Summary
Este protocolo describe un ensayo no radioactivo para medir la actividad quinasa de las quinasas de polinucleótidos (PNK) en sustratos pequeños de ADN y ARN.
Abstract
Las quinasas de polinucleótidos (PNK) son enzimas que catalizan la fosforilación del extremo hidroxilo de 5' del ADN y los oligonucleótidos de ARN. La actividad de los PNK se puede cuantificar mediante enfoques directos o indirectos. Aquí se presenta un enfoque directo e in vitro para medir la actividad de PNK que se basa en un sustrato de oligonucleótido con etiqueta fluorescente y electroforesis de gel de poliacrilamida. Este enfoque proporciona la resolución de los productos fosforilados evitando el uso de sustratos radiomarcados. El protocolo detalla cómo configurar la reacción de fosforilación, preparar y ejecutar grandes geles de poliacrilamida, y cuantificar los productos de reacción. La parte técnicamente más difícil de este ensayo es verter y ejecutar los grandes geles de poliacrilamida; por lo tanto, se proporcionan detalles importantes para superar las dificultades comunes. Este protocolo fue optimizado para Grc3, un PNK que se ensambla en un complejo de procesamiento de ARN pre-ribosomal obligado con su socio de unión, la nucleasa Las1. Sin embargo, este protocolo se puede adaptar para medir la actividad de otras enzimas PNK. Además, este ensayo también se puede modificar para determinar los efectos de diferentes componentes de la reacción, como el trifosfato de nucleósidos, iones metálicos y oligonucleótidos.
Introduction
Las quinasas polinucleótidas (PNK) desempeñan un papel fundamental en muchas vías de procesamiento de ADN y ARN, como la reparación del ADN y el ensamblaje ribosoma1,,2,,3,,4,,5. Estas enzimas fundamentales catalizan la transferencia del monofosfato terminal (gamma) de un trifosfato de nucleósido (NTP, más a menudo ATP) al extremo hidroxilo de 5' de un sustrato de nucleótido. Uno de los PNK más caracterizados es el bacteriófago T4 PNK, que tiene una amplia especificidad de sustrato y es muy utilizado por los laboratorios de biología molecular para la incorporación de etiquetas de isótopos radiactivos en el 5 terminus de un sustrato de ADN o ARN6,7,8,9,10,11,12. Otro ejemplo de una enzima PNK es CLP1, que se encuentra en Eukarya, Eubacteria y Archaea, y está implicado en varias vías de procesamiento de ARN4,13,14,15.
Históricamente, la mayoría de los ensayos que miden la actividad de polinucleótido quinasa dependen del etiquetado de isótopos radiactivos y de la posterior autoradiografía5,,16. En los últimos años se han desarrollado una serie de ensayos adicionales para medir la actividad de PNK, incluyendo enfoques de molécula única, electroforesis de microchip, balizas moleculares, así como ensayos colorimétricos y basados en luminiscencia17,18,19,20,21,22. Si bien muchos de estos nuevos enfoques proporcionan límites de detección mejorados y evitan el uso de radiactividad, cada uno tiene inconvenientes, como el costo, la dependencia de la resina inmovilizada y las limitaciones en la elección del sustrato.
Grc3 es un polinucleótido quinasa que desempeña un papel fundamental en el procesamiento de ARN pre-ribosomal2,3,23. Grc3 forma un complejo obligado con la endoribonucleasa Las1, que corta el Espaciador Transcrito Interno 2 (ITS2) del ARN pre-ribosomal3. Cleavage del ITS2 de Las1 genera un producto que alberga un hidroxilo de 5' que posteriormente es fosforilado por la Grc3 quinasa3. Para investigar la especificidad de nucleótidos y sustratos de Grc3, se requirió un ensayo barato que permitió realizar pruebas de diferentes sustratos de oligonucleótidos. Por lo tanto, se desarrolló un ensayo de fosforilación PNK utilizando sustratos con etiqueta fluorescente. Este ensayo se utilizó con éxito para determinar que Grc3 puede utilizar cualquier NTP para la actividad de transferencia de fósforo, pero favorece ATP24. Este protocolo adapta el ensayo original para medir la actividad PNK de Grc3 en una imitación de ARN de su sustrato de ARN pre-ribosomal (SC-ITS2, Tabla 1). Un aspecto desafiante de este enfoque basado en la fluorescencia es la dependencia de grandes geles de poliacrilamida para resolver eficazmente los sustratos fosforilados y no fosforilados. El protocolo proporciona detalles específicos sobre cómo verter estos geles grandes y evitar escollos comunes al hacerlo.
