Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

תרגום לא רדיואקטיבי למדוד פוספורילציה פולינוקלאוטיד של מצעי נוקלאוטיד קטנים

Published: May 8, 2020 doi: 10.3791/61258
Automatic Translation
1, 1
1Signal Transduction Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, Department of Health and Human Services, National Institutes of Health

Summary

פרוטוקול זה מתאר תסה לא רדיואקטיבית כדי למדוד פעילות קינאז של קינאז פולינוקלאוטיד (PNKs) על מצעי DNA ו RNA קטנים.

Abstract

קינאזים פולינוקלאוטידים (PNKs) הם אנזימים כי לזליז את הפוספורילציה של 5 ' סוף הידרוקסיל של DNA ו RNA אוליגונוקליאוטידים. ניתן לכמת את הפעילות של PNKs באמצעות גישות ישירות או עקיפות. מוצג כאן היא גישה ישירה, במבחנה כדי למדוד פעילות PNK המסתמכת על פלורסנט תיוג אוליגונוקלאוטיד ואלקטרופורזה ג'ל polyacrylamide. גישה זו מספקת רזולוציה של המוצרים זרחן תוך הימנעות משימוש ב מצעים עם תייבל רדיו. הפרוטוקול מפרט כיצד להגדיר את תגובת פוספורילציה, להכין ולהפעיל ג'לים פוליקרילאמיד גדולים, ולכימת את מוצרי התגובה. החלק המאתגר ביותר מבחינה טכנית של תס"א זה הוא לשפוך ולהריץ את ג'לים פוליקרילאמיד גדולים; לפיכך, מסופקים פרטים חשובים להתגבר על קשיים נפוצים. פרוטוקול זה היה אופטימיזציה עבור Grc3, PNK מירכב לתוך מתחם עיבוד RNA pre-ribosomal מחויב עם השותף המחייב שלה, גרעין Las1. עם זאת, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם כדי למדוד את הפעילות של אנזימי PNK אחרים. יתר על כן, ניתן גם לשנות את ההתארגנות הזו כדי לקבוע את ההשפעות של רכיבים שונים של התגובה, כגון טריפוספט נוקלאוטיד, יונים מתכת, ואוליגונוקליאוטידים.

Introduction

קינאזים פולינוקלאוטידים (PNK) לשחק תפקידים קריטיים רבים DNA ו- RNA עיבוד מסלולים, כגון תיקון DNA והרכבת ריבוזום1,,2,,3,,4,,5. אנזימים בסיסיים אלה מקטנים את העברת המונופוספט של המסוף (גמא) מפרופסוף נוקלאוטיד (NTP, לרוב ATP) לקצה ההידרוקסיל של 5 אינץ' של מלת נוקלאוטיד. אחד PNKs המאופיין היטב ביותר הוא bacteriophage T4 PNK, אשר יש ספציפיות שקוע רחב והוא מנוצל בכבדות על ידי מעבדות ביולוגיה מולקולרית לשילוב תוויות איזוטופ רדיואקטיבי על 5 מסוף של DNA או RNA בטוב6, 7,8,,,9,,10,,11,,12.8 דוגמה נוספת של אנזים PNK היא CLP1, אשר נמצא Eukarya, Eubacteria, ו Archaea, והוא מעורב במספר מסלולי עיבוד RNA4,13,14,15.

מבחינה היסטורית, רוב ההתמרמרות המודדות את פעילות הקינאז הפולינוקלאוטיד תלויות בתיוג איזוטופ רדיואקטיביובאוטוביוגרפיה הבאה 5,16. בשנים האחרונות פותחו מספר בדיקות נוספות כדי למדוד את פעילות PNK, כולל גישות מולקולה אחת, אלקטרופורזה שבב, משואות מולקולריות,כמו גם צבעיםומבוססי זוהר 17,18,19,20,21,22., בעוד שרבות מהגישות החדשות הללו מספקות מגבלות זיהוי משופרות ומומנעות משימוש ברדיואקטיביות, לכל אחת מהן יש חסרונות, כגון עלות, הסתמכות על שרף משותק ומגבלות בבחירה במצוע.

Grc3 הוא קינאז polynucleotide המי משחק תפקיד מרכזי בעיבוד של RNA טרום ריבוזומאל2,,3,,23. Grc3 מהווה קומפלקס מחייב עם ה-endoribonuclease Las1, אשר מפצל את ה-Spacer הפנימי 2 (ITS2) של ה-RNA הטרום-ריבוזומל3. מחשוף של ITS2 על ידי Las1 מייצר מוצר מחסה 5 ' הידרוקסיל כי הוא לאחר מכן זרחן על ידי הקינאז Grc33. כדי לחקור את הנוקלאוטיד ואת ספציפיות מצע של Grc3, תסרוקת זולה שאיפשרה בדיקה של מצעים oligonucleotide שונים נדרש. לכן, פותחה תסרוק פוספורילציה PNK באמצעות מצעים עם תווית פלורסנטית. תסיסה זו שימשה בהצלחה כדי לקבוע כי Grc3 יכול לנצל כל NTP עבור פעילות העברת פוספוריל, אבל מעדיף ATP24. פרוטוקול זה מתאים את ההסכם המקורי כדי למדוד את פעילות PNK של Grc3 על חיקוי RNA של העיבוד הטרום-ריבוזומאלי שלו RNA (SC-ITS2, טבלה 1). אחד ההיבטים המאתגרים של גישה זו מבוססת פלואורסץ הוא ההסתמכות על ג'לים פוליאקרילאמיד גדולים כדי לפתור ביעילות מצעים זרחן ולא זרחן. הפרוטוקול מספק פרטים ספציפיים על איך לשפוך ג'לים גדולים אלה ולהימנע מלכודות נפוצות בעת ביצוע פעולה זו.

