Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Ikke-radioaktiv analyse til måling af polynukleotid phosphorylation af små nukleotid substrater

Published: May 8, 2020 doi: 10.3791/61258
Automatic Translation
1, 1
1Signal Transduction Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, Department of Health and Human Services, National Institutes of Health

Summary

Denne protokol beskriver en ikke-radioaktiv analyse til måling af kinase aktivitet af polynukleotidkinaser (PNKs) på små DNA- og RNA-substrater.

Abstract

Polynukleotidkinaser (PNKs) er enzymer, der katalyserer fosforyleringen af 5' hydroxylenden af DNA og RNA oligonukleotider. PNKs' aktivitet kan kvantificeres ved hjælp af direkte eller indirekte tilgange. Præsenteret her er en direkte, in vitro tilgang til at måle PNK aktivitet, der bygger på en fluorescerende mærket oligonukleotid substrat og polyacryamide gel elektroforese. Denne fremgangsmåde giver opløsning af fosforylerede produkter og samtidig undgå brugen af radioaktivt mærkede substrater. Protokollen beskriver, hvordan fosforyleringsreaktionen skal opsættes, forberede og køre store polyacryamidgeler og kvantificere reaktionsprodukterne. Den mest teknisk udfordrende del af denne analyse er at hælde og køre de store polyacryamid geler; der gives derfor vigtige detaljer for at overvinde fælles vanskeligheder. Denne protokol blev optimeret til Grc3, en PNK, der samler sig i et forpligtende præ-ribosomal RNA-behandlingskompleks med sin bindende partner, Las1-nukleasen. Denne protokol kan dog tilpasses til måling af andre PNK-enzymers aktivitet. Desuden kan denne analyse også ændres for at bestemme virkningerne af forskellige komponenter i reaktionen, såsom nukleosidens trefat, metalioner og oligonukleotider.

Introduction

Polynukleotidkinider (PNK) spiller en afgørende rolle i mange DNA- og RNA-behandlingsveje, såsom DNA-reparation og ribosomsamling1,2,,3,4,5. Disse grundlæggende enzymer katalyserer overførslen af terminalen (gamma) monofosfat fra en nukleosid tripfosfat (NTP, oftest ATP) til 5 ' hydroxyl ende af et nukleotid substrat. En af de mest vel karakteriseret PNKs er bakteriofage T4 PNK, som har bred substrat specificitet og er stærkt udnyttet af molekylærbiologi labs til at indarbejde radioaktive isotop etiketter på 5 endestation af en DNA eller RNA substrat6,7,8,9,10,11,12. Et andet eksempel på en PNK enzym er CLP1, som findes i Eukarya, Eubacteria, og Archaea, og er involveret i flere RNA behandling veje4,13,14,15.

Historisk set er de fleste analyser, der måler polynukleotid kinase aktivitet er afhængige af radioaktiv isotop mærkning og efterfølgende autoradiografi5,16. I de senere år er der udviklet en række yderligere analyser til måling af PNK-aktivitet, herunder enkeltmolekyle tilgange, mikrochip elektroforese, molekylære beacons, samt kolortrimetriske og luminescens-baserede analyser17,18,19,20,21,22. Mens mange af disse nye tilgange giver forbedret detektion grænser og undgå brugen af radioaktivitet, hver har ulemper, såsom omkostninger, afhængighed af immobiliseret harpiks, og begrænsninger i substrat valg.

Grc3 er en polynukleotid kinase , der spiller en central rolle i behandlingen af præ-ribosomal RNA2,3,23. Grc3 danner et obligate kompleks med endoribonuclease Las1, som kløver den interne transskriberede Spacer 2 (ITS2) af pre-ribosomal RNA3. Spaltning af ITS2 af Las1 genererer et produkt, der huser en 5 ' hydroxyl, der efterfølgende fosforyleret af Grc3 kinase3. For at undersøge nukleotid og substrat specificitet af Grc3, en billig analyse, der tillod test af forskellige oligonukleotid substrater var påkrævet. Derfor blev der udviklet en PNK-fosforyleringsanalyse ved hjælp af fluorescerende mærkede underlag. Denne analyse blev med succes brugt til at bestemme, at Grc3 kan udnytte enhver NTP for fosforyl overførsel aktivitet, men favoriserer ATP24. Denne protokol tilpasser den oprindelige analyse til at måle PNK aktivitet Grc3 på en RNA efterligne af sin præ-ribosomal RNA substrat (SC-ITS2, Tabel 1). Et udfordrende aspekt af denne fluorescens-baserede tilgang er afhængigheden af store polyarylamid geler til effektivt at løse fosforylerede og ikke-fosforede substrater. Protokollen indeholder specifikke detaljer om, hvordan man hælder disse store geler og undgå almindelige faldgruber, når du gør det.