Trabajar con ARN requiere un cuidado especial porque es muy susceptible a la degradación. Hay medidas preventivas simples que uno puede tomar para limitar la contaminación por ribonucleasa. Una estación de trabajo de ARN independiente que se puede tratar fácilmente con un agente limpiador que contiene inhibidores de la ARNa a menudo es útil. Es necesario usar siempre guantes cuando se manejen muestras y se utilicen consumibles certificados sin RNase. Debido a que el agua es otra fuente común de contaminación, lo mejor es utilizar agua recién purificada y esterilizar todas las soluciones utilizando un filtro de 0,22 m.
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Protocol
1. Preparación
- Prepare el búfer y los reactivos.
- Haga 1x Buffer de Reacción combinando 20 l de 1 M Tris (pH a 8,0), 40 ml de cloruro de sodio de 5 M, 2,5 l de cloruro de magnesio de 2 M, 100 l de 50% (v/v) de glicerol y agua libre de RNase para alcanzar un volumen total de 1 ml.
- Haga el tinte de carga de urea combinando 4,8 g de urea, 200 l de 1 M Tris (pH a 8,0), 20 l de 0,5 M EDTA (pH a 8,0), 0,5 ml de 1% (p/v) de agua libre de romo para alcanzar un volumen total de 10 mL.
- Haga un tampón TBE 10x combinando 108 g de base Tris, 55 g de ácido bórico, 40 ml de 0,5 M EDTA (pH a 8,0) y agua libre de RNase para alcanzar un volumen total de 1 L.
- Hacer 10% (p/v) persulfato de amonio (APS). Pesar 0,5 g de APS y añadir 3 ml de agua libre de RNase para disolver el sólido. Añadir agua libre de RNase para alcanzar un volumen total de 5 ml. Envuelva el tubo en papel de aluminio y almacene la solución a 4 oC.
NOTA: El APS disuelto se descompone con el tiempo. Sustituya el stock de APS del 10% cada 2 semanas.
- Obtener enzima polinucleótida quinasa.
- Adquirir la enzima pura Las1-Grc3PNK2 almacenada en Búfer de reacción (ver paso 1.1.1) en una concentración de stock de 20 oM. El búfer de almacenamiento variará dependiendo del PNK específico.
- Preparar sustrato de ácido nucleico.
NOTA: Este protocolo supervisa la 5'-fosforilación de un sustrato de ARN de 27 nt que alberga el sitio de procesamiento Las1-Grc3 (sitio C2) contenido en el espaciador interno transcrito De Saccharomyces cerevisiae pre-ribosomal 2 (SC-ITS2; véase la Tabla 1)2,25,26.- Sintetiza químicamente un sustrato de oligonucleótido de ARN que contenga un extremo de 5'-hidroxilo junto con una etiqueta fluorescente de 3'. El fluoróforo se utilizará para la visualización del ARN. Asegúrese de que el fluoróforo esté colocado en el extremo del ARN que no está dirigido a la fosforilación. Como alternativa a las fuentes comerciales, el etiquetado fluorescente interno y terminal de sustratos de ARN se puede realizar internamente utilizando protocolos rentables27.
- Eliminar el exceso de fluoróforo de la reacción de etiquetado de ARN por HPLC-purificación28.
- Resuspender el ARN liofilizado utilizando agua libre de RNase a 500 nM.
- Almacene las alícuotas de ARN a -80 oC para almacenamiento a largo plazo o a -20 oC para almacenamiento a corto plazo.
- Prepare la serie de concentración de ATP.
- Haga un stock de trabajo de 20 mM de ATP usando El búfer de reacción (véase el paso 1.1.1). Utilice este stock de trabajo para generar cuatro diluciones en serie que van desde 20 mM-0.02 mM.
- Para realizar la primera dilución de la serie de concentración, mezcle 1 l del stock de trabajo ATP de 20 mM con 9 ml de búfer de reacción. Esto resultará en una dilución de 10 veces el ATP con una concentración final de 2 mM.
