Summary
Dit protocol beschrijft een niet-radioactieve test om kinase activiteit van polynucleotide kinases (PNKs) te meten op kleine DNA- en RNA-substraten.
Abstract
Polynucleotide kinases (PNKs) zijn enzymen die de fosforylatie van het 5'hydrcoxyleinde van DNA en RNA oligonunucleotiden katalyseren. De activiteit van PNKs kan worden gekwantificeerd met behulp van directe of indirecte benaderingen. Hier gepresenteerd is een directe, in vitro benadering om PNK activiteit die is gebaseerd op een fluorescerend gelabeld oligonucleotide substraat en polyacrylamide gel elektroforese te meten. Deze aanpak biedt een oplossing van de fosforgeyleerde producten en vermijdt het gebruik van radioactief gelabelde substraten. Het protocol beschrijft hoe de fosforylatiereactie in te stellen, grote polyacrylamidegels te bereiden en uit te voeren, en kwantificeren van de reactieproducten. Het meest technisch uitdagende deel van deze test is het gieten en uitvoeren van de grote polyacrylamide gels; Er worden dus belangrijke details verstrekt om gemeenschappelijke moeilijkheden te overwinnen. Dit protocol is geoptimaliseerd voor Grc3, een PNK die zich assembleert tot een verplicht pre-ribosomale RNA verwerkingscomplex met zijn bindingspartner, de Las1 nuclease. Dit protocol kan echter worden aangepast om de activiteit van andere PNK-enzymen te meten. Bovendien kan deze test ook worden gewijzigd om de effecten van verschillende componenten van de reactie te bepalen, zoals het nucleoside-sfosfaat, metaalionen en oligonucleotiden.
Introduction
Polynucleotide kinases (PNK) spelen een cruciale rol in veel DNA- en RNA-verwerkingstrajecten, zoals DNA-herstel en ribosoomassemblage1,2,,3,4,5. Deze fundamentele enzymen katalyseren de overdracht van het terminale (gamma) monofosfaat van een nucleoside triphosfaet (NTP, meestal ATP) naar het 5'hydroxyleinde van een nucleotideubstraat. Een van de meest goed gekarakteriseerde PNKs is bacteriofaag T4 PNK, die brede substraat specificiteit heeft en zwaar wordt gebruikt door moleculaire biologielaboratoria voor het opnemen van radioactieve isotopenlabels op het 5-eindpunt van een DNA- of RNA-substraat6,7,8,9,10,11,12. Een ander voorbeeld van een PNK-enzym is CLP1, dat wordt gevonden in Eukarya, Eubacteriën en Archaea, en is betrokken bij verschillende RNA-verwerkingstrajecten4,,13,,14,15.
Historisch gezien zijn de meeste tests die polynucleotide kinaseactiviteit meten afhankelijk van radioactieve isotopenetikettering endaaropvolgendeautoradiografie 5,16. In de afgelopen jaren zijn een aantal aanvullende tests ontwikkeld om de PNK-activiteit te meten, waaronder single molecule benaderingen, microchip elektroforese, moleculaire bakens, evenals colorimetrische en luminescentie-gebaseerde tests17,18,19,20,21,22. Hoewel veel van deze nieuwe benaderingen verbeterde detectielimieten bieden en het gebruik van radioactiviteit vermijden, heeft elk nadeel, zoals kosten, afhankelijkheid van geïmmobiliseerde hars en beperkingen in de keuze van het substraat.
Grc3 is een polynucleotide kinase die een centrale rol speelt bij de verwerking van preririmaal RNA2,3,23. Grc3 vormt een obligate complex met de endoribonuclease Las1, die de interne transcribed Spacer 2 (ITS2) van het pre-ribosomale RNA3splijt. Decolleté van de ITS2 door Las1 genereert een product met een 5'-hydroxyl dat vervolgens wordt gefossyleerd door de Grc3 kinase3. Om de nucleotide en substraatspecificiteit van Grc3 te onderzoeken, was een goedkope test nodig die het testen van verschillende oligonucleotide substraten mogelijk maakte. Daarom werd een PNK fosforylatietest ontwikkeld met fluorescerend gelabelde substraten. Deze test werd met succes gebruikt om te bepalen dat Grc3 elke NTP kan gebruiken voor fosforyloverdrachtactiviteit, maar bevoordeelt ATP24. Dit protocol past de oorspronkelijke test aan om de PNK-activiteit van Grc3 te meten op een RNA-nabootsing van het preririmaal RNA-substraat (SC-ITS2, tabel 1). Een uitdagend aspect van deze fluorescentie-gebaseerde aanpak is de afhankelijkheid van grote polyacrylamide gels om fosforyleerde en niet-phosphorylated substraten effectief op te lossen. Het protocol geeft specifieke details over hoe deze grote gels te gieten en te voorkomen dat gemeenschappelijke valkuilen wanneer dit te doen.