Arbejde med RNA kræver særlig omhu, fordi det er stærkt modtagelige for nedbrydning. Der er enkle forebyggende skridt man kan tage for at begrænse ribonuclease forurening. En separat RNA-arbejdsstation, der let kan behandles med et RNase-inhibitor-holdige rengøringsmiddel, er ofte nyttig. Det er altid nødvendigt at bære handsker ved håndtering af prøver og brug af RNase-fri certificerede forbrugsstoffer. Da vand er en anden almindelig forureningskilde, er det bedst at bruge frisk renset vand og sterilisere alle opløsninger ved hjælp af et 0,22 μm filter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forberedelse

  1. Forbered buffer og reagenser.
    1. Der skal laves 1x reaktionsbuffer ved at kombinere 20 μL 2 M Tris (pH = 8,0), 40 μL 5 M natriumchlorid, 2,5 μL 2 M magnesiumchlorid, 100 μL på 50 % (v/v) glycerol og RNase-frit vand for at nå et samlet volumen på 1 ml mL.
    2. Der skal laves urinstofbelastningsfarve ved at kombinere 4,8 g urinstof, 200 μL 1 M Tris (pH = 8,0), 20 μL μL 0,5 M EDTA (pH = 8,0), 0,5 ml 1% (w/v) bromophenolblå, og RNasefrit vand for at nå et samlet volumen på 10 ml.
    3. Der laves 10x TBE-buffer ved at kombinere 108 g Tris-base, 55 g borsyre, 40 ml 0,5 M EDTA (pH = 8,0) og RNase-frit vand for at nå et samlet volumen på 1 L.
    4. Gør 10% (w / v) ammonium persulfat (APS). 0,5 g APS vejes, og der tilsættes 3 ml RNase-frit vand for at opløse det faste stof. Tilsæt RNase-frit vand for at nå et samlet volumen på 5 ml. Rørfolien vikles i folien, og opløsningen opbevares ved 4 °C.
      BEMÆRK: Opløst APS henfalder over tid. Udskift 10% APS-aktien hver anden uge.
  2. Anskaf polynukleotid kinaseenzym.
    1. Der erhverves ren Las1-Grc3 PNK-enzym2, der opbevares i reaktionsbuffer (se trin 1.1.1) i en lagerkoncentration på 20 μM. Lagerbufferen varierer afhængigt af den specifikke PNK.
  3. Forbered nukleinsyre substrat.
    BEMÆRK: Denne protokol overvåger 5'-fosforylering af et 27 nt RNA-substrat, der huser Las1-Grc3-behandlingsstedet (C2-anlægget), der er indeholdt i Saccharomyces cerevisiae-præ-ribosomal intern transskriberet spacer 2 (SC-ITS2; se tabel 1)2,25,26.
    1. Kemisk syntetisere en RNA oligonukleotid substrat, der indeholder en 5'-hydroxyl ende sammen med en 3'-fluorescerende etiket. Fluorophore vil blive brugt til visualisering af RNA. Sørg for, at fluorophore er placeret på RNA-enden, som ikke er målrettet mod fosforylering. Som et alternativ til kommercielle kilder kan intern og terminal fluorescerende mærkning af RNA-substrater udføres internt ved hjælp af omkostningseffektive protokoller27.
    2. Fjern overskydende fluorophore fra RNA-mærkningsreaktionen ved HJÆLP AF HPLC-rensning28.
    3. Resuspend den frysede RNA ved hjælp af RNase-fri vand til 500 nM.
    4. RNA-aliquots opbevares ved -80 °C til langtidsopbevaring eller -20 °C til korttidsopbevaring.
  4. Forbered ATP koncentration serien.
    1. Lav en 20 mM arbejdsbestand af ATP ved hjælp af Reaction Buffer (se trin 1.1.1). Brug dette arbejdslager til at generere fire serielle fortyndinger fra 20 mM-0,02 mM.
    2. For at foretage den første fortynding af koncentrationsserien blandes 1 μL af 20 mM ATP-arbejdsmassen med 9 μL reaktionsbuffer. Dette vil resultere i en 10-fold fortynding af ATP med en endelig koncentration på 2 mM.
    3. Brug det 2 mM ATP-lager, der genereres i trin 1.4.2, til at foretage den næste fortynding i koncentrationsserien. ΜL af 2 mM ATP-materiel blandes med 9 μL reaktionsbuffer. Dette vil gøre en ny ATP bestand koncentration på 0,2 mM.
    4. Fortsætte med at fortynde 1 μL af det tidligere ATP-lager med 9 μL reaktionsbuffer for at gøre den efterfølgende ATP-bestand i koncentrationsserien.

