Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Ikke-radioaktiv analyse for å måle polynukleotidfosforylering av små nukleotids underlag

Published: May 8, 2020 doi: 10.3791/61258
Automatic Translation
1, 1
1Signal Transduction Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, Department of Health and Human Services, National Institutes of Health

Summary

Denne protokollen beskriver en ikke-radioaktiv analyse for å måle kinaseaktiviteten til polynukleotidkinaser (PNKs) på små DNA- og RNA-substrater.

Abstract

Polynukleotidkinaser (PNKs) er enzymer som katalyserer fosforyleringen av 5' hydroksylende dna og RNA oligonukleotider. Aktiviteten til PNKs kan kvantifiseres ved hjelp av direkte eller indirekte tilnærminger. Presentert her er en direkte, in vitro tilnærming for å måle PNK aktivitet som er avhengig av en fluorescerende merket oligonucleotide substrat og polyakrylamid gel elektroforese. Denne tilnærmingen gir oppløsning av fosforylert produkter samtidig som du unngår bruk av radiomerkede underlag. Protokollen beskriver hvordan man setter opp fosforyleringsreaksjonen, forbereder og kjører store polyakrylamidgeler og kvantifiserer reaksjonsproduktene. Den mest teknisk utfordrende delen av denne analysen er å helle og kjøre de store polyakrylamidgelene; Dermed er viktige detaljer for å overvinne vanlige vanskeligheter gitt. Denne protokollen ble optimalisert for Grc3, en PNK som monteres i et obligatorisk pre-ribosomal RNA-behandlingskompleks med sin bindende partner, Las1-kjernen. Denne protokollen kan imidlertid tilpasses for å måle aktiviteten til andre PNK-enzymer. Videre kan denne analysen også endres for å bestemme effekten av forskjellige komponenter i reaksjonen, for eksempel nukleosidtrifosfat, metallioner og oligonukleotider.

Introduction

Polynukleotid kinases (PNK) spille kritiske roller i mange DNA og RNA behandlingsveier, for eksempel DNA reparasjon og ribosommontering 1,2,3,4,5. Disse grunnleggende enzymene katalyserer overføringen av terminalen (gamma) monofosfat fra et nukleosidtriafosfat (NTP, oftest ATP) til 5' hydroksylende av et nukleotidsubstrat. En av de mest godt karakteriserte PNKs er bakteriofage T4 PNK, som har bred substrat spesifisitet og er tungt utnyttet av molekylærbiologi laboratorier for å innlemme radioaktive isotop etiketter på 5 terminus av et DNA eller RNA substrat6,7,8,9,10,11,12. Et annet eksempel på et PNK-enzym er CLP1, som finnes i Eukarya, Eubacteria og Archaea, og er innblandet i flere RNA-behandlingsveier4,,13,,14,,15.

Historisk sett er de fleste analyser som måler polynukleotidkinaseaktivitet avhengig av radioaktiv isotopmerking og påfølgende autoradiografi5,16. I de senere årene har en rekke ekstra analyser blitt utviklet for å måle PNK-aktivitet, inkludert enkeltmolekyltilnærminger, mikrochipelektroforese, molekylære beacons, samt kolorimetriske og luminescence-baserte analyser17,18,19,20,21,22. Mens mange av disse nye tilnærmingene gir forbedrede deteksjonsgrenser og unngår bruk av radioaktivitet, har hver av dem ulemper, for eksempel kostnader, avhengighet av immobilisert harpiks og begrensninger i substratvalg.

Grc3 er en polynukleotid kinase som spiller en avgjørende rolle i behandlingen av pre-ribosomal RNA2,3,23. Grc3 danner et obligatorisk kompleks med endoribonuclease Las1, som cleaves den interne transkriberte Spacer 2 (ITS2) av pre-ribosomal RNA3. Cleavage av ITS2 av Las1 genererer et produkt som huser en 5 'hydroxyl som senere fosforylert av Grc3 kinase3. For å undersøke nukleotid og substrat spesifisitet av Grc3, en billig analyse som tillot testing av forskjellige oligonukleotid underlag var nødvendig. Derfor ble det utviklet en PNK fosforyleringsanalyse ved hjelp av fluorescerende merkede substrater. Denne analysen ble brukt til å fastslå at Grc3 kan bruke en hvilken som helst NTP for fosforyloverføringsaktivitet, men favoriserer ATP24. Denne protokollen tilpasser den opprinnelige analysen for å måle PNK-aktiviteten til Grc3 på en RNA-etterligning av det pre-ribosomale RNA-substratet (SC-ITS2, tabell 1). Et utfordrende aspekt ved denne fluorescensbaserte tilnærmingen er avhengigheten av store polyakrylamidgeler for effektivt å løse fosforylert og ikke-fosforylerte underlag. Protokollen gir spesifikke detaljer om hvordan du kan helle disse store gelene og unngå vanlige fallgruver når du gjør det.