Werken met RNA vereist bijzondere zorg omdat het sterk gevoelig is voor afbraak. Er zijn eenvoudige preventieve stappen die men kan nemen om ribonuclease besmetting te beperken. Een apart RNA-werkstation dat gemakkelijk kan worden behandeld met een RNase-remmerhoudend reinigingsmiddel is vaak nuttig. Altijd handschoenen dragen bij het hanteren van monsters en het gebruik van RNase-vrije gecertificeerde verbruiksartikelen is noodzakelijk. Omdat water een andere veel voorkomende bron van verontreiniging is, is het het beste om vers gezuiverd water te gebruiken en alle oplossingen te steriliseren met behulp van een filter van 0,22 μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding
- Buffer en reagentia voorbereiden.
- Maak 1x Reactiebuffer door 20 μL van 1 M Tris (pH = 8.0), 40 μL natriumchloride van 5 M, 2,5 μL van 2 M magnesiumchloride, 100 μL van 50% (v/v) glycerol en RNase-vrij water te combineren om een totaal volume van 1 mL te bereiken.
- Maak ureum ladingkleurstof door 4,8 g ureum te combineren, 200 μL van 1 M Tris (pH = 8.0), 20 μL van 0,5 M EDTA (pH = 8,0), 0,5 mL van 1% (w/v) bromofenolblauw en RNase-vrij water om een totaal volume van 10 mL te bereiken.
- Maak 10x TBE buffer door het combineren van 108 g Tris basis, 55 g boorzuur, 40 mL van 0,5 M EDTA (pH = 8,0), en RNase-vrij water om een totaal volume van 1 L te bereiken.
- Maak 10% (w/v) ammonium persulfate (APS). Weeg 0,5 g APS af en voeg 3 mL RNase-vrij water toe om de vaste stof op te lossen. Voeg RNase-vrij water toe om een totaal volume van 5 mL te bereiken. Wikkel de buis in folie en bewaar de oplossing op 4 °C.
OPMERKING: Opgeloste APS vervalt na verloop van tijd. Vervang de 10% APS voorraad om de 2 weken.
- Verkrijg polynucleotide kinase enzym.
- Verwerf zuiver Las1-Grc3 PNK enzym2 opgeslagen in Reaction Buffer (zie stap 1.1.1) in een voorraadconcentratie van 20 μM. De opslagbuffer is afhankelijk van de specifieke PNK.
- Bereid nucleïnezuur substraat.
OPMERKING: Dit protocol controleert 5'-fosforylatie van een 27 nt RNA-substraat dat de Las1-Grc3-verwerkingslocatie (C2-site) herbergt die zich in de Saccharomyces cerevisiae pre-ribosomal intern getranscribeerd spacer 2 (SC-ITS2; zie tabel 1)2,25,26.- Chemisch synthetiseren een RNA oligonucleotide substraat met een 5'-hydroxyl einde samen met een 3'fluorescerend label. De fluorofophore zal worden gebruikt voor de visualisatie van het RNA. Zorg ervoor dat de fluorofophore is geplaatst op het RNA-uiteinde dat niet is gericht op fosforylatie. Als alternatief voor commerciële bronnen kan interne en terminal fluorescerende etikettering van RNA substraten in eigen huis worden uitgevoerd met behulp van kosteneffectieve protocollen27.
- Verwijder overtollige fluorofoforeren uit de RNA-etiketteringsreactie van HPLC-zuivering28.
- Resuspend de lyophilized RNA met behulp van RNase-vrij water tot 500 nM.
- Sla RNA-aliquots op bij -80 °C voor langdurige opslag of -20 °C voor opslag op korte termijn.
- Bereid de ATP-concentratiereeks voor.
- Maak een werkvoorraad van 20 mM van ATP met behulp van Reaction Buffer (zie stap 1.1.1). Gebruik deze werkvoorraad om vier seriële verdunningen te genereren, variërend van 20 mM-0,02 mM.
- Om de eerste verdunning van de concentratiereeks te maken, mengt u 1 μL van de 20 mM ATP-werkvoorraad met 9 μL reactiebuffer. Dit zal resulteren in een 10-voudige verdunning van de ATP met een uiteindelijke concentratie van 2 mM.
- Gebruik de 2 mM ATP-voorraad gegenereerd in stap 1.4.2 om de volgende verdunning in de concentratiereeks te maken. Meng 1 μL van de 2 mM ATP-voorraad met 9 μL reactiebuffer. Dit zal een nieuwe ATP voorraadconcentratie van 0,2 mM maken.
