Summary
基于Ca2+高程的向前遗传屏幕作为读出，可以识别植物中钙依赖信号通路所涉及的遗传成分。
Abstract
前向基因筛选是公正地识别涉及几种生物途径的遗传成分的重要工具。屏幕的基础是生成一个突变群体，可以筛选与感兴趣的表型。EMS（乙基甲烷硫酸盐）是一种常用的烷基化剂，用于诱导经典正向基因筛选中的随机突变，以识别任何给定过程中涉及的多个基因。细胞性钙 （Ca2+）高程是压力感知激活的关键早期信号通路。然而，在很多研究系统中，Ca2+的受体、通道、泵和运输器的身份仍然难以捉摸。Aequorin 是一种细胞钙活化蛋白，从 Aequorea 维多利亚分离，稳定地用阿拉伯语表达。利用这一点，我们设计了一个前向基因屏幕，其中我们EMS突变的阿奎林转基因。从突变植物的种子收集 （M1）， 并在分离 （M2） 种群中进行感兴趣的表型筛查.使用 96 井高通量 Ca2+ 测量协议，可以识别几个具有不同钙反应并实时测量的新颖突变体。具有兴趣表型的突变体被拯救和传播，直到获得同源突变植物种群。该协议提供了一种在Ca2+报告者背景中进行遗传筛选的方法，并识别新的Ca2+调控目标。
Introduction
细胞酸钙（Ca2+）浓度的变化，在生物刺激或非生物刺激的感知是一个研究良好的早期信号事件，激活许多信号通路1，2，3，4。2,3,41处于基础静止状态的细胞在细胞固原中保持较低的Ca 2+浓度，在各种细胞内细胞器和细胞外凋亡中保持较低的Ca2+浓度，导致陡峭的Ca 2+梯度5，6。,6在信号感知后，由于来自细胞外和/或细胞内源的Ca2+的涌入，细胞胶中的Ca2+水平上升，并产生刺激特异性钙质特征7，8，9。,8,9细胞胶中的Ca 2+高程被许多刺激激活，但特异性由不同的商店释放Ca2+，一个独特的Ca2+签名和适当的传感器蛋白10，11。10,11
使用烷基拉特剂，乙烷硫酸盐（EMS）的诱变是经典前向基因筛选中一个强大的工具，用于识别过程中涉及的多个独立基因。EMS 是一种化学突变，主要诱导 C 到 T 和 G 到 A 在整个基因组中随机过渡，并且每 125 kb 的基因组产生 1 bp 的变化。EMS突变将诱导+1000单碱基对变化，插入/删除（InDel）或单核苷酸多态性（SNP）每个基因组12。EMS 诱导突变是多点突变，突变频率从 1/300 到 1/30000 打击位。这减少了寻找给定基因突变所需的M1植物的数量。M1种子种群范围为2000-3000，通常用于获得对阿拉比多普西斯·塔利亚13，14感兴趣的突变。
Aequorin转基因植物是阿拉伯哥伦比亚-0（Col-0）生态型植物表达p35S-阿波埃奎林（pMAQ2）在细胞索尔15。Aequorin是一种由蛋白酶和由荧光素分子（coelenterazine）组成的假体组成的Ca 2+结合蛋白。Ca2+ 与aequorin 的结合，它有三个 Ca 2+结合 EF 手位点，导致 coelenterazine 被氧化和循环，以给予二氧甲酮中间体，然后蛋白质的一致性变化，伴随着二氧化碳和单兴奋共体酰胺 16的释放。如此产生的二甲酰胺会发出蓝光（最大，470maxnm），可由亮度计17检测到。因此，极快的Ca 2+高程可以实时测量，并利用快速前进的遗传屏幕。该协议旨在利用钙反应的特异性来识别参与 Ca2+ 签名的新的关键参与者。为了完成此任务，我们使用转基因 aequorin 中的 EMS 突变，并识别与更改的 Ca2+信号相关的 SNPs。该协议标识在增加刺激时显示无或减少 Ca2+高程的突变体。然后，可以映射这些突变体，以识别负责Ca2+反应的基因。该方法适用于导致Ca2+高程的植物中的任何类型的液体刺激。由于 Ca2+高程是植物防御信号通路中的第一批响应之一，因此对上游响应成分的识别可以为基因工程提供开发弹性植物的候选方法。
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Protocol
1. EMS 突变和单一基于血统的种子收集（1-3 个月）
- 重150毫克的种子（+7500）的equorin为EMS突变（M0种子）。再称150毫克种子作为控制。
- 将种子转移到 50 mL 管中，并加入 25 mL 的 0.2% EMS （v/v） （注意） （用于治疗） 或 25 mL 的自动处理水（用于控制）。
注：乙酰甲烷硫酸盐是一种用于植物材料突变的化学剂。 - 用半膜密封管子，用铝箔包裹。在室温下将管端旋转 18 小时。
- 让种子安顿下来。小心地取出 EMS 溶液，并丢弃在一个废物容器中，该容器内含有 1 M NaOH 的同等体积（NaOH 有助于中和/灭活 EMS，使其安全丢弃）。在 1 M NaOH 溶液中丢弃用过的塑料制品。
注：24小时后，按照危险材料实验室的做法处置丢弃物。 - 用40 mL的自洗水彻底清洗静音种子至少8次。如上文所述，将含有水的 EMS 丢弃在 NaOH 废物容器中。
- 对于最后的洗涤，加入40 mL的100 mM硫硫酸钠，并冲洗3次，以去除EMS的痕迹。
- 将种子浸泡在40 mL的自洗水中约1小时，将EMS从种子中散开，然后放在滤纸上，直到完全干燥。
- 将种子转移到微离心管中，在40 mL的自自功能化水中将种子在4°C下分层2-4天。这有助于打破种子休眠，并确保同质生长。
- 将突变种子 （M0）和控制种子转移到土壤（土壤成分：农用石：土壤，1：1），并将它们转移到生长室与 16 h 光/8 小时暗光时间，光强度 150μmol m+2 +2[s +1和 +70% 相对湿度。
- 要确定诱变是否成功，请寻找降低的发芽速度和幼苗生长，以及叶绿素分界18（图1A）。将突变植物与对照植物进行比较，以识别这些生理和发育差异。
注：不同的方法可用于从M1植物中收获种子。在此协议中，我们使用了基于单一血统的种子收集方法。每个 M1工厂都有一个唯一的数字，从 A1 到 A3500。 - 将单独编号的工厂作为离散工厂线（图 1B）。
- 成熟后，从这些个体突变植物中收获种子，并储存为单独的M1线（图2）。从单一基于血统的种子集合中，我们获得了大约 5000 M1行，其中 3500 M1行被筛选。
2. 高通量筛选，选择突变体（8个月）
- 根据 Ca2+对所选刺激的响应确定新型突变体。在这里，我们使用H2O2作为示例。
- 要识别突变体，请筛选 M2代。由于隐性突变体在EMS突变14时以M2代的1/8频率分离，8-12 M2-分离植物的筛选覆盖一个M 1线，并识别同酶隐性突变体（使用12株幼苗可增加发现突变体的可能性）。从每个独立的 M1线，测试 12 M2幼苗的 Ca2+响应 H2O2 （12 M2苗每 M1线）。
- 使用高通量种子灭菌和水培植物生长协议19。将每M 1线近12-15 M2种子放在24孔组织培养板的个别井中，并使用氯气（40 mL 12% 次氯酸钠和盐酸，3：1，v/v）在烟气罩中干燥器中消毒 4 小时。程序后，打开干燥器，并过夜，使氯气蒸发。
- 灭菌后，将板放在外面，并将液体 1/2 MS 介质（无糖的半强度 MS）添加到单个孔中。用副膜密封板，在4°C下将种子分层2-4天，然后在20-22°C的相对湿度下将种子移至10小时光/14小时暗光的生长室。
- 一旦幼苗是8-12天大，将12M 2幼苗从每行单独放在一个96井的发光计板。要测量 Ca2+响应 H2O2，请使用发光计板读卡器。
- 幼苗转移后，在暗/低光区域的个别井中加入150μL的5-10μM二甲酸酯溶液（从5mM甲醇的自功能利水中稀释）（CAUTION）在暗光/低光区，并在21°C的黑暗中储存8小时。
注：Coelentrazine 是一个假肢组，它与阿波-阿奎林结合，并将其重组为功能 aequorin。Coelentrazine 对光敏感，因此储存在深色瓶子中，不受光线影响。 - 第二天，使用10 mM H2O2作为刺激，执行突变屏幕，并测量随后的Ca2+响应。
- 对于 24 孔的同步测量，创建一个自动动力学程序，测量背景 1 分钟，然后测量 10 分钟，然后测量 10 分钟，然后测量总 aequorin 放电 （2 M CaCl2在 150 μL 20% 乙醇） 1-2 分钟。
注：需要总equorin的末放电来量化测量的Ca2+，并作为功能aequorin的额外控制。末放电为1-2分钟，不会导致严重的植物死亡。或者，如果植物在排放步骤后死亡，则重新筛选特定的 M1 线，并进行救援，不释放。这种突变体可以在M3和M4代中使用放电步骤得到确认。 - 使用 24 井格式扫描方法，每行以 7 秒的间隔测量每行，每个测量点集成时间为 300 ms。在每一行中使用野生型幼苗作为控件，以便比较和评估突变体。
注：一个包含M2幼苗的96井板将覆盖8个单独的M 1线（8 M1 *12+96 M2），可以在2.5小时筛选，每天32M1线将筛选，640 M1植物每月。工厂准备好后的整个筛选过程需要大约8个月的时间。 - 使用 H 2 O 2 根据 Ca2+ 响应的丢失或减少识别突变体。通过基于抗生素的洗涤过程抢救选定的突变体。用25毫克/升的cefotaxime溶液洗涤两次，然后转移到1~2MS agar中含有25毫克/升的洗涤介质。
- 在10小时光/14小时暗光时长板，获得突变植物。cefotaxime 洗涤有助于去除幼苗上任何有害的微生物。由于重建后的幼苗保持未密封，在转移回无菌状态时尽量减少污染。
- 将突变植物转移到土壤中，以获得同源M3种群。
3. 数据分析和突变识别（1-3个月）
注：上述方法提供的读数为相对光单位 （RLU）。
- 要计算 [Ca2]cyt浓度，请使用以下浓度方程20。
pCa = 0.332588（=日志（最大L/L））= 5.5593
亮度计数 （） 和总剩余计数 （最大值）。 - 将所得 pCa 值转换为 [Ca2]cyt值（以 μM 为单位），乘以 106。然后以图形方式绘制对 aequorin （转基因 Col-0 aequorin） 控件，用于识别对 Ca2+响应的生成 H 2 O2 突变体。
- 救援幼苗显示损失或反应减少 H2O2申请获救。
- 成熟后，从获救的突变体中收获种子，并重新筛选，以响应M3幼苗中的H2O2。如果所有 12 M3幼苗都表现出与母植物相似的 Ca2+响应，则认为种群是同源 M3突变体。如果所有12株幼苗都未表现出这种反应，则将它们进行M4生成并重新筛选以获得同源种群。
- 获得同源植物线后，使用下一代测序识别导致表型改变的基因。
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Representative Results
EMS 总体被筛查为 H2O2诱导 Ca2+高程。如前所述，从每一个M1线筛选了12个单独的M2幼苗。在图 3中，绘制了一条这样的 M1线，每个面板显示 12 个单独的 M2幼苗。野生型 aequorin 用作比较和评估突变反应的控制。隐性突变体以1：7的比例分离（突变体：非突变体）。每M 1线筛选12个个体幼苗时，我们可以识别每行1或2个突变体。我们已经从12M 2幼苗中鉴定了2个突变体（图3）。这些突变体被进一步被带到M3和M4，并生成同源。同源突变体被进一步映射，以确定因果基因。
图1：EMS变异阿拉伯。（A） 为了确定成功的EMS突变，我们寻找诱变植物种群中的叶绿素区（用箭头表示）。据统计，0.1至1%的M1植物必须显示氯含量。（B） M1植物的个别盆栽用于进行单一的基于血统的种子收集。请单击此处查看此图的较大版本。
图2：前向基因筛选方法的示意图表示。在 Col-0 中表达细胞性 Aequorin （Aeq） 的 7500 种转基因 Arabidopsis 植物在 M0代用乙基甲烷硫化酯 （EMS） 进行突变。M1代的约5000株幼苗通过单一谱系法单独繁殖，并传播到M2代。每M 2线有12个植物被筛选为感兴趣的表型（约3000-3500 M1线）。突变的表型的兴趣被拯救和传播到M3代，并筛选为同性。请单击此处查看此图的较大版本。
图3：识别对H2O2治疗反应改变的突变体。显示了一个代表性的数字，从单个隔离 M1 行中描绘突变选择。面板显示筛选结果（12分离M2幼苗每个人M 1线）刺激与10 mM H2O2。WT（Aequorin）控制（绿线），所有12M2幼苗的平均是平均响应（红线）和1-X（黑线）是单个幼苗编号从1-12。对于每个图形，y 轴为 [Ca2]cyt （μM），x 轴为时间 （分钟）。[Ca2]细胞水平是根据相对光单位（RLUS）计算的。请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
EMS突变是一个强大的工具，在种群中产生突变。使用EMS的经典前向基因筛选是识别新基因的有效工具，原因有二：第一，它们不需要任何基因识别的先前假设;其次，它们不引入任何偏见。有几种方法可以生成筛选人群，如 EMS、T-DNA 插入、辐射等。在所有方法中，基于 EMS 的诱变与其他方法相比几乎没有优势。首先，它更容易产生突变体群体通过暴露于EMS，如目前的协议21，22,所述。其次，可以生成足够数量的突变种子群体，可用于一个或多个刺激的多个屏幕。第三，可以识别由于错位突变而产生的基本基因的弱等位基因。第四，利用EMS屏幕可以识别一系列基因功能效应，包括功能完全丧失、部分功能丧失、功能改变和组成基因功能。它可以帮助识别双突变体，这是不可行的其他突变方法23，24，25。,24,25. 该协议中使用的基于 M1种子的单一血统集合也是有利的，因为它允许一个人回到母体群体再次识别相同的突变体，如果后代在随后的后代中丢失。它提供了恢复突变的可能性，这些突变在同源时不育，并且可以通过突变植物的异质兄弟姐妹进行恢复。其次，与M1代种子的膨胀相比，这种策略保证了分离的所有突变体的独立性。它确保从M2集合中分离的突变是同一位点的不同等位基因，而不是同一突变事件26。
通过EMS突变细胞筛选识别的基因依赖于用于筛查种群的表型。感兴趣的表型筛选得越快，就越容易识别新的路径。Ca2+是一个无处不在的辅助信使，是第一批被激活的信令级联之一。它充当植物对各种生物刺激和非生物刺激反应的中介。此外，钙报告器阿奎林可以本地化到各种亚细胞室和细胞器27，28，29。27,28,29这为,识别这些隔间中蛋白质在钙反应动力学30、31、32,中局部的作用开辟了道路。
自发现以来，基于Es-突变的正向基因屏幕，以及使用Ca2+作为读出一直是当代的。这种方法的优点已经超过了陷阱。然而，该技术的一些局限性仍需要仔细评估。屏幕是劳动和时间密集型的，需要识别突变植物从大量的突变人口。因此，在开始试验计划之前，必须根据资源可用性、工作人员要求和空间限制进行详细规划。基于 aequorin 的 Ca2+ 屏幕的第二个主要挑战是，在没有放电步骤的情况下出现误报的可能性。因此，协议中包含了很短的放电步骤。随机突变也可能导致生成因多重突变而无法拯救的无菌植物。第三，Ca2+签名具有高度的组织特异性，必须保证筛查的一致性。
没有多少前向基因筛选已经识别出Ca2+的受体、通道、泵和运输器，因为使用Ca2+作为前向遗传学中的筛选表型是罕见的。在我们的方法中，刺激（例如，H2O2）诱导Ca 2+高程被用作前进基因筛选的标记，以识别过程中涉及的新遗传成分。使用EMS突变的aequorin种群的类似策略已经导致许多受体的发现，如DONN1，这是eATP受体33，钙通道OSCA34，LORE受体参与脂质多糖传感35和核糖酶PARN136。吴等人最近发表的一项研究使用了一种非常相似的方法，在H2O2引出物上筛选EMS突变的甲氧素植物，以识别新型过氧化氢传感器HPCA137。因此，在Ca2+记者背景中使用EMS突变的协议是刺激性传感中新基因发现的一种有希望的方法。
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Disclosures
没有一个作者有任何利益冲突可以声明。
Acknowledgments
我们感谢国家植物基因组研究所 - 植物生长植物学设施，孟买地区视频拍摄，以及生物技术系-电子图书馆联盟提供电子资源访问。这项工作得到了印度生物技术部通过国家植物基因组研究所核心赠款、马克斯·普朗克·格塞尔沙夫特-印度伙伴小组方案的支持;和CSR-初级研究金（至D.M和S.M）和生物技术系-初级研究金（至R.P）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well tissue culture plate | Jetbiofil | 11024 | for growing seedlings |
| 96 well white cliniplate | Thermo Scientific | 9502887 | for luminometer measurements |
| Aequorin | |||
| Agropet | Lab Chem India | for plant growth | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 12135 | for discharge solution |
| Coelenterazine | PJK | 55779-48-1 | prosthetic group for aequorin |
| Ehtylmethane sulfonate | Sigma Aldrich | M0880-5G | for seed mutagenesis |
| Ethanol | Analytical reagent | 1170 | for discharge solution |
| Hydrochloric acid | Merck Life Sciences | 1.93001.0521 | sterlization solution |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | 15465 | as stimulus for Calcium elevation |
| Luminoskan ascent | Thermo Scientific | 5300172 | aequorin luminescence measurement |
| MES buffer | Himedia | RM1128-100G | plant growth |
| Murashige and skoog media | Himedia | PT021-25L | plant growth |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | 27805 | for neutralizing EMS |
| Sodium hypochlorite | Merck Life Sciences | 1.93607.5021 | sterlization solution |
| Sodium thiosulfate | Fisher Scientific | 28005 | for seed washing in step 1.6 |
| soilrite | Lab Chem India | for plant growth | |
| Square pots | Lab Chem India | for plant growth | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | plant growth |
| Taxim | Alkem | 7180720 | for seedling rescue |
References
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