2. In vitro RNA kinase reaktion

BEMÆRK: Denne analyse kan bruges til at måle flere variabler såsom tid, nukleotid niveauer, eller enzymkoncentration. Målet med dette eksperiment er at vurdere mængden af fosforyleret RNA i nærvær af konstante Las1-Grc3 komplekse og varierende ATP niveauer.

  1. For hver RNA-enzym kinase reaktion, kombinere 1 μL af 500 nM RNA substrat, 8.3 μL af 130 nM Las1-Grc3, og 0.2 μL af 5 mM EDTA.
    BEMÆRK: Hvis der udføres flere reaktioner, forberedes en masterbestand af RNA-enzymblandingen og aliquot 9,5 μL af denne masterblanding på hvert reaktionsrør.
  2. Start analysen.
    1. Varmblokken indstilles til 37 °C.
    2. Med 10 s intervaller blandes 0,5 μL af et ATP-substock fra ATP-koncentrationsserien, der er fremstillet i trin 1.4, med en RNA-enzymblanding, og reaktionen anvendes i 37 °C-varmeblokken.
      BEMÆRK: Der tilsættes 0,5 μL reaktionsbuffer i stedet for ATP til en RNA-enzymblanding for en PNK negativ kontrol. Brug også en anden nødvendig kontrol (dvs. RNA-substrat i mangel af PNK-enzym).
    3. Der inkuberes reaktionerne i 60 min ved 37 °C.
      BEMÆRK: Fluorescerende mærket RNA er lysfølsom; dæk derfor reaktionerne med folie.
    4. I samme rækkefølge som i trin 2.2.2 slukkes hver reaktion hver 10.
      BEMÆRK: Ud over 4 M urinstof kan proteinase K tilsættes ved dette trin for at nedbryde enzymet. Følg leverandørens anvisninger for at bestemme den krævede protease mængde og reaktionsbetingelser.
    5. Brug straks de slukket in vitro RNA-kinasereaktioner til downstream-analyse (se afsnit 3), eller opbevar ved -20 °C, der skal analyseres på et senere tidspunkt.