- Blijf 1 μL van de vorige ATP-voorraad verdunnen met 9 μL reactiebuffer om de daaropvolgende ATP-voorraad in de concentratiereeks te maken.
2. In vitro RNA kinase reactie
OPMERKING: Deze test kan worden gebruikt om verschillende variabelen te meten, zoals tijd, nucleotideniveaus of enzymconcentratie. Het doel van dit experiment is om de hoeveelheid fosforylated RNA te beoordelen in aanwezigheid van constante Las1-Grc3 complexe en verschillende ATP niveaus.
- Combineer voor elke RNA-enzym kinasereactie 1 μL van 500 nM RNA substraat, 8,3 μL van 130 nM Las1-Grc3 en 0,2 μL van 5 mM EDTA.
OPMERKING: Bereid bij het uitvoeren van verschillende reacties een hoofdvoorraad van het RNA-enzymmengsel en aliquot 9,5 μL van deze mastermix voor op elke reactiebuis. - Start de test.
- Stel het hitteblok in op 37 °C.
- Meng met intervallen van 10 s 0,5 μL van één ATP-ondervoorraad uit de ATP-concentratiereeks die in stap 1.4 wordt bereid met één RNA-enzymmengsel en plaats de reactie in het 37 °C-warmteblok.
OPMERKING: Voeg 0,5 μL reactiebuffer in plaats van ATP toe aan één RNA-enzymmengsel voor een PNK-negatieve controle. Gebruik ook een andere noodzakelijke controle (d.w.z. RNA-substraat bij afwezigheid van PNK-enzym). - Broed de reacties 60 min bij 37 °C uit.
OPMERKING: Fluorescerend gelabeld RNA is lichtgevoelig; bedek daarom de reacties met folie. - Met dezelfde volgorde als in stap 2.2.2, blus elke reactie om de 10 s door de reactie te spiking met 10 μL ureum ladingskleurstof (zie stap 1.1.2).
OPMERKING: Naast 4 M ureum kan bij deze stap proteinase K worden toegevoegd om het enzym te degraderen. Volg de instructies van de leverancier om de vereiste protease bedrag en reactievoorwaarden te bepalen. - Gebruik de gebluste in vitro RNA kinase reacties onmiddellijk voor downstream analyse (zie sectie 3) of bewaar op -20 °C om op een later tijdstip te analyseren.
3. Gel elektroforese
- Bereid 15% acrylamide/8 M ureum gel oplossing.
LET OP: Acrylamide moet met zorg worden behandeld, omdat het een neurotoxine is. Draag altijd handschoenen, een labjas en een bril bij het hanteren ervan.- Combineer in een glazen bekerglas van 150 mL 22,5 mL voorgemengde 40% acrylamide/bis-acrylamide 29:1 oplossing, 6 mL van 10x TBE (zie stap 1.1.3), 28,8 g ureum en RNase-vrij water tot een totaal volume van 59 mL. Roer de oplossing voorzichtig door.
OPMERKING: Afhankelijk van de lengte van het RNA-substraat kan het wijzigen van het percentage polyacrylamide de resolutie tussen onfosfof en fosforylated RNA verbeteren. - Om het ureum op te lossen, verwarm de oplossing in de magnetron voor 20 s, roer de vloeistof, en onmiddellijk plaats de oplossing terug in de magnetron voor nog eens 20 s. Roer de oplossing voorzichtig door tot de ureum volledig oplost.
- Koel de oplossing langzaam af door het glazen bekerglas in een ondiep waterbad met koud water te plaatsen. Zorg ervoor dat het niveau van koud water rond het glazen bekerglas boven het niveau van de oplossing in het glazen bekerglas ligt. Dit zal een efficiënte warmteoverdracht bevorderen. Wacht 5 minuten.
LET OP: Ga niet verder met dit protocol als de glazen beker warm aanvoelt; het water lager moet zijn dan 25 °C. Als het na 5 minuten nog warm aanvoelt, vervang dan het water in het waterbad door vers koud water en wacht nog eens 5 minuten. - Filter en ontgeert de oplossing met behulp van een 0,22 μm wegwerpfiltratie-eenheid om deeltjes en microscopischkleine luchtbellen te verwijderen.
- Combineer in een glazen bekerglas van 150 mL 22,5 mL voorgemengde 40% acrylamide/bis-acrylamide 29:1 oplossing, 6 mL van 10x TBE (zie stap 1.1.3), 28,8 g ureum en RNase-vrij water tot een totaal volume van 59 mL. Roer de oplossing voorzichtig door.
- Giet de denaturering gel.
