 基材的 5 端进行磷酸化，尽管速率较低。这证实了先前的工作，表明Grc3 PNK显示基板优先于其C2 RNA基质24。图 3 显示了不成功的 变性凝胶。这种凝胶没有成功，因为21 ntRNA基质含有降解产物（图3，第一通道）。这些降解产物与磷酸化产物重叠，无法准确量化磷酸化。相比之下，最短的RNA降解产物（图3，灰箭）可以成功分析，因为凝胶的这个区域不包含任何额外的RNA物种，这妨碍了其磷酸酸酯对应物的精确定量。为避免RNA降解带，保持工作空间和溶液无RNase，并限制RNA冷冻-解冻周期的数量。
图1：磷酸化RNA变性凝胶分析示例。 Las1-Grc3（110 nM）的体外RNA激酶测定用500 nM SC-ITS2 RNA孵育。X 标记没有 Las1-Grc3 的控制反应，黑色三角形表示 ATP 从 0-10 mM 的滴定。C2 RNA 是 Las1 核酸酶的 SC-ITS2 RNA 裂解的结果，是 Grc3 PNK 活性的内源性基质。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：RNA磷酸化的定量。 Las1-Grc3 RNA激酶活性的密度图在ATP浓度序列中以未磷化C2 RNA（灰线;5-OH C2 RNA）和磷酸化C2RNA（棕色线;5-P C2RNA）的百分比表示。错误条标记与三个独立技术复制的标准偏差。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：磷酸化RNA变性凝胶分析失败的例子。 体外RNA激酶测定T4 PNK（0-0.625 U）孵育5μm 21 ntRNA。X 标记没有 T4 PNK 的控制反应。这种RNA只含有降解RNA产物，使得无法区分21吨磷酸化产物和降解产物（黑箭）。可以分析最短RNA降解产物（灰箭）的磷酸化，因为没有与磷酸化产物重叠的去化产物。 请单击此处查看此图的较大版本。
| 序列 （5'→3'） | 奥利戈代码 | 源 | |
| Sc - its2 | 古古加古亚克 CAACUGCGC/36-FAM/ |
mp 911 | （Pillon等人 NSMB 2019）26 |
| C2 RNA | 古阿卡库格 CGGC/36-FAM/ |
不和 | SC-ITS2 的 Las1 裂解产品 |
| 21-nt | 阿夸克格加 UACUUCGAA/36-TAMSP/ |
mp 596 | （皮隆等人RNA，2018年）24 |
表1：荧光标记的RNA基质。
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Discussion
所述是测量Grc3 PNK在荧光标记核苷酸基质基质上激酶活性的测定方法。该协议可以通过调整反应缓冲液和寡核苷酸基质来应用于其他PNK酶的特性。例如，协议要求跟踪量为 EDTA。添加EDTA是有益的，原因有二：首先，这种方法有利于镁结合Grc3，防止酶与混合物中微量的污染金属结合。其次，少量的EDTA抑制污染金属依赖性核糖核酸的活动，而不会破坏相关的Las1金属独立核糖核糖的活性。EDTA 的浓度可能会根据特定 PNK 的来源而改变。与传统的PNK磷酸化测定相比，这种测定还具有优势，这些测定方法依赖于标有短半寿命放射性同位素的寡核苷酸（即磷-32的2周半寿命）。该协议可以适应测量特定的酶活性和Michaelis-Menten动力学，并确定磷酸化对各种参数的依赖性，如核苷酸、基质和金属离子的性质。
该协议依赖于运行大型变性聚丙烯酰胺凝胶，以实现足够的分辨率，以区分未磷化基质的基材及其磷酸化产品。浇注和处理这些凝胶是协议中的关键步骤。例如，丙烯酰胺溶液必须加热以溶解尿素，然后在浇注凝胶之前缓慢冷却。冷却这种溶液太快会导致晶体的形成。在浇注和设置凝胶时，也注意避免产生气泡和灰尘。建议在不取下玻璃板的情况下对凝胶进行成像，以避免从玻璃板上取下后，使凝胶变薄且难以处理。
该协议可用于测量不同尺寸寡核苷酸基质的磷酸化。该特定测定使用 15% 丙烯酰胺凝胶实现 27 nt （SC-ITS2 RNA） 和 18 nt （C2 RNA） 基材的磷酸化分辨率。与较短的C2RNA5磷酸化引起的移动变化相比，在SC-ITS2 RNA的5端中加入一个磷酸盐组会产生适度的变化（图1）。这突出了使用此技术时RNA长度的限制。随着RNA基质的延长，磷酸盐组对RNA物种整体分子量的贡献减少。因此，丙烯酰胺的百分比以及凝胶的运行时间可以优化，以实现不同尺寸基板的分辨率29。一般来说，丙烯酰胺的百分比较高用于较小的寡核苷酸基质，而丙烯酰胺的百分比较低（低于 8%）提供更大的寡核苷酸基质的更好分辨率。
这种测定的主要局限性是低通量。浇注和运行变性凝胶需要大量的时间，限制了一天中可分析的凝胶和样品的数量。克服这一限制的未来应用可能是开发能够解决磷酸化寡核苷酸产品的微流体芯片。与传统凝胶电泳相比，基于微流体的凝胶电泳具有许多优点，例如样品尺寸更小、自动化和速度。然而，目前的微流体芯片没有单核苷酸分辨率。总之，利用变性凝胶电泳检测非放射性寡核苷酸的转化变化，为监测多核苷酸激酶的催化要求和基质偏好提供了一种有用的技术。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢安德鲁·西克马博士和安德里亚·卡明斯基对这份手稿的批判性解读。这项工作得到了美国国家卫生研究院校内研究项目的支持;美国国家环境卫生科学研究所（NIEHS;ZIA ES103247 至 R.E.S） 和加拿大卫生研究所 （CIHR; 146626 到 M.C.P）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4 mm 34-well comb | BioRad | 1653848 | |
| 0.4 mm spacer | BioRad | 1653812 | |
| 0.5 M EDTA ph 8.0 | KD Medical | RGF-3130 | |
| 1M Magnesium Chloride | KD Medical | CAC-5290 | |
| 1M Tris pH 8.0 | KD Medical | RGF-3360 | |
| 40% Acrylamide/Bis Solution 29:1 | BioRad | 1610146 | |
| 5M Sodium Chloride | KD Medical | RGF-3720 | |
| ammonium persulfate (APS) | BioRad | 161-0700 | |
| ATP | Sigma | A2383-1G | |
| boric acid | Sigma | B0394 | |
| bromophenol blue sodium salt | Sigma | B5525-5G | |
| Glass Plates | Thomas Scientific | 1188K51 | |
| Hoefer SQ3 Sequencer | Hoefer | N/A | |
| Image J Software | N/A | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Labeled RNA oligonucleotides | IDT | Custom Order | |
| Pharmacia EPS 3500 Power Supply | Pharmacia | N/A | |
| Steriflip 0. 22 um Filter | Millipore | 5FCP00525 | |
| TEMED | BioRad | 161-0800 | |
| tris base | Sigma | TRIS-RO | |
| Typhoon FLA 9500 gel imager | GE Healthcare | N/A | |
| Ultra Pure DEPC Water | Invitrogen | 750023 | |
| Ultra Pure Glycerol | Invitrogen | 19E1056865 | |
| urea | Fisher Chemical | U15-500 |
References
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