- Utilice el stock DE ATP de 2 mM generado en el paso 1.4.2 para realizar la siguiente dilución en la serie de concentración. Mezcle 1 l de la población de ATP de 2 mM con 9 ml de búfer de reacción. Esto hará una nueva concentración de acciones ATP de 0,2 mM.
- Continúe diluyendo 1 l de la población anterior de ATP con 9 sl de búfer de reacción para hacer el stock de ATP subsiguiente en la serie de concentración.
2. Reacción in vitro del ARN quinasa
NOTA: Este ensayo se puede utilizar para medir varias variables como el tiempo, los niveles de nucleótidos o la concentración enzimática. El objetivo de este experimento es evaluar la cantidad de ARN fosforilado en presencia de niveles constantes de ATP complejos Las1-Grc3 y variados.
- Para cada reacción de arn-enzima quinasa, combine 1 l de sustrato de ARN de 500 nM, 8,3 l de 130 nM Las1-Grc3 y 0,2 l de EDTA de 5 mM.
NOTA: Si realiza varias reacciones, prepare un stock maestro de la mezcla de ARN-enzima y alícuota de 9,5 ml de esta mezcla maestra a cada tubo de reacción. - Comience el ensayo.
- Ajuste el bloque de calor a 37 oC.
- A intervalos de 10 s, mezcle 0,5 ml de un substock ATP de la serie de concentración de ATP preparado en el paso 1.4 con una mezcla de ARN-enzima y coloque la reacción en el bloque de calor de 37 oC.
NOTA: Agregue 0,5 ml de búfer de reacción en lugar de ATP a una mezcla de enzimas ARN para un control negativo PNK. Utilice también otro control necesario (es decir, sustrato de ARN en ausencia de enzima PNK). - Incubar las reacciones durante 60 min a 37oC.
NOTA: El ARN con etiqueta fluorescente es sensible a la luz; por lo tanto, cubrir las reacciones con papel de aluminio. - Usando el mismo orden que en el paso 2.2.2, apague cada reacción cada 10 s escupiendo la reacción con 10 l de tinte de carga de urea (ver paso 1.1.2).
NOTA: Además de 4 M de urea, se puede añadir proteinasa K en este paso para degradar la enzima. Siga las instrucciones proporcionadas por el proveedor para determinar la cantidad de proteasa requerida y las condiciones de reacción. - Utilice inmediatamente las reacciones de ARN quinasa in vitro apagados para el análisis posterior (ver sección 3) o almacenar a -20 oC para analizarse más adelante.
3. Electroforesis de gel
- Preparar 15% de acrilamida/8 M solución de gel de urea.
ADVERTENCIA: La acrilamida debe manejarse con cuidado, ya que es una neurotoxina. Use siempre guantes, un abrigo de laboratorio y gafas cuando lo manipule.- En un vaso de vidrio de 150 ml, combine 22,5 ml de solución premezclada de acrilamida/bis-acrilamida 29:1, 6 ml de TBE de 10x (ver paso 1.1.3), 28,8 g de urea y agua libre de RNase hasta un volumen total de 59 ml. Revuelva suavemente la solución.
NOTA: Dependiendo de la longitud del sustrato de ARN, la alteración del porcentaje de poliacrilamida puede mejorar la resolución entre ARN sin fosforilado y fosforilado. - Para disolver la urea, calentar la solución en el microondas durante 20 s, agitar el líquido, y volver a colocar inmediatamente la solución en el microondas durante otros 20 s. Revuelva suavemente la solución hasta que la urea se disuelva por completo.
- Enfríe lentamente la solución colocando el vaso de precipitados de vidrio en un baño de aguas poco profundas que contenga agua fría. Asegúrese de que el nivel de agua fría que rodea el vaso de precipitados de vidrio está por encima del nivel de solución dentro del vaso de precipitados de vidrio. Esto promoverá una transferencia de calor eficiente. Espere 5 min.
NOTA: No continúe con este protocolo si el vaso de vidrio se siente caliente; el agua debe estar por debajo de 25 oC. Si todavía se siente caliente después de 5 minutos, a continuación, reemplace el agua en el baño de agua con agua fría fresca y esperar otros 5 minutos. - Filtrar y desgascar la solución utilizando una unidad de filtración desechable de 0,22 m para eliminar partículas y burbujas de aire microscópicas.