- Gebruik zeep en warm water om een korte en lange glasplaat te reinigen die is ontworpen voor gels met een totale afmetingen van 31,0 cm x 38,5 cm. Spray elke glasplaat met 95% ethanol en veeg het glas af om vocht te verwijderen.
LET OP: Een van de twee platen kan worden geconsliceerd om schade aan de gel te voorkomen bij het scheiden van de sandwich van de glasplaat. Deze stap is echter niet nodig omdat dit protocol is ontworpen om het RNA te visualiseren zonder de glasplaten te scheiden. - Plaats de lange glasplaat horizontaal op de top van een doos, zodat het is verhoogd van het bankje.
LET OP: Acrylamide is giftig, daarom moet het gelgiestation bedekt zijn met bankpapier dat gemorste vloeistof kan absorberen en onmiddellijk in een afvalzak kan worden geplaatst nadat de procedure is voltooid. - Plaats een schone 0,4 mm spacer langs de lange randen van de lange glasplaat.
- Leg de korte glasplaat bovenop de lange plaat en zorg ervoor dat de randen van de korte plaat, lange plaat en afstandhouders zijn uitgelijnd. Klem elke kant met behulp van drie gelijkmatig verdeelde metalen klemmen.
- Voeg 24 μL TEMED toe aan de 15% acrylamide/8 M ureumoplossing bereid in stap 3.1 en meng de oplossing.
- Voeg 600 μL van 10% (w/v) APS (zie stap 1.1.4) toe aan de oplossing in stap 3.2.5 en meng de oplossing voorzichtig.
- Giet de oplossing onmiddellijk tussen de glasplaten.
OPMERKING: Om bubbels te voorkomen, tikt u op het glas terwijl de oplossing wordt gegoten. - Voeg voorzichtig een schone, 0,4 mm, 32 goed kam aan de bovenkant van de glasplaat sandwich.
- Laat een minimum van 30 min voor de acrylamide te polymeriseren.
- Gebruik zeep en warm water om een korte en lange glasplaat te reinigen die is ontworpen voor gels met een totale afmetingen van 31,0 cm x 38,5 cm. Spray elke glasplaat met 95% ethanol en veeg het glas af om vocht te verwijderen.
- Voer de denaturering gel.
- Stel het hitteblok in op 75 °C.
- Verwijder de metalen klemmen die de sandwich van de glasplaat bij elkaar houden en was en droog de sandwich van de glasplaat grondig.
- Plaats de sandwich van de glasplaat in het gelapparaat met de korte plaat naar binnen gericht.
- Bereid 0,5x TBE hardloopbuffer voor door 100 mL 10x TBE te combineren met 1,9 L RNase-vrij water. Voeg 600 mL van de loopbuffer toe aan de boven- en onderkamers van het gelapparaat.
- Verwijder voorzichtig de kam en spoel de putten grondig af met een spuit.
LET OP: Deze stap is van cruciaal belang voor het verwijderen van ureum uit de putten. - Pre-run de gel voor 30 min op 50 W. Spanning is ongeveer 2.000 V.
LET OP: Dit gelapparaat werkt met een hoog wattage en gebruikers moeten uit voorzorg tentoonstellen. - Spoel de putten grondig af met een spuit.
OPMERKING: Deze stap is van cruciaal belang voor zelfs het laden van het monster in de putten. - Pulse spin de gedoofde reacties van stap 2.2.5. Vervolgens de buizen 3 min incubeer maken op 75 °C. Herhaal de pulsspin.
- Laad onmiddellijk 10 μL monster per put en laat de gel 3 uur op 50 W lopen.
OPMERKING: Fluorescerend gelabeld RNA is lichtgevoelig; Bedek daarom het gelapparaat met folie.
- Beeld de denatureringgel voor.
- Schakel de voeding uit en laat de bovenste kamer van het gelapparaat uitlekken.
- Was en droog de buitenkant van de glazen plaat sandwich met behulp van zeep en water. Bedek de sandwich van de glasplaat met folie tijdens het transport van de gel.
- Monteer de sandwich van de glasplaat op het podium van een laserscanner die in staat is kwantitatieve en gevoelige fluorescentiedetectie te detecteren.
LET OP: Deze gel is extreem dun voor maximale resolutie. Om deze reden is dit protocol ontworpen om de moeilijkheden van het verwijderen van de gel uit de sandwich van de glasplaat te voorkomen door het fluorescerende RNA direct door de glasplaten te visualiseren. Het gebruik van commercieel verkrijgbaar laagfluorescentieglasplaten zal het vastgelegde signaal verhogen door de signaal-ruisverhouding te verbeteren. - Stel de excitatie en emissiegolflengten van de laserscanner in op de gewenste fluorofofoër.
LET OP: De optimale opwinding en emissiegolflengten kunnen verschillen voor specifieke fluoroforen. Voor de FAM fluorofoof zijn de excitatie- en emissiegolflengten respectievelijk 495 nm en 535 nm. - Definieer het gebied dat moet worden gevisualiseerd op de laserscannerfase en beeld de gel volgens de instructies van de fabrikant (figuur 1).
4. Beeldanalyse en signaalkwantificering
- Laad de digitale gelafbeelding die in stap 3.4.5 is verkregen in beeldprocessoftware (zie Tabel van materialen).
- Klik met de linkerknop van de muis op een rechthoek en sleep deze om een sjabloonvak te definiëren om de grenzen op de digitale gelafbeelding te markeren die wordt gebruikt om elke RNA-band te kwantificeren. De RNA-band gezien in het reactiemengsel dat zich afspeelt in de afwezigheid van PNK-enzym is meestal een goede band om deze sjabloon te genereren.
OPMERKING: Om bias veroorzaakt door achtergrondsignaal te voorkomen, is het van cruciaal belang dat het gebied rondom elke RNA-band die wordt gemeten identiek is. Om deze reden is het het beste om dezelfde sjabloon vak te gebruiken om elke RNA-band af te bakenen. - Open de ROI-manager onder' Hulpmiddelen'en markeer de positie van het sjabloonvak door opToevoegen teklikken.
OPMERKING: Kwantificeringsprogramma's kunnen ook automatisch vakken tekenen volgens de handleiding van de softwaregebruiker. - Klik met de linkerknop van de muis op het sjabloonvak en sleep het naar de volgende RNA-band en herhaal stap 4.3. Continute dit proces totdat de positie van alle niet-phosphorylated en fosforylated RNA banden in elke reactie zijn gemarkeerd.
- Meet de geïntegreerde dichtheid in elk vak door te klikken op "Measure" in de ROI Manager.
- Om de relatieve hoeveelheid fosforylated RNA in een reactie te berekenen, verdeelt u de geïntegreerde dichtheid van de fosforgeyleerde RNA-band door de som van de geïntegreerde dichtheden van de niet-phosphorylated en fosforylated RNA-banden van dezelfde reactie. Deze benadering kan ook worden toegepast om de relatieve hoeveelheid onfosfoforylated RNA te berekenen.
- Om de accumulatie van fosforylated RNA-product en de overeenkomstige uitputting van het niet-phosphorylated RNA-substraat over de ATP-concentratiereeks te visualiseren, wordt de relatieve hoeveelheid RNA, berekend in stap 4.6, afgezet tegen de concentratie ATP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een succesvolle representatieve denaturerende gel van een titratie van ATP met een vaste hoeveelheid Las1-Grc3 complex wordt weergegeven in figuur 1. Toevoeging van enzym resulteerde in Las1-gemedieerd RNA decolleté van het SC-ITS2 RNA substraat, wat leidde tot een gedefinieerd RNA-fragment (5-OH C2 RNA). Na toevoeging van ATP werd het C2 RNA-fragment gefossyleerd door Grc3 PNK (5-P C2 RNA). Bij denatureringsgels migreert het fosforyleerde RNA sneller dan zijn ongefoscipeerde tegenhanger. Zoals blijkt uit figuur 2,kan fosforylatie van het C2 RNA-fragment worden gevisualiseerd door de relatieve hoeveelheid ongefosfofyleerde en fosforyleerde C2 RNA tegen de ATP-concentratie in kaart te brengen. Grc3 PNK fosforyleerde ook de 5-end van het onbesneden SC-ITS2 substraat, zij het in een lager tempo. Dit bevestigt eerdere werkzaamheden suggereert Grc3 PNK toont substraat voorkeur voor zijn C2 RNA substraat24. Een mislukte denatureringsgel wordt weergegeven in figuur 3. Deze gel was niet succesvol omdat het 21 nt RNA substraat afbraakproducten bevatte (Figuur 3, eerste rijstrook). Deze afbraakproducten overlapten met het fosforyleerde product en maakten het onmogelijk om fosforylatie nauwkeurig te kwantificeren. Het kortste RNA-afbraakproduct(figuur 3, grijze pijlen) kon daarentegen met succes worden geanalyseerd omdat dit gebied van de gel geen extra RNA-soorten bevatte die een nauwkeurige kwantificering van zijn fosforyleerde tegenhanger belemmerden. Om RNA-afbraakbanden te voorkomen, houdt u de werkruimte en oplossingen RNase-vrij en beperkt u het aantal RNA-vriesdooicycli.