עבודה עם RNA דורשת טיפול מסוים כי הוא רגיש מאוד להשפלה. ישנם צעדי מניעה פשוטים שניתן לנקוט כדי להגביל את זיהום ריבונוקלאז. תחנת עבודה נפרדת RNA שניתן לטפל בה בקלות עם חומר ניקוי המכיל מעכב RNase היא לעתים קרובות מועילה. יש צורך ללבוש כפפות תמיד בעת טיפול בדגימות ושימוש בחומרים מתכלים מאושרים ללא RNase. מכיוון שהמים הם מקור נפוץ נוסף לזיהום, עדיף להשתמש במים מטוהרים טריים ולחטא את כל הפתרונות באמצעות מסנן 0.22 μm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנה

  1. הכן מאגר ים ותריגנטים.
    1. להפוך 1x מאגר תגובה על ידי שילוב 20 μL של 1 M Tris (pH = 8.0), 40 μL של 5 M נתרן כלוריד, 2.5 μL של 2 M מגנזיום כלוריד, 100 μL של 50% (v /v) גליצרול, ומים RNase ללא להגיע נפח כולל של 1 mL.
    2. להפוך את אוריאה טעינת צבע על ידי שילוב 4.8 גרם של אוריאה, 200 μL של 1 M Tris (pH = 8.0), 20 μL של 0.5 M EDTA (pH = 8.0), 0.5 מ"ל של 1% (w / v) ברומונול כחול, ומים RNase ללא להגיע לנפח כולל של 10 מ"ל.
    3. הפוך את מאגר TBE 10x על-ידי שילוב 108 גרם של בסיס Tris, 55 גרם של חומצה בור, 40 מ"ל של 0.5 M EDTA (pH = 8.0), ומים ללא RNase כדי להגיע לנפח כולל של 1 L.
    4. להפוך 10% (w / v) אמוניום שכנוע (APS). לשקול 0.5 גרם של APS ולהוסיף 3 מ"ל של מים ללא RNase כדי להמיס את המוצק. הוסף מים ללא RNase כדי להגיע לנפח כולל של 5 מ"ל. עוטפים את הצינור בנייר כסף ומאחסנים את הפתרון ב-4°C.
      הערה: APS מומס נרקב לאורך זמן. החלף את מניית APS ב-10% כל שבועיים.
  2. להשיג אנזים קינאז פולינוקלאוטיד.
    1. לרכוש טהור Las1-Grc3 PNKאנזים 2 מאוחסן מאגר תגובה (ראה שלב 1.1.1) בריכוז מלאי של 20 μM. מאגר האחסון ישתנה בהתאם ל- PNK הספציפי.
  3. הכן את החומצה הגרעינית.
    הערה: פרוטוקול זה מפקח על 5'-phosphorylation של 27 nt RNA מסעדה המקיש את אתר העיבוד Las1-Grc3 (אתר C2) הכלול בתוך Saccharomyces cerevisiae pre-ribosomal פנימי תמלול רווח 2 (SC-ITS2; ראה טבלה 1)2,25,26.
    1. לסנתז כימית את הצוללת RNA אוליגונוקלאוטיד המכילה קצה הידרוקסיל 5'-הידרוקסיל יחד עם תווית 3'-פלורסנט. הפלואורופור ישמש להדמיה של ה-RNA. ודא כי פלואורופור ממוקם בקצה RNA כי אינו ממוקד עבור פוספורילציה. כחלופה למקורות מסחריים, ניתן לבצע תיוג פלורסנט פנימי ומסוף של מצעי RNA בתוך הבית באמצעות פרוטוקוליםחסכוניים 27.
    2. הסר פלואורופור עודף מתגובת תיוג RNA על-ידי HPLC-טיהור28.
    3. תוסתה מחדש את ה-RNA הליופי באמצעות מים ללא RNase ל-500 000 000 000 00:00:00,000 -------------------------------
    4. אחסן 10 אלציטוט RNA ב- -80°C לאחסון לטווח ארוך או -20°C לאחסון לטווח קצר.
  4. הכן את סדרת ריכוז ATP.
    1. הפוך את מלאי עבודה של 20 mM של ATP באמצעות מאגר תגובה (ראה שלב 1.1.1). השתמש במלאי עובד זה כדי ליצור ארבעה דילולים טוריים הנעים בין 20 mM-0.02 mM.
    2. כדי לבצע את דילול הראשון של סדרת הריכוז, לערבב 1 μL של 20 mM ATP עובד מניות עם 9 μL של מאגר תגובה. כתוצאה מכך דילול פי 10 של ATP עם ריכוז סופי של 2 מ"מ.
    3. השתמש במלאי ATP של 2 מ"מ שנוצר בשלב 1.4.2 כדי לבצע דילול הבא בסדרת הריכוז. לערבב 1 μL של 2 mM ATP מניות עם 9 μL של מאגר תגובה. זה יעשה ריכוז מניות ATP חדש של 0.2 mM.
    4. המשך דילול 1 μL של מניית ATP הקודמת עם 9 μL של מאגר תגובה כדי להפוך את מניית ATP עוקבות בסדרת הריכוז.