- En un vaso de vidrio de 150 ml, combine 22,5 ml de solución premezclada de acrilamida/bis-acrilamida 29:1, 6 ml de TBE de 10x (ver paso 1.1.3), 28,8 g de urea y agua libre de RNase hasta un volumen total de 59 ml. Revuelva suavemente la solución.
- Vierta el gel desnatural.
- Utilice jabón y agua tibia para limpiar una placa de vidrio corta y larga diseñada para geles con dimensiones totales de 31,0 cm x 38,5 cm. Rocíe cada placa de vidrio con 95% de etanol y limpie el vidrio para eliminar cualquier humedad.
NOTA: Una de las dos placas se puede siliconar para evitar daños en el gel al separar el sándwich de placa de vidrio. Sin embargo, este paso no es necesario porque este protocolo está diseñado para visualizar el ARN sin separar las placas de vidrio. - Coloque la placa de vidrio larga horizontalmente en la parte superior de una caja para que se eleve fuera de la mesa.
ADVERTENCIA: La acrilamida es tóxica, por lo tanto, la estación de vertido de gel debe estar cubierta en papel de banco que pueda absorber cualquier líquido derramado y colocarse inmediatamente en una bolsa de residuos una vez completado el procedimiento. - Coloque un espaciador limpio de 0,4 mm a lo largo de los bordes largos de la placa de vidrio larga.
- Poner la placa de vidrio corta encima de la placa larga y asegurar que los bordes de la placa corta, placa larga, y espaciadores están alineados. Sujete cada lado con tres abrazaderas metálicas espaciadas uniformemente.
- Añadir 24 l de TEMED a la solución de urea de 15% de acrilamida/8 M preparada en el paso 3.1 y mezclar la solución.
- Añadir 600 l de APS al 10% (p/v) (ver paso 1.1.4) a la solución en el paso 3.2.5 y mezclar suavemente la solución.
- Verter inmediatamente la solución entre las placas de vidrio.
NOTA: Para evitar burbujas, toque el vaso mientras se vierte la solución. - Agregue cuidadosamente un peine limpio, de 0,4 mm y 32 pozos a la parte superior del sándwich de placa de vidrio.
- Permita un mínimo de 30 min para que la acrilamida se polimerice.
- Utilice jabón y agua tibia para limpiar una placa de vidrio corta y larga diseñada para geles con dimensiones totales de 31,0 cm x 38,5 cm. Rocíe cada placa de vidrio con 95% de etanol y limpie el vidrio para eliminar cualquier humedad.
- Ejecuta el gel desnatural.
- Ajuste el bloque de calor a 75 oC.
- Retire las abrazaderas metálicas que sujetan el sándwich de placa de vidrio y lave y seque bien el sándwich de placa de vidrio.
- Coloque el sándwich de placa de vidrio en el aparato de gel con la placa corta orientada hacia adentro.
- Prepare el búfer de funcionamiento TBE de 0,5x combinando 100 ml de TBE de 10x con agua libre de RNase de 1,9 L. Añada 600 ml del tampón de funcionamiento a las cámaras superior e inferior del aparato de gel.
- Retire suavemente el peine y enjuague bien los pozos con una jeringa.
NOTA: Este paso es fundamental para eliminar la urea de los pozos. - Pre-ejecutar el gel durante 30 min a 50 W. El voltaje es de aproximadamente 2.000 V.
ADVERTENCIA: Este aparato de gel funciona a una alta potencia y los usuarios deben exhibir precaución. - Enjuague bien los pozos con una jeringa.
NOTA: Este paso es fundamental para cargar incluso la muestra en los pozos. - Pulse girar las reacciones agudadas del paso 2.2.5. A continuación, incubar los tubos a 75oC durante 3 min. Repite el giro del pulso.
- Cargue inmediatamente 10 ml de muestra por pozo y ejecute el gel durante 3 h a 50 W.
NOTA: El ARN con etiqueta fluorescente es sensible a la luz; por lo tanto, cubra el aparato de gel con papel de aluminio.
- Imagen del gel desnatural.
- Apague la fuente de alimentación y drene la cámara superior del aparato de gel.
- Lave y seque el lado exterior del sándwich de placa de vidrio con agua y jabón. Cubra el sándwich de placa de vidrio con papel de aluminio mientras transporta el gel.
- Monte el sándwich de placa de vidrio en el escenario de un escáner láser capaz de detección cuantitativa y sensible de fluorescencia.
NOTA: Este gel es extremadamente delgado para una resolución máxima. Por esta razón, este protocolo está diseñado para evitar las dificultades de retirar el gel del sándwich de placa de vidrio mediante la visualización directa del ARN con etiqueta fluorescente a través de las placas de vidrio. El uso de placas de vidrio de baja fluorescencia disponibles comercialmente aumentará la señal capturada mejorando la relación señal-ruido. - Establezca las longitudes de onda de excitación y emisión del escáner láser para el fluoróforo deseado.
NOTA: Las longitudes de onda óptimas de excitación y emisión pueden diferir para fluoróforos específicos. Para el fluoróforo FAM, las longitudes de onda de excitación y emisión son de 495 nm y 535 nm, respectivamente. - Defina el área que se visualizará en la etapa del escáner láser e imagen del gel de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Figura 1).
4. Análisis de imágenes y cuantificación de señales
- Cargue la imagen de gel digital adquirida en el paso 3.4.5 en el software de procesamiento de imágenes (consulte Tabla de materiales).
- Con el botón izquierdo del ratón, haga clic y arrastre un rectángulo para definir un cuadro de plantilla para marcar los límites de la imagen de gel digital que se utilizará para cuantificar cada banda de ARN. La banda de ARN vista en la mezcla de reacción establecida en ausencia de enzima PNK es generalmente una buena banda para generar esta plantilla.
NOTA: Para evitar el sesgo causado por la señal de fondo, es fundamental que el área que rodea cada banda de ARN que se mide sea idéntica. Por esta razón, es mejor utilizar el mismo cuadro de plantilla para demarcar cada banda de ARN. - Abra el Administrador de ROI en"Herramientas"y marque la posición del cuadro de plantilla haciendo clic en "Agregar".
NOTA: Los programas de cuantificación también pueden dibujar cuadros automáticamente siguiendo el manual del usuario del software. - Con el botón izquierdo del ratón, haga clic y arrastre el cuadro de plantilla a la siguiente banda de ARN y repita el paso 4.3. Continuar este proceso hasta que se haya marcado la posición de todas las bandas de ARN sin fosforilado y fosforilado en cada reacción.
- Mida la densidad integrada dentro de cada cuadro haciendo clic en"Medir"en el Administrador de ROI.
- Para calcular la cantidad relativa de ARN fosforilado en una reacción, divida la densidad integrada de la banda de ARN fosforilada por la suma de las densidades integradas de las bandas de ARN no fosforiladas y fosforiladas de la misma reacción. Este enfoque también se puede aplicar para calcular la cantidad relativa de ARN no fosforilado.
- Para visualizar la acumulación de producto de ARN fosforilado y el correspondiente agotamiento del sustrato de ARN sin fosforilado en toda la serie de concentración de ATP, trazar la cantidad relativa de ARN calculado en el paso 4.6 contra la concentración de ATP.
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Representative Results
Un gel de desnaturalismo representativo exitoso de una valoración de ATP con una cantidad fija del complejo Las1-Grc3 se muestra en la Figura 1. La adición de enzimas dio lugar a la escisión de ARN mediada por Las1 del sustrato de ARN SC-ITS2, lo que dio lugar a un fragmento de ARN definido (ARN C2 de 5-OH C2). Tras la adición de ATP, el fragmento de ARN C2 fue fosforilado por Grc3 PNK (5-P C2 RNA). En geles desnaturalados, el ARN fosforilado migra más rápido que su contraparte no fosforilada. Como se muestra en la Figura 2,la fosforilación del fragmento de ARN C2 podría visualizarse trazando la cantidad relativa de ARN C2 sin fosforilado y fosforilado contra la concentración de ATP. Grc3 PNK también fosforiló el extremo 5 del sustrato SC-ITS2 sin cortar, aunque a una tasa más baja. Esto confirma el trabajo previo sugiriendo que Grc3 PNK muestra la preferencia de sustrato hacia su sustrato de ARN C224. Un gel desnaturalismo sin éxito se muestra en la Figura 3. Este gel no tuvo éxito porque el sustrato de ARN de 21 nt contenía productos de degradación(Figura 3, primer carril). Estos productos de degradación se superponieron con el producto fosforilado y hicieron imposible cuantificar con precisión la fosforilación. Por el contrario, el producto de degradación de ARN más corto(Figura 3, flechas grises) pudo ser analizado con éxito porque esta área del gel no contenía ninguna especie de ARN adicional que obstaculizara la cuantificación precisa de su contraparte fosforilada. Para evitar bandas de degradación de ARN, mantenga el espacio de trabajo y las soluciones libres de RNase y limite el número de ciclos de congelación y descongelación de ARN.
Figura 1: Ejemplo de análisis de gel desnaturalado de ARN fosforilado. Ensayo in vitro de ARN quinasa de Las1-Grc3 (110 nM) incubado con ARN SC-ITS2 de 500 nM. X marca la reacción de control sin Las1-Grc3 y el triángulo negro representa la valoración de ATP de 0-10 mM. El ARN C2 es el resultado de la escisión de ARN SC-ITS2 por la nucleasa Las1 y es el sustrato endógeno para la actividad de Grc3 PNK. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Cuantificación de la fosforilación del ARN. Gráfica densiométrica de la actividad de ARN quinasa Las1-Grc3 expresada como un porcentaje de ARN C2 sin fosforilado (línea gris; 5-OH C2 ARN) y ARN C2 fosforilado (línea marrón; 5-P C2 ARN) a través de una serie de concentración de ATP. Las barras de error marcan la desviación estándar de tres réplicas técnicas independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Ejemplo de un análisis de gel desnaturalismo infructuoso de ARN fosforilado. Ensayo in vitro de ARN quinasa de T4 PNK (0-0.625 U) incubado con ARN de 5 m 21 nt. X marca la reacción de control sin T4 PNK. Este control de ARN sólo contiene productos de ARN degradados que hacen imposible distinguir el producto fosforilado de 21 nt del producto de degradación (flechas negras). Se puede analizar la fosforilación del producto de degradación de ARN más corto (flechas grises), ya que no hay productos de dedradación que se superpongan con su contraparte fosforilada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Secuencia (5'→3') | Código Oligo | Fuente | |
| SC-ITS2 | GUCGUUUUAGGUUUUAC CAACUGCGGC/36-FAM/ |
mp 911 | NSMB 2019) 26 |
| C2 ARN | GGUUUUACCAACUG CGGC/36-FAM/ |
N/A | Producto de escote Las1 de SC-ITS2 |
| 21-nt | ACGUACGCGGAA UACUUCGAA/36-TAMSp/ |
mp 596 | (Pillon et al. RNA, 2018) 24 |
Tabla 1: Sustratos de ARN con etiqueta fluorescente.
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Discussion
Se describe un ensayo para medir la actividad quinasa de Grc3 PNK en sustratos de nucleótidos con etiqueta fluorescente. Este protocolo se puede aplicar para caracterizar otras enzimas PNK adaptando el búfer de reacción y el sustrato de oligonucleótido. Por ejemplo, el protocolo requiere una cantidad de seguimiento de EDTA. La adición de EDTA es beneficiosa por dos razones: En primer lugar, este enfoque favorece grc3 unido al magnesio al impedir que la enzima se une a cantidades traza de metales contaminantes en la mezcla. En segundo lugar, una pequeña cantidad de EDTA inhibe la actividad de contaminar las ribonucleasas dependientes del metal sin interrumpir la actividad de la ribonucleasa independiente del metal Las1 asociada. La concentración de EDTA puede ser alterada dependiendo de la fuente del PNK específico. Este ensayo también proporciona una ventaja sobre los ensayos tradicionales de fosforilación PNK que se basan en oligonucleótidos etiquetados con radioisótopos de corta vida media (es decir, vida media de 2 semanas para el fósforo-32). Este protocolo se puede adaptar para medir la actividad enzimática específica y la cinética Michaelis-Menten, así como para determinar la dependencia de la fosforilación en varios parámetros, como la naturaleza de los nucleótidos, sustratos e iones metálicos.
Este protocolo se basa en la ejecución de grandes geles de poliacrilamida desnaturalización con el fin de lograr una resolución suficiente para distinguir un sustrato no fosforilado de su producto fosforilado. El vertido y el manejo de estos geles son pasos críticos en el protocolo. Por ejemplo, la solución de acrilamida debe calentarse para disolver la urea y luego enfriarse lentamente antes de verter el gel. Enfriar esta solución demasiado rápido puede conducir a la formación de cristales. También se debe tener cuidado para evitar la introducción de burbujas de aire y polvo mientras se vierte y se fija el gel. Se recomienda tomar imágenes del gel sin quitar las placas de vidrio para evitar rasgar el gel, que es delgado y difícil de manejar una vez retirado de las placas de vidrio.
Este protocolo se puede adaptar para medir la fosforilación de sustratos de oligonucleótidos de diferentes tamaños. Este ensayo en particular utilizó un gel de acrilamida del 15% para lograr una resolución de fosforilación de sustratos de 27 nt (ARN SC-ITS2) y 18 nt (ARN C2). La adición de un grupo de fosfato al 5 extremos del ARN SC-ITS2 produce un cambio modesto en comparación con el cambio de movilidad inducido sobre la 5-fosforilación del ARN C2 más corto (Figura 1). Esto resalta una limitación en la longitud del ARN cuando se utiliza esta técnica. Con sustratos de ARN más largos, la contribución de un grupo fosfato al peso molecular general de la especie de ARN disminuye. Por esta razón, el porcentaje de acrilamida, así como el tiempo de funcionamiento del gel se pueden optimizar para lograr la resolución de sustratos de diferentes tamaños29. En general, se utilizan porcentajes más altos de acrilamida para sustratos de oligonucleótidos más pequeños, mientras que los porcentajes más bajos de acrilamida (hasta el 8%) proporcionar una mejor resolución de sustratos de oligonucleótidos más grandes.
La principal limitación de este ensayo es que es de bajo rendimiento. Verter y ejecutar geles desnaturalados toma una cantidad significativa de tiempo, limitando el número de geles y muestras que se pueden analizar en un día. Una aplicación futura para superar esta limitación podría ser el desarrollo de chips microfluídicos capaces de resolver productos de oligonucleótidos fosforilados. La electroforesis de gel a base de microfluidica tiene muchas ventajas sobre la electroforesis de gel tradicional, como el tamaño de la muestra más pequeño, la automatización y la velocidad. Sin embargo, los chips microfluídicos actuales no tienen una sola resolución de nucleótidos. En conclusión, el uso de electroforesis de gel desnaturalización para detectar la migración alterada de oligonucleótidos noradioactivos proporciona una técnica útil para monitorear los requisitos catalíticos y la preferencia de sustrato de las enzimas quinasas de polinucleótidos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos al Dr. Andrew Sikkema y Andrea Kaminski por su lectura crítica de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación Intramuros del Instituto Nacional de Salud de los Estados Unidos; Instituto Nacional de Ciencias de la Salud Ambiental de los Estados Unidos (NIEHS; ZIA ES103247 a R.E.S) y los Institutos Canadienses de Investigación Sanitaria (CIHR; 146626 a M.C.P).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4 mm 34-well comb | BioRad | 1653848 | |
| 0.4 mm spacer | BioRad | 1653812 | |
| 0.5 M EDTA ph 8.0 | KD Medical | RGF-3130 | |
| 1M Magnesium Chloride | KD Medical | CAC-5290 | |
| 1M Tris pH 8.0 | KD Medical | RGF-3360 | |
| 40% Acrylamide/Bis Solution 29:1 | BioRad | 1610146 | |
| 5M Sodium Chloride | KD Medical | RGF-3720 | |
| ammonium persulfate (APS) | BioRad | 161-0700 | |
| ATP | Sigma | A2383-1G | |
| boric acid | Sigma | B0394 | |
| bromophenol blue sodium salt | Sigma | B5525-5G | |
| Glass Plates | Thomas Scientific | 1188K51 | |
| Hoefer SQ3 Sequencer | Hoefer | N/A | |
| Image J Software | N/A | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Labeled RNA oligonucleotides | IDT | Custom Order | |
| Pharmacia EPS 3500 Power Supply | Pharmacia | N/A | |
| Steriflip 0. 22 um Filter | Millipore | 5FCP00525 | |
| TEMED | BioRad | 161-0800 | |
| tris base | Sigma | TRIS-RO | |
| Typhoon FLA 9500 gel imager | GE Healthcare | N/A | |
| Ultra Pure DEPC Water | Invitrogen | 750023 | |
| Ultra Pure Glycerol | Invitrogen | 19E1056865 | |
| urea | Fisher Chemical | U15-500 |
References
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