Figuur 1: Voorbeeld van deatureringgelanalyse van fosforylated RNA. In vitro RNA kinase test van Las1-Grc3 (110 nM) geïncubeerd met 500 nM SC-ITS2 RNA. X markeert de controlereactie zonder Las1-Grc3 en de zwarte driehoek vertegenwoordigt de titratie van ATP van 0-10 mM. C2 RNA is het resultaat van SC-ITS2 RNA decolleté door de Las1 nuclease en is het endogene substraat voor Grc3 PNK activiteit. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Kwantificering van RNA-fosforylatie. Densiometrische plot van Las1-Grc3 RNA kinase activiteit uitgedrukt als een percentage van onfosforylated C2 RNA (grijze lijn; 5-OH C2 RNA) en fosforylated C2 RNA (bruine lijn; 5-P C2 RNA) over een ATP-concentratiereeks. Foutbalken markeren de standaardafwijking van drie onafhankelijke technische replicaties. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Voorbeeld van een mislukte deatureringgelanalyse van fosforylated RNA. In vitro RNA kinase test van T4 PNK (0-0,625 U) geïncubeerd met 5 μm 21 nt RNA. X markeert de controlereactie zonder T4 PNK. Deze RNA-controle bevat alleen gedegradeerde RNA-producten die het onmogelijk maken om het 21 nt fosforyleerde product te onderscheiden van het afbraakproduct (zwarte pijlen). Fosforylatie van het kortste RNA-afbraakproduct (grijze pijlen) kan worden geanalyseerd, omdat er geen dedradatieproducten zijn die overlappen met de fosforylated tegenhanger. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Reeks (5'→3') | Oligo-code | Bron | |
| SC-ITS2 | GUCGUUUUAGGUUUUAC CAACUGCGGC/36-FAM/ |
mp 911 | (Pillon et al. NSMB 2019) 26. |
| C2 RNA | GGUUUUACCAACUG CGGC/36-FAM/ |
N/a | Las1 decolleté product van SC-ITS2 |
| 21-nt | ACGUACGCGGAA UACUUCGAA/36-TAMSp/ |
mp 596 | (Pillon et al. RNA, 2018) 24. |
Tabel 1: Fluorescerend gelabelde RNA-substraten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beschreven is een test om kinase activiteit van Grc3 PNK te meten op fluorescerend gelabelde nucleotide substraten. Dit protocol kan worden toegepast om andere PNK enzymen te karakteriseren door de Reaction Buffer en oligonucleotide substraat aan te passen. Het protocol vraagt bijvoorbeeld om een traceerbedrag van EDTA. De toevoeging van EDTA is gunstig om twee redenen: Ten eerste, deze aanpak bevordert magnesium-gebonden Grc3 door te voorkomen dat het enzym te binden om hoeveelheden vervuilende metalen in het mengsel te traceren. Ten tweede remt een kleine hoeveelheid EDTA de activiteit van vervuilende metaalafhankelijke ribonucleases zonder de activiteit van de bijbehorende Las1 metaalonafhankelijke ribonuclease te verstoren. De concentratie van EDTA kan worden gewijzigd afhankelijk van de bron van de specifieke PNK. Deze test biedt ook een voordeel ten opzichte van traditionele PNK fosforylatietesten die afhankelijk zijn van oligonucleotiden gelabeld met korte halfwaardetijd radio-isotopen (dat wil zeggen, 2 week halfwaardetijd voor fosfor-32). Dit protocol kan worden aangepast om specifieke enzymactiviteit en Michaelis-Menten kinetiek te meten en de afhankelijkheid van fosforylatie te bepalen op verschillende parameters, zoals de aard van de nucleotiden, substraten en metaalionen.
Dit protocol is gebaseerd op het uitvoeren van grote denaturering polyacrylamide gels om voldoende resolutie te bereiken om een onfosforylated substraat te onderscheiden van zijn fosforylated product. Gieten en hanteren van deze gels zijn cruciale stappen in het protocol. Zo moet de acrylamideoplossing worden verwarmd om het ureum op te lossen en vervolgens langzaam worden gekoeld voordat de gel wordt gegoten. Het te snel koelen van deze oplossing kan leiden tot de vorming van kristallen. Zorg moet ook worden genomen om te voorkomen dat de invoering van luchtbellen en stof tijdens het gieten en het instellen van de gel. Beeldvorming van de gel zonder het verwijderen van de glazen platen wordt aanbevolen om te voorkomen dat rippen van de gel, die is dun en moeilijk te hanteren eenmaal verwijderd uit de glazen platen.
Dit protocol kan worden aangepast om de fosforylatie van verschillende grootte oligonucleotide substraten te meten. Deze specifieke test gebruikte een 15% acrylamide gel om een resolutie van fosforylatie van 27 nt (SC-ITS2 RNA) en 18 nt (C2 RNA) substraten te bereiken. De toevoeging van één fosfaatgroep aan het 5-eind van SC-ITS2 RNA zorgt voor een bescheiden verschuiving ten opzichte van de mobiliteitsverandering die wordt veroorzaakt bij 5-fosforylatie van het kortere C2 RNA (figuur 1). Dit benadrukt een beperking in RNA lengte bij het gebruik van deze techniek. Met langere RNA-substraten wordt de bijdrage van een fosfaatgroep aan het totale moleculaire gewicht van de RNA-soorten verminderd. Om deze reden kan het percentage acrylamide en de gellooptijd worden geoptimaliseerd om de resolutie van verschillende substraten van verschillende grootte29te bereiken. In het algemeen worden hogere percentages acrylamide gebruikt voor kleinere oligonucleotide substraten, terwijl lagere percentages acrylamide (tot 8%) zorgen voor een betere resolutie van grotere oligonucleotide substraten.
De belangrijkste beperking van deze test is dat het een lage doorvoer is. Gieten en uitvoeren van denaturering gels duurt een aanzienlijke hoeveelheid tijd, het beperken van het aantal gels en monsters die kunnen worden geanalyseerd in een dag. Een toekomstige toepassing om deze beperking te overwinnen zou de ontwikkeling kunnen zijn van microfluïde chips die fosforyleerde oligonucleotideproducten kunnen oplossen. Microfluidic-based gel elektroforese heeft vele voordelen ten opzichte van traditionele gel elektroforese, zoals kleinere steekproef grootte, automatisering, en snelheid. De huidige microfluïde chips hebben echter geen enkele nucleotideresolutie. Concluderend, het gebruik van denaturerende gel elektroforese om veranderde migratie van niet-radioactieve oligonucleotiden te detecteren biedt een nuttige techniek om de katalytische eisen en substraatvoorkeur van polynucleotide kinase enzymen te controleren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Dr. Andrew Sikkema en Andrea Kaminski voor hun kritische lezing van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door het Us National Institute of Health Intramural Research Program; Us National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS; ZIA ES103247 aan R.E.S) en de Canadian Institutes of Health Research (CIHR; 146626 tot M.C.P).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4 mm 34-well comb | BioRad | 1653848 | |
| 0.4 mm spacer | BioRad | 1653812 | |
| 0.5 M EDTA ph 8.0 | KD Medical | RGF-3130 | |
| 1M Magnesium Chloride | KD Medical | CAC-5290 | |
| 1M Tris pH 8.0 | KD Medical | RGF-3360 | |
| 40% Acrylamide/Bis Solution 29:1 | BioRad | 1610146 | |
| 5M Sodium Chloride | KD Medical | RGF-3720 | |
| ammonium persulfate (APS) | BioRad | 161-0700 | |
| ATP | Sigma | A2383-1G | |
| boric acid | Sigma | B0394 | |
| bromophenol blue sodium salt | Sigma | B5525-5G | |
| Glass Plates | Thomas Scientific | 1188K51 | |
| Hoefer SQ3 Sequencer | Hoefer | N/A | |
| Image J Software | N/A | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Labeled RNA oligonucleotides | IDT | Custom Order | |
| Pharmacia EPS 3500 Power Supply | Pharmacia | N/A | |
| Steriflip 0. 22 um Filter | Millipore | 5FCP00525 | |
| TEMED | BioRad | 161-0800 | |
| tris base | Sigma | TRIS-RO | |
| Typhoon FLA 9500 gel imager | GE Healthcare | N/A | |
| Ultra Pure DEPC Water | Invitrogen | 750023 | |
| Ultra Pure Glycerol | Invitrogen | 19E1056865 | |
| urea | Fisher Chemical | U15-500 |
References
- Pillon, M. C., Stanley, R. E. Nuclease integrated kinase super assemblies (NiKs) and their role in RNA processing. Current Genetics. 64 (1), 183-190 (2018).
- Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 114 (28), E5530-E5538 (2017).
- Gasse, L., Flemming, D., Hurt, E. Coordinated Ribosomal ITS2 RNA Processing by the Las1 Complex Integrating Endonuclease, Polynucleotide Kinase, and Exonuclease Activities. Molecular Cell. 60 (5), 808-815 (2015).
- Dikfidan, A., et al. RNA specificity and regulation of catalysis in the eukaryotic polynucleotide kinase Clp1. Molecular Cell. 54 (6), 975-986 (2014).
- Bernstein, N. K., et al. The molecular architecture of the mammalian DNA repair enzyme, polynucleotide kinase. Molecular Cell. 17 (5), 657-670 (2005).
- Rio, D. C. 5'-end labeling of RNA with [gamma-32P]ATP and T4 polynucleotide kinase. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (4), 441-443 (2014).
- Paredes, E., Evans, M., Das, S. R. RNA labeling, conjugation and ligation. Methods. 54 (2), 251-259 (2011).
- Hilario, E. End labeling procedures: an overview. Molecular Biotechnology. 28 (1), 77-80 (2004).
- Eastberg, J. H., Pelletier, J., Stoddard, B. L. Recognition of DNA substrates by T4 bacteriophage polynucleotide kinase. Nucleic Acids Research. 32 (2), 653-660 (2004).
- Lillehaug, J. R., Kleppe, K. Kinetics and specificity of T4 polynucleotide kinase. Biochemistry. 14 (6), 1221-1225 (1975).
- Richardson, C. C. Phosphorylation of nucleic acid by an enzyme from T4 bacteriophage-infected Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 54 (1), 158-165 (1965).
- Galburt, E. A., Pelletier, J., Wilson, G., Stoddard, B. L. Structure of a tRNA repair enzyme and molecular biology workhorse: T4 polynucleotide kinase. Structure. 10 (9), 1249-1260 (2002).
- Saito, M., et al. Large-Scale Molecular Evolutionary Analysis Uncovers a Variety of Polynucleotide Kinase Clp1 Family Proteins in the Three Domains of Life. Genome Biology Evolution. 11 (10), 2713-2726 (2019).
- Jain, R., Shuman, S. Characterization of a thermostable archaeal polynucleotide kinase homologous to human Clp1. RNA. 15 (5), 923-931 (2009).
- Weitzer, S., Hanada, T., Penninger, J. M., Martinez, J. CLP1 as a novel player in linking tRNA splicing to neurodegenerative disorders. Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 6 (1), 47-63 (2015).
- Wang, L. K., Lima, C. D., Shuman, S. Structure and mechanism of T4 polynucleotide kinase: an RNA repair enzyme. EMBO Journal. 21 (14), 3873-3880 (2002).
- Zhang, Y., Zhao, J., Chen, S., Li, S., Zhao, S. A novel microchip electrophoresis laser induced fluorescence detection method for the assay of T4 polynucleotide kinase activity and inhibitors. Talanta. 202, 317-322 (2019).
- Cui, L., Li, Y., Lu, M., Tang, B., Zhang, C. Y. An ultrasensitive electrochemical biosensor for polynucleotide kinase assay based on gold nanoparticle-mediated lambda exonuclease cleavage-induced signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 99, 1-7 (2018).
- Wang, L. J., Zhang, Q., Tang, B., Zhang, C. Y. Single-Molecule Detection of Polynucleotide Kinase Based on Phosphorylation-Directed Recovery of Fluorescence Quenched by Au Nanoparticles. Analytical Chemistry. 89 (13), 7255-7261 (2017).
- Liu, H., Ma, C., Wang, J., Chen, H., Wang, K. Label-free colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase/phosphatase activity and its inhibitors based on G-quadruplex/hemin DNAzyme. Analytical Biochemistry. 517, 18-21 (2017).
- Du, J., Xu, Q., Lu, X., Zhang, C. Y. A label-free bioluminescent sensor for real-time monitoring polynucleotide kinase activity. Analytical Chemistry. 86 (16), 8481-8488 (2014).
- Jiang, C., Yan, C., Jiang, J., Yu, R. Colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase activity based on the horseradish peroxidase-mimicking DNAzyme combined with lambda exonuclease cleavage. Analytica Chimica Acta. 766, 88-93 (2013).
- Castle, C. D., et al. Las1 interacts with Grc3 polynucleotide kinase and is required for ribosome synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 41 (2), 1135-1150 (2013).
- Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex. RNA. 24 (5), 721-738 (2018).
- Geerlings, T. H., Vos, J. C., Raue, H. A. The final step in the formation of 25S rRNA in Saccharomyces cerevisiae is performed by 5'-->3' exonucleases. RNA. 6 (12), 1698-1703 (2000).
- Pillon, M. C., et al. Cryo-EM reveals active site coordination within a multienzyme pre-rRNA processing complex. Nature Structural Molecular Biology. 26 (9), 830-839 (2019).
- Solomatin, S., Herschlag, D. Methods of site-specific labeling of RNA with fluorescent dyes. Methods in Enzymology. 469, 47-68 (2009).
- Giusti, W. G., Adriano, T. Synthesis and characterization of 5'-fluorescent-dye-labeled oligonucleotides. PCR Methods Application. 2 (3), 223-227 (1993).
- Petrov, A., Tsa, A., Puglisi, J. D. Analysis of RNA by analytical polyacrylamide gel electrophoresis. Methods in Enzymology. 530, 301-313 (2013).