2. במבחנה RNA קינאז תגובה

הערה: ניתן להשתמש בהנאה זו כדי למדוד מספר משתנים כגון זמן, רמות נוקלאוטיד או ריכוז אנזימים. מטרת הניסוי היא להעריך את כמות RNA זרחן בנוכחות קבוע Las1-Grc3 מורכב ורמות ATP שונות.

  1. עבור כל תגובה קינאז RNA-אנזים, לשלב 1 μL של 500 nM RNA substrate, 8.3 μL של 130 nM Las1-Grc3, ו 0.2 μL של 5 mM EDTA.
    הערה: אם ביצוע מספר תגובות, להכין מלאי ראשי של תערובת RNA-אנזים aliquot 9.5 μL של תערובת מאסטר זה לכל צינור תגובה.
  2. תתחיל עם ההתנייעות.
    1. הגדר את בלוק החום ל- 37 °C.
    2. במרווחי זמן של 10 שניות, לערבב 0.5 μL של תת-סטוק ATP אחד מסדרת ריכוז ATP מוכן בשלב 1.4 עם תערובת אחת RNA-אנזים ולמקם את התגובה בבלוק חום 37 מעלות C.
      הערה: הוסף 0.5 μL של מאגר תגובה במקום ATP לתערובת אחת RNA-אנזים עבור שליטה שלילית PNK. השתמש בפקד הכרחי אחר גם (כלומר, פגם RNA בהיעדר אנזים PNK).
    3. דגירה את התגובות במשך 60 דקות ב 37 °C.
      הערה: RNA עם תווית פלורסנטית הוא רגיש לאור; לכן, לכסות את התגובות עם רדיד.
    4. באמצעות אותו סדר כמו בשלב 2.2.2, להרוות כל תגובה כל 10 s על ידי spiking התגובה עם 10 μL של צבע טעינת אוריאה (ראה שלב 1.1.2).
      הערה: בנוסף 4 M urea, חלבון K עשוי להתווסף בשלב זה כדי להשפיל את האנזים. בצע את ההוראות שסופקו על-ידי הספק כדי לקבוע את כמות הפרוטאז הנדרשת ואת תנאי התגובה.
    5. השתמש במבחנה מרווה במבחנה קינאז תגובות מיד לניתוח במורד הזרם (ראה סעיף 3) או לאחסן ב -20 °C כדי להיות מנותח במועד מאוחר יותר.