Arbeid med RNA krever spesiell forsiktighet fordi det er sterkt utsatt for nedbrytning. Det er enkle forebyggende skritt man kan ta for å begrense ribonuclease forurensning. En separat RNA-arbeidsstasjon som enkelt kan behandles med et RNase-hemmerholdig rengjøringsmiddel er ofte nyttig. Bruk alltid hansker ved håndtering av prøver og bruk av RNase-frie sertifiserte forbruksvarer er nødvendig. Fordi vann er en annen vanlig forurensningskilde, er det best å bruke nyrenset vann og sterilisere alle løsninger ved hjelp av et 0,22 μm filter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forberedelse

  1. Klargjør buffer og reagenser.
    1. Lag 1x reaksjonsbuffer ved å kombinere 20 μL på 1 M Tris (pH = 8,0), 40 μL på 5 M natriumklorid, 2,5 μL på 2 M magnesiumklorid, 100 μL på 50 % (v/v) glyserol og RNasefritt vann for å nå et totalt volum på 1 ml.
    2. Gjør urea lasting fargestoff ved å kombinere 4,8 g urea, 200 μL på 1 M Tris (pH = 8,0), 20 μL på 0,5 M EDTA (pH = 8,0), 0,5 ml 1 % (w/v) bromofenolblått og RNasefritt vann for å nå et totalt volum på 10 ml.
    3. Lag 10x TBE buffer ved å kombinere 108 g Tris base, 55 g borsyre, 40 ml 0,5 M EDTA (pH = 8,0) og RNase-fritt vann for å nå et totalt volum på 1 L.
    4. Lag 10% (w / v) ammonium persulfat (APS). Vei 0,5 g APS og tilsett 3 ml RNase-fritt vann for å oppløse det faste. Tilsett RNase-fritt vann for å nå et totalt volum på 5 ml. Pakk røret i folie og oppbevar oppløsningen ved 4 °C.
      MERK: Oppløst APS forfaller over tid. Erstatt 10% APS lager annenhver uke.
  2. Oppnå polynukleotid kinase enzym.
    1. Tilegne deg rent Las1-Grc3 PNK-enzym2 som er lagret i reaksjonsbufferen (se trinn 1.1.1) i en lagerkonsentrasjon på 20 μM. Lagringsbufferen vil variere avhengig av den spesifikke PNK.
  3. Forbered nukleinsyresubstrat.
    MERK: Denne protokollen overvåker 5'-fosforylering av et 27 nt RNA-substrat som huser Las1-Grc3-behandlingsstedet (C2-området) som finnes i Saccharomyces cerevisiae pre-ribosomal intern transkribert avstandss avstands 2 (SC-ITS2; se tabell 1)2,25,26.
    1. Kjemisk syntetisere en RNA oligonucleotide substrat som inneholder en 5'-hydroxyl ende sammen med en 3'-fluorescerende etikett. Fluoroforen vil bli brukt til visualisering av RNA. Sørg for at fluorofor er plassert på RNA-enden som ikke er rettet mot fosforylering. Som et alternativ til kommersielle kilder kan intern og terminal fluorescerende merking av RNA-substrater utføres internt ved hjelp av kostnadseffektiveprotokoller 27.
    2. Fjern overflødig fluorofor fra RNA-merkingsreaksjonen ved HPLC-rensing28.
    3. Resuspend lyofilisert RNA ved hjelp av RNase-fritt vann til 500 nM.
    4. Oppbevar RNA-aliquots ved -80 °C for langtidslagring eller -20 °C for korttidslagring.
  4. Forbered ATP-konsentrasjonsserien.
    1. Lag en 20 mM arbeidslager av ATP ved hjelp av reaksjonsbuffer (se trinn 1.1.1). Bruk denne arbeideren til å generere fire seriell fortynninger fra 20 mM-0,02 mM.
    2. For å gjøre den første fortynningen av konsentrasjonsserien, bland 1 μL av 20 mM ATP-arbeidsmassen med 9 μL reaksjonsbuffer. Dette vil resultere i en 10-ganger fortynning av ATP med en endelig konsentrasjon på 2 mM.
    3. Bruk 2 mM ATP-aksjen som ble generert i trinn 1.4.2 for å gjøre neste fortynning i konsentrasjonsserien. Bland 1 μL av 2 mM ATP-lageret med 9 μL reaksjonsbuffer. Dette vil gjøre en ny ATP lager konsentrasjon på 0,2 mM.
    4. Fortsett å fortynne 1 μL av den forrige ATP-bestanden med 9 μL reaksjonsbuffer for å lage den påfølgende ATP-bestanden i konsentrasjonsserien.

2. In vitro RNA kinase reaksjon

MERK: Denne analysen kan brukes til å måle flere variabler som tid, nukleotidnivåer eller enzymkonsentrasjon. Målet med dette eksperimentet er å vurdere mengden fosforylert RNA i nærvær av konstant Las1-Grc3 kompleks og varierende ATP nivåer.

  1. For hver RNA-enzym kinasereaksjon, kombinere 1 μL av 500 nM RNA substrat, 8,3 μL av 130 nM Las1-Grc3, og 0,2 μL av 5 mM EDTA.
    MERK: Hvis du utfører flere reaksjoner, må du lage en hovedbestand av RNA-enzymblandingen og aliquot 9,5 μL av denne masterblandingen til hvert reaksjonsrør.
  2. Start analysen.
    1. Sett varmeblokken på 37 °C.
    2. Ved 10 s intervaller blandes 0,5 μL av ett ATP-substock fra ATP-konsentrasjonsserien tilberedt i trinn 1,4 med én RNA-enzymblanding og plasserer reaksjonen i 37 °C varmeblokken.
      MERK: Tilsett 0,5 μL reaksjonsbuffer i stedet for ATP i én RNA-enzymblanding for en PNK negativ kontroll. Bruk en annen nødvendig kontroll også (det vil vil at RNA-substrat i fravær av PNK-enzym).
    3. Inkuber reaksjonene i 60 min ved 37 °C.
      MERK: Fluorescerende merket RNA er lysfølsom; Dekk derfor reaksjonene med folie.
    4. Ved hjelp av samme rekkefølge som i trinn 2.2.2, slukke hver 10 s ved å spiking reaksjonen med 10 μL urea lasting fargestoff (se trinn 1.1.2).
      MERK: I tillegg til 4 M urea kan proteinase K tilsettes på dette trinnet for å forringe enzymet. Følg instruksjonene fra leverandøren for å bestemme de nødvendige proteasemengden og reaksjonsforholdene.
    5. Bruk de slukkede in vitro RNA kinasereaksjonene umiddelbart for nedstrømsanalyse (se avsnitt 3) eller oppbevar ved -20 °C som skal analyseres på et senere tidspunkt.

3. Gel elektroforese

  1. Forbered 15% akrylamid / 8 M urea gel løsning.
    FORSIKTIG: Akrylamid må håndteres med forsiktighet, fordi det er et nevrotoksin. Bruk alltid hansker, en labfrakk og vernebriller når du håndterer den.
    1. I et 150 ml glassbeger, kombinere 22,5 ml forhåndsbavet 40% akrylamid / bis-akrylamid 29:1 løsning, 6 ml 10x TBE (se trinn 1.1.3), 28.8 g urea, og RNase-fritt vann til et totalt volum på 59 ml. Rør forsiktig løsningen.
      MERK: Avhengig av RNA-substratlengden kan endring av prosentandelen av polyakrylamid forbedre oppløsningen mellom ukosforylert og fosforylert RNA.
    2. For å oppløse urea, varme opp løsningen i mikrobølgeovnen i 20 s, rør væsken og plasser umiddelbart løsningen tilbake i mikrobølgeovnen i ytterligere 20 s. Rør forsiktig løsningen til ureaen er helt oppløst.
    3. Avkjøl oppløsningen langsomt ved å plassere glassbegeret i et grunt vannbad som inneholder kaldt vann. Pass på at nivået av kaldt vann rundt glassbegeret er over oppløsningsnivået inne i glassbegeret. Dette vil fremme effektiv varmeoverføring. Vent 5 min.
      MERK: Ikke fortsett med denne protokollen hvis glassbegeret føles varmt; vannet skal være under 25 °C. Hvis det fortsatt føles varmt etter 5 min, så erstatt vannet i vannbadet med friskt kaldt vann og vent ytterligere 5 min.
    4. Filtrer og degas oppløsningen ved hjelp av en 0,22 μm engangsfiltreringsenhet for å fjerne partikler og mikroskopiske luftbobler.
  2. Hell denaturing gel.
    1. Bruk såpe og varmt vann til å rengjøre en kort og lang glassplate designet for geler med totale dimensjoner på 31,0 cm x 38,5 cm. Spray hver glassplate med 95% etanol og tørk av glasset for å fjerne fuktighet.
      MERK: En av de to platene kan silikoniseres for å hindre skade på gelen når du skiller glassplatens sandwich. Dette trinnet er imidlertid ikke nødvendig fordi denne protokollen er utformet for å visualisere RNA uten å skille glassplatene.
    2. Plasser den lange glassplaten horisontalt på toppen av en boks slik at den heves av benkeplaten.
      FORSIKTIG: Akrylamid er giftig, derfor må gelestasjonen dekkes av benkpapir som kan absorbere sølt væske og umiddelbart plasseres i en avfallspose etter at prosedyren er fullført.
    3. Plasser en ren avstandss avstand på 0,4 mm langs langsidene på den lange glassplaten.
    4. Legg den korte glassplaten på toppen av den lange platen og sørg for at kantene på den korte platen, langplaten og avstandsslene er justert. Klem på hver side ved hjelp av tre jevnt fordelte metallklemmer.
    5. Tilsett 24 μL TEMED i 15% akrylamid/8 M ureaoppløsning tilberedt i trinn 3.1 og bland oppløsningen.
    6. Tilsett 600 μL på 10 % (w/v) APS (se trinn 1.1.4) i oppløsningen i trinn 3.2.5 og bland oppløsningen forsiktig.
    7. Hell umiddelbart løsningen mellom glassplatene.
      MERK: For å unngå bobler, trykk på glasset når oppløsningen helles.
    8. Tilsett forsiktig en ren, 0, 4 mm, 32 godt kam til toppen av glassplaten sandwich.
    9. La det være minst 30 min for akrylamidet å polymerisere.
  3. Kjør denaturing gel.
    1. Sett varmeblokken på 75 °C.
    2. Fjern metallklemmene som holder glassplatens sandwich sammen, og vask og tørk glassplatens sandwich grundig.
    3. Legg glassplatens sandwich i gelapparatet med den korte platen vendt innover.
    4. Forbered 0,5 x TBE-løpebuffer ved å kombinere 100 ml 10x TBE med 1,9 L RNasefritt vann. Tilsett 600 ml av løpebufferen til de øvre og nedre kamrene i gelapparatet.
    5. Fjern forsiktig kammen og skyll brønnene grundig med en sprøyte.
      MERK: Dette trinnet er avgjørende for å fjerne urea fra brønnene.
    6. Forløp gelen i 30 min ved 50 W. Spenningen er ca. 2000 V.
      FORSIKTIG: Dette gelapparatet opererer med høy effekt, og brukerne bør vise forholdsregler.
    7. Skyll brønnene grundig med en sprøyte.
      MERK: Dette trinnet er avgjørende for jevn lasting av prøve i brønnene.
    8. Pulsspinne de slukkede reaksjonene fra trinn 2.2.5. Deretter inkubere rørene ved 75 °C i 3 min. Gjenta pulsspinnen.
    9. Legg straks 10 μL prøve per brønn og kjør gelen i 3 timer ved 50 W.
      MERK: Fluorescerende merket RNA er lysfølsom; Dekk derfor gelapparatet med folie.
  4. Bilde denaturing gel.
    1. Slå av strømforsyningen og tøm det øvre kammeret på gelapparatet.
    2. Vask og tørk den ytre siden av glassplaten sandwich med såpe og vann. Dekk glassplaten sandwich med folie mens du transporterer gelen.
    3. Monter glassplatesmørbrødet på scenen på en laserskanner som er i stand til kvantitativ og sensitiv fluorescensdeteksjon.
      MERK: Denne gelen er ekstremt tynn for maksimal oppløsning. Av denne grunn er denne protokollen utformet for å unngå vanskelighetene med å fjerne gelen fra glassplatens sandwich ved å visualisere den fluorescerende merkede RNA gjennom glassplatene. Bruken av kommersielt tilgjengelige glassplater med lav fluorescens vil øke det fangede signalet ved å forbedre signal-til-støy-forholdet.
    4. Still inn eksitasjons- og utslippsbølgelengdene til laserskanneren for ønsket fluorofor.
      MERK: De optimale eksitasjons- og utslippsbølgelengdene kan variere for spesifikke fluoroforer. For FAM-fluorofor er eksitasjons- og utslippsbølgelengdene henholdsvis 495 nm og 535 nm.
    5. Definer området som skal visualiseres på laserskannerstadiet, og bilde gelen i henhold til produsentens instruksjoner (figur 1).

4. Bildeanalyse og signalkvantifisering

  1. Last det digitale gelbildet som er anskaffet i trinn 3.4.5 i bildeprocesing-programvare (se Materialse tabell).
  2. Bruk venstre knapp på musen til å klikke og dra et rektangel for å definere en malboks for å markere grensene for det digitale gelbildet som skal brukes til å kvantifisere hvert RNA-bånd. RNA-båndet sett i reaksjonsblandingen satt i fravær av PNK-enzymet er vanligvis et godt bånd for å generere denne malen.
    MERK: For å unngå skjevhet forårsaket av bakgrunnssignal, er det avgjørende at området rundt hvert RNA-bånd som måles, er identisk. Av denne grunn er det best å bruke den samme malboksen til å avgrense hvert RNA-bånd.
  3. Åpne ROI Manager under"Verktøy"og merk plasseringen av malboksen ved å klikke " Leggtil".
    MERK: Kvantiseringsprogrammer kan også tegne bokser automatisk ved å følge brukerhåndboken for programvaren.
  4. Bruk venstre knapp på musen, klikk og dra malboksen over til neste RNA-bånd og gjenta trinn 4.3. Continute denne prosessen til plasseringen av alle de ukosforylert og fosforylert RNA band i hver reaksjon er merket.
  5. Mål den integrerte tettheten i hver boks ved å klikkepå "Mål"i ROI Manager.
  6. For å beregne den relative mengden fosforylert RNA i en reaksjon, del den integrerte tettheten av det fosforylerte RNA-båndet ved summen av de integrerte tetthetene til de ukosforylerte og fosforylerte RNA-båndene fra samme reaksjon. Denne tilnærmingen kan også brukes til å beregne den relative mengden ukosforylert RNA.
  7. For å visualisere akkumuleringen av fosforylert RNA-produkt og tilsvarende uttømming av ukosforylert RNA-substrat på tvers av ATP-konsentrasjonsserien, plotter du den relative mengden RNA beregnet i trinn 4.6 mot konsentrasjonen av ATP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En vellykket representativ denaturing gel av en titrering av ATP med en fast mengde Las1-Grc3 kompleks er vist i figur 1. Tilsetning av enzym resulterte i Las1-mediert RNA-spaltning av SC-ITS2 RNA-substratet, noe som førte til et definert RNA-fragment (5-OH C2 RNA). Ved tilsetning av ATP ble C2 RNA-fragmentet fosforylert av Grc3 PNK (5-P C2 RNA). I denaturing geler fosforyler RNA migrerer raskere enn sin ukosforylert motstykke. Som vist i figur 2kan fosforylering av C2 RNA-fragmentet visualiseres ved å plotte den relative mengden ukosforylert og fosforylert C2 RNA mot ATP-konsentrasjonen. Grc3 PNK fosforet også 5-enden av det ukuttede SC-ITS2-substratet, om enn i en lavere hastighet. Dette bekrefter tidligere arbeid som tyder på Grc3 PNK viser substrat preferanse mot sin C2 RNA substrat24. En mislykket denaturing gel er vist i figur 3. Denne gelen var mislykket fordi 21 nt RNA-substratet inneholdt nedbrytningsprodukter (figur 3, første kjørefelt). Disse nedbrytningsproduktene overlappet med fosforylert produkt og gjorde det umulig å nøyaktig kvantifisere fosforylering. I motsetning kan det korteste RNA-nedbrytningsproduktet (figur 3, grå piler) analyseres med hell fordi dette området av gelen ikke inneholdt noen ekstra RNA-arter som hindret nøyaktig kvantifisering av sin fosforylert motstykke. Hvis du vil unngå RNA-nedbrytningsbånd, holder du arbeidsområdet og løsningene RNase-fri, og begrenser antall RNA fryse-tine sykluser.

Figure 1
Figur 1: Eksempel på denaturing gel analyse av fosforylert RNA. In vitro RNA kinase analyse av Las1-Grc3 (110 nM) inkubert med 500 nM SC-ITS2 RNA. X markerer kontrollreaksjonen uten Las1-Grc3, og den svarte trekanten representerer titrering av ATP fra 0-10 mM. C2 RNA er et resultat av SC-ITS2 RNA cleavage av Las1-kjernen og er det endogene substratet for Grc3 PNK-aktivitet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Kvantifisering av RNA fosforylering. Densiometriske plott av Las1-Grc3 RNA kinase aktivitet uttrykt som en prosentandel av ukosforylert C2 RNA (grå linje; 5-OH C2 RNA) og fosforylert C2 RNA (brun linje; 5-P C2 RNA) over en ATP konsentrasjonsserie. Feilfelt markerer standardavviket fra tre uavhengige tekniske replikeringer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Eksempel på en mislykket denaturing gelanalyse av fosforylert RNA. In vitro RNA kinase analyse av T4 PNK (0-0.625 U) inkubert med 5 μm 21 nt RNA. X markerer kontrollreaksjonen uten T4 PNK. Denne RNA-kontrollen inneholder bare degraderte RNA-produkter som gjør det umulig å skille det 21 nt fosforylertproduktet fra nedbrytningsproduktet (svarte piler). Fosforylering av det korteste RNA-nedbrytningsproduktet (grå piler) kan analyseres, fordi det ikke er noen avdradasjonsprodukter som overlapper med sin fosforylert motstykke. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Sekvens (5'→3') Oligo-kode Kilde
SC-ITS2 GUCGUUUUAGGUUUUAC LEILIGHET
CAACUGCGGC/36-FAM/		 911 200. (Pillon et al. NSMB 2019) 26.
C2 RNA GGUUUUACCAACUG
CGGC/36-FAM/		 N/a Las1 cleavage produkt av SC-ITS2
21-nt leilighet AcguacGCGGAA Leilighet
UACUUCGAA/36-TAMSp/		 2009: 2009: 000 (Pillon et al. RNA, 2018) 24.

Tabell 1: Fluorescerende merkede RNA-substrater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Beskrevet er en analyse for å måle kinaseaktiviteten til Grc3 PNK på fluorescerende merkede nukleotidunderstrater. Denne protokollen kan brukes til å karakterisere andre PNK enzymer ved å tilpasse reaksjonsbufferen og oligonukleotidsubstratet. Protokollen krever for eksempel et sporbeløp på EDTA. Tilsetning av EDTA er gunstig av to grunner: For det første favoriserer denne tilnærmingen magnesiumbundet Grc3 ved å forhindre at enzymet bindes til spormengder av forurensende metaller i blandingen. For det andre hemmer en liten mengde EDTA aktiviteten til å forurense metallavhengige ribonukleer uten å forstyrre aktiviteten til den tilhørende Las1 metalluavhengige ribonukleæren. Konsentrasjonen av EDTA kan endres avhengig av kilden til den spesifikke PNK. Denne analysen gir også en fordel over tradisjonelle PNK fosforyleringsanalyser som er avhengige av oligonukleotider merket med korte halveringstid radioisotoper (det vil si 2 ukers halveringstid for fosfor-32). Denne protokollen kan tilpasses for å måle spesifikk enzymaktivitet og Michaelis-Menten kinetikk, samt bestemme avhengigheten av fosforylering på ulike parametere, for eksempel arten av nukleotider, substrater og metallioner.

Denne protokollen er avhengig av å kjøre store denaturing polyakrylamid geler for å oppnå tilstrekkelig oppløsning for å skille et ukosforylert substrat fra fosforylert produkt. Helle og håndtere disse gelene er kritiske skritt i protokollen. For eksempel må akrylamidløsningen varmes opp for å oppløse urea og deretter avkjøles sakte før gelen helles. Kjøling av denne løsningen for raskt kan føre til dannelse av krystaller. Det må også tas hensyn til for å unngå å innføre luftbobler og støv mens du heller og setter gelen. Bilde av gelen uten å fjerne glassplatene anbefales for å unngå å rive gelen, noe som er tynt og vanskelig å håndtere når den er fjernet fra glassplatene.

Denne protokollen kan tilpasses for å måle fosforylering av forskjellige størrelse oligonukleotid underlag. Denne analysen brukte en 15% akrylamidgel for å oppnå oppløsning av fosforylering av 27 nt (SC-ITS2 RNA) og 18 nt (C2 RNA) substrater. Tilsetningen av en fosfatgruppe til 5-enden av SC-ITS2 RNA gir et beskjedent skifte sammenlignet med mobilitetsendringen indusert ved 5-fosforylering av den kortere C2 RNA (figur 1). Dette fremhever en begrensning i RNA-lengde når du bruker denne teknikken. Med lengre RNA-substrater reduseres bidraget fra en fosfatgruppe til den generelle molekylvekten til RNA-arten. Av denne grunn kan prosentandelen av akrylamid samt gelens kjøretid optimaliseres for å oppnå oppløsning av forskjellige størrelses underlag29. Generelt brukes høyere prosentandeler av akrylamid til mindre oligonukleotidunderstrater, mens lavere prosentandeler av akrylamid (ned til 8 %) gir bedre oppløsning av større oligonukleotid underlag.

Den store begrensningen av denne analysen er at den er lav gjennomstrømming. Helle og kjøre denaturing geler tar en betydelig mengde tid, begrense antall geler og prøver som kan analyseres på en dag. En fremtidig søknad om å overvinne denne begrensningen kan være utviklingen av mikrofluidiske chips i stand til å løse fosforylert oligonukleotid produkter. Mikrofluidisk-basert gel elektroforese har mange fordeler fremfor tradisjonell gel elektroforese, for eksempel mindre prøvestørrelse, automatisering, og hastighet. Nåværende mikrofluidiske brikker har imidlertid ikke en enkelt nukleotidoppløsning. Til slutt gir bruk av denaturing gelelektroforese for å oppdage endret migrering av ikke-radioaktive oligonukleotider en nyttig teknikk for å overvåke katalytiske krav og substratpreferanse av polynukleotidkinaseenzymer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Andrew Sikkema og Andrea Kaminski for deres kritiske lesning av dette manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av US National Institute of Health Intramural Research Program; Us National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS; ZIA ES103247 til R.E.S) og Canadian Institutes of Health Research (CIHR; 146626 til M.C.P).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.4 mm 34-well comb BioRad 1653848
0.4 mm spacer BioRad 1653812
0.5 M EDTA ph 8.0 KD Medical RGF-3130
1M Magnesium Chloride KD Medical CAC-5290
1M Tris pH 8.0 KD Medical RGF-3360
40% Acrylamide/Bis Solution 29:1 BioRad 1610146
5M Sodium Chloride KD Medical RGF-3720
ammonium persulfate (APS) BioRad 161-0700
ATP Sigma A2383-1G
boric acid Sigma B0394
bromophenol blue sodium salt Sigma B5525-5G
Glass Plates Thomas Scientific 1188K51
Hoefer SQ3 Sequencer Hoefer N/A
Image J Software N/A N/A https://imagej.nih.gov/ij/
Labeled RNA oligonucleotides IDT Custom Order
Pharmacia EPS 3500 Power Supply Pharmacia N/A
Steriflip 0. 22 um Filter Millipore 5FCP00525
TEMED BioRad 161-0800
tris base Sigma TRIS-RO
Typhoon FLA 9500 gel imager GE Healthcare N/A
Ultra Pure DEPC Water Invitrogen 750023
Ultra Pure Glycerol Invitrogen 19E1056865
urea Fisher Chemical U15-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pillon, M. C., Stanley, R. E. Nuclease integrated kinase super assemblies (NiKs) and their role in RNA processing. Current Genetics. 64 (1), 183-190 (2018).
  2. Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 114 (28), E5530-E5538 (2017).
  3. Gasse, L., Flemming, D., Hurt, E. Coordinated Ribosomal ITS2 RNA Processing by the Las1 Complex Integrating Endonuclease, Polynucleotide Kinase, and Exonuclease Activities. Molecular Cell. 60 (5), 808-815 (2015).
  4. Dikfidan, A., et al. RNA specificity and regulation of catalysis in the eukaryotic polynucleotide kinase Clp1. Molecular Cell. 54 (6), 975-986 (2014).
  5. Bernstein, N. K., et al. The molecular architecture of the mammalian DNA repair enzyme, polynucleotide kinase. Molecular Cell. 17 (5), 657-670 (2005).
  6. Rio, D. C. 5'-end labeling of RNA with [gamma-32P]ATP and T4 polynucleotide kinase. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (4), 441-443 (2014).
  7. Paredes, E., Evans, M., Das, S. R. RNA labeling, conjugation and ligation. Methods. 54 (2), 251-259 (2011).
  8. Hilario, E. End labeling procedures: an overview. Molecular Biotechnology. 28 (1), 77-80 (2004).
  9. Eastberg, J. H., Pelletier, J., Stoddard, B. L. Recognition of DNA substrates by T4 bacteriophage polynucleotide kinase. Nucleic Acids Research. 32 (2), 653-660 (2004).
  10. Lillehaug, J. R., Kleppe, K. Kinetics and specificity of T4 polynucleotide kinase. Biochemistry. 14 (6), 1221-1225 (1975).
  11. Richardson, C. C. Phosphorylation of nucleic acid by an enzyme from T4 bacteriophage-infected Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 54 (1), 158-165 (1965).
  12. Galburt, E. A., Pelletier, J., Wilson, G., Stoddard, B. L. Structure of a tRNA repair enzyme and molecular biology workhorse: T4 polynucleotide kinase. Structure. 10 (9), 1249-1260 (2002).
  13. Saito, M., et al. Large-Scale Molecular Evolutionary Analysis Uncovers a Variety of Polynucleotide Kinase Clp1 Family Proteins in the Three Domains of Life. Genome Biology Evolution. 11 (10), 2713-2726 (2019).
  14. Jain, R., Shuman, S. Characterization of a thermostable archaeal polynucleotide kinase homologous to human Clp1. RNA. 15 (5), 923-931 (2009).
  15. Weitzer, S., Hanada, T., Penninger, J. M., Martinez, J. CLP1 as a novel player in linking tRNA splicing to neurodegenerative disorders. Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 6 (1), 47-63 (2015).
  16. Wang, L. K., Lima, C. D., Shuman, S. Structure and mechanism of T4 polynucleotide kinase: an RNA repair enzyme. EMBO Journal. 21 (14), 3873-3880 (2002).
  17. Zhang, Y., Zhao, J., Chen, S., Li, S., Zhao, S. A novel microchip electrophoresis laser induced fluorescence detection method for the assay of T4 polynucleotide kinase activity and inhibitors. Talanta. 202, 317-322 (2019).
  18. Cui, L., Li, Y., Lu, M., Tang, B., Zhang, C. Y. An ultrasensitive electrochemical biosensor for polynucleotide kinase assay based on gold nanoparticle-mediated lambda exonuclease cleavage-induced signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 99, 1-7 (2018).
  19. Wang, L. J., Zhang, Q., Tang, B., Zhang, C. Y. Single-Molecule Detection of Polynucleotide Kinase Based on Phosphorylation-Directed Recovery of Fluorescence Quenched by Au Nanoparticles. Analytical Chemistry. 89 (13), 7255-7261 (2017).
  20. Liu, H., Ma, C., Wang, J., Chen, H., Wang, K. Label-free colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase/phosphatase activity and its inhibitors based on G-quadruplex/hemin DNAzyme. Analytical Biochemistry. 517, 18-21 (2017).
  21. Du, J., Xu, Q., Lu, X., Zhang, C. Y. A label-free bioluminescent sensor for real-time monitoring polynucleotide kinase activity. Analytical Chemistry. 86 (16), 8481-8488 (2014).
  22. Jiang, C., Yan, C., Jiang, J., Yu, R. Colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase activity based on the horseradish peroxidase-mimicking DNAzyme combined with lambda exonuclease cleavage. Analytica Chimica Acta. 766, 88-93 (2013).
  23. Castle, C. D., et al. Las1 interacts with Grc3 polynucleotide kinase and is required for ribosome synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 41 (2), 1135-1150 (2013).
  24. Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex. RNA. 24 (5), 721-738 (2018).
  25. Geerlings, T. H., Vos, J. C., Raue, H. A. The final step in the formation of 25S rRNA in Saccharomyces cerevisiae is performed by 5'-->3' exonucleases. RNA. 6 (12), 1698-1703 (2000).
  26. Pillon, M. C., et al. Cryo-EM reveals active site coordination within a multienzyme pre-rRNA processing complex. Nature Structural Molecular Biology. 26 (9), 830-839 (2019).
  27. Solomatin, S., Herschlag, D. Methods of site-specific labeling of RNA with fluorescent dyes. Methods in Enzymology. 469, 47-68 (2009).
  28. Giusti, W. G., Adriano, T. Synthesis and characterization of 5'-fluorescent-dye-labeled oligonucleotides. PCR Methods Application. 2 (3), 223-227 (1993).
  29. Petrov, A., Tsa, A., Puglisi, J. D. Analysis of RNA by analytical polyacrylamide gel electrophoresis. Methods in Enzymology. 530, 301-313 (2013).

Tags

Biokjemi utgave 159 polynukleotid kinase polyakrylamid gel fosforyl overføring reaksjon RNA fosforylering Grc3 ikke-radioaktiv analyse
Ikke-radioaktiv analyse for å måle polynukleotidfosforylering av små nukleotids underlag
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pillon, M. C., Stanley, R. E.… More

Pillon, M. C., Stanley, R. E. Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates. J. Vis. Exp. (159), e61258, doi:10.3791/61258 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter