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Biology

फॉरवर्ड जेनेटिक स्क्रीन ट्रांसजेनिक कैल्शियम रिपोर्टर Aequorin का उपयोग करने के लिए कैल्शियम सिग्नलिंग में उपन्यास लक्ष्य की पहचान

Published: August 1, 2020 doi: 10.3791/61259

Summary

एक पढ़ने के रूप में Ca2 + ऊंचाई पर आधारित एक आगे आनुवंशिक स्क्रीन पौधों में कैल्शियम निर्भर सिग्नलिंग रास्तों में शामिल आनुवंशिक घटकों की पहचान की ओर जाता है ।

Abstract

फॉरवर्ड जेनेटिक स्क्रीन कई जैविक रास्तों में शामिल आनुवंशिक घटकों की निष्पक्ष पहचान में महत्वपूर्ण उपकरण रहे हैं । स्क्रीन का आधार एक उत्परिवर्ती आबादी उत्पन्न करना है जिसे ब्याज के फेनोटाइप के साथ जांचा जा सकता है। ईएमएस (एथिल मीथेन सल्फोनेट) किसी भी प्रक्रिया में शामिल कई जीन की पहचान करने के लिए शास्त्रीय फॉरवर्ड जेनेटिक स्क्रीन में यादृच्छिक उत्परिवर्तन को प्रेरित करने के लिए आमतौर पर उपयोग किया जाने वाला एल्किलाटिंग एजेंट है। साइटोसोलिक कैल्शियम (सीए2 +)ऊंचाई एक प्रमुख प्रारंभिक संकेत मार्ग है जो तनाव धारणा पर सक्रिय होता है। हालांकि रिसेप्टर्स, चैनलों, पंपों और Ca2 + के ट्रांसपोर्टरों की पहचान अभी भी कई अध्ययन प्रणालियों में मायावी है । Aequorin एक सेलुलर कैल्शियम रिपोर्टर प्रोटीन Aequorea विक्टोरिया से अलग है और stably अरबीडोप्सिस में व्यक्त किया है । इसका शोषण करते हुए, हमने एक फॉरवर्ड जेनेटिक स्क्रीन तैयार की जिसमें हमने ईएमएस-म्यूटेजेनाइज्ड एटोरिन ट्रांसजेनिक को डिजाइन किया। उत्परिवर्ती पौधों से बीज एकत्र किए गए (एम1)और अलग (एम2) आबादीमें ब्याज की फेनोटाइप के लिए स्क्रीनिंग की गई थी। 96-अच्छी तरह से उच्च-थ्रूपुट सीए2 + माप प्रोटोकॉल का उपयोग करके, कई उपन्यास म्यूटेंट की पहचान की जा सकती है जिनमें कैल्शियम की अलग-अलग प्रतिक्रिया होती है और वास्तविक समय में मापा जाता है। ब्याज के फेनोटाइप वाले म्यूटेंट को बचाया जाता है और तब तक प्रचारित किया जाता है जब तक कि एक होमोज़िगस उत्परिवर्ती पौधे की आबादी प्राप्त नहीं हो जाती है। यह प्रोटोकॉल Ca2+ रिपोर्टर पृष्ठभूमि में अग्रेषित आनुवंशिक स्क्रीन के लिए एक विधि प्रदान करता है और उपन्यास Ca2 + विनियमित लक्ष्यों की पहचान करता है।

Introduction

बायोटिक या अजैविक उत्तेजना की धारणा पर साइटोसोलिक कैल्शियम (सीए2 +)एकाग्रता में परिवर्तन एक अच्छी तरह से अध्ययन किया गया प्रारंभिक संकेत घटना है जो कई सिग्नलिंगरास्तों कोसक्रिय करती है 1 ,2,,,3,,4। इसके बेसल विश्राम राज्य में एक कोशिका साइटोसोल में कम सीए2 + एकाग्रता बनाए रखती है और विभिन्न इंट्रासेलुलर ऑर्गेनेल्स और एक्सट्रासेलुलर एपोप्लास्ट में अतिरिक्त सीए2 + को अलग रखती है जिससे खड़ी सीए2 + ढाल5,,6होती है। सिग्नल धारणा पर, एक्सट्रासेलुलर और/या इंट्रासेलुलर स्रोतों से सीए 2 + की आमद के कारण साइटोसोल में सीए 2+ का स्तर बढ़जाता है और एक,उत्तेजना विशिष्ट कैल्शियम हस्ताक्षर7,,8,9उत्पन्न करता है। साइटोसोल में सीए2 + ऊंचाई कई उत्तेजनाओं द्वारा सक्रिय होती है, लेकिन विशिष्टता सीए2 +,एक अद्वितीय सीए 2 + हस्ताक्षर और उपयुक्त सेंसर प्रोटीन10,,11को जारी करने वाले अलग-अलग स्टोर द्वारा बनाए रखी जाती है।2+

म्यूटेनेसिस के लिए एल्किलेटिंग एजेंट, एथिल-मीथेन सल्फोनेट (ईएमएस) का उपयोग शास्त्रीय फॉरवर्ड जेनेटिक स्क्रीन में एक शक्तिशाली उपकरण है जो एक प्रक्रिया में शामिल कई स्वतंत्र जीन की पहचान करता है। ईएमएस एक रासायनिक म्यूटाजेन मुख्य रूप से सी को टी और जी को जीनोम में बेतरतीब ढंग से संक्रमण के लिए प्रेरित करता है और जीनोम के हर 125 किलोब में 1 बीपी परिवर्तन पैदा करता है। ईएमएस म्यूटेनेसिस ≈१००० एकल आधार जोड़ी परिवर्तन, या तो प्रविष्टि/विलोपन (InDel) या एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता (एसएनपी) प्रति जीनोम12प्रेरित करेगा । ईएमएस-प्रेरित उत्परिवर्तन 1/3000 से 1/30000 प्रति लोकस तक उत्परिवर्तन आवृत्ति के साथ कई बिंदु उत्परिवर्तन हैं। यह किसी दिए गए जीन में उत्परिवर्तन खोजने के लिए आवश्यक एम1 पौधों की संख्या को कम करता है। 2000-3000 की एम1 बीज जनसंख्या सीमा का उपयोग आमतौर पर अरबीडोप्सिस थैलियाना13 , 14,में ब्याज के उत्परिवर्तन प्राप्त करने के लिए कियाजाताहै।

एकोरिन ट्रांसजेनिक्स अरबीडोप्सिस कोलंबिया-0 (कर्नल-0) इकोटाइप पौधे हैं जो साइटोसोल15में p35S-apoaequorin (pMAQ2) व्यक्त करते हैं। Aequorin एक सीए2 + बाध्यकारी प्रोटीन है जो एपोप्रोटीन से बना है और एक कृत्रिम समूह है जिसमें लूसिफ़ेरिन अणु, कोएलेंटेरज़ीन शामिल हैं। सीए2 + से ऐकोरिन के लिए बाध्यकारी, जिसमें तीन सीए2 + बाध्यकारी ईएफ-हाथों की साइटें हैं, जिसके परिणामस्वरूप कोएलेंटेरज़ीन को डाइऑक्सेटोन इंटरमीडिएट देने के लिए ऑक्सीकृत और चक्रीय किया जा रहा है, जिसके बाद कार्बन डाइऑक्साइड और सिंगलेट-उत्साहित कोलेरेंटेरामाइड16की रिहाई के साथ प्रोटीन का एक अनुरूप परिवर्तन हुआ। इस प्रकार उत्पादित कोलेरेंटेमाइड एक नीली रोशनी (λअधिकतम,470 एनएम) उत्सर्जित करता है जिसका पता ल्यूमिनोमीटर17द्वारा लगाया जा सकता है। बेहद तेजी से Ca2 + ऊंचाई इस प्रकार वास्तविक समय में मापा जा सकता है, और तेजी से आगे आनुवंशिक स्क्रीन के लिए शोषण किया । इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य सीए2 + हस्ताक्षर में शामिल उपन्यास प्रमुख खिलाड़ियों की पहचान करने के लिए कैल्शियम प्रतिक्रिया की विशिष्टता का उपयोग करना है। इस कार्य को प्राप्त करने के लिए, हम ट्रांसजेनिक एकोरिन में ईएमएस म्यूटेनेसिस का उपयोग करते हैं और परिवर्तित सीए2 + सिग्नलिंग से जुड़े एस्प्स की पहचान करते हैं। प्रोटोकॉल म्यूटेंट की पहचान करता है जो उत्तेजनाओं के अलावा पर सीए2 + ऊंचाई नहीं दिखाते हैं। इसके बाद इन म्यूटेंट को सीए2 + प्रतिक्रिया के लिए जिम्मेदार जीन की पहचान करने के लिए मैप किया जा सकता है । यह विधि पौधों में किसी भी प्रकार की तरल उत्तेजनाओं पर लागू होती है जिसके परिणामस्वरूप सीए2 + ऊंचाई होती है। चूंकि सीए2 + ऊंचाई संयंत्र रक्षा सिग्नलिंग मार्ग में पहली प्रतिक्रियाओं में से एक है, इसलिए अपस्ट्रीम प्रतिक्रिया घटकों की पहचान लचीला पौधों को विकसित करने के लिए आनुवंशिक इंजीनियरिंग के लिए उम्मीदवारों को प्रदान कर सकती है।

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Protocol

1. ईएमएस म्यूटेनेसिस और एकल वंशावली-आधारित बीज संग्रह (1-3 महीने)

  1. ईएमएस म्यूटेनेसिस (एम 0 बीज) के लिए एकोरिन के 150 मिलीग्राम बीज (~7500) का वजन करें। एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा करने के लिए एक और 150 मिलीग्राम बीज वजन।
  2. बीजों को 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और 0.2% ईएमएस (v/v) (सावधानी) (उपचार के लिए) या ऑटोक्लेव्ड पानी के 25 एमएल (नियंत्रण के लिए) के 25 एमएल जोड़ें।
    नोट: एथिल-मीथेन सल्फोनेट पौधे सामग्री को म्यूटेजेनाइज करने के लिए एक रासायनिक एजेंट है।
  3. पैराफिल्म के साथ ट्यूब को सील करें और इसे एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटें। कमरे के तापमान पर 18 घंटे के लिए ट्यूब एंड-ओवर-एंड घुमाएं।
  4. बीजों को व्यवस्थित होने दें। ईएमएस समाधान को ध्यान से निकालें और समान मात्रा में 1 एम नाओएच युक्त अपशिष्ट कंटेनर में त्यागें (नाओएच ईएमएस को बेअसर/निष्क्रिय करने में मदद करता है जिससे इसे त्यागना सुरक्षित हो जाता है)। 1 एम नाओएच समाधान में उपयोग किए गए प्लास्टिकवेयर को छोड़ दें।
    नोट: 24 घंटे के बाद, खतरनाक सामग्री प्रयोगशाला प्रथाओं के अनुसार डिस्कार्ड का निपटान करें।
  5. म्यूटेग्नाइज्ड सीड्स को कम से कम 8 बार ऑटोक्लेव्ड पानी के 40 एमएल के साथ अच्छी तरह से धोएं। ऊपर बताए गए नाओएच अपशिष्ट कंटेनर में पानी युक्त ईएमएस को त्यागें।
  6. अंतिम धोने के लिए, 100 मिलियन सोडियम थिओसल्फेट के 40 एमएल जोड़ें और ईएमएस के निशान को हटाने के लिए 3 बार कुल्ला करें।
  7. बीजों से बाहर ईएमएस फैलाना करने के लिए ~ 1 एच के लिए ऑटोक्लेव पानी के 40 मिलीलन में बीज सोख लें और फिर उन्हें पूरी तरह से सूखने तक फिल्टर पेपर पर रखें।
  8. बीजों को एक माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और 2-4 दिनों के लिए ऑटोक्लेवित पानी के 40 एमएल में बीजों को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्तरीकृत करें। यह बीज निद्रा को तोड़ने में मदद करता है और समरूप विकास सुनिश्चित करता है।
  9. मिट्टी (मिट्टी संरचना: एग्रोपेट: मिट्टी,1:1)पर म्यूटेजेनाइज्ड बीज (एम 0) और नियंत्रण बीज दोनों को स्थानांतरित करें और उन्हें 16 घंटे की रोशनी/8 एच डार्क फोटोपीरियोड के साथ विकास कक्षों में स्थानांतरित करें, 150 μmol की हल्की तीव्रता∙ 2 ∙−1और ~70% सापेक्ष आर्द्रता।
  10. यह निर्धारित करने के लिए कि क्या म्यूटेनेसिस सफल रहा था, कम अंकुरण गति और अंकुर विकास की तलाश करें, और क्लोरोफिल सेक्टरिंग18 (चित्रा 1 ए)। इन शारीरिक और विकासात्मक मतभेदों की पहचान करने के लिए म्यूटेनेकृत पौधों की तुलना नियंत्रण पौधों से करें।
    नोट: एम1 पौधों से बीजों की कटाई के लिए विभिन्न तरीकों का उपयोग किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में हमने सिंगल वंशावली आधारित बीज संग्रह विधि का इस्तेमाल किया है । प्रत्येक एम1 संयंत्र एक अद्वितीय संख्या दी जाती है, जो A1 से A3500 तक शुरू होती है।
  11. अलग-अलग गिने जाने वाले पौधों को असतत पौधों की रेखाओं(चित्रा 1B) केरूप में बनाए रखें।
  12. परिपक्वता पर, इन व्यक्तिगत उत्परिवर्ती पौधों से फसल के बीज और व्यक्तिगत एम1 लाइनों(चित्रा 2) केरूप में स्टोर करते हैं। एकल वंशावली आधारित बीज संग्रह से, हमने लगभग 5000 एम1 लाइनें प्राप्त कीं जिनमें से 3500 एम1 लाइनों की जांच की गई।

2. म्यूटेंट का चयन करने के लिए उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग (8 महीने)

  1. चयनित उत्तेजना के लिए सीए2 + प्रतिक्रिया के आधार पर उपन्यास म्यूटेंट की पहचान करें। यहां हमने उदाहरण के तौर पर एच22 का इस्तेमाल किया ।
  2. म्यूटेंट की पहचान के लिए, एम2 पीढ़ी को स्क्रीन करें। चूंकि अप्रभावी म्यूटेंट ईएमएस म्यूटेनेसिस 14 पर एम2 पीढ़ी में1/8आवृत्ति पर अलग होते हैं, इसलिए 8-12 एम2-अलगपौधों की स्क्रीनिंग एक एम1 लाइन को कवर करती है और एक होमोज़िगस अप्रभावी अप्रभावी उत्परिवर्ती की पहचान करती है (12 रोपण का उपयोग करके म्यूटेंट खोजने की संभावना बढ़ जाती है)। प्रत्येक स्वतंत्र एम1 लाइन से, सीए 2 + प्रतिक्रिया के लिए 12 एम2 रोपण का परीक्षण एच 2 ओ2(12 एम2 रोपण प्रति एम1 लाइन) के लिए।2
  3. उच्च थ्रूपुट बीज नसबंदी और हाइड्रोपोनिक पादप विकास प्रोटोकॉल का प्रयोगकरें 19. एक 24 अच्छीतरह से ऊतक संस्कृति प्लेट के व्यक्तिगत कुओं में लगभग 12-15 एम 2 बीज प्रति एम1 लाइन रखें और क्लोरीन गैस (12% सोडियम हाइपोक्लोराइट और हाइड्रोक्लोरिक एसिड, 3:1, v/v) का उपयोग करके एक फूम हुड में 4 एच के लिए एक desiccator में बंध्याकरण । प्रक्रिया के बाद, डिसिकेटर खोलें और क्लोरीन गैस को वाष्पित करने के लिए रात भर छोड़ दें।
  4. नसबंदी के बाद, प्लेटों को बाहर लाएं और व्यक्तिगत कुओं में तरल 1/2 एमएस मीडिया (आगर के बिना आधी ताकत एमएस) जोड़ें। प्लेटों को पैराफिल्म के साथ सील करें और बीजों को 4 डिग्री सेल्सियस पर 2-4 दिनों के लिए स्तरीय करें और फिर बीजों को 70% सापेक्ष आर्द्रता के साथ 20-22 डिग्री सेल्सियस पर 10 घंटे की रोशनी/14 घंटे अंधेरे फोटोपीरियोड के साथ एक विकास कक्ष में ले जाएं।
  5. एक बार रोपण 8-12 दिन पुराना हो, एक 96-अच्छी तरह से ल्यूमिनोमीटर प्लेट में व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक पंक्ति से 12 एम2 अंकुर रखें। एच 22 के लिए सीए2+ प्रतिक्रिया को मापने के लिए, एक ल्यूमिनोमीटर प्लेट रीडर का उपयोग करें।
  6. अंकुर हस्तांतरण के बाद, 5-10 माइक्रोन कोलेन्ट्राज़ीन समाधान (मेथनॉल में 5 mm स्टॉक से ऑटोक्लेव्ड पानी में पतला) (सावधानी) एक अंधेरे/कम प्रकाश क्षेत्र में व्यक्तिगत कुओं में 150 माइक्रोन जोड़ें और 8 घंटे के लिए 21 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में स्टोर करें।
    नोट: Coelentrazine एक कृत्रिम समूह है जो एपो-एकोरिन को बांधता है और इसे कार्यात्मक एकोरिन के लिए पुनर्गठित करता है। Coelentrazine प्रकाश संवेदनशील है और इसलिए गहरे रंग की बोतलों में संग्रहीत किया जाता है, प्रकाश से संरक्षित।
  7. अगले दिन, एक उत्तेजना के रूप में 10 mM H2O2 का उपयोग कर उत्परिवर्ती स्क्रीन प्रदर्शन और बाद में Ca2 + प्रतिक्रिया को मापने ।
  8. 24 कुओं के एक साथ माप के लिए, एक स्वचालित गतिज कार्यक्रम बनाएं जो 1 मिनट के लिए पृष्ठभूमि को मापता है, इसके बाद उत्तेजनाओं के अलावा (40 माइक्रोन) और 10 मिनट के लिए माप, इसके बाद कुल एकोरिन डिस्चार्ज (150 माइक्रोल20% इथेनॉल में 2 एम सीसीएल 2) 1-2 मिनट के लिए।
    नोट: कुल aequorin के लिए एक अंत निर्वहन मापा Ca2 + और कार्यात्मक aequorin के लिए अतिरिक्त नियंत्रण के रूप में मात्रा की जरूरत है । अंत निर्वहन 1-2 मिनट का एक छोटा सा रन है और महत्वपूर्ण पौधे की मौत का कारण नहीं बनता है। वैकल्पिक रूप से, यदि पौधे निर्वहन चरण के बाद मर जाते हैं, तो विशिष्ट एम1 लाइन को फिर से स्क्रीन करें और डिस्चार्ज के बिना बचाव करें। डिस्चार्ज स्टेप का इस्तेमाल करते हुए एम3 और एम4 पीढ़ियों में ऐसे म्यूटेंट की पुष्टि की जा सकती है।
  9. 24-अच्छी तरह से प्रारूप स्कैनिंग विधि का उपयोग करें जो प्रत्येक पंक्ति को 7 एस अंतराल में माप बिंदु के अनुसार 300 एमएस एकीकरण समय के साथ मापता है। उत्परिवर्ती की तुलना और मूल्यांकन के लिए प्रत्येक पंक्ति में नियंत्रण के रूप में एक जंगली प्रकार के रोपण का उपयोग करें।
    नोट: एम2 रोपण युक्त एक एकल 96 अच्छी तरह से प्लेट 8 व्यक्तिगत एम 1 लाइन (8 एम1 *12= 96 एम2)को कवर करेगी और 2.5 घंटे में जांच की जा सकती है और प्रत्येक दिन 32 एम1 लाइनों की जांच की जाएगी, प्रति माह 640 एम1 पौधे। पौधों के तैयार होने के बाद पूरी स्क्रीनिंग प्रक्रिया में लगभग 8 महीने लगेंगे।
  10. एच22 के साथ सीए2 + प्रतिक्रिया के नुकसान या कम के आधार पर म्यूटेंट की पहचान करें। एंटीबायोटिक आधारित धोने की प्रक्रिया के माध्यम से चयनित म्यूटेंट को बचाएं। रोपण को 25 मिलीग्राम/L सेफोटैक्सिम समाधान के साथ दो बार धोएं और फिर बचाव माध्यम में स्थानांतरित करें जिसमें 1/2 एमएस एगर में 25 मिलीग्राम/L सेफोटैक्सिम शामिल है ।
  11. एक उत्परिवर्ती पौधे को प्राप्त करने के लिए प्लेटों को 10 घंटे की रोशनी/14 घंटे डार्क फोटोपीरियोड पर उगाएं । सेफोटैक्सिम वॉश अंकुर पर किसी भी हानिकारक सूक्ष्म जीवों को हटाने में मदद करता है। चूंकि पुनर्गठन के बाद रोपण को संयुक्त राष्ट्र-सील रखा जाता है, इसलिए बाँझ स्थिति में वापस स्थानांतरित करते समय संदूषण को कम करें।
  12. होमोज़िगस एम3 आबादी प्राप्त करने के लिए उत्परिवर्ती पौधे को मिट्टी में स्थानांतरित करें।

3. डेटा विश्लेषण और उत्परिवर्ती पहचान (1-3 महीने)

नोट: उपरोक्त विधि से प्रदान की गई रीडिंग सापेक्ष प्रकाश इकाइयों (आरएलयू) में हैं।

  1. गणना के लिए [Ca2 +]साइट एकाग्रता, निम्नलिखित एकाग्रता समीकरण का उपयोग करें20
    पीसीए = 0.332588 (−लॉग (एल/एलमैक्स))+ 5.5593
    ल्यूमिनेसेंस मायने रखता है () और कुल शेष मायने रखता है(अधिकतम)
  2. प्राप्त पीसीए मूल्यों को 106से गुणा करके माइक्रोन में [सीए2 +]साइट मानों में परिवर्तित करें । फिर रेखांकन Ca 2 + प्रतिक्रिया के लिए ख्यात एच 2 O2म्यूटेंट की पहचान करने के लिए एक aequorin (ट्रांसजेनिक कर्नल-0 aequorin) नियंत्रण के खिलाफ साजिश ।2
  3. बचाव रोपण एच2O2 आवेदन के लिए या कम प्रतिक्रिया की हानि दिखा बचाया ।
  4. परिपक्वता पर, एम3 रोपणमें एच 2 O2के जवाब के लिए बचाया उत्परिवर्ती और फिर से स्क्रीन से फसल बीज । यदि सभी 12 एम3 रोपण मां संयंत्र के समान सीए2 + प्रतिक्रिया दिखाते हैं, तो जनसंख्या को एक होमोज़िगस एम 3 उत्परिवर्तीआबादी मानते हैं। यदि सभी 12 रोपण ऐसी प्रतिक्रिया नहीं दिखाते हैं, तो उन्हें एम 4 पीढ़ी में ले जाएं और होमोज़िगसआबादी प्राप्त करने के लिए फिर से स्क्रीन करें।
  5. एक बार एक होमोज़िगस संयंत्र लाइन प्राप्त कर लिया गया है, जीन की पहचान करने के लिए अगली पीढ़ी अनुक्रमण का उपयोग कर बदल फेनोटाइप के लिए अग्रणी ।

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Representative Results

ईएमएस आबादी एच 2 O2प्रेरित Ca2 + ऊंचाई के लिए जांच की गई थी । जैसा कि पहले चर्चा की गई थी, प्रत्येक एम 1 लाइन से12 व्यक्तिगत एम2 रोपण की जांच की गई थी। चित्रा 3में, ऐसी एक एम1 लाइन को प्रत्येक पैनल के साथ प्लॉट किया जाता है जिसमें 12 व्यक्तिगत एम2 रोपण दिखाई देते हैं। एक जंगली प्रकार aequorin की तुलना और उत्परिवर्ती प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने के लिए नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है । एक अप्रभावी उत्परिवर्ती 1:7 के अनुपात में अलग करता है (उत्परिवर्ती: गैर उत्परिवर्ती)। जब प्रति एम 1 लाइन 12 व्यक्तिगत रोपण स्क्रीनिंग, हम प्रति लाइन1 या 2 म्यूटेंट की पहचान कर सकते हैं । हमने 12 एम 2 रोपण(चित्रा 3)से2 ख्यात म्यूटेंट की पहचान की है। इन म्यूटेंट को आगे एम 3 और एम4 में ले जायाजाता है और एक होमोज़िगस आबादी उत्पन्न होती है। होमोज़िगस उत्परिवर्ती को कारण जीन की पहचान करने के लिए आगे मैप किया जाता है।

Figure 1
चित्रा 1: ईएमएस म्यूटेजेनाइज्ड अरबीडोप्सिस। (क)एक सफल ईएमएस म्यूटागेनेसिस निर्धारित करने के लिए, हमने म्यूटेजेनाइज्ड पौधे की आबादी (तीर द्वारा इंगित) में क्लोरोफिल सेक्टरिंग की तलाश की। सांख्यिकीय रूप से, एम 1 संयंत्रों के 0.1 से1% को हरित क्षेत्रों को दिखाना चाहिए। 1)एक ही वंशावली आधारित बीज संग्रह करने के लिए एम1 पौधों की व्यक्तिगत पॉटिंग की गई । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: आगे आनुवंशिक स्क्रीन पद्धति का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। कर्नल-0 में साइटोसोलिक एइकोरिन (एईक्यू) को व्यक्त करने वाले 7500 ट्रांसजेनिक अरबीडोप्सिस पौधों को एम-0 पीढ़ी में एथिल मीथेनसल्फोनेट (ईएमएस) के साथ म्यूटेजेनाइज्ड कियाजाता है। एम 1 पीढ़ी से लगभग 5000 रोपण को व्यक्तिगत रूप से एकल वंशावली विधि द्वारा प्रचारित कियाजाता है और एम 2 पीढ़ी को प्रचारित कियाजाता है। प्रत्येक एम 2 लाइन से12 पौधों ब्याज की फेनोटाइप (लगभग 3000-3500 एम1 लाइनों) के लिए जांच की जाती है। ब्याज की फेनोटाइप के लिए उत्परिवर्ती को बचाया जाता है और एम 3 पीढ़ी को प्रचारित कियाजाता है और होमोज़िगोसिटी की जांच की जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: एच2O2 उपचार के लिए बदल प्रतिक्रिया के साथ म्यूटेंट की पहचान। एक अलग एम1 लाइन से उत्परिवर्ती चयन को चित्रित करने के लिए एक प्रतिनिधि आंकड़ा दिखाया गया है। पैनल 10 m H2 O 2 के साथ उत्तेजना पर स्क्रीनिंग परिणाम(12 अलग एम2रोपण प्रति व्यक्तिगत एम1लाइन) दिखाते हैं । डब्ल्यूटीई (Aequorin) नियंत्रण (ग्रीन लाइन), सभी 12 एम2 रोपण का औसत औसत प्रतिक्रिया (लाल रेखा) और A1-X (काली रेखा) व्यक्तिगत रोपण 1-12 से गिने जाते हैं । प्रत्येक ग्राफ के लिए, वाई-एक्सिस [सीए2+]साइट (μM) है और एक्स-एक्सिस समय (न्यूनतम) है। [Ca2+] साइट के स्तर की गणना सापेक्ष प्रकाश इकाइयों (आरआरएलयू) से की गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

ईएमएस म्यूटेनेसिस जनसंख्या में उत्परिवर्तन उत्पन्न करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। ईएमएस का उपयोग कर शास्त्रीय आगे आनुवंशिक स्क्रीन दो प्रमुख कारणों के लिए उपंयास जीन की पहचान करने के लिए एक प्रभावी उपकरण रहा है: सबसे पहले, वे जीन पहचान पर किसी भी पूर्व मांयताओं की आवश्यकता नहीं है और दूसरे, वे किसी भी पूर्वाग्रह परिचय नहीं है । ईएमएस, टी-डीएनए सम्मिलन, विकिरण आदि जैसी स्क्रीनिंग आबादी उत्पन्न करने के लिए कई तरीके हैं। सभी तरीकों में से, ईएमएस-आधारित म्यूटेनेसिस के अन्य तरीकों पर कुछ फायदे हैं। सबसे पहले, वर्तमान प्रोटोकॉल21, 22,में वर्णित ईएमएस के संपर्क में आने से उत्परिवर्ती आबादी उत्पन्न करना आसानहै। दूसरा, उत्परिवर्ती बीज आबादी की एक पर्याप्त बड़ी संख्या उत्पन्न की जा सकती है, जिसका उपयोग एक या अधिक उत्तेजनाओं के लिए कई स्क्रीन के लिए किया जा सकता है। तीसरा, एक मिसेंस उत्परिवर्तन के कारण उत्पन्न एक आवश्यक जीन के कमजोर एलील की पहचान की जा सकती है । चौथा, जीन फ़ंक्शन प्रभावों की एक सरणी को ईएमएस स्क्रीन का उपयोग करके पहचाना जा सकता है जिसमें पूर्ण हानि-कार्य, आंशिक कार्य हानि, परिवर्तित कार्य और एक संविलियन जीन फ़ंक्शन शामिल हैं। यह दोहरे म्यूटेंट की पहचान करने में मदद कर सकता है जो अन्य म्यूटेनेसिस विधियों23 , 24,,25से संभव नहींहै । 24 इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाने वाला एकल वंशावली आधारित एम 1 बीज संग्रह भी लाभप्रद है क्योंकि यह एक ही उत्परिवर्ती को फिर से पहचानने के लिए मां कीआबादी पर वापस जाने की अनुमति देता है, अगर बाद की भावी पीढ़ियों में संतान खो जाती है। यह उत्परिवर्तन है कि जब homozygous है और उत्परिवर्ती पौधों के विषम भाई बहन के माध्यम से बरामद किया जा सकता है ठीक करने के लिए संभावना प्रदान करता है । दूसरे, यह रणनीति एम1 पीढ़ी में बीजों के थोक की तुलना में अलग-थलग पड़े सभी म्यूटेंट की स्वतंत्रता की गारंटी देती है । यह सुनिश्चित करता है कि एम2 संग्रह से अलग म्यूटेशन एक ही उत्परिवर्तनीय घटना26के बजाय एक ही टिड्डी पर अलग-अलग एलील्स हैं।

ईएमएस म्यूटेनेसिस स्क्रीन के माध्यम से पहचाने गए जीन जनसंख्या की स्क्रीनिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले फेनोटाइप पर निर्भर हैं। ब्याज के फेनोटाइप जितनी तेजी से दिखाई जा सकते हैं, उतना ही आसान उपन्यास के रास्तों की पहचान करना है। Ca2+ एक सर्वव्यापी माध्यमिक दूत है जो सक्रिय होने वाले पहले सिग्नलिंग कैस्केड में से एक है। यह बायोटिक और अजैविक उत्तेजनाओं की एक विस्तृत सरणी के खिलाफ पौधे की प्रतिक्रिया के लिए मध्यस्थ के रूप में कार्य करता है। इसके अतिरिक्त, कैल्शियम रिपोर्टर एकोरिन को विभिन्न उप-सेलुलर डिब्बों और ऑर्गेनेल्स27, 28, 29,28,तक स्थानीयकृत किया जासकताहै। इससे कैल्शियम प्रतिक्रिया डायनेमिक्स30 , 31,32में इन डिब्बों में स्थानीयकृत प्रोटीन की भूमिकाओं की पहचान करनेकेरास्तेखुलते हैं .

एकोरिन में ईएमएस-म्यूटेनेसिस पर आधारित फॉरवर्ड जेनेटिक स्क्रीन और सीए2 + का उपयोग करके उनकी खोज के बाद से समकालीन बने हुए हैं। इस विधि के फायदे नुकसान से पल्ला झाड़ चुके हैं । हालांकि, तकनीक की कुछ सीमाओं को अभी भी ध्यान से मूल्यांकन करने की आवश्यकता है। स्क्रीन श्रम और समय-प्रधान है और एक विशाल उत्परिवर्तनीय आबादी से उत्परिवर्ती पौधों की पहचान की आवश्यकता होती है। इसलिए, प्रायोगिक योजना तैयार करने से पहले संसाधन उपलब्धता, कार्य कर्मियों की आवश्यकता और अंतरिक्ष विवशों के आधार पर विस्तृत योजना बनाई जानी चाहिए । aequorin आधारित Ca2 + स्क्रीन के साथ दूसरी बड़ी चुनौती एक निर्वहन कदम के बिना झूठी सकारात्मक की संभावना है । इसलिए प्रोटोकॉल में एक बहुत ही कम निर्वहन कदम शामिल है। यादृच्छिक उत्परिवर्तन भी बाँझ पौधों की पीढ़ी के लिए नेतृत्व कर सकते हैं जिन्हें कई उत्परिवर्तनों के कारण बचाया नहीं जा सकता है। तीसरा, सीए2 + हस्ताक्षर अत्यधिक ऊतक विशिष्ट है और स्क्रीनिंग में स्थिरता सुनिश्चित की जानी चाहिए4

नहीं कई आगे आनुवंशिक स्क्रीन रिसेप्टर्स, चैनलों, पंपों और Ca2 + के ट्रांसपोर्टरों की पहचान की है के रूप में Ca2 + के उपयोग के रूप में आगे आनुवंशिकी में एक स्क्रीनिंग फेनोटाइप दुर्लभ था । उत्तेजनाओं (जैसे, एच 2 O2)प्रेरित Ca2+ ऊंचाई हमारी पद्धति में एक आगे आनुवंशिक स्क्रीन के लिए मार्कर के रूप में प्रयोग कियाजाता है, इस प्रक्रिया में शामिल नए आनुवंशिक घटकों की पहचान करने के लिए । ईएमएस म्यूटेनेनाइज्ड एकोरिन आबादी का उपयोग करने वाली इसी तरह की रणनीति के कारण डॉर्न1 जैसे कई रिसेप्टर्स की खोज हुई है जो ईएटीपी रिसेप्टर33,कैल्शियम चैनल ओएससीए34, लिपोपोलिनासेकरीड सेंसिंग35 और रिबोन्यूक्लेस पारएन 136में शामिल विद्या रिसेप्टर है। वू एट अल द्वारा प्रकाशित एक हालिया अध्ययन में उपन्यास हाइड्रोजन पेरोक्साइड सेंसर एचपीसीए137की पहचान करने के लिए एच22 प्रकाशित पर ईएमएस-म्यूटेजेनाइज्ड एइकोरिन पौधों की स्क्रीनिंग की एक बहुत ही समान पद्धति का उपयोग किया गया है। इसलिए सीए2 + रिपोर्टर पृष्ठभूमि में ईएमएस म्यूटागेनेसिस का उपयोग करने वाला प्रोटोकॉल उत्तेजनाओं संवेदन में शामिल उपन्यास जीन खोज के लिए एक आशाजनक तरीका है।

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Disclosures

किसी भी लेखक के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

हम राष्ट्रीय संयंत्र जीनोम अनुसंधान संस्थान-संयंत्र विकास के लिए फाइटोट्रॉन सुविधा, वीडियो शूट के लिए बॉम्बे लोकल और ई-संसाधनों तक पहुंच प्रदान करने के लिए जैव प्रौद्योगिकी विभाग-eLibrary कंसोर्टियम को धन्यवाद देते हैं । इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ प्लांट जीनोम रिसर्च कोर ग्रांट, मैक्स प्लैंक गेसेल्सचैफ्ट-इंडिया पार्टनर ग्रुप प्रोग्राम के माध्यम से बायोटेक्नोलॉजी विभाग, भारत द्वारा समर्थित किया गया था; और सीएसआईआर-जूनियर रिसर्च फेलोशिप (डीएम और एस.एम. और जैव प्रौद्योगिकी विभाग-जूनियर रिसर्च फैलोशिप (आर.पी.) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 well tissue culture plate Jetbiofil 11024 for growing seedlings
96 well white cliniplate Thermo Scientific 9502887 for luminometer measurements
Aequorin
Agropet Lab Chem India for plant growth
Calcium chloride Fisher Scientific 12135 for discharge solution
Coelenterazine PJK 55779-48-1 prosthetic group for aequorin
Ehtylmethane sulfonate Sigma Aldrich M0880-5G for seed mutagenesis
Ethanol Analytical reagent 1170 for discharge solution
Hydrochloric acid Merck Life Sciences 1.93001.0521 sterlization solution
Hydrogen peroxide Fisher Scientific 15465 as stimulus for Calcium elevation
Luminoskan ascent Thermo Scientific 5300172 aequorin luminescence measurement
MES buffer Himedia RM1128-100G plant growth
Murashige and skoog media Himedia PT021-25L plant growth
Sodium hydroxide Fisher Scientific 27805 for neutralizing EMS
Sodium hypochlorite Merck Life Sciences 1.93607.5021 sterlization solution
Sodium thiosulfate Fisher Scientific 28005 for seed washing in step 1.6
soilrite Lab Chem India for plant growth
Square pots Lab Chem India for plant growth
Sucrose Sigma Aldrich S0389 plant growth
Taxim Alkem 7180720 for seedling rescue

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जीव विज्ञान अंक 162 एकोरिन अरेबिडोप्सिस कैल्शियम सिग्नलिंग ईएमएस फॉरवर्ड जेनेटिक स्क्रीन
फॉरवर्ड जेनेटिक स्क्रीन ट्रांसजेनिक कैल्शियम रिपोर्टर Aequorin का उपयोग करने के लिए कैल्शियम सिग्नलिंग में उपन्यास लक्ष्य की पहचान
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Mittal, D., Mishra, S., Prajapati,More

Mittal, D., Mishra, S., Prajapati, R., Vadassery, J. Forward Genetic Screen Using Transgenic Calcium Reporter Aequorin to Identify Novel Targets in Calcium Signaling. J. Vis. Exp. (162), e61259, doi:10.3791/61259 (2020).

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