3. Gelelektrophoresis

  1. Forbered 15% acrylamid/8 M urea gel opløsning.
    FORSIGTIG: Acrylamid skal håndteres med forsigtighed, fordi det er et neurotoksin. Bær altid handsker, en laboratoriekittel og beskyttelsesbriller, når du håndterer den.
    1. I et 150 ml glasbæger, kombineres 22,5 ml forblandet 40% acrylamid/bis-acrylamid 29:1 opløsning, 6 ml 10x TBE (se trin 1.1.3), 28,8 g urinstof og RNase-frit vand til et samlet volumen på 59 mL. Rør forsigtigt opløsningen.
      BEMÆRK: Afhængigt af RNA-substratlængden kan en ændring af procentdelen af polyarylamid forbedre opløsningen mellem uphosphorylated og fosforyleret RNA.
    2. Ureaen opløses ved at opvarme opløsningen i mikrobølgeovnen i 20 s, væsken omrøres, og opløsningen straks sættes tilbage i mikrobølgeovnen i yderligere 20 s. Rør forsigtigt opløsningen, indtil urinstofet er helt opløst.
    3. Afkøl langsomt opløsningen ved at placere glasbægeret i et lavt vandbad med koldt vand. Sørg for, at niveauet af koldt vand omkring glasbægeren er over opløsningsniveauet inde i glasbægeret. Dette vil fremme en effektiv varmeoverførsel. Vent 5 min.
      BEMÆRK: Fortsæt ikke med denne protokol, hvis glasbægeret føles varmt. vandet skal være under 25 °C. Hvis det stadig føles varmt efter 5 min, derefter erstatte vandet i vandbad med frisk koldt vand og vente yderligere 5 min.
    4. Opløsningen filtreres og afgasses ved hjælp af en 0,22 μm engangsfiltreringsenhed til at fjerne partikler og mikroskopiske luftbobler.
  2. Hæld denatureringsgelen.
    1. Brug sæbe og varmt vand til at rengøre en kort og lang glasplade designet til geler med overordnede dimensioner på 31,0 cm x 38,5 cm. Spray hver glasplade med 95% ethanol og tør glasset for at fjerne fugt.
      BEMÆRK: En af de to plader kan silikoniseres for at forhindre beskadigelse af gelen ved adskillelse af glaspladesandwichen. Dette trin er dog ikke nødvendigt, fordi denne protokol er designet til at visualisere RNA uden at adskille glaspladerne.
    2. Placer den lange glasplade vandret oven på en kasse, så den løftes op fra bordpladen.
      FORSIGTIG: Acrylamid er giftigt, derfor skal gelvarmestationen være dækket af bænkpapir, der kan absorbere spildt væske og straks anbringes i en affaldssæk, når proceduren er afsluttet.
    3. Placer en ren 0,4 mm afstandsbiske langs de lange kanter af den lange glasplade.
    4. Læg den korte glasplade oven på den lange plade, og sørg for, at kanterne af den korte plade, den lange plade og afstandsbelændingene er justeret. Klem hver side ved hjælp af tre jævnt fordelte metalklemmer.
    5. Der tilsættes 24 μL TEMED til 15% acrylamid/8 M ureaopløsning, der er fremstillet i trin 3.1, og opløsningen blandes.
    6. Opløsningen i trin 3.2.5 tilsættes 600 μL på 10 % (w/v) APS (se trin 1.1.4) og blandes forsigtigt.
    7. Hæld straks opløsningen mellem glaspladerne.
      BEMÆRK: For at undgå bobler skal du banke på glasset, mens opløsningen hældes.
    8. Tilsæt forsigtigt en ren, 0,4 mm, 32 brøndkam til toppen af glaspladesandwichen.
    9. Lad mindst 30 min for acrylamid at polymerisere.
  3. Kør denatureringsgelen.
    1. Varmblokken indstilles til 75 °C.
    2. Fjern metalklemmerne, der holder glaspladesandwichen sammen, og vask og tør glaspladesandwichen grundigt.
    3. Sæt glaspladesandwichen i gelapparatet med den korte plade vendt indad.
    4. Forbered 0,5 x TBE løbebuffer ved at kombinere 100 ml 10x TBE med 1,9 L RNase-frit vand. Der tilsættes 600 ml løbebuffer til gelapparatets øvre og nedre kamre.
    5. Fjern forsigtigt kammen og skyl godtingerne grundigt med en sprøjte.
      BEMÆRK: Dette trin er afgørende for at fjerne urinstof fra brøndene.
    6. For-køre gelen i 30 min ved 50 W. Spænding er ca 2.000 V.
      FORSIGTIG: Dette gelapparat fungerer ved høj effekt, og brugerne skal udvise forsigtighed.
    7. Skyl brøndene grundigt med en sprøjte.
      BEMÆRK: Dette trin er afgørende for jævn belastning af prøven i brøndene.
    8. Pulse spin de slukkete reaktioner fra trin 2.2.5. Derefter inkuberes rørene ved 75 °C i 3 min. Gentag pulsspinen.
    9. Der skal straks vejes 10 μL prøve pr. brønd, og gelen køres i 3 timer ved 50 W.
      BEMÆRK: Fluorescerende mærket RNA er lysfølsom; Dæk derfor gelapparatet med folie.
  4. Billede denaturering gel.
    1. Sluk for strømforsyningen og tøm gelapparatets øverste kammer.
    2. Vask og tør den ydre side af glaspladen sandwich ved hjælp af sæbe og vand. Dæk glaspladesandwichen med folie under transport af gelen.
    3. Monter glaspladesandwichen på scenen af en laserscanner, der kan detektion af kvantitativ og følsom fluorescens.
      BEMÆRK: Denne gel er ekstremt tynd for maksimal opløsning. Af denne grund er denne protokol designet til at undgå vanskelighederne ved at fjerne gelen fra glaspladesandwichen ved direkte at visualisere det fluorescerende mærkede RNA gennem glaspladerne. Brugen af kommercielt tilgængelige glasplader med lav fluorescens vil øge det optagne signal ved at forbedre signal-støj-forholdet.
    4. Indstil excitation og emission bølgelængder af laserscanneren for den ønskede fluorophore.
      BEMÆRK: De optimale excitation og emissionsbølgelængder kan variere for specifikke fluorophores. For FAM-fluorophore er ophidselses- og emissionsbølgelængderne henholdsvis 495 nm og 535 nm.
    5. Definer det område, der skal visualiseres på laserscannerfasen, og afbild gelen afbildes i overensstemmelse med producentens anvisninger (Figur 1).

4. Billedanalyse og signal kvantificering

  1. Indlæs det digitale gelbillede, der er anskaffet i trin 3.4.5, i billedbearbejdende software (se Materialetabel).
  2. Brug venstre knap med musen til at klikke og trække et rektangel for at definere en skabelonboks for at markere grænserne for det digitale gelbillede, der skal bruges til at kvantificere hvert RNA-bånd. RNA-båndet set i reaktionsblandingen, der er sat i mangel af PNK enzym, er normalt et godt bånd til at generere denne skabelon.
    BEMÆRK: For at undgå bias forårsaget af baggrundssignal er det afgørende, at området omkring hvert RNA-bånd, der måles, er identisk. Af denne grund er det bedst at bruge den samme skabelon boks til at afgrænse hver RNA band.
  3. Åbn roi-chefen under "Tools", og markér skabelonboksens placering ved at klikke på "Tilføj".
    BEMÆRK: Kvantiseringsprogrammer kan også automatisk tegne bokse efter brugervejledningen til softwaren.
  4. Brug den venstre knap med musen til at klikke og trække skabelonboksen over til det næste RNA-bånd og gentage trin 4.3. Fortsættelse af denne proces, indtil placeringen af alle de ufosforet og fosforylerede RNA-bånd i hver reaktion er markeret.
  5. Mål den integrerede tæthed i hver boks ved at klikke på "Mål "i ROI Manager.
  6. For at beregne den relative mængde fosforyleret RNA i en reaktion divideres den integrerede tæthed af det fosforede RNA-bånd med summen af de integrerede tætheder i de ikke-forphorylaterede og fosforylerede RNA-bånd fra samme reaktion. Denne fremgangsmåde kan også anvendes til at beregne den relative mængde af uphosphorylated RNA.
  7. For at visualisere akkumulering af fosforyleret RNA-produkt og den tilsvarende udtynding af uphosphorylated RNA-substrat i hele ATP-koncentrationsserien afbildes den relative mængde RNA beregnet i trin 4.6 i forhold til koncentrationen af ATP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En vellykket repræsentativ denatureringsgel af en titrering af ATP med et fast antal Las1-Grc3-kompleks er vist i figur 1. Tilsætning af enzym resulterede i Las1-medieret RNA-spaltning af SC-ITS2 RNA-substratet, hvilket førte til et defineret RNA-fragment (5-OH C2 RNA). Ved tilsætning af ATP blev C2 RNA-fragmentet fosforyleret af Grc3 PNK (5-P C2 RNA). Ved denaturering af geler vandrer det fosforylerede RNA hurtigere end dets ufostænkede modstykke. Som vist i figur 2kan fosforylering af C2 RNA-fragmentet visualiseres ved at afbilde den relative mængde uphosphorylated og fosforyleret C2 RNA mod ATP-koncentrationen. Grc3 PNK også fosfosforede 5-end af den uslebne SC-ITS2 substrat, om end i et lavere tempo. Dette bekræfter tidligere arbejde tyder Grc3 PNK viser substrat præference mod sin C2 RNA substrat24. En mislykket denatureringsgel er vist i figur 3. Denne gel mislykkedes, fordi 21 nt RNA-substratet indeholdt nedbrydningsprodukter (Figur 3,første vognbane). Disse nedbrydningsprodukter overlappede med det fosforylerede produkt og gjorde det umuligt præcist at kvantificere fosforylering. I modsætning hertil kunne det korteste RNA nedbrydningsprodukt (Figur 3,grå pile) analyseres med succes, fordi dette område af gelen ikke indeholdt yderligere RNA-arter, der hindrede nøjagtig kvantificering af dets fosforylerede modstykke. For at undgå RNA nedbrydningsbånd skal du holde arbejdsområdet og løsningerne RNase-fri og begrænse antallet af RNA-fryse-tø-cyklusser.

Figure 1
Figur 1: Eksempel på denaturering af gelanalyse af fosforyleret RNA. In vitro RNA kinase assay af Las1-Grc3 (110 nM) inkuberet med 500 nM SC-ITS2 RNA. X markerer kontrolreaktionen uden Las1-Grc3, og den sorte trekant repræsenterer titreringen af ATP fra 0-10 mM. C2 RNA er resultatet af SC-ITS2 RNA-spaltningen ved Las1-nuklease og er det endogene substrat for Grc3 PNK-aktivitet. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Kvantificering af RNA-fosforylering. Detsiometriske plot af Las1-Grc3 RNA kinase aktivitet udtrykt som en procentdel af unphosphorylated C2 RNA (grå linje; 5-OH C2 RNA) og fosforyleret C2 RNA (brun linje; 5-P C2 RNA) på tværs af en ATP koncentrationsserie. Fejllinjer markerer standardafvigelsen fra tre uafhængige tekniske replikater. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Eksempel på en mislykket denatureringsgelanalyse af fosforyleret RNA. In vitro RNA kinase assay af T4 PNK (0-0.625 U) inkuberet med 5 μm 21 nt RNA. X markerer kontrolreaktionen uden T4 PNK. Denne RNA-kontrol indeholder kun forringede RNA-produkter, der gør det umuligt at skelne det 21 nt fosforede produkt fra nedbrydningsproduktet (sorte pile). Fosforylering af det korteste RNA nedbrydningsprodukt (grå pile) kan analyseres, fordi der ikke er nogen afdradationsprodukter, der overlapper med dets fosforylerede modstykke. Klik her for at se en større version af dette tal.

Sekvens (5'→3') Oligo-kode Kilde
SC-ITS2 GUCGUUUUAGGUUUUUUUU
CAACUGCGGC/36-FAM/		 mp 911 (Pillon et al. NSMB 2019) kr.
C2 RNA GGUUUUACCAACUG
CGGC/36-FAM/		 Nielsen Las1 spaltning produkt af SC-ITS2
21-nt ACGUACGCGGAA
UACUUCGAA/36-TAMSp/		 mp 596 (Pillon et al. RNA, 2018) kr.

Tabel 1: Fluorescerende mærkede RNA-substrater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Beskrevet er en analyse til at måle kinase aktivitet Grc3 PNK på fluorescerende mærket nukleotid substrater. Denne protokol kan anvendes til at karakterisere andre PNK enzymer ved at tilpasse reaction buffer og oligonucleotid substrat. F.eks. kræver protokollen en sporingsmængde af EDTA. Tilføjelsen af EDTA er gavnlig af to grunde: For det første favoriserer denne tilgang magnesiumbundet Grc3 ved at forhindre enzymet i at binde sig til at spore mængder af forurenende metaller i blandingen. For det andet hæmmer en lille mængde EDTA aktiviteten af forurenende metalafhængige ribonukleaser uden at forstyrre aktiviteten af den tilhørende Las1 metal-uafhængige ribonuklease. Koncentrationen af EDTA kan ændres afhængigt af kilden til den specifikke PNK. Denne analyse giver også en fordel i forhold til traditionelle PNK phosphorylation assays, der er afhængige af oligonukleotider mærket med korte halveringstid radioisotoper (dvs. 2 ugers halveringstid for fosfor-32). Denne protokol kan tilpasses til at måle specifikke enzymaktivitet og Michaelis-Menten kinetik samt bestemme afhængigheden af fosforylering på forskellige parametre, såsom arten af nukleotider, substrater og metalioner.

Denne protokol er baseret på at køre store denaturering polyarylamid geler for at opnå tilstrækkelig opløsning til at skelne en unphosphorylated substrat fra sit fosforylerede produkt. Hælde og håndtere disse geler er kritiske trin i protokollen. For eksempel skal acrylamidopløsningen opvarmes for at opløse urinstofet og derefter afkøles langsomt, før gelen hældes. Køling denne løsning for hurtigt kan føre til dannelsen af krystaller. Man skal også være opmærksom på at undgå at indføre luftbobler og støv, mens gelen hældes og indstilles. Billeddannelse gelen uden at fjerne glaspladerne anbefales for at undgå at rippe gelen, som er tynd og vanskelig at håndtere, når den er fjernet fra glaspladerne.

Denne protokol kan tilpasses til at måle fosforylering af forskellige størrelser oligonukleotid substrater. Denne særlige analyse anvendte en 15% acrylamidgel til at opnå opløsning af fosforylering af 27 nt (SC-ITS2 RNA) og 18 nt (C2 RNA) substrater. Tilføjelsen af en fosfatgruppe til 5-endlsen af SC-ITS2 RNA giver et beskedent skift i forhold til den mobilitetsændring, der er forårsaget ved 5-fosforylering af den kortere C2 RNA (Figur 1). Dette fremhæver en begrænsning i RNA længde, når du bruger denne teknik. Med længere RNA-substrater mindskes en fosfatgruppes bidrag til RNA-arternes samlede molekylvægt. Af denne grund kan procentdelen af acrylamid samt gel køretid optimeres til at opnå opløsning af forskellig størrelse substrater29. Generelt anvendes højere procenter af acrylamid for mindre oligonukleotidsubstrater, mens lavere procentdele af acrylamid (ned til 8%) bedre opløsning af større oligonukleotidsunderlag.

Den største begrænsning af denne analyse er, at det er lav-gennemløb. Hælde og køre denaturering geler tager en betydelig mængde tid, begrænse antallet af geler og prøver, der kan analyseres på en dag. En fremtidig anvendelse til at overvinde denne begrænsning kunne være udvikling af mikrofluidic chips i stand til at løse fosforylerede oligonukleotid produkter. Mikrofluidisk-baseret gelelektrophoresis har mange fordele i forhold til traditionel gelelektroforese, såsom mindre prøvestørrelse, automatisering og hastighed. De nuværende mikrofluidiske chips har dog ikke en enkelt nukleotidopløsning. Det kan konkluderes, at anvendelsen af denaturering af gelelektrophorsis til påvisning af ændret migration af ikke-radioaktive oligonukleotider giver en nyttig teknik til at overvåge katalytiske krav og substratpræference af polynukleokinkinaseenzymer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Andrew Sikkema og Andrea Kaminski for deres kritiske læsning af dette manuskript. Dette arbejde blev støttet af US National Institute of Health Intramural Research Program; US National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS; ZIA ES103247 til R.E.S) og canadian Institutes of Health Research (CIHR; 146626 til M.C.P).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.4 mm 34-well comb BioRad 1653848
0.4 mm spacer BioRad 1653812
0.5 M EDTA ph 8.0 KD Medical RGF-3130
1M Magnesium Chloride KD Medical CAC-5290
1M Tris pH 8.0 KD Medical RGF-3360
40% Acrylamide/Bis Solution 29:1 BioRad 1610146
5M Sodium Chloride KD Medical RGF-3720
ammonium persulfate (APS) BioRad 161-0700
ATP Sigma A2383-1G
boric acid Sigma B0394
bromophenol blue sodium salt Sigma B5525-5G
Glass Plates Thomas Scientific 1188K51
Hoefer SQ3 Sequencer Hoefer N/A
Image J Software N/A N/A https://imagej.nih.gov/ij/
Labeled RNA oligonucleotides IDT Custom Order
Pharmacia EPS 3500 Power Supply Pharmacia N/A
Steriflip 0. 22 um Filter Millipore 5FCP00525
TEMED BioRad 161-0800
tris base Sigma TRIS-RO
Typhoon FLA 9500 gel imager GE Healthcare N/A
Ultra Pure DEPC Water Invitrogen 750023
Ultra Pure Glycerol Invitrogen 19E1056865
urea Fisher Chemical U15-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pillon, M. C., Stanley, R. E. Nuclease integrated kinase super assemblies (NiKs) and their role in RNA processing. Current Genetics. 64 (1), 183-190 (2018).
  2. Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 114 (28), E5530-E5538 (2017).
  3. Gasse, L., Flemming, D., Hurt, E. Coordinated Ribosomal ITS2 RNA Processing by the Las1 Complex Integrating Endonuclease, Polynucleotide Kinase, and Exonuclease Activities. Molecular Cell. 60 (5), 808-815 (2015).
  4. Dikfidan, A., et al. RNA specificity and regulation of catalysis in the eukaryotic polynucleotide kinase Clp1. Molecular Cell. 54 (6), 975-986 (2014).
  5. Bernstein, N. K., et al. The molecular architecture of the mammalian DNA repair enzyme, polynucleotide kinase. Molecular Cell. 17 (5), 657-670 (2005).
  6. Rio, D. C. 5'-end labeling of RNA with [gamma-32P]ATP and T4 polynucleotide kinase. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (4), 441-443 (2014).
  7. Paredes, E., Evans, M., Das, S. R. RNA labeling, conjugation and ligation. Methods. 54 (2), 251-259 (2011).
  8. Hilario, E. End labeling procedures: an overview. Molecular Biotechnology. 28 (1), 77-80 (2004).
  9. Eastberg, J. H., Pelletier, J., Stoddard, B. L. Recognition of DNA substrates by T4 bacteriophage polynucleotide kinase. Nucleic Acids Research. 32 (2), 653-660 (2004).
  10. Lillehaug, J. R., Kleppe, K. Kinetics and specificity of T4 polynucleotide kinase. Biochemistry. 14 (6), 1221-1225 (1975).
  11. Richardson, C. C. Phosphorylation of nucleic acid by an enzyme from T4 bacteriophage-infected Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 54 (1), 158-165 (1965).
  12. Galburt, E. A., Pelletier, J., Wilson, G., Stoddard, B. L. Structure of a tRNA repair enzyme and molecular biology workhorse: T4 polynucleotide kinase. Structure. 10 (9), 1249-1260 (2002).
  13. Saito, M., et al. Large-Scale Molecular Evolutionary Analysis Uncovers a Variety of Polynucleotide Kinase Clp1 Family Proteins in the Three Domains of Life. Genome Biology Evolution. 11 (10), 2713-2726 (2019).
  14. Jain, R., Shuman, S. Characterization of a thermostable archaeal polynucleotide kinase homologous to human Clp1. RNA. 15 (5), 923-931 (2009).
  15. Weitzer, S., Hanada, T., Penninger, J. M., Martinez, J. CLP1 as a novel player in linking tRNA splicing to neurodegenerative disorders. Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 6 (1), 47-63 (2015).
  16. Wang, L. K., Lima, C. D., Shuman, S. Structure and mechanism of T4 polynucleotide kinase: an RNA repair enzyme. EMBO Journal. 21 (14), 3873-3880 (2002).
  17. Zhang, Y., Zhao, J., Chen, S., Li, S., Zhao, S. A novel microchip electrophoresis laser induced fluorescence detection method for the assay of T4 polynucleotide kinase activity and inhibitors. Talanta. 202, 317-322 (2019).
  18. Cui, L., Li, Y., Lu, M., Tang, B., Zhang, C. Y. An ultrasensitive electrochemical biosensor for polynucleotide kinase assay based on gold nanoparticle-mediated lambda exonuclease cleavage-induced signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 99, 1-7 (2018).
  19. Wang, L. J., Zhang, Q., Tang, B., Zhang, C. Y. Single-Molecule Detection of Polynucleotide Kinase Based on Phosphorylation-Directed Recovery of Fluorescence Quenched by Au Nanoparticles. Analytical Chemistry. 89 (13), 7255-7261 (2017).
  20. Liu, H., Ma, C., Wang, J., Chen, H., Wang, K. Label-free colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase/phosphatase activity and its inhibitors based on G-quadruplex/hemin DNAzyme. Analytical Biochemistry. 517, 18-21 (2017).
  21. Du, J., Xu, Q., Lu, X., Zhang, C. Y. A label-free bioluminescent sensor for real-time monitoring polynucleotide kinase activity. Analytical Chemistry. 86 (16), 8481-8488 (2014).
  22. Jiang, C., Yan, C., Jiang, J., Yu, R. Colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase activity based on the horseradish peroxidase-mimicking DNAzyme combined with lambda exonuclease cleavage. Analytica Chimica Acta. 766, 88-93 (2013).
  23. Castle, C. D., et al. Las1 interacts with Grc3 polynucleotide kinase and is required for ribosome synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 41 (2), 1135-1150 (2013).
  24. Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex. RNA. 24 (5), 721-738 (2018).
  25. Geerlings, T. H., Vos, J. C., Raue, H. A. The final step in the formation of 25S rRNA in Saccharomyces cerevisiae is performed by 5'-->3' exonucleases. RNA. 6 (12), 1698-1703 (2000).
  26. Pillon, M. C., et al. Cryo-EM reveals active site coordination within a multienzyme pre-rRNA processing complex. Nature Structural Molecular Biology. 26 (9), 830-839 (2019).
  27. Solomatin, S., Herschlag, D. Methods of site-specific labeling of RNA with fluorescent dyes. Methods in Enzymology. 469, 47-68 (2009).
  28. Giusti, W. G., Adriano, T. Synthesis and characterization of 5'-fluorescent-dye-labeled oligonucleotides. PCR Methods Application. 2 (3), 223-227 (1993).
  29. Petrov, A., Tsa, A., Puglisi, J. D. Analysis of RNA by analytical polyacrylamide gel electrophoresis. Methods in Enzymology. 530, 301-313 (2013).

Tags

Biokemi polynukleotid kinase polyarylamid gel phosphoryl overførsel reaktion RNA phosphorylation Grc3 ikke-radioaktiv analyse
Ikke-radioaktiv analyse til måling af polynukleotid phosphorylation af små nukleotid substrater
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pillon, M. C., Stanley, R. E.… More

Pillon, M. C., Stanley, R. E. Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates. J. Vis. Exp. (159), e61258, doi:10.3791/61258 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter