Summary
Dieses Protokoll beschreibt einen nicht radioaktiven Test zur Messung der Kinaseaktivität von Polynukleotid-Kinasen (PNKs) auf kleinen DNA- und RNA-Substraten.
Abstract
Polynukleotid-Kinasen (PNKs) sind Enzyme, die die Phosphorylierung des 5'-Hydroxylendes von DNA- und RNA-Oligonukleotiden katalysieren. Die Aktivität von PNKs kann mit direkten oder indirekten Ansätzen quantifiziert werden. Hier wird ein direkter In-vitro-Ansatz zur Messung der PNK-Aktivität vorgestellt, der auf einem fluoreszierend markierten Oligonukleotidsubstrat und polyacrylamidgelelektrophorese beruht. Dieser Ansatz ermöglicht die Auflösung der phosphorylierten Produkte bei gleichzeitiger Vermeidung der Verwendung von radioaktiv markierten Substraten. Das Protokoll beschreibt, wie die Phosphorylierungsreaktion eingerichtet, große Polyacrylamid-Gele zubereitet und betrieben werden und die Reaktionsprodukte quantifiziert werden. Der technisch anspruchsvollste Teil dieses Assays ist das Gießen und Betreiben der großen Polyacrylamidgele; daher werden wichtige Details zur Überwindung gemeinsamer Schwierigkeiten bereitgestellt. Dieses Protokoll wurde für Grc3 optimiert, ein PNK, das sich mit seinem Bindungspartner, der Las1-Nuklease, zu einem obligaten präribosomalen RNA-Verarbeitungskomplex zusammensetzt. Dieses Protokoll kann jedoch angepasst werden, um die Aktivität anderer PNK-Enzyme zu messen. Darüber hinaus kann dieser Test auch modifiziert werden, um die Auswirkungen verschiedener Komponenten der Reaktion zu bestimmen, wie z. B. Nukleosidtriphosphat, Metallionen und Oligonukleotide.
Introduction
Polynukleotid-Kiinasen (PNK) spielen in vielen DNA- und RNA-Verarbeitungswegen eine entscheidende Rolle, wie z. B. DNA-Reparatur und Ribosome-Montage1,2,3,4,5. Diese grundlegenden Enzyme katalysieren die Übertragung des terminalen (Gamma)-Monophosphats von einem Nukleosidtriphosphat (NTP, am häufigsten ATP) auf das 5' Hydroxylende eines Nukleotidsubstrats. Eines der am besten charakterisierten PNKs ist das Bakteriophagen T4 PNK, das eine breite Substratspezifität hat und von molekularbiologischen Labors stark genutzt wird, um radioaktive Isotopenetiketten auf den 5 Endpunkt eines DNA- oder RNA-Substrats6,7,8,9,10,11,12zu integrieren. Ein weiteres Beispiel für ein PNK-Enzym ist CLP1, das in Eukarya, Eubacteria und Archaea vorkommt und in mehrere RNA-Verarbeitungswege4,13,14,15verwickelt ist.
Historisch gesehen sind die meisten Assays, die die Aktivität der Polynukleotidkinase messen, von der Kennzeichnung radioaktiver Isotope und der anschließenden Autoradiographie5,16abhängig. In den letzten Jahren wurden eine Reihe zusätzlicher Assays entwickelt, um die PNK-Aktivität zu messen, darunter Einzelmolekülansätze, Mikrochip-Elektrophorese, molekulare Leuchttürme sowie kolorimetrische und lumineszenzbasierte Assays17,18,19,20,21,22. Während viele dieser neuen Ansätze verbesserte Nachweisgrenzen bieten und den Einsatz von Radioaktivität vermeiden, hat jeder Nachteile, wie Kosten, Abhängigkeit von immobilisiertem Harz und Einschränkungen bei der Substratauswahl.
Grc3 ist eine Polynukleotidkinase, die eine zentrale Rolle bei der Verarbeitung von präribosomaler RNA2,3,23spielt. Grc3 bildet einen obligaten Komplex mit der Endoribonuklease Las1, die den Internal Transcribed Spacer 2 (ITS2) der präribosomalen RNA3spaltet. Die Spaltung des ITS2 durch Las1 erzeugt ein Produkt, das ein 5' Hydroxyl beherbergt, das anschließend von der Grc3-Kinase3phosphoryliert wird. Um die Nukleotid- und Substratspezifität von Grc3 zu untersuchen, war ein kostengünstiger Test erforderlich, der das Testen verschiedener Oligonukleotidsubstrate ermöglichte. Daher wurde ein PNK-Phosphorylierungstest mit fluoreszierend markierten Substraten entwickelt. Dieser Test wurde erfolgreich verwendet, um festzustellen, dass Grc3 jedes NTP für Phosphoryltransferaktivität nutzen kann, begünstigt aber ATP24. Dieses Protokoll passt den ursprünglichen Assay an, um die PNK-Aktivität von Grc3 auf einer RNA-Mimik seines präribosomalen RNA-Substrats zu messen (SC-ITS2, Tabelle 1). Ein herausfordernder Aspekt dieses fluoreszenzbasierten Ansatzes ist die Abhängigkeit von großen Polyacrylamid-Gelen, um phosphorylierte und nicht phosphorylierte Substrate effektiv zu lösen. Das Protokoll enthält spezifische Details darüber, wie diese großen Gele gegossen werden und dabei häufige Fallstricke vermieden werden können.
Die Arbeit mit RNA erfordert besondere Sorgfalt, da sie stark anfällig für Degradation ist. Es gibt einfache vorbeugende Schritte, um ribonuklease-Kontamination zu begrenzen. Eine separate RNA-Workstation, die leicht mit einem RNase-Inhibitor-haltigen Reinigungsmittel behandelt werden kann, ist oft hilfreich. Bei der Handhabung von Proben und der Verwendung von RNase-freien zertifizierten Verbrauchsmaterialien ist immer Handschuhe zu tragen. Da Wasser eine weitere häufige Kontaminationsquelle ist, ist es am besten, frisch gereinigtes Wasser zu verwenden und alle Lösungen mit einem 0,22 m-Filter zu sterilisieren.
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Protocol
1. Vorbereitung
- Puffer und Reagenzien vorbereiten.
- Machen Sie 1x Reaktionspuffer, indem Sie 20 l von 1 M Tris (pH = 8,0), 40 l 5 m Natriumchlorid, 2,5 l 2 m Magnesiumchlorid, 100 l 50 % (v/v) Glycerin und RNase-freies Wasser kombinieren, um ein Gesamtvolumen von 1 ml zu erreichen.
- Harnstoff-Ladefarbstoff durch Kombination von 4,8 g Harnstoff, 200 l 1 M Tris (pH = 8,0), 20 l 0,5 M EDTA (pH = 8,0), 0,5 ml 1% (w/v) Bromophenolblau und RNase-freiem Wasser für ein Gesamtvolumen von 10 ml.
- Machen Sie 10x TBE Puffer durch Kombination von 108 g Tris-Basis, 55 g Borsäure, 40 ml 0,5 M EDTA (pH = 8,0) und RNase-freiem Wasser, um ein Gesamtvolumen von 1 L zu erreichen.
- Machen Sie 10% (w/v) Ammoniumpersulfat (APS). Wiegen Sie 0,5 g APS und fügen Sie 3 ml RNase-freies Wasser hinzu, um den Feststoff aufzulösen. Fügen Sie RNase-freies Wasser hinzu, um ein Gesamtvolumen von 5 ml zu erreichen. Das Rohr in Folie wickeln und bei 4 °C aufbewahren.
HINWEIS: Gelöste APS zerfällt im Laufe der Zeit. Ersetzen Sie die 10% APS Aktie alle 2 Wochen.
- Erhalten Sie Polynukleotid-Kinase-Enzym.
- Erwerben Sie reines Las1-Grc3 PNK-Enzym2, das im Reaktionspuffer (siehe Schritt 1.1.1) in einer Lagerkonzentration von 20 M gespeichert ist. Der Speicherpuffer variiert je nach PNK.
- Nukleinsäuresubstrat zubereiten.
HINWEIS: Dieses Protokoll überwacht die 5'-Phosphorylierung eines 27 nt RNA-Substrats, das die Las1-Grc3-Verarbeitungsstelle (C2-Site) beherbergt, die in der Saccharomyces cerevisiae vor-ribosomalen internen transkribierten Spacer 2 (SC-ITS2; siehe Tabelle 1)2,25,26enthalten ist.- Chemisch synthetisieren Sie ein RNA-Oligonukleotidsubstrat, das ein 5'-Hydroxyl-Ende zusammen mit einem 3'-Fluoreszenz-Label enthält. Das Fluorophor wird zur Visualisierung der RNA verwendet. Stellen Sie sicher, dass das Fluorophor am RNA-Ende positioniert ist, das nicht für die Phosphorylierung vorgesehen ist. Als Alternative zu kommerziellen Quellen kann die interne und terminale fluoreszierende Kennzeichnung von RNA-Substraten intern mit kostengünstigen Protokollen27durchgeführt werden.
- Entfernen Sie überschüssiges Fluorophor aus der RNA-Etikettierungsreaktion durch HPLC-Reinigung28.
- Setzen Sie die lyophilisierte RNA mit RNase-freiem Wasser auf 500 nM aus.
- Speichern Sie RNA-Aliquots bei -80 °C für die Langzeitlagerung oder -20 °C für die kurzfristige Lagerung.
- Bereiten Sie die ATP-Konzentrationsserie vor.
- Erstellen Sie einen 20 mM-Betriebsbestand von ATP mit Reaktionspuffer (siehe Schritt 1.1.1). Verwenden Sie diesen Arbeitsbestand, um vier serielle Verdünnungen von 20 mM-0,02 mM zu erzeugen.
- Um die erste Verdünnung der Konzentrationsserie zu machen, mischen Sie 1 l des 20 mM ATP-Arbeitsbestands mit 9 l Reaktionspuffer. Dies führt zu einer 10-fachen Verdünnung des ATP mit einer Endkonzentration von 2 mM.
- Verwenden Sie den in Schritt 1.4.2 erzeugten ATP-Bestand von 2 mM, um die nächste Verdünnung in der Konzentrationsserie vorzunehmen. Mischen Sie 1 l des 2 mM ATP-Bestands mit 9 l Reaktionspuffer. Damit wird eine neue ATP-Lagerkonzentration von 0,2 mM möglich sein.
- Verdünnen Sie weiterhin 1 L des vorherigen ATP-Bestands mit 9 l Reaktionspuffer, um den nachfolgenden ATP-Bestand in der Konzentrationsserie herzustellen.
2. In-vitro-RNA-Kinase-Reaktion
HINWEIS: Dieser Test kann verwendet werden, um mehrere Variablen wie Zeit, Nukleotidspiegel oder Enzymkonzentration zu messen. Das Ziel dieses Experiments ist es, die Menge der phosphorylierten RNA in Gegenwart von konstanten Las1-Grc3-Komplex und variierenden ATP-Spiegeln zu bewerten.
- Kombinieren Sie für jede RNA-Enzym-Kinase-Reaktion 1 l 500 nM RNA-Substrat, 8,3 l von 130 nM Las1-Grc3 und 0,2 l mit 5 mM EDTA.
HINWEIS: Wenn Sie mehrere Reaktionen durchführen, bereiten Sie einen Master-Bestand des RNA-Enzym-Gemischs und aliquot 9,5 l dieser Master-Mischung zu jedem Reaktionsröhrchen vor. - Starten Sie den Test.
- Stellen Sie den Wärmeblock auf 37 °C ein.
- Mischen Sie in 10 s Intervallen 0,5 l eines ATP-Substocks aus der ATP-Konzentrationsserie, die in Schritt 1.4 mit einem RNA-Enzym-Gemisch hergestellt wird, und legen Sie die Reaktion in den 37 °C-Wärmeblock.
ANMERKUNG: Fügen Sie 0,5 L Reaktionspuffer anstelle von ATP zu einer RNA-Enzym-Mischung für eine PNK-Negativkontrolle hinzu. Verwenden Sie auch eine andere notwendige Kontrolle (d. h. RNA-Substrat in Abwesenheit von PNK-Enzym). - Inkubieren Sie die Reaktionen für 60 min bei 37 °C.
HINWEIS: Fluoreszierend markierte RNA ist lichtempfindlich; daher die Reaktionen mit Folie abdecken. - Mit der gleichen Reihenfolge wie in Schritt 2.2.2, löschen Sie jede Reaktion alle 10 s, indem Sie die Reaktion mit 10 l Harnstoff-Ladefarbstoff saugen (siehe Schritt 1.1.2).
HINWEIS: Zusätzlich zu 4 M Harnstoff kann in diesem Schritt Proteinase K hinzugefügt werden, um das Enzym zu abbauen. Befolgen Sie die Anweisungen des Lieferanten, um die erforderliche Proteasemenge und Reaktionsbedingungen zu bestimmen. - Verwenden Sie die abgeschreckten In-vitro-RNA-Kinase-Reaktionen sofort für die nachgeschaltete Analyse (siehe Abschnitt 3) oder speichern Sie sie bei -20 °C, um zu einem späteren Zeitpunkt analysiert zu werden.
3. Gelelektrophorese
- 15% Acrylamid/8 M Harnstoffgellösung zubereiten.
VORSICHT: Acrylamid muss mit Vorsicht behandelt werden, da es sich um ein Neurotoxin handelt. Tragen Sie beim Umgang mit Handschuhen, laborierter Kleidung und Brille immer Handschuhe und Schutzbrillen.- In einem 150 ml Glasbecher 22,5 ml vorgemischtes 40%-Acrylamid/Bis-Acrylamid 29:1-Lösung, 6 ml 10x TBE (siehe Schritt 1.1.3), 28,8 g Harnstoff und RNase-freies Wasser mit einem Gesamtvolumen von 59 ml kombinieren. Rühren Sie die Lösung vorsichtig.
HINWEIS: Je nach Länge des RNA-Substrats kann die Veränderung des Polyacrylamidanteils die Auflösung zwischen nichtphosphorylierter und phosphorylierter RNA verbessern. - Um den Harnstoff aufzulösen, erhitzen Sie die Lösung in der Mikrowelle für 20 s, rühren Sie die Flüssigkeit, und legen Sie die Lösung sofort wieder in die Mikrowelle für weitere 20 s. Rühren Sie die Lösung vorsichtig, bis sich der Harnstoff vollständig auflöst.
- Kühlen Sie die Lösung langsam ab, indem Sie den Glasbecher in ein flaches Wasserbad mit kaltem Wasser legen. Stellen Sie sicher, dass der Grad des kalten Wassers, das den Glasbecher umgibt, über dem Niveau der Lösung im Glasbecher liegt. Dies wird eine effiziente Wärmeübertragung fördern. Warten Sie 5 min.
HINWEIS: Fahren Sie nicht mit diesem Protokoll fort, wenn sich der Glasbecher warm anfühlt; sollte das Wasser unter 25 °C liegen. Wenn es sich nach 5 min noch warm anfühlt, dann ersetzen Sie das Wasser im Wasserbad durch frisches kaltes Wasser und warten Sie weitere 5 min. - Filtern und entgasen Sie die Lösung mit einer Einwegfiltrationseinheit von 0,22 m, um Partikel und mikroskopische Luftblasen zu entfernen.
- In einem 150 ml Glasbecher 22,5 ml vorgemischtes 40%-Acrylamid/Bis-Acrylamid 29:1-Lösung, 6 ml 10x TBE (siehe Schritt 1.1.3), 28,8 g Harnstoff und RNase-freies Wasser mit einem Gesamtvolumen von 59 ml kombinieren. Rühren Sie die Lösung vorsichtig.
- Gießen Sie das denaturierende Gel.
- Verwenden Sie Seife und warmes Wasser, um eine kurze und lange Glasplatte für Gele mit Gesamtabmessungen von 31,0 cm x 38,5 cm zu reinigen. Sprühen Sie jede Glasplatte mit 95% Ethanol und wischen Sie das Glas ab, um Feuchtigkeit zu entfernen.
HINWEIS: Eine der beiden Platten kann silikonisiert werden, um Schäden am Gel beim Trennen des Glasplatten-Sandwiches zu verhindern. Dieser Schritt ist jedoch nicht notwendig, da dieses Protokoll entwickelt wurde, um die RNA zu visualisieren, ohne die Glasplatten zu trennen. - Legen Sie die lange Glasplatte horizontal auf eine Box, so dass sie von der Tischplatte erhöht wird.
VORSICHT: Acrylamid ist giftig, daher muss die Gelgießstation mit Bankpapier abgedeckt werden, das jede verschüttete Flüssigkeit aufnehmen kann und nach Abschluss des Verfahrens sofort in einen Abfallbeutel gelegt werden kann. - Legen Sie einen sauberen 0,4 mm Abstandsraum an den langen Rändern der langen Glasplatte.
- Legen Sie die kurze Glasplatte auf die lange Platte und stellen Sie sicher, dass die Kanten der kurzen Platte, der langen Platte und der Abstandshalter ausgerichtet sind. Klemmen Sie jede Seite mit drei gleichmäßig verteilten Metallklemmen.
- Fügen Sie der in Schritt 3.1 zubereiteten 15% Acrylamid/8 M Harnstofflösung 24 l TEMED hinzu und mischen Sie die Lösung.
- Fügen Sie der Lösung in Schritt 3.2.5 600 l von 10 % (w/v) APS (siehe Schritt 1.1.4) hinzu und mischen Sie die Lösung vorsichtig.
- Gießen Sie sofort die Lösung zwischen die Glasplatten.
HINWEIS: Um Blasen zu vermeiden, tippen Sie auf das Glas, während die Lösung gegossen wird. - Fügen Sie vorsichtig einen sauberen, 0,4 mm, 32 gut Kamm auf die Oberseite der Glasplatte Sandwich.
- Mindestens 30 min für die Polymerisation des Acrylamids zulassen.
- Verwenden Sie Seife und warmes Wasser, um eine kurze und lange Glasplatte für Gele mit Gesamtabmessungen von 31,0 cm x 38,5 cm zu reinigen. Sprühen Sie jede Glasplatte mit 95% Ethanol und wischen Sie das Glas ab, um Feuchtigkeit zu entfernen.
- Führen Sie das denaturierende Gel aus.
- Stellen Sie den Wärmeblock auf 75 °C ein.
- Entfernen Sie die Metallklemmen, die das Glasplatten-Sandwich zusammenhalten, und waschen und trocknen Sie das Glasplatten-Sandwich gründlich.
- Legen Sie das Glasplatten-Sandwich in das Gelgerät mit der kurzen Platte nach innen gerichtet.
- Bereiten Sie 0,5x TBE Laufpuffer vor, indem Sie 100 ml 10x TBE mit 1,9 L RNase-freiem Wasser kombinieren. Fügen Sie 600 ml des Laufpuffers in die oberen und unteren Kammern des Gelapparats ein.
- Entfernen Sie den Kamm vorsichtig und spülen Sie die Brunnen gründlich mit einer Spritze.
HINWEIS: Dieser Schritt ist entscheidend für die Entfernung von Harnstoff aus den Brunnen. - Vorlauf das Gel für 30 min bei 50 W. Spannung ist ca. 2.000 V.
VORSICHT: Dieses Gelgerät arbeitet mit einer hohen Wattleistung und Benutzer sollten Vorsichtsmaßnahmen an den Stellen an den Stellen anstellen. - Spülen Sie die Brunnen gründlich mit einer Spritze.
HINWEIS: Dieser Schritt ist entscheidend für das gleichmäßige Laden von Proben in die Brunnen. - Pulsdrehen Sie die abgeschreckten Reaktionen ab Schritt 2.2.5. Dann die Rohre bei 75 °C für 3 min inkubieren. Wiederholen Sie den Pulsdreh.
- Laden Sie sofort 10 l Probe pro Bohrgut und führen Sie das Gel für 3 h bei 50 W.
HINWEIS: Fluoreszierend markierte RNA ist lichtempfindlich; daher das Gelgerät mit Folie bedecken.
- Bild das denaturierende Gel.
- Schalten Sie die Stromversorgung aus und entleeren Sie die obere Kammer des Gelgeräts.
- Waschen und trocknen Sie die Außenseite des Glasplatten-Sandwiches mit Seife und Wasser. Bedecken Sie das Glasplatten-Sandwich mit Folie, während Sie das Gel transportieren.
- Montieren Sie das Glasplatten-Sandwich auf die Bühne eines Laserscanners, der in der Lage ist, quantitative und empfindliche Fluoreszenzzuerkennen durchzuführen.
HINWEIS: Dieses Gel ist extrem dünn für maximale Auflösung. Aus diesem Grund wurde dieses Protokoll entwickelt, um die Schwierigkeiten zu vermeiden, das Gel aus dem Glasplatten-Sandwich zu entfernen, indem die fluoreszierend markierte RNA direkt durch die Glasplatten visualisiert wird. Die Verwendung von handelsüblichen Niedrigfluoreszenz-Glasplatten wird das erfasste Signal erhöhen, indem das Signal-Rausch-Verhältnis verbessert wird. - Stellen Sie die Anregungs- und Emissionswellenlängen des Laserscanners für das gewünschte Fluorophor ein.
HINWEIS: Die optimalen Anregungs- und Emissionswellenlängen können sich für bestimmte Fluorophore unterscheiden. Für das FAM-Fluorophor betragen die Anregungs- und Emissionswellenlängen 495 nm bzw. 535 nm. - Definieren Sie den bereich, der auf der Laserscanner-Bühne visualisiert werden soll, und stellen Sie das Gel gemäß den Anweisungen des Herstellers ab (Abbildung 1).
4. Bildanalyse und Signalquantifizierung
- Laden Sie das in Schritt 3.4.5 aufgenommene digitale Gelbild in bildprocesing-Software (siehe Materialtabelle).
- Klicken und ziehen Sie mithilfe der linken Maustaste auf ein Rechteck, um ein Vorlagenfeld zu definieren, um die Grenzen auf dem digitalen Gelbild zu markieren, das zur Quantifizierung jedes RNA-Bands verwendet wird. Das RNA-Band, das in der Reaktionsmischung gesehen wird, die in Abwesenheit von PNK-Enzym eingestellt ist, ist in der Regel ein gutes Band, um diese Vorlage zu erzeugen.
HINWEIS: Um Verzerrungen durch Hintergrundsignale zu vermeiden, ist es wichtig, dass der Bereich, der jedes gemessene RNA-Band umgibt, identisch ist. Aus diesem Grund ist es am besten, die gleiche Vorlagenbox zu verwenden, um jedes RNA-Band abzugrenzen. - Öffnen Sie den ROI-Manager unter "Werkzeuge" und markieren Sie die Position des Vorlagenfelds, indem Sie auf "Hinzufügen" klicken.
HINWEIS: Quantitationsprogramme können auch automatisch nach dem Software-Benutzerhandbuch Boxen zeichnen. - Klicken und ziehen Sie mit der linken Maustaste das Vorlagenfeld auf das nächste RNA-Band, und wiederholen Sie Schritt 4.3. Kontinuierliche diesen Prozess, bis die Position aller nicht phosphorylierten und phosphorylierten RNA-Bänder in jeder Reaktion markiert ist.
- Messen Sie die integrierte Dichte in jedem Feld, indem Sie im ROI Manager auf"Messen"klicken.
- Um die relative Menge der phosphorylierten RNA in einer Reaktion zu berechnen, teilen Sie die integrierte Dichte des phosphorylierten RNA-Bandes durch die Summe der integrierten Dichten der nicht phosphorylierten und phosphorylierten RNA-Bänder aus derselben Reaktion. Dieser Ansatz kann auch angewendet werden, um die relative Menge der nichtphosphorylierten RNA zu berechnen.
- Um die Ansammlung von phosphoryliertem RNA-Produkt und der entsprechenden Erschöpfung des nichtphosphorylierten RNA-Substrats über die ATP-Konzentrationsserie zu visualisieren, zeichnen Sie die relative Menge der in Schritt 4.6 berechneten RNA-Menge gegen die ATP-Konzentration auf.
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Representative Results
Abbildung 1zeigt ein erfolgreiches repräsentatives Denaturierungsgel einer Titration von ATP mit einer festen Menge an Las1-Grc3-Komplex . Die Zugabe des Enzyms führte zu einer Las1-vermittelten RNA-Spaltung des SC-ITS2-RNA-Substrats, was zu einem definierten RNA-Fragment (5-OH C2 RNA) führte. Nach Zugabe von ATP wurde das C2-RNA-Fragment durch Grc3 PNK (5-P C2 RNA) phosphoryliert. Bei der Denaturierung von Gelen wandert die phosphorylierte RNA schneller als ihr nicht phosphoryliertes Pendant. Wie in Abbildung 2dargestellt, konnte die Phosphorylierung des C2-RNA-Fragments visualisiert werden, indem die relative Menge an nicht phosphorylierter und phosphorylierter C2-RNA gegen die ATP-Konzentration dargestellt wurde. Grc3 PNK phosphorylierte auch das 5-Ende des ungeschnittenen SC-ITS2 Substrats, wenn auch mit einer niedrigeren Rate. Dies bestätigt frühere Arbeiten, die darauf hindeuten, dass Grc3 PNK die Substratpräferenz gegenüber seinem C2-RNA-Substrat24zeigt. Abbildung 3zeigt ein erfolgloses Denaturierungsgel . Dieses Gel war erfolglos, da das 21 nt RNA-Substrat Abbauprodukte enthielt(Abbildung 3, erste Spur). Diese Abbauprodukte überlappten sich mit dem phosphorylierten Produkt und machten es unmöglich, die Phosphorylierung genau zu quantifizieren. Im Gegensatz dazu konnte das kürzeste RNA-Abbauprodukt(Abbildung 3, graue Pfeile) erfolgreich analysiert werden, da dieser Bereich des Gels keine zusätzlichen RNA-Arten enthielt, die eine genaue Quantifizierung seines phosphorylierten Gegenstücks behinderten. Um RNA-Abbaubänder zu vermeiden, halten Sie den Arbeitsbereich und die Lösungen RNase-frei, und begrenzen Sie die Anzahl der RNA-Gefrier-Tau-Zyklen.
Abbildung 1: Beispiel für die Denaturierung der Gelanalyse von phosphorylierter RNA. In-vitro-RNA-Kinase-Assay von Las1-Grc3 (110 nM) inkubiert mit 500 nM SC-ITS2 RNA. X markiert die Steuerreaktion ohne Las1-Grc3 und das schwarze Dreieck stellt die Titration von ATP von 0-10 mM dar. C2-RNA ist das Ergebnis der SC-ITS2-RNA-Spaltung durch die Las1-Nuklease und ist das endogene Substrat für die Grc3 PNK-Aktivität. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Quantifizierung der RNA-Phosphorylierung. Densiometrische Darstellung der Las1-Grc3-RNA-Kinase-Aktivität, ausgedrückt als Prozentsatz der nichtphosphorylierten C2-RNA (graue Linie; 5-OH C2 RNA) und phosphorylierter C2-RNA (braune Linie; 5-P C2 RNA) über eine ATP-Konzentrationsreihe. Fehlerbalken markieren die Standardabweichung von drei unabhängigen technischen Replikationen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Beispiel für eine erfolglose Denaturierungsgelanalyse der phosphorylierten RNA. In-vitro-RNA-Kinase-Assay von T4 PNK (0-0,625 U) inkubiert mit 5 m 21 nt RNA. X markiert die Steuerungsreaktion ohne T4 PNK. Diese RAS-Kontrolle enthält nur degradierte RNA-Produkte, die es unmöglich machen, das 21 nt phosphorylierte Produkt vom Abbauprodukt (schwarze Pfeile) zu unterscheiden. Die Phosphorylierung des kürzesten RNA-Abbauprodukts (graue Pfeile) kann analysiert werden, da es keine Dedradierungsprodukte gibt, die sich mit seinem phosphorylierten Gegenstück überlappen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Sequenz (5'→3') | Oligo-Code | Quelle | |
| SC-its2 | GUCGUUUUAGGUUUUAC CAACUGCGGC/36-FAM/ |
mp 911 | (Pillon et al. NSMB 2019) 26 |
| C2-RNA | GGUUUUACCAACUG CGGC/36-FAM/ |
N/A | Las1-Spaltungsprodukt von SC-ITS2 |
| 21-nt | ACGUACGCGGAA UACUUCGAA/36-TAMSp/ |
mp 596 | (Pillon et al. RNA, 2018) 24 |
Tabelle 1: Fluoreszierend markierte RNA-Substrate.
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Discussion
Beschrieben ist ein Test zur Messung der Kinase-Aktivität von Grc3 PNK auf fluoreszierend markierten Nukleotidsubstraten. Dieses Protokoll kann angewendet werden, um andere PNK-Enzyme durch Anpassung des Reaktionspuffers und des Oligonukleotidsubstrats zu charakterisieren. Beispielsweise fordert das Protokoll eine Rückverfolgungsmenge von EDTA. Die Zugabe von EDTA ist aus zwei Gründen von Vorteil: Erstens begünstigt dieser Ansatz Magnesium-gebundene Grc3, indem verhindert wird, dass das Enzym an die Rückverfolgbarkeit von Mengen kontaminierender Metalle in der Mischung bindet. Zweitens hemmt eine geringe Menge EDTA die Aktivität der Kontaminierung metallabhängiger Ribonukleasen, ohne die Aktivität der zugehörigen las1-metallunabhängigen Ribonuklease zu stören. Die Konzentration von EDTA kann in Abhängigkeit von der Quelle des spezifischen PNK verändert werden. Dieser Test bietet auch einen Vorteil gegenüber herkömmlichen PNK-Phosphorylierungstests, die auf Oligonukleotiden basieren, die mit kurzen Halbwertsradioisotopen gekennzeichnet sind (d. h. 2 Wochen Halbwertszeit für Phosphor-32). Dieses Protokoll kann angepasst werden, um spezifische Enzymaktivität und Michaelis-Menten-Kinetik zu messen sowie die Abhängigkeit der Phosphorylierung von verschiedenen Parametern zu bestimmen, wie z. B. der Art der Nukleotide, Substrate und Metallionen.
Dieses Protokoll beruht auf der Ausführung großer denaturierender Polyacrylamid-Gele, um eine ausreichende Auflösung zu erzielen, um ein nicht phosphoryliertes Substrat von seinem phosphorylierten Produkt zu unterscheiden. Das Gießen und Behandeln dieser Gele sind wichtige Schritte im Protokoll. Zum Beispiel muss die Acrylamidlösung erhitzt werden, um den Harnstoff aufzulösen und dann langsam abkühlen, bevor das Gel gegossen wird. Eine zu schnelle Kühlung dieser Lösung kann zur Bildung von Kristallen führen. Es muss auch darauf geachtet werden, dass luftblasen und Staub beim Gießen und Setzen des Gels vermieden wird. Es wird empfohlen, das Gel zu fänden, ohne die Glasplatten zu entfernen, um zu vermeiden, dass das Gel, das dünn und schwer zu handhaben ist, wenn es von den Glasplatten entfernt wird, gerissen wird.
Dieses Protokoll kann angepasst werden, um die Phosphorylierung von Oligonukleotidsubstraten unterschiedlicher Größe zu messen. Dieser spezielle Assay verwendete ein 15% Acrylamid-Gel, um eine Auflösung der Phosphorylierung von 27 nt (SC-ITS2 RNA) und 18 nt (C2 RNA) Substraten zu erreichen. Die Zugabe einer Phosphatgruppe zum 5-Ende der SC-ITS2-RNA erzeugt eine bescheidene Verschiebung im Vergleich zu der Mobilitätsänderung, die bei der 5-Phosphorylierung der kürzeren C2-RNA induziert wird (Abbildung 1). Dies unterstreicht eine Einschränkung der RNA-Länge bei der Verwendung dieser Technik. Bei längeren RNA-Substraten wird der Beitrag einer Phosphatgruppe zum Gesamtmolekulargewicht der RNA-Art verringert. Aus diesem Grund können der Acrylamidanteil sowie die Gellaufzeit optimiert werden, um eine Auflösung unterschiedlich großer Substrate zu erreichen29. Im Allgemeinen werden höhere Acrylamidanteile für kleinere Oligonukleotidsubstrate verwendet, während niedrigere Acrylamidanteile (bis zu 8 %) eine bessere Auflösung größerer Oligonukleotidsubstrate.
Die Hauptbeschränkung dieses Assays ist, dass es niedriger Durchsatz ist. Das Gießen und Führen von denaturierenden Gelen nimmt eine erhebliche Zeit in Anspruch und begrenzt die Anzahl der Gele und Proben, die an einem Tag analysiert werden können. Eine zukünftige Anwendung, um diese Einschränkung zu überwinden, könnte die Entwicklung von mikrofluidischen Chips sein, die in der Lage sind, phosphorylierte Oligonukleotidprodukte aufzulösen. Die mikrofluidische Gelelektrophorese hat gegenüber der herkömmlichen Gelelektrophorese viele Vorteile, wie z. B. geringere Probengröße, Automatisierung und Geschwindigkeit. Aktuelle mikrofluidische Chips haben jedoch keine einzige Nukleotidauflösung. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Verwendung der denaturierenden Gelelektrophorese zur Detektion einer veränderten Migration nichtradioaktiver Oligonukleotide eine nützliche Technik zur Überwachung der katalytischen Anforderungen und der Substratpräferenz von Polynukleotidkinaseenzymen bietet.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Andrew Sikkema und Andrea Kaminski für ihre kritische Lektüre dieses Manuskripts. Diese Arbeit wurde vom US National Institute of Health Intramural Research Program unterstützt; US National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS; ZIA ES103247 an R.E.S) und die Canadian Institutes of Health Research (CIHR; 146626 bis M.C.P).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4 mm 34-well comb | BioRad | 1653848 | |
| 0.4 mm spacer | BioRad | 1653812 | |
| 0.5 M EDTA ph 8.0 | KD Medical | RGF-3130 | |
| 1M Magnesium Chloride | KD Medical | CAC-5290 | |
| 1M Tris pH 8.0 | KD Medical | RGF-3360 | |
| 40% Acrylamide/Bis Solution 29:1 | BioRad | 1610146 | |
| 5M Sodium Chloride | KD Medical | RGF-3720 | |
| ammonium persulfate (APS) | BioRad | 161-0700 | |
| ATP | Sigma | A2383-1G | |
| boric acid | Sigma | B0394 | |
| bromophenol blue sodium salt | Sigma | B5525-5G | |
| Glass Plates | Thomas Scientific | 1188K51 | |
| Hoefer SQ3 Sequencer | Hoefer | N/A | |
| Image J Software | N/A | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Labeled RNA oligonucleotides | IDT | Custom Order | |
| Pharmacia EPS 3500 Power Supply | Pharmacia | N/A | |
| Steriflip 0. 22 um Filter | Millipore | 5FCP00525 | |
| TEMED | BioRad | 161-0800 | |
| tris base | Sigma | TRIS-RO | |
| Typhoon FLA 9500 gel imager | GE Healthcare | N/A | |
| Ultra Pure DEPC Water | Invitrogen | 750023 | |
| Ultra Pure Glycerol | Invitrogen | 19E1056865 | |
| urea | Fisher Chemical | U15-500 |
References
- Pillon, M. C., Stanley, R. E. Nuclease integrated kinase super assemblies (NiKs) and their role in RNA processing. Current Genetics. 64 (1), 183-190 (2018).
- Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 114 (28), E5530-E5538 (2017).
- Gasse, L., Flemming, D., Hurt, E. Coordinated Ribosomal ITS2 RNA Processing by the Las1 Complex Integrating Endonuclease, Polynucleotide Kinase, and Exonuclease Activities. Molecular Cell. 60 (5), 808-815 (2015).
- Dikfidan, A., et al. RNA specificity and regulation of catalysis in the eukaryotic polynucleotide kinase Clp1. Molecular Cell. 54 (6), 975-986 (2014).
- Bernstein, N. K., et al. The molecular architecture of the mammalian DNA repair enzyme, polynucleotide kinase. Molecular Cell. 17 (5), 657-670 (2005).
- Rio, D. C. 5'-end labeling of RNA with [gamma-32P]ATP and T4 polynucleotide kinase. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (4), 441-443 (2014).
- Paredes, E., Evans, M., Das, S. R. RNA labeling, conjugation and ligation. Methods. 54 (2), 251-259 (2011).
- Hilario, E. End labeling procedures: an overview. Molecular Biotechnology. 28 (1), 77-80 (2004).
- Eastberg, J. H., Pelletier, J., Stoddard, B. L. Recognition of DNA substrates by T4 bacteriophage polynucleotide kinase. Nucleic Acids Research. 32 (2), 653-660 (2004).
- Lillehaug, J. R., Kleppe, K. Kinetics and specificity of T4 polynucleotide kinase. Biochemistry. 14 (6), 1221-1225 (1975).
- Richardson, C. C. Phosphorylation of nucleic acid by an enzyme from T4 bacteriophage-infected Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 54 (1), 158-165 (1965).
- Galburt, E. A., Pelletier, J., Wilson, G., Stoddard, B. L. Structure of a tRNA repair enzyme and molecular biology workhorse: T4 polynucleotide kinase. Structure. 10 (9), 1249-1260 (2002).
- Saito, M., et al. Large-Scale Molecular Evolutionary Analysis Uncovers a Variety of Polynucleotide Kinase Clp1 Family Proteins in the Three Domains of Life. Genome Biology Evolution. 11 (10), 2713-2726 (2019).
- Jain, R., Shuman, S. Characterization of a thermostable archaeal polynucleotide kinase homologous to human Clp1. RNA. 15 (5), 923-931 (2009).
- Weitzer, S., Hanada, T., Penninger, J. M., Martinez, J. CLP1 as a novel player in linking tRNA splicing to neurodegenerative disorders. Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 6 (1), 47-63 (2015).
- Wang, L. K., Lima, C. D., Shuman, S. Structure and mechanism of T4 polynucleotide kinase: an RNA repair enzyme. EMBO Journal. 21 (14), 3873-3880 (2002).
- Zhang, Y., Zhao, J., Chen, S., Li, S., Zhao, S. A novel microchip electrophoresis laser induced fluorescence detection method for the assay of T4 polynucleotide kinase activity and inhibitors. Talanta. 202, 317-322 (2019).
- Cui, L., Li, Y., Lu, M., Tang, B., Zhang, C. Y. An ultrasensitive electrochemical biosensor for polynucleotide kinase assay based on gold nanoparticle-mediated lambda exonuclease cleavage-induced signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 99, 1-7 (2018).
- Wang, L. J., Zhang, Q., Tang, B., Zhang, C. Y. Single-Molecule Detection of Polynucleotide Kinase Based on Phosphorylation-Directed Recovery of Fluorescence Quenched by Au Nanoparticles. Analytical Chemistry. 89 (13), 7255-7261 (2017).
- Liu, H., Ma, C., Wang, J., Chen, H., Wang, K. Label-free colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase/phosphatase activity and its inhibitors based on G-quadruplex/hemin DNAzyme. Analytical Biochemistry. 517, 18-21 (2017).
- Du, J., Xu, Q., Lu, X., Zhang, C. Y. A label-free bioluminescent sensor for real-time monitoring polynucleotide kinase activity. Analytical Chemistry. 86 (16), 8481-8488 (2014).
- Jiang, C., Yan, C., Jiang, J., Yu, R. Colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase activity based on the horseradish peroxidase-mimicking DNAzyme combined with lambda exonuclease cleavage. Analytica Chimica Acta. 766, 88-93 (2013).
- Castle, C. D., et al. Las1 interacts with Grc3 polynucleotide kinase and is required for ribosome synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 41 (2), 1135-1150 (2013).
- Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex. RNA. 24 (5), 721-738 (2018).
- Geerlings, T. H., Vos, J. C., Raue, H. A. The final step in the formation of 25S rRNA in Saccharomyces cerevisiae is performed by 5'-->3' exonucleases. RNA. 6 (12), 1698-1703 (2000).
- Pillon, M. C., et al. Cryo-EM reveals active site coordination within a multienzyme pre-rRNA processing complex. Nature Structural Molecular Biology. 26 (9), 830-839 (2019).
- Solomatin, S., Herschlag, D. Methods of site-specific labeling of RNA with fluorescent dyes. Methods in Enzymology. 469, 47-68 (2009).
- Giusti, W. G., Adriano, T. Synthesis and characterization of 5'-fluorescent-dye-labeled oligonucleotides. PCR Methods Application. 2 (3), 223-227 (1993).
- Petrov, A., Tsa, A., Puglisi, J. D. Analysis of RNA by analytical polyacrylamide gel electrophoresis. Methods in Enzymology. 530, 301-313 (2013).