3. אלקטרופורזה ג'ל

  1. הכן 15% acrylamide / 8 M תמיסת ג'ל אוריאה.
    התראה: Acrylamide חייב להיות מטופל בזהירות, כי זה רעלן עצבי. תמיד ללבוש כפפות, חלוק מעבדה, ומגן בעת טיפול בו.
    1. ב זכוכית 150 מל, לשלב 22.5 מל של premixed 40% acrylamide / bis-acrylamide 29:1 פתרון, 6 מל של 10x TBE (ראה שלב 1.1.3), 28.8 גרם אוריאה, ומים RNase חינם לנפח כולל של 59 מל. מערבבים בעדינות את התמיסה.
      הערה: בהתאם לאורך ה-RNA, שינוי אחוז הפוליאקרילאמיד עשוי לשפר את הרזולוציה בין RNA לא זרחן לבין RNA זרחן.
    2. כדי להמיס את אוריאה, מחממים את התמיסה במיקרוגל ל-20 ש', מערבבים את הנוזל ומזרים מיד את התמיסה בחזרה למיקרוגל ל-20 שניות נוספות. מערבבים בעדינות את התמיסה עד שהתריאה נמסה לחלוטין.
    3. לאט לאט לקרר את הפתרון על ידי הצבת הזכוכית לתוך אמבט מים רדודים המכיל מים קרים. ודא כי רמת המים הקרים המקיפים את הזכוכית היא מעל רמת הפתרון בתוך הזכוכית. זה יקדם העברת חום יעילה. חכה 5 דקות.
      הערה: אל תמשיך בפרוטוקול זה אם הזכוכית מרגישה חמה; המים צריכים להיות מתחת 25 מעלות צלזיוס. אם זה עדיין מרגיש חם אחרי 5 דקות, אז להחליף את המים באמבט המים עם מים קרים טריים ולחכות עוד 5 דקות.
    4. לסנן degas הפתרון באמצעות יחידת סינון חד פעמית 0.22 μm כדי להסיר חלקיקים ובועות אוויר מיקרוסקופיות.
  2. יוצקים את הג'ל הנוקב.
    1. השתמשו בסבון ומים חמים כדי לנקות צלחת זכוכית קצרה וארוך המיועדת לג'לים עם ממדים כוללים של 31.0 ס"מ על 38.5 ס"מ. מרססים כל צלחת זכוכית עם 95% אתנול ומנגבים את הזכוכית כדי להסיר לחות.
      הערה: אחת משתי הצלחות יכולה להיות סיליקון כדי למנוע נזק לג'ל בעת הפרדת כריך צלחת הזכוכית. עם זאת, שלב זה אינו נחוץ מכיוון פרוטוקול זה נועד לדמיין את RNA מבלי להפריד את לוחות הזכוכית.
    2. מניחים את צלחת הזכוכית הארוכה אופקית על גבי קופסה כך שהיא מורמת מעל הספסל.
      התראה: Acrylamide הוא רעיל, ולכן תחנת שפיכת הג'ל חייב להיות מכוסה בנייר ספסל שיכול לספוג כל נוזל שנשפך ולהיות ממוקם באופן מיידי בשקית פסולת לאחר השלמת ההליך.
    3. מניחים מקשר נקי 0.4 מ"מ לאורך הקצוות הארוכים של לוח הזכוכית הארוך.
    4. מניחים את צלחת הזכוכית הקצרה על הצלחת הארוכה ומוודאים שקצוות הצלחת הקצרה, הלוח הארוך והשטחים מיושרים. מהדקים כל צד באמצעות שלושה מהדקי מתכת במותך שווה.
    5. הוסף 24 μL של TEMED לפתרון 15% acrylamide/8 M אוריאה מוכן בשלב 3.1 ולערבב את הפתרון.
    6. הוסף 600 μL של 10% (w/v) APS (ראה שלב 1.1.4) לפתרון בשלב 3.2.5 ולערבב בעדינות את הפתרון.
    7. מיד יוצקים את הפתרון בין צלחות הזכוכית.
      הערה: כדי למנוע בועות, הקש על הזכוכית בזמן מוזג הפתרון.
    8. בזהירות להוסיף נקי, 0.4 מ"מ, 32 גם מסרק לראש כריך צלחת זכוכית.
    9. אפשר מינימום של 30 דקות עבור אקרילאמיד פולימר.
  3. תריץ את הג'ל הנוקב.
    1. הגדר את בלוק החום ל- 75 °C.
    2. הסר את מהדקי המתכת המחזיקים יחד את כריך צלחת הזכוכית ושוטפים ביסודיות ויבשים את כריך צלחת הזכוכית.
    3. מניחים את כריך צלחת הזכוכית לתוך אפליקציית הג'ל עם צלחת קצרה פונה פנימה.
    4. הכן מאגר פועל של 0.5x TBE על-ידי שילוב של 100 מ"ל של TBE של 10x עם מים ללא RNase של 1.9 L RNase. הוסף 600 מ"ל של מאגר הריצה לתאים העליונים והתוארים של אפליקציית הג'ל.
    5. מסירים בעדינות את המסרק וצורף היטב את הבארות באמצעות מזרק.
      הערה: שלב זה הוא קריטי להסרת אוריאה מהבארות.
    6. הפעל מראש את הג'ל במשך 30 דקות ב- 50 W. מתח הוא כ 2,000 V.
      התראה: אפליקציית ג'ל זו פועלת בהספק גבוה ועל המשתמשים להפגין אמצעי זהירות.
    7. יש לשטוף את הבארות ביסודיות באמצעות מזרק.
      הערה: שלב זה הוא קריטי אפילו לטעינת דגימה לתוך הבארים.
    8. הדופק מסובב את התגובות המיוות ממדרגה 2.2.5. לאחר מכן דגירה את הצינורות ב 75 ° C במשך 3 דקות. חזור על סיבוב הדופק.
    9. מיד לטעון 10 μL של מדגם לכל טוב ולהפעיל את הג'ל במשך 3 שעות ב 50 W.
      הערה: RNA עם תווית פלורסנטית הוא רגיש לאור; לכן, לכסות את אפליקציית הג'ל בנייר כסף.
  4. דמיין את הג'ל הנוקב.
    1. כבה את ספק הכוח ורוקן את התא העליון של מערכת הג'ל.
    2. לשטוף וייבש את הצד החלקי של כריך צלחת הזכוכית באמצעות סבון ומים. מכסים את כריך צלחת הזכוכית בנייר כסף תוך כדי הובלת הג'ל.
    3. הר את כריך צלחת הזכוכית על הבמה של סורק לייזר המסוגל לזיהוי פלואורסצנס כמותי ורגיש.
      הערה: ג'ל זה הוא דק מאוד עבור רזולוציה מקסימלית. מסיבה זו, פרוטוקול זה נועד למנוע את הקשיים של הסרת הג'ל מסנדוויץ צלחת הזכוכית על ידי הדמיה ישירה RNA תיוג פלורסנט דרך צלחות הזכוכית. השימוש של לוחות זכוכית פלואורסצנס נמוך זמין מסחרי תגביר את האות שנתפסו על ידי שיפור יחס אות לרעש.
    4. הגדר את אורכי הגל של העירור והפליטה של סורק הלייזר עבור הפלואורופור הרצוי.
      הערה: אורכי הגל של העירור והפליטה האופטימליים עשויים להיות שונים עבור פלואורופורים ספציפיים. עבור פלואורופור FAM, אורכי גל העירור והפליטה הם 495 נה"מ ו- 535 נה"מ, בהתאמה.
    5. הגדר את האזור כך שיזוין על במת סורק הלייזר ותמונה הג'ל בהתאם להוראות היצרן (איור 1).

4. ניתוח תמונה וכמות אותות

  1. טען את תמונת הג'ל הדיגיטלית שנרכשה בשלב 3.4.5 לתוכנת תחינת תמונה (ראה טבלת חומרים).
  2. באמצעות הלחצן השמאלי של העכבר, לחץ וגרור מלבן כדי להגדיר תיבת תבנית כדי לסמן את הגבולות בתדמית הג'ל הדיגיטלית שישמש לכמת כל רצועה RNA. להקת RNA לראות את תערובת התגובה להגדיר בהיעדר אנזים PNK היא בדרך כלל להקה טובה כדי ליצור תבנית זו.
    הערה: כדי למנוע הטיה הנגרמת על-ידי אות רקע, חשוב שהאזור המקיף כל רצועה RNA הנמדדת זהה. מסיבה זו, עדיף להשתמש באותה תיבת תבנית כדי לפענח כל רצועה RNA.
  3. פתח את מנהל ההחזר על ההשקעה תחת "כלים" וסמן את מיקום תיבת התבנית על-ידי לחיצה על "הוסף".
    הערה: תוכניות כמות יכולות גם לצייר תיבות באופן אוטומטי בהתאם למדריך למשתמש של התוכנה.
  4. באמצעות הלחצן השמאלי של העכבר, לחץ וגרור את תיבת התבנית אל פס ה- RNA הבא וחזור על שלב 4.3. המשיכו בתהליך זה עד שהמיקום של כל להקות ה-RNA הלא פוספוריות והזרחן בכל תגובה סומנו.
  5. מדוד את הצפיפות המשולבת בתוך כל תיבה על-ידי לחיצה על "מידה" ב-ROI Manager.
  6. כדי לחשב את הכמות היחסית של RNA זרחן בתגובה, לחלק את הצפיפות המשולבת של פס RNA זרחן על ידי סכום הצפיפות המשולבת של להקות RNA לא זרחן זרחן מאותה תגובה. ניתן להחיל גישה זו גם כדי לחשב את הכמות היחסית של RNA לא זרחן.
  7. כדי לדמיין את ההצטברות של מוצר RNA זרחן ואת הדלדול המתאים של RNA לא זרחן על פני סדרת ריכוז ATP, להתוות את הכמות היחסית של RNA מחושב בשלב 4.6 נגד הריכוז של ATP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ג'ל מייצג מוצלח של טיתור של ATP עם כמות קבועה של קומפלקס Las1-Grc3 מוצג באות 1. תוספת של אנזים הביאה למחשוף RNA בתיווך Las1 של ה-SC-ITS2 RNA, מה שהוביל לשבר RNA מוגדר (5-OH C2 RNA). עם התוספת של ATP, שבר RNA C2 היה זרחן על ידי Grc3 PNK (5-P C2 RNA). בג'לים denaturing RNA זרחן נודד מהר יותר מאשר מקבילו לא זרחן. כפי המוצג באות 2, פוספורילציה של שבר RNA C2 ניתן לדמיין על ידי התוויית הכמות היחסית של RNA C2 זרחן זרחן נגד ריכוז ATP. Grc3 PNK גם phosphorylated 5-end של הצוללת הלא מלוטשת SC-ITS2, אם כי בשיעור נמוך יותר. זה מאשר עבודה קודמת מציע Grc3 PNK מראה העדפת פרוצה כלפי שלה C2 RNA פרוצה24. ג'ל denaturing לא מוצלח מוצג איור 3. ג'ל זה לא הצליח כי ה-21 nt RNA מכיל מוצרי השפלה(איור 3,נתיב ראשון). מוצרים אלה השפלה חופפים עם המוצר זרחן ועשה את זה בלתי אפשרי לכמת פוספורילציה במדויק. לעומת זאת, ניתן לנתח בהצלחה את מוצר ההשפלה הקצר ביותר של RNA(איור 3,חצים אפורים), משום שאזור זה של הג'ל לא הכיל מינים נוספים של RNA שעכבו כימות מדויקת של מקבילו הזרחני. כדי להימנע מרצועות השפלה של RNA, שמור על סביבת העבודה והפתרונות ללא RNase והגביל את מספר מחזורי ההפשרה של RNA.

Figure 1
איור 1: דוגמה לניתוח ג'ל denaturing של RNA זרחן. במבחנה RNA kinase תסה של Las1-Grc3 (110 nM) דגירה עם 500 nM SC-ITS2 RNA. X מסמן את תגובת הבקרה ללא Las1-Grc3 והמשולש השחור מייצג את הטיתור של ATP מ- 0-10 mM. C2 RNA הוא תוצאה של מחשוף RNA SC-ITS2 על ידי גרעין Las1 והוא השקוע אנדוגני עבור פעילות Grc3 PNK. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: כימות פוספורילציה של RNA. העלילה Densiometric של פעילות קינאז RNA Las1-Grc3 מבוטא כאחוז של RNA C2 לא זרחן (קו אפור; 5-OH C2 RNA) ו RNA C2 זרחן (קו חום; 5-P C2 RNA) על פני סדרת ריכוז ATP. קווי שגיאה מסמנים את סטיית התקן משלושה משכפלים טכניים עצמאיים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: דוגמה לניתוח ג'ל לא מוצלח של RNA זרחן. במבחנה RNA kinase תסחוב של T4 PNK (0-0.625 U) דגירה עם 5 μm 21 nt RNA. X מסמן את תגובת הבקרה ללא T4 PNK. פקד RNA זה מכיל רק מוצרי RNA מושפלים שלא מאפשרים להבחין בין המוצר ה-21 nt phosphorylated לבין מוצר ההשפלה (חצים שחורים). ניתן לנתח Phosphorylation של מוצר ההשפלה RNA הקצר ביותר (חצים אפורים), מכיוון שאין מוצרי dedradation החופפים עם מקבילו זרחן. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

רצף (1.→3 אינ' ) אוליגו קוד מקור
SC-ITS2 גוגואוגאוגואואק
- CAACUGCGGC / 36-FAM /		 ת"א 911 (פילון ואח ' NSMB 2019) 26 00:00:
C2 RNA ג'וגוואה אקוג
CGGC/36-FAM/		 לא יה"ח מוצר מחשוף Las1 של SC-ITS2
21-nt ליאור הירש
אואקווקגה/36-TAMSp/		 ת"א 596 (פילון ואח 'RNA, 2018) 24 00:00:

טבלה 1: מצעי RNA המסויגים בתווית פלורסנט.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מתואר הוא אזהרה כדי למדוד את פעילות kinase של Grc3 PNK על מצעי נוקלאוטיד נוקלאוטיד תיוג פלורסנט. פרוטוקול זה ניתן להחיל כדי לאפיין אנזימי PNK אחרים על ידי התאמת מאגר התגובה ומולת oligonucleotide. לדוגמה, הפרוטוקול דורש כמות מעקב של EDTA. התוספת של EDTA היא מועילה משתי סיבות: ראשית, גישה זו מעדיפה מגנזיום כבול Grc3 על ידי מניעת האנזים מאיגוד כדי לעקוב אחר כמויות של מתכות מזהמות בתערובת. שנית, כמות קטנה של EDTA מעכבת את הפעילות של ריבוזונוקלאז תלוי מתכת מזהם מבלי לשבש את הפעילות של ribonuclease מתכת הקשורים לאס1. הריכוז של EDTA עשוי להשתנות בהתאם למקור של PNK ספציפי. תסיסה זו מספקת גם יתרון על פני פוספורילציה PNK מסורתית פוספורילציה המסתמכים על oligonucleotides המסומנות עם radioisotopes מחצית חיים קצר (כלומר, 2 שבוע מחצית חיים עבור זרחן-32). פרוטוקול זה יכול להיות מותאם למדוד פעילות אנזימים ספציפיים וkinetics Michaelis-Menten, כמו גם לקבוע את התלות של phosphorylation על פרמטרים שונים, כגון טבעם של נוקלאוטידים, מצעים, ויונים מתכת.

פרוטוקול זה מסתמך על הפעלת ג'לים פוליאקרילאמיד גדולים כדי להשיג רזולוציה מספקת כדי להבחין בצוללת לא זרחן מהמוצר הזרחן שלה. שפיכה וטיפול בג'לים אלה הם צעדים קריטיים בפרוטוקול. לדוגמה, תמיסת אקרילאמיד חייבת להיות מחוממת כדי להמיס את אוריאה ולאחר מכן מקורר לאט לפני שפיכת הג'ל. קירור פתרון זה מהר מדי יכול להוביל להיווצרות גבישים. יש גם לנקוט בזהירות כדי להימנע מהחדרת בועות אוויר ואבק תוך שפיכה והגדרת הג'ל. הדמיה של הג'ל מבלי להסיר את צלחות הזכוכית מומלצת כדי להימנע קריעת הג'ל, שהוא דק וקשה להתמודד פעם אחת הוסר מצלחת הזכוכית.

פרוטוקול זה יכול להיות מותאם כדי למדוד את הפוספורילציה של מצעים אוליגונוקלאוטידים בגדלים שונים. תסרוקת מסוימת זו השתמשה 15% ג'ל אקרילאמיד כדי להשיג רזולוציה של phosphorylation של 27 nt (SC-ITS2 RNA) ו 18 nt (C2 RNA) מצעים. התוספת של קבוצת פוספט אחת ל-5-end של SC-ITS2 RNA מייצרת שינוי צנוע בהשוואה לשינוי הניידות שנגרם על 5-phosphorylation של RNA C2 קצר יותר(איור 1). בעיה זו מדגישה מגבלה באורך RNA בעת שימוש בטכניקה זו. עם מצעי RNA ארוכים יותר, התרומה של קבוצת פוספט למשקל המולקולרי הכולל של מין ה-RNA מצטמצמת. מסיבה זו, אחוז acrylamide, כמו גם את זמן הריצה ג'ל ניתן לייעל כדי להשיג רזולוציה של מצעיםבגדלים שונים 29. באופן כללי, אחוזים גבוהים יותר של אקרילאמיד משמשים ל מצעים אוליגונוקלאוטידים קטנים יותר בעוד אחוזים נמוכים יותר של אקרילאמיד (עד 8%) לספק רזולוציה טובה יותר של מצעים אוליגונוקלאוטידים גדולים יותר.

המגבלה העיקרית של תפוקה זו היא כי היא תפוקה נמוכה. שפיכה וריצה של ג'לים denaturing לוקח כמות משמעותית של זמן, הגבלת מספר ג'לים ודגימות שניתן לנתח ביום. יישום עתידי כדי להתגבר על מגבלה זו יכול להיות הפיתוח של שבבים microfluidic מסוגל לפתור מוצרי oligonucleotide phosphorylated. אלקטרופורזה מבוססת ג'ל מיקרופלוידיק יש יתרונות רבים על פני אלקטרופורזה ג'ל מסורתית, כגון גודל מדגם קטן יותר, אוטומציה, ומהירות. עם זאת, שבבים מיקרופלואידיים הנוכחיים אין רזולוציה נוקלאוטיד יחיד. לסיכום, השימוש של אלקטרופורזה ג'ל denaturing כדי לזהות הגירה שונה של oligonucleotides nonradioactive מספק טכניקה שימושית כדי לפקח על הדרישות קטליטיות והעדפת ההעדפה של קינאז קינאז פולינוקלאוטיד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לסופרים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים לד"ר אנדרו סיקמה ואנדראה קמינסקי על הקריאה הביקורתית שלהם בכתב יד זה. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי של ארה"ב למחקר פנים-עצבי; המכון הלאומי למדעי בריאות הסביבה בארה"ב (NIEHS; ZIA ES103247 ל-R.E.S) והכונים הקנדיים לחקר הבריאות (CIHR; 146626 ל-M.C.P).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.4 mm 34-well comb BioRad 1653848
0.4 mm spacer BioRad 1653812
0.5 M EDTA ph 8.0 KD Medical RGF-3130
1M Magnesium Chloride KD Medical CAC-5290
1M Tris pH 8.0 KD Medical RGF-3360
40% Acrylamide/Bis Solution 29:1 BioRad 1610146
5M Sodium Chloride KD Medical RGF-3720
ammonium persulfate (APS) BioRad 161-0700
ATP Sigma A2383-1G
boric acid Sigma B0394
bromophenol blue sodium salt Sigma B5525-5G
Glass Plates Thomas Scientific 1188K51
Hoefer SQ3 Sequencer Hoefer N/A
Image J Software N/A N/A https://imagej.nih.gov/ij/
Labeled RNA oligonucleotides IDT Custom Order
Pharmacia EPS 3500 Power Supply Pharmacia N/A
Steriflip 0. 22 um Filter Millipore 5FCP00525
TEMED BioRad 161-0800
tris base Sigma TRIS-RO
Typhoon FLA 9500 gel imager GE Healthcare N/A
Ultra Pure DEPC Water Invitrogen 750023
Ultra Pure Glycerol Invitrogen 19E1056865
urea Fisher Chemical U15-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pillon, M. C., Stanley, R. E. Nuclease integrated kinase super assemblies (NiKs) and their role in RNA processing. Current Genetics. 64 (1), 183-190 (2018).
  2. Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 114 (28), E5530-E5538 (2017).
  3. Gasse, L., Flemming, D., Hurt, E. Coordinated Ribosomal ITS2 RNA Processing by the Las1 Complex Integrating Endonuclease, Polynucleotide Kinase, and Exonuclease Activities. Molecular Cell. 60 (5), 808-815 (2015).
  4. Dikfidan, A., et al. RNA specificity and regulation of catalysis in the eukaryotic polynucleotide kinase Clp1. Molecular Cell. 54 (6), 975-986 (2014).
  5. Bernstein, N. K., et al. The molecular architecture of the mammalian DNA repair enzyme, polynucleotide kinase. Molecular Cell. 17 (5), 657-670 (2005).
  6. Rio, D. C. 5'-end labeling of RNA with [gamma-32P]ATP and T4 polynucleotide kinase. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (4), 441-443 (2014).
  7. Paredes, E., Evans, M., Das, S. R. RNA labeling, conjugation and ligation. Methods. 54 (2), 251-259 (2011).
  8. Hilario, E. End labeling procedures: an overview. Molecular Biotechnology. 28 (1), 77-80 (2004).
  9. Eastberg, J. H., Pelletier, J., Stoddard, B. L. Recognition of DNA substrates by T4 bacteriophage polynucleotide kinase. Nucleic Acids Research. 32 (2), 653-660 (2004).
  10. Lillehaug, J. R., Kleppe, K. Kinetics and specificity of T4 polynucleotide kinase. Biochemistry. 14 (6), 1221-1225 (1975).
  11. Richardson, C. C. Phosphorylation of nucleic acid by an enzyme from T4 bacteriophage-infected Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 54 (1), 158-165 (1965).
  12. Galburt, E. A., Pelletier, J., Wilson, G., Stoddard, B. L. Structure of a tRNA repair enzyme and molecular biology workhorse: T4 polynucleotide kinase. Structure. 10 (9), 1249-1260 (2002).
  13. Saito, M., et al. Large-Scale Molecular Evolutionary Analysis Uncovers a Variety of Polynucleotide Kinase Clp1 Family Proteins in the Three Domains of Life. Genome Biology Evolution. 11 (10), 2713-2726 (2019).
  14. Jain, R., Shuman, S. Characterization of a thermostable archaeal polynucleotide kinase homologous to human Clp1. RNA. 15 (5), 923-931 (2009).
  15. Weitzer, S., Hanada, T., Penninger, J. M., Martinez, J. CLP1 as a novel player in linking tRNA splicing to neurodegenerative disorders. Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 6 (1), 47-63 (2015).
  16. Wang, L. K., Lima, C. D., Shuman, S. Structure and mechanism of T4 polynucleotide kinase: an RNA repair enzyme. EMBO Journal. 21 (14), 3873-3880 (2002).
  17. Zhang, Y., Zhao, J., Chen, S., Li, S., Zhao, S. A novel microchip electrophoresis laser induced fluorescence detection method for the assay of T4 polynucleotide kinase activity and inhibitors. Talanta. 202, 317-322 (2019).
  18. Cui, L., Li, Y., Lu, M., Tang, B., Zhang, C. Y. An ultrasensitive electrochemical biosensor for polynucleotide kinase assay based on gold nanoparticle-mediated lambda exonuclease cleavage-induced signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 99, 1-7 (2018).
  19. Wang, L. J., Zhang, Q., Tang, B., Zhang, C. Y. Single-Molecule Detection of Polynucleotide Kinase Based on Phosphorylation-Directed Recovery of Fluorescence Quenched by Au Nanoparticles. Analytical Chemistry. 89 (13), 7255-7261 (2017).
  20. Liu, H., Ma, C., Wang, J., Chen, H., Wang, K. Label-free colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase/phosphatase activity and its inhibitors based on G-quadruplex/hemin DNAzyme. Analytical Biochemistry. 517, 18-21 (2017).
  21. Du, J., Xu, Q., Lu, X., Zhang, C. Y. A label-free bioluminescent sensor for real-time monitoring polynucleotide kinase activity. Analytical Chemistry. 86 (16), 8481-8488 (2014).
  22. Jiang, C., Yan, C., Jiang, J., Yu, R. Colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase activity based on the horseradish peroxidase-mimicking DNAzyme combined with lambda exonuclease cleavage. Analytica Chimica Acta. 766, 88-93 (2013).
  23. Castle, C. D., et al. Las1 interacts with Grc3 polynucleotide kinase and is required for ribosome synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 41 (2), 1135-1150 (2013).
  24. Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex. RNA. 24 (5), 721-738 (2018).
  25. Geerlings, T. H., Vos, J. C., Raue, H. A. The final step in the formation of 25S rRNA in Saccharomyces cerevisiae is performed by 5'-->3' exonucleases. RNA. 6 (12), 1698-1703 (2000).
  26. Pillon, M. C., et al. Cryo-EM reveals active site coordination within a multienzyme pre-rRNA processing complex. Nature Structural Molecular Biology. 26 (9), 830-839 (2019).
  27. Solomatin, S., Herschlag, D. Methods of site-specific labeling of RNA with fluorescent dyes. Methods in Enzymology. 469, 47-68 (2009).
  28. Giusti, W. G., Adriano, T. Synthesis and characterization of 5'-fluorescent-dye-labeled oligonucleotides. PCR Methods Application. 2 (3), 223-227 (1993).
  29. Petrov, A., Tsa, A., Puglisi, J. D. Analysis of RNA by analytical polyacrylamide gel electrophoresis. Methods in Enzymology. 530, 301-313 (2013).

Tags

ביוכימיה גיליון 159 קינאז פולינוקלאוטיד ג'ל פוליאקרילאמיד תגובת העברת פוספוריל פוספורילציה RNA Grc3 אסה לא רדיואקטיבית
תרגום לא רדיואקטיבי למדוד פוספורילציה פולינוקלאוטיד של מצעי נוקלאוטיד קטנים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pillon, M. C., Stanley, R. E.… More

Pillon, M. C., Stanley, R. E. Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates. J. Vis. Exp. (159), e61258, doi:10.3791/61